KR102127570B1

KR102127570B1 - 계요등 꽃 앱솔루트를 포함하는 피부 재생 및 상처 치료용 조성물

Info

Publication number: KR102127570B1
Application number: KR1020180125036A
Authority: KR
Inventors: 이환명; 김하빈; 황대일; 박수민; 김도윤; 최인호
Original assignee: 호서대학교 산학협력단
Priority date: 2018-10-19
Filing date: 2018-10-19
Publication date: 2020-06-26
Also published as: KR20200044373A

Abstract

본 발명은 계요등 꽃으로부터 추출된 앱솔루트를 포함하는 피부재생용 조성물 및 화장료에 관한 것으로, 상기 앱솔루트는 피부세포 수준에서 세포 증식과 이동 및 콜라겐 합성 유도효과를 통하여 우수한 피부 재생, 피부 탄력 증진 및 상처 치유 효과를 제공한다.

Description

계요등 꽃 앱솔루트를 포함하는 피부 재생 및 상처 치료용 조성물{COMPOSITION FOR SKIN REGENERATION AND WOUND HEALING CONTAINING ABSOLUTE OF PAEDERIA FOETIDA FLOWER}

본 발명은 계요등(Paederia foetida)으로부터 추출된 앱솔루트를 유효성분으로 포함하는 피부 재생 및 상처 치료용 조성물 및 이의 화장료 및 피부 외용제 용도에 대한 것이다.

피부(skin)는 인체의 가장 외부를 덮고 있는 조직으로 인체를 보호하고 장벽기능을 하여 외부의 화학적·물리적 충격으로부터 몸을 보호하는 일차적인 방어기능을 한다. 피부는 표피(epidermis)와 진피(dermis), 피하지방층(subcutis)의 3개의 층으로 구성되어 있으며, 가장 바깥층에 위치하고 있는 표피층은 95%가 각질형성세포(keratinocyte)로 구성되어있다. 표피의 각질형성세포는 피부에 침투하는 세균, 화학 물질 등에 효율적으로 방어하고, 다양한 사이토카인을 분비하여 피부의 염증반응과 면역반응에 관여한다. 또한, 각질형성세포의 이동과 증식은 상처치유와 피부 재생을 제공할 뿐만 아니라, 콜라젠(collagen) 합성을 유도하여 피부의 탄력 증진과 기저막 형성에 중요한 역할을 한다. 콜라젠은 α-chain에 따라 20종 이상의 콜라젠이 있으며, 사람의 피부에는 type I, III, IV, V, VI 및 VII 형 콜라겐이 분포하고 있다. 주로 type I 콜라젠은 피부 진피층의 85% 이상을 구성하고, type IV 콜라겐은 기저막(basement membrane)의 주요 구조 단백질로서, type I 및 IV 콜라겐의 합성은 피부의 탄력을 증진시키고, 기저막 형성을 향상시켜 피부 세포들의 부착과 증식이 조절되고, 유해물질을 선택적으로 투과하는 장벽기능의 향상과 표피와 진피의 상호작용 등을 제공하는 것으로 알려졌다. 이로 인해, 피부 표피 각질형성세포의 이동과 증식, 그리고 콜라젠 합성의 유도는 피부 재생과 상처치유 뿐만 아니라 피부 탄력을 증진시키고 건강한 피부가 유지되도록 도와준다.

최근 화장품·의약외품에서 사용되는 여러 화학합성 물질의 인체에 대한 높은 독성과 호르몬 교란 등의 문제가 인식되면서 천연 소재의 개발을 필요로 하고 있다. 특히 천연 향료는 향과 아로마테라피 효과 뿐만 아니라 항균 및 항염증 작용에 대한 효과까지 알려지면서 천연물 유래 천연 향료에 대한 연구가 더욱 부각되고 있다. 천연 향료(香料)는 추출물, 추출법, 용도 및 목적에 따라 다양하게 분류되며, 식물 유래 천연향료는 추출법에 따라 에센셜 오일(essential oil), 엡솔루트(absolute), 콘크리트(concrete) 등으로 분류된다. 식물 유래 천연 향료는 식물의 2차 대사 산물 중 인체에 약리효과를 나타내는 휘발성 화학물질로, 알코올·알데히드·케톤·에스테르 등 많은 테르펜화합물이 성분이다. 이러한 천연 향료의 방향성 성분이 피부, 순환계, 후각계를 통해 스트레스 해소, 피로 회복, 근육 이완 등의 효과를 나타냄과 동시에 항균작용, 면역 증진, 항알러지 작용 등의 치료효과를 나타내어 오래전부터 질병의 치료와 예방에 활용되어왔으며 식품 향료와 향장품 원료로 사용되고 있다. 세계적으로 소비자들이 건강한 삶을 추구함에 따라 천연성분을 사용한 제품 및 천연원료에 관심을 갖게 됐고, 그 결과 천연향료 시장 또한 광범위하고 다양한 산업분야에서 응용되고 있다. 이렇듯 천연 소재가 필수적으로 요구되면서, 천연물 유래 기능성 소재 개발 관련 연구가 요구되고 있다.

계요등(Paederia foetida.)은 꼭두서니과(Rubiaceae)에 속하는 여러해살이 풀로 우리나라 남부지역에서 자생하며 산기슭 양지바른 곳이나 바닷가 풀밭에서 자란다. 길이는 5~7 m 이며 어린 가지에 잔털이 나고 독특한 냄새 때문에 계각등, 구렁내덩굴 이라고도 한다. 작은 나팔 모양을 한 꽃은 7~9월에 피며 겉은 하얀색, 안쪽은 보라색을 띤다. 예로부터 뿌리, 줄기 및 열매를 이용하여 염증성 질환 등의 치료를 위해 사용되어왔으며 현재까지 계요등은 잎을 이용한 항균활성, 항산화활성, 항고지혈증 등의 연구가 이루어져 있다.

한국공개특허 제10-2011-0036317호

상기와 같은 문제를 해소하기 위해, 본 발명은 계요등 꽃에서 앱솔루트를 추출하여 이의 구성 성분을 규명하고, 인체피부 유래 각질형성세포주(HaCat)의 증식과 이동 및 콜라겐 합성에 미치는 영향을 확인함으로써 이의 피부 탄력증진, 피부재생 및 상처 치유 효능을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 계요등(Paederia foetida.) 꽃으로부터 추출된 앱솔루트를 유효성분으로 포함하는 피부 재생 및 상처 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 앱솔루트는 휘발성 용제를 이용하여 유기용매 추출법에 의해 추출될 수 있으며, 유기용매 추출법에 의해 추출된 콘크리트를 알코올로 추출하여 불용성 왁스를 제거한 앱솔루트일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 앱솔루트는 휘발성 유기 화합물을 포함하며, 예를 들어, 헥사노데카노인산(Hexadecanoic acid), 리놀렌산(Linolenic acid), 노나데칸(Nonadecane), Anti Ox, 테트라코산(-)(Tetracosane(-)), Muscalure, 펜타코산(Pentacosane), Pentadecane, 3-methyl-, 헥사코산(Hexacosane), 10-Heneicosene, 헵타코산(Heptacosane), Tetracosanal, 옥타코산(Octacosane), 1-테트라코사놀(1-Tetracosanol), 베타-토코페롤(ß-Tocopherol), 1-heneicosene, 비타민 E(Vitamin E), 12-메톡시아비타-8,11,13-트리엔-20-알루미늄(12-Methoxyabieta-8,11,13-trien-20-al), 캄페스테롤(Campesterol), 클리오나스테롤(Clionasterol), 시클로아르테놀(Cycloartenol), 24-메틸렌시클로아르타놀(24-Methylenecycloartanol) 및 테트라미졸(Tetramisole)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 휘발성 유기 화합물을 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 앱솔루트는 1~100 μg/mL의 범위로 포함될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 앱솔루트는 표피 각질형성세포의 증식 및 이동을 유도할 수 있다. 구체적으로, 상기 앱솔루트는 인체피부 유래 각질형성세포주(HaCat)의 증식과 이동 및 콜라겐 합성을 유도할 수 있다.

또한, 본 발명은 계요등 꽃으로부터 추출한 앱솔루트를 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 계요등 꽃으로부터 추출한 앱솔루트를 유효성분으로 포함하는 피부 외용제 조성물을 제공한다.

본 발명은 계요등 꽃으로부터 추출된 앱솔루트의 성분을 규명하고, 이의 피부 탄력증진, 피부재생 및 상처 치유 효능을 입증한 것으로, 피부세포 수준에서 세포 증식 및 이동을 유도하여 피부 재생 및 상처 치유에 우수한 효과를 갖는다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 있어서 계요등 꽃으로부터 앱솔루트(absolute)를 추출하는 과정을 나타내는 흐름도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 있어서 계요등 꽃으로부터 추출한 앱솔루트의 표피 각질형성세포에 대한 독성을 나타내는 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 있어서 계요등 꽃의 앱솔루트가 표피 각질형성세포의 (A) 증식 및 (B) 이동에 미치는 효과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 있어서 계요등 꽃의 앱솔루트의 (A) 표피 각질형성세포에서 콜라젠 맹아(sprouting) 자연성장(out growth)에 미치는 효과를 나타낸 이미지 및 (B) 콜라젠 맹아(sprouting) 자연성장(out growth)에 미치는 결과를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 있어서 계요등 꽃의 앱솔루트의 (A) 콜라겐 type I 합성에 미치는 효과, 및 (B) 콜라겐 type Ⅳ 합성에 미치는 효과를 정량화하여 나타낸 그래프이다.

이하 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예들을 상세히 설명한다. 이하의 설명에 있어, 당업자에게 주지 저명한 기술에 대해서는 그 상세한 설명을 생략할 수 있다. 또한, 본 발명을 설명함에 있어서, 관련된 공지 기능 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다.

따라서 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

본 발명은 계요등 꽃으로부터 추출된 앱솔루트를 유효성분으로 포함하는 피부 재생 및 상처 치유용 조성물, 이를 포함하는 화장료 조성물 및 피부 외용제 조성물에 대한 것이다

상기 앱솔루트는 건조하지 않은 계요등 꽃으로부터 얻는 것이 바람직하며, 유기용매 추출법에 의해 추출된 콘크리트(concrete)를 알코올로 추출하여 불용성 왁스(wax)를 제거한 앱솔루트(absolute)일 수 있다.

구체적으로, 상기 앱솔루트는 계요등 꽃을 휘발성 용제를 이용한 유기용매 추출법으로 추출하여 콘크리트(concrete)를 얻는 단계; 및 상기 얻은 콘크리트를 알코올로 추출하여 불용성 왁스(wax)를 제거하고 앱솔루트(absolute)를 얻는 단계에 의해 추출될 수 있다.

일 예로서, 상기 앱솔루트는 도 1의 흐름도와 같이 추출할 수 있다. 우선, 건조하지 않은 계요등 꽃을 헥산(n-hexane)에 침전시킨 뒤, 얻은 추출물을 회전식 증발기(rotary evaporation)를 이용하여 농축시켜서 콘크리트를 얻은 다음, 상기 얻은 콘크리트에 에틸알코올(ethyl alcohol)을 넣고 -20℃에서 12시간 동안 보관하여 용해시킨 후, 진공 냉각 필터(vacuum cooling filtration) 및 회전식 증발기를 이용하여 분리/정제함으로써, 본 발명에 따른 계요등 꽃 앱솔루트를 제조할 수 있다.

상기 유기용매 추출법과 추출물로부터 앱솔루트를 분리하는 방법은 이 기술 분야에서 보통의 지식을 가진 자가 변형할 수 있는 모든 방법을 포함하는 것이 가능하다.

계요등 꽃에서 추출한 상기 앱솔루트는 다양한 생리활성을 나타내는 성분을 함유하고 있는데, 보다 구체적으로 헥사노데카노인산(Hexadecanoic acid), 리놀렌산(Linolenic acid), 노나데칸(Nonadecane), Anti Ox, 테트라코산(-)(Tetracosane(-)), Muscalure, 펜타코산(Pentacosane), Pentadecane, 3-methyl-, 헥사코산(Hexacosane), 10-Heneicosene, 헵타코산(Heptacosane), Tetracosanal, 옥타코산(Octacosane), 1-테트라코사놀(1-Tetracosanol), 베타-토코페롤(ß-Tocopherol), 1-heneicosene, 비타민 E(Vitamin E), 12-메톡시아비타-8,11,13-트리엔-20-알루미늄(12-Methoxyabieta-8,11,13-trien-20-al), 캄페스테롤(Campesterol), 클리오나스테롤(Clionasterol), 시클로아르테놀(Cycloartenol), 24-메틸렌시클로아르타놀(24-Methylenecycloartanol) 및 테트라미졸(Tetramisole)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 휘발성 유기 화합물을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 이들 성분의 함량은 구체적으로 헥사노데카노인산(Hexadecanoic acid) 1~2 중량% , 리놀렌산(Linolenic acid) 27~28 중량%, 노나데칸(Nonadecane) 0.1~1 중량%, Anti Ox 5~6 중량%, 테트라코산(-)(Tetracosane(-)) 8~9 중량%, Muscalure 1~2 중량%, 펜타코산(Pentacosane) 2~3 중량%, Pentadecane, 3-methyl- 0.1~1 중량%, 헥사코산(Hexacosane) 4~5 중량%, 10-Heneicosene 6~7 중량%, 헵타코산(Heptacosane) 0.1~1 중량%, Tetracosanal 0.1~1 중량%, 옥타코산(Octacosane) 1~2 중량%, 1-테트라코사놀(1-Tetracosanol) 5~6 중량%, 베타-토코페롤(ß-Tocopherol) 4~5 중량%, 1-heneicosene 7~8 중량%, 비타민 E(Vitamin E) 2~3 중량%, 12-메톡시아비타-8,11,13-트리엔-20-알루미늄(12-Methoxyabieta-8,11,13-trien-20-al) 1~2 중량%, 캄페스테롤(Campesterol) 6~7 중량%, 클리오나스테롤(Clionasterol) 5~6 중량%, 시클로아르테놀(Cycloartenol) 1~2 중량%, 24-메틸렌시클로아르타놀(24-Methylenecycloartanol) 0.1~1 중량% 및 테트라미졸(Tetramisole) 0.1~1 중량% 범위 안에서 포함될 수 있다.

본 발명에서는 계요등에서 추출한 앱솔루트가 상기에서 기술한 생리활성을 나타내는 성분들을 포함하고 있고, 이러한 성분들에 의해 표피 각질형성세포의 증식과 이동의 효과를(도 3 참조) 나타낸다는 것을 규명하였다.

이에 따라 본 발명에 따른 계요등 꽃에서 추출한 앱솔루트를 유효성분으로 포함하는 피부 재생 및 상처치유 조성물로 사용될 수 있으며, 약학적으로 유효한 양의 계요등에서 추출한 앱솔루트를 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다.

본 발명의 상기 앱솔루트를 피부재생 및 상처치유 조성물로 사용하는 경우 앱솔루트는 1 ~ 100 μg/mL의 농도로 사용할 수 있다. 계요등 꽃 앱솔루트를 1 μg/mL 이하의 농도로 사용할 경우에는 표피 각질형성세포의 증식과 이동의 효과가 미미하며, 앱솔루트를 100 μg/mL 이상의 농도로 사용할 경우에는 함유량 증가에 따른 뚜렷한 효과의 증가가 나타나지 않고 오히려 감소하므로 바람직하지 않다.

상기에서 "약학적으로 유효한 양"이란 상기 생리활성성분이 동물 또는 사람에게 투여되어 목적하는 생리학적 또는 약리학적 활성을 나타내기에 충분한 양을 말한다. 그러나 상기 약학적으로 유효한 양은 증상의 정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등에 따라 적절히 변화될 수 있다.

또한, 상기에서 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 것을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있으며, 경구 또는 비경구 투여를 위한 다양한 형태로 제형화 될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캡슐, 멸균 주사용액, 멸균 분말, 연고, 로션, 크림, 고약, 페이스트 등의 형태일 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며, 활성 성분의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 목적하는 효과를 상승시킬 수 있는 공지의 화합물과도 병행하여 투여할 수 있다.

나아가 본 발명에 따른 조성물은 상기 기술한 바와 같이 약학적 조성물로 사용할 수 있을 뿐만 아니라, 건강기능식품으로도 사용할 수 있다. 예컨대, 식품의 주원료, 부원료, 식품 첨가제, 기능성 식품 또는 음료로 용이하게 활용할 수 있다.

상기 “식품”이란, 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 바람직하게는 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며, 통상적인 의미로서, 식품, 식품 첨가제, 기능성식품 및 음료를 모두 포함하는 것을 말한다.

상기 식품용 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합체, 기능성 식품 등이 있다. 추가로, 특수영양식품(예, 조제유류, 영, 유아식 등), 식육가공품, 어육제품, 두부류, 묵류, 면류(예, 라면류, 국수류 등), 빵류, 건강보조식품, 조미식품(예, 간장, 된장, 고추장, 혼합장 등), 소스류, 과자류(예, 스낵류), 캔디류, 쵸코렛류, 껌류, 아이스크림류, 유가공품(예, 발효유, 치즈 등), 기타 가공식품, 김치, 절임식품(각종 김치류, 장아찌 등), 음료(예, 과실음료, 채소류 음료, 두유류, 발효음료류 등), 천연조미료(예, 라면스프 등)를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 식품, 음료 또는 식품첨가제는 통상의 제조방법으로 제조될 수 있다.

또한, 상기 “기능성 식품”또는 “건강기능성 식품”이란 식품에 물리적, 생화학적, 생물 공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체내조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 의미하며, 구체적으로는 건강 기능성 식품일 수 있다. 상기 기능성 식품에는 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함할 수 있으며, 기능성 식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.

상기 건강보조식품의 종류로는 이에 제한되지는 않으나, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료 형태 일 수 있다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예들은 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1: 계요등 꽃 앱솔루트의 제조

도 1에 도시된 공정에 따라 계요등 꽃 앱솔루트를 제조하였다.

본 실시예에서 계요등 꽃은 전남해남에서 자생된 계요등 꽃을 채취하여 사용하였다. 계요등 꽃이 피기 직전의 꽃망울 전체를 채취하여 세척 후, 생초 2 kg를 유기용매 추출법을 이용하여 추출하였다.

즉, 건조하지 않은 계요등 꽃을 헥산(n-hexane)에 침전시켰고, 이렇게 얻은 침전물을 회전식 증발기(rotary evaporation)에서 증발시켜서 농축시킴으로서 고형의 콘크리트(concrete)를 획득하였다. 그 다음, 상기 콘크리트를 에틸알코올(ethyl alcohol)를 넣어서 용해시키고 영하 20℃에서 보관한 후, 진공 냉각 필터(vacuum cooling filtration)를 거쳐서 불용성 왁스(wax)를 제거하였으며, 다시 회전식 증발기를 활용하여 농축 및 분리/정제함으로써 계요등 꽃 앱솔루트를 제조하였다. 그리고 상기 제조한 계요등 꽃 앱솔루트는 영하 80℃의 냉동고에서 보관하였다.

실시예 2. 계요등 꽃 앱솔루트의 성분 분석

계요등 꽃 앱솔루트의 성분 분석은 KBSI(Korea Basic Science Institute, Seoul Center)에 의뢰하였다. 가스 크로마토그래피/질량분석계(6890N GC/5975i MS, Agilent, USA)를 사용하였고, GC/MS의 컬럼(column)은 DB5-MS (30 m×50 μm, 0.25 μm)를 사용하였으며, 캐리어 가스(carrier gas)는 헬륨을 사용하여 1 mL/분으로 흐르게 하여 분석하였다. 오븐의 온도는 40℃-2℃/분-230℃-5℃/분-300℃(5분)으로 유지하였으며, injection의 온도는 280℃에서 분석하였다. 또한 Interface의 온도는 300℃, ion source의 온도는 230℃, analyzer의 온도는 150℃에서 분석하였으며, Mass range는 40~800 m/z에서 분석하였다.

계요등 꽃 앱솔루트 성분의 확인은 휘발성분의 지체시간(retention indices, RI)과 표준물질의 지체시간과 일치하거나 휘발물질의 질량 스펙트럼과 Wiley 7Nist 05 library의 질량 스펙트럼을 비교하여 물질을 확인하였다. RI는 C₆ ~ C₂₄ (nalkane)를 이용하여 시료와 동일 조건에서 결정하였다. 그 결과, 총 23개의 성분으로 구성되어 있음을 확인할 수 있었다(표 1).

실험예 1. 계요등 앱솔루트가 각질형성세포에 미치는 독성(세포 생존율) 측정

상기 실시예 1에서 얻은 계요등 앱솔루트를 이용하여 각질형성세포에 미치는 독성(세포생존율)을 조사하였다.

각질형성세포를 0.1 ㎎/㎖의 콜라겐(collagen, type I) 코팅된 96 well-plate에 5×10³/100㎕/well의 농도로 넣은 다음, 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 12시간 배양하였다. 12시간 후, 계요등 앱솔루트를 0.1 ~ 200 ㎍/㎖ 농도로 처리하고 24시간 배양하였으며, EZ-cytox를 처리한 후, 450 nm에서 흡광도를 측정하고 그 결과를 도 2에 나타내었다.

실험 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 계요등 앱솔루트는 0.1 ~ 200 ㎍/㎖의 농도에서는 각질형성세포의 세포독성이 관찰되지 않았고, 50 ~ 150 ㎍/㎖의 농도에서는 세포생존율이 증가함을 나타내었다. 따라서 본 발명에 사용되는 계요등 앱솔루트 성분의 농도는 200 ㎍/㎖ 이하의 농도가 바람직하다.

실험예 2. 계요등 꽃 앱솔루트가 표피 각질형성세포의 증식에 미치는 효과

상기 실시예 1에서 얻은 계요등 꽃 앱솔루트가 피부 표피 각질형성세포 증식에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 하기와 같이 조사하였다.

사람 피부 유래 표피 각질형성세포(HaCat)를 10%의 우태아 혈청(fetal bovine serum)이 포함된 DMEM 배지를 이용하여 배양하고 본 발명의 실험예에 활용하였다. 표피 각질형성세포를 96 well microtiter plate에 각 well 당 세포수 3 X 10³cells/100 μL/well이 되도록 주입하여 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 부착시켰다.

계요등 꽃 앱솔루트 1 ~ 100 μg/mL 농도로 각 well에 100 μL씩 처리하여 48시간 동안 배양시켰다. Ez-cytox와 DMEM를 1:2로 혼합하여 각 well 당 30 μL씩 처리한 후 배양기에서 30분간 반응시켰다. ELISA plate reader(Synerge2, BioTek, USA)를 이용하여 450 nm에서 흡광도 측정 후, 백분율로 환산하여 계요등 꽃 앱솔루트의 피부 표피각질형성세포 증식에 대한 결과를 확보하였다. 도 3A는 본 발명의 실시예 1에 의해 추출된 계요등 꽃 앱솔루트의 표피 각질형성세포의 증식 효과를 나타낸 그래프이다. 여기서, 음성 대조군은 계요등 꽃 앱솔루트를 이용하지 않은 것이고, 양성 대조군은 종래에 상처치유 및/또는 피부 재생에 활용되고 있는 표피성장인자(epithermal growth factor, EGF 50 ng/mL)를 이용한 것이다.

그 결과, 도 3A에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 계요등 꽃 앱솔루트는 표피 각질형성세포의 증식을 농도 의존적으로 유도하는 것으로 나타났다.

즉, 표피성장인자(50 ng/mL)에 의한 표피 각질형성세포의 증식은 127.20±0.80% 유도가 되었으며, 양성 대조군가 비교하여 계요등 꽃 앱솔루트 50 μg/mL 농도에서 141.60±8.27%의 증식 유도율을 나타내었고, 100 μg/mL의 농도에서 200.40±12.39%의 증식 유도율을 나타내어, 각질형성세포의 증식을 효과적으로 유도하는 것으로 나타났다.

실험예 3. 계요등 꽃 앱솔루트가 표피 각질형성세포 이동에 미치는 효과

상기 실시예 1에서 얻은 계요등 꽃 앱솔루트가 피부 표피 각질형성세포 이동에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 하기와 같이 실험하였다.

사람 피부 유래 표피 각질형성세포(HaCat)를 10%의 우태아 혈청(fetal bovine serum)이 포함된 DMEM 배지를 이용하여 배양하고 본 발명의 실험예에 활용하였다. 48 well Boyden microchemotaxis chamber를 사용하여 표피 각질형성세포의 이동률을 조사하였으며, 먼저 lower chamber에 계요등 꽃 앱솔루트를 각각 1 ~ 100 μg/mL 의 농도로 처리하고, type I 콜라겐 코팅이 된 8 μm pore의 polycarbonate membrane을 올려 주었다. 이후, upper chamber에 표피 각질형성세포를 well당 1×10⁶cell/50μL씩 처리하였다. Chamber를 37℃ 배양기에서 3시간 30분 배양시킨 후, membrane을 Diff-Quick solution으로 고정 및 염색하였다.

Membrane을 통과하여 이동한 세포의 수를 세어, 백분율로 환산하여 계요등 꽃 앱솔루트의 피부 표피 각질형성세포 이동에 대한 결과를 확보하였다.

도 3B는 본 발명의 일 실시예 1에 의해 추출된 계요등 꽃 앱솔루트의 피부각질형성세포의 이동효과를 나타내는 그래프이다. 음성 대조군은 계요등 꽃 앱솔루트를 이용하지 않은 것이고, 양성 대조군은 종래에 상처치유 및/또는 피부 재생에 활용되는 있는 표피성장인자(epithermal growth factor, EGF 1 ng/mL)를 이용한 것이다.

그 결과, 도 3B에 나타난 바와 같이, 본 발명의 실시예 1에 따른 계요등 꽃 앱솔루트는 표피 각질형성세포의 이동을 농도 의존적으로 유도하였으며, 특히, 계요등 꽃 앱솔루트 10 μg/mL의 농도에서 105.96±6.46%의 이동 유도율 나타내었고, 50 μg/mL의 농도에서 122.52±5.87%의 최대 이동률을 나타내어, 계요등 꽃 앱솔루트가 각질형성세포의 이동을 효과적으로 유도하는 것으로 나타났다.

실험예 4. 계요등 꽃 앱솔루트가 표피 각질형성세포 콜라겐 sprouting의 out growth에 미치는 영향

상기 실시예 1에 의해 얻은 계요등 꽃 앱솔루트가 표피 각질형성세포 콜라겐 type I과 콜라겐 type Ⅳ 합성에 미치는 영향을 측정하기 위해서, 하기와 같이 조사하였다.

Type I 콜라겐과 표피 각질형성세포를 2.5×10⁷ cells/mL이 되도록 섞은 후, NaOH (1 N)용액을 처리하여 중화한 후, 24 well plate에 5 μL씩 spoting하고, 10분간 상온에서 건조하여 인공피부조직을 형성하였다. 샘플을 농도별로 처리하고, 48시간 동안 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다. 배양액을 제거하고, Diff-Quik solution을 이용하여 세포와 조직을 고정 및 염색하였으며, 염색된 세포와 조직을 촬영하여 결과를 확보하였다.

도 4는 본 발명의 실시예 1에 의해 추출된 계요등 꽃 앱솔루트의 표피 각질형성세포 콜라겐 sprouting의 out growth에 미치는 영향을 나타낸 결과이며, 음성 대조군은 계요등 꽃 앱솔루트를 이용하지 않은 것이고, 양성 대조군은 종래의 상처치유 및/또는 피부 재생에 활용되는 있는 표피성장인자(epithermal growth factor, EGF 1 ng/mL)를 이용한 것이다.

그 결과, 도 4A에 나타난 바와 같이, 계요등 꽃 앱솔루트는 표피 각질형성세포 콜라겐 sprouting의 out growth를 농도 의존적으로 유도하는 것으로 나타났다. 즉, 양성 대조군과 비교하여 계요등 꽃 앱솔루트 50 μg/mL 농도에서 각질형성세포 콜라겐 sprouting의 out growth를 효과적으로 유도하는 것으로 나타났다. 특히, 도 4B에 나타난 바와 같이 계요등 꽃 앱솔루트 50 μg/mL 농도에서 749.43±15.56%가 유도되었으며, 100 μg/mL 농도에서 586.78±50.23%가 유도되었다.

실험예 5. 계요등 꽃 앱솔루트가 표피 각질형성세포 콜라겐 type I과 콜라겐 type Ⅳ 합성에 미치는 영향

상기 실시예 1에 의해 얻은 계요등 꽃 앱솔루트가 표피 각질형성세포 콜라겐 sprouting의 out growth에 미치는 효과를 측정하기 위해서, 하기와 같이 조사하였다.

96 well microtiter plate에 monoclonal anti-collagen I 또는 IV Ab(2 μg/well/PBS)를 주입 후 12시간 동안 상온에서 코팅하였다. Blocking buffer로 상온에서 1시간 동안 blocking 후, 샘플을 well당 100 μL 씩 처리하여 상온에서 90분 동안 반응시켰다. 샘플은 계요등 꽃 앱솔루트를 처리하지 않은 표피 각질형성세포의 배양액(CM)과 계요등 꽃 앱솔루트 10 mg/mL 농도로 처리된 표피 각질형성세포의 배양액(CM), 계요등 꽃 앱솔루트 100 mg/mL 농도로 처리된 표피 각질형성세포의 배양액(CM)을 처리하였다. 그 후, polyclonal anti-collagen I 또는 IV Ab를 각 well에 100 μL 처리하여 상온에서 90분 동안 반응시킨 다음, avidin-HRP를 각 well에 처리하여 상온에서 60분 동안 반응시켰다. Supersignal ELISA pico chemiluminescent substrate를 각 well 당 100 μL 씩 주입하여 10분 동안 반응시킨 후, ELISA plate reader를 이용하여 luminescence 정도를 측정하였고, 계요등 꽃 앱솔루트의 표피 각질형성세포의 type I 또는 IV 콜라겐 합성과 분비에 대한 결과를 도 5와 같이 확보하였다. 특히, 도 5A에 나타난 바와 같이 계요등 꽃 앱솔루트 100 μg/mL 농도에서 콜라겐 type I의 합성은 140.01±8.96%가 유도되었으며, 도 5B에 나타난 바와 같이 계요등 꽃 앱솔루트 100 μg/mL 농도에서 콜라겐 type IV의 합성은 153.43±9.60%가 유도되었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

하기 단계를 포함하여 제조되는 계요등(Paederia foetida.) 꽃 분획물을 유효성분으로 포함하는 피부 재생 및 상처 치료용 조성물:
계요등(Paederia foetida.) 꽃의 헥산 추출물을 농축하여 고상의 침전물을 얻는 단계(단계 1); 및
상기 침전물을 에틸알코올에 용해시켜 불용성 왁스를 제거하고, 농축하여 분획물을 얻는 단계(단계 2).
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제 1 항에 있어서,
상기 분획물은 헥사노데카노인산(Hexadecanoic acid), 리놀렌산(Linolenic acid), 노나데칸(Nonadecane), Anti Ox, 테트라코산(-)(Tetracosane(-)), Muscalure, 펜타코산(Pentacosane), Pentadecane, 3-methyl-, 헥사코산(Hexacosane), 10-Heneicosene, 헵타코산(Heptacosane), Tetracosanal, 옥타코산(Octacosane), 1-테트라코사놀(1-Tetracosanol), 베타-토코페롤(ß-Tocopherol), 1-heneicosene, 비타민 E(Vitamin E), 12-메톡시아비타-8,11,13-트리엔-20-알루미늄(12-Methoxyabieta-8,11,13-trien-20-al), 캄페스테롤(Campesterol), 클리오나스테롤(Clionasterol), 시클로아르테놀(Cycloartenol), 24-메틸렌시클로아르타놀(24-Methylenecycloartanol) 및 테트라미졸(Tetramisole)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 휘발성 유기 화합물을 포함하는 것인 피부 재생 및 상처 치료용 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 분획물은 1 ~ 100 μg/mL의 범위로 포함되는 것인 피부 재생 및 상처 치료용 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 분획물은 표피 각질형성세포의 증식 및 이동을 유도하는 것인 피부 재생 및 상처 치료용 조성물.
하기 단계를 포함하여 제조되는 계요등(Paederia foetida.) 꽃 분획물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물:
계요등(Paederia foetida.) 꽃의 헥산 추출물을 농축하여 고상의 침전물을 얻는 단계(단계 1); 및
상기 침전물을 에틸알코올에 용해시켜 불용성 왁스를 제거하고, 농축하여 분획물을 얻는 단계(단계 2).
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