KR102341631B1

KR102341631B1 - 마이크로버블을 이용한 계요등으로부터 패데로시딕 에시드의 고수율 추출방법 및 패데로시딕 에시드를 포함하는 피부장벽 개선용 또는 보습용 화장료 조성물

Info

Publication number: KR102341631B1
Application number: KR1020210062259A
Authority: KR
Inventors: 박미희; 심수안; 이정노; 박성민; 조항의; 김재연; 이정우; 차영권
Original assignee: 주식회사 코씨드바이오팜; 주식회사 코스메카코리아
Priority date: 2021-05-13
Filing date: 2021-05-13
Publication date: 2021-12-23

Abstract

본 발명은 마이크로버블을 이용하여 유효성분을 고수율로 추출하는 방법에 관한 것으로, 상세하게는 반응표면분석법 (RSM, Response Surface Methodology)을 이용한 최적의 추출조건에서 생성되는 마이크로버블을 이용하여 계요등으로부터 패데로시딕 에시드 (paederosidic acid)를 고수율로 추출하여 피부 장벽 개선용 또는 보습용 화장료 조성물을 제공하고자 한다.

Description

마이크로버블을 이용한 계요등으로부터 패데로시딕 에시드의 고수율 추출방법 및 패데로시딕 에시드를 포함하는 피부장벽 개선용 또는 보습용 화장료 조성물 {High-yield extraction method of paederosidic acid from Paederia scandens with microbubbles and cosmetic composition for improving skin barrier or moisturizing with paederosidic acid}

본 발명은 마이크로버블을 이용한 계요등으로부터 패데로시딕 에시드의 고수율 추출방법 및 패데로시딕 에시드를 포함하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 반응표면분석법 (RSM, Response Surface Methodology)을 사용하여 계요등으로부터 패데로시딕 에시드의 고수율 마이크로버블 추출방법 및 패데로시딕 에시드를 포함하는 피부장벽 개선용 또는 보습용 화장료 조성물에 관한 것이다.

종래에 천연물로부터 유효성분을 추출하기 위해 일반적으로 활용되고 있는 추출법은 대체로 열수 추출, 유기용매 추출, 초임계 추출 등의 방법으로 사용되고 있다. 그러나 열수를 이용한 추출법은 극성용매인 물의 분자운동 활성화에 의한 추출방법으로 유효성분이 극성성분에 한정되어 수용성의 성분 위주로 추출되거나 높은 온도에 의해 유효성분이 파괴되는 문제점이 발생한다. 유기용매를 이용한 추출법은 유기용매에 의한 화학적 변성 및 잔류 용매로 인한 적용상의 한계점과 용매를 제거하기 위한 에너지 소비가 높아 경제적이지 못하다. 초임계 추출법은 추출 수율 및 추출성분 변성 등의 측면에서 유용한 효과가 있으나 추출장비 및 추출비용이 고가인 문제점이 존재한다. 따라서 상기 추출방법의 단점을 보완하여 유효성분의 추출수율을 높이고, 성분의 변형이 없는 추출방법과 경제성 등의 문제해결이 요구되고 있다.

통상 인간이 들을 수 있는 가청(可聽)범위를 넘는 20 kHz 보다 높은 진동수를 갖는 소리를 초음파라고 한다. 초음파는 최근 제약이나 약제의 합성, 그리고 식품의 가공에 점차 그 영역을 확대하고 있는 추세이다. 용액에 초음파를 처리하면 미소한 공동을 만드는 캐비테이션(Cavitation) 현상이 발생한다. 심한 압축력과 감압력을 용액 중에서 교대로 영향을 미치며 직진하지만, 감압력이 작용할 때 용액 중에 진공의 공동을 생성하여 순간적으로 용액에 용해하고 있는 기체에 의해 충만되어 초당 수백에서 수천만개의 미세기포(Microbubble)를 생성한다. 이 미세기포들이 생성과 소멸을 반복하면서 높은 난류 상태를 일으켜, 순간적으로 온도를 상승시키고 압력을 발생시켜 반응이 촉진되거나 주위 물질을 파괴하게 된다. 이러한 초음파의 공동현상에 의한 미세기포가 조직을 파괴하고 침투함으로써 세척, 잔류농약의 제거, 생리활성물질의 추출 등에 적용되고 있다. 초음파의 진동수가 많은 고주파일수록 캐비테이션 강도는 약해지지만, 기포의 크기가 미세해 짐으로써 분산, 침투 등의 효과는 증대되어 추출효율을 상승시킬 수 있게 된다. 하지만 초음파의 진동수에 따라 발생하는 캐비테이션에 현상에 의해 발생되는 마이크로버블에 따른 추출조건과 수율에 대한 연구가 전무한 실정이다. 일반적인 캐비테이션에 의한 응집, 침식, 파괴에 대한 가장 효율적인 진동수와 온도, 시간에 대한 연구 진행을 통해 에너지를 절약하여 경제적일 뿐만 아니라, 추출 효과도 높일 수 있다.

천연물의 추출물은 다양한 생리활성을 가지고 있으며 추출용매, 추출시간, 추출온도, 시료와 용매의 비율 등 많은 추출조건이 생리활성에 영향을 미친다. 따라서 이를 제품으로 개발하기 위해서는 추출방법에 대한 최적화가 필수적이다. 반응 표면 분석은 최소한의 실험으로 얻어진 결과를 분석하여 예상 값으로부터 최적조건을 찾는 방법이다. 이는 몇 가지 변수를 동시에 분석해 줌으로써 실험시간이 짧고 합리적으로 최적조건을 찾을 수 있기 때문에 여러 개의 변수를 최적화 할 때 효과적이다.

세린-팔미토일 전이효소(Serine-palmitoyl transferase, SPT)는 세라마이드 생합성을 증가시키며 스핑고미엘린(sphingomyelin)의 가수분해를 가속화시킴으로써 세라마이드의 합성을 촉진시키는 역할을 한다(Choi MJ., et al. 2005). 또한, 급성 피부 장벽 손상모델에서 SPT가 발현됨에 따라 세라마이드 합성이 촉진되어 피부장벽 기능의 손상 회복 및 유지 등에 중요한 역할을 한다는 보고가 있다(Holleran WM., et al. 1991, Sphingolipids Are Required for Mammalian Epidermal Barrier Function Inhibition of Sphingolipid Synthesis Delays Barrier Recovery After Acute Perturbation., The Journal of Clinical Investigation, Inc. Volume 88, 1991, 1338-1345 ).

한편, 피부 내 보습 능력은 피부 장벽의 기능과 긴밀한 관계를 가지고 있으며, 피부 장벽 기능은 노화 및 외부 자극에 의해 파괴될 수 있다. 피부 장벽 손상은 직접적인 피부 수분량 감소와 주름 생성을 유발하고, 이를 해결하기 위한 많은 연구가 진행되고 있다. 그 중 층을 구성하는 주된 세포인 각질형성세포 간의 밀착연접(tight junction, TJ)이 중요한 요인으로 작용하고 있다.

밀착연접은 세포 간 부착을 연계하여 인체 내부의 수분 손실 및 외부 유해물질의 침입을 막는 역할을 수행한다. 밀착연접 단백질로는 Occludin, Claudin, ZO-1 등이 알려졌으며, 대부분의 밀착연접 단백질은 표피의 과립세포층의 사이에 존재한다. 그 중 막투과단백질인 Claudin-1은 고리 형태의 구조로 이루어져 세포 사이의 공간을 단단히 채워 세포 간 간격을 조절함으로써 수분의 이동 경로를 효율적으로 차단한다. 최근, 연구결과를 통해 Claudin-1이 피부 장벽 기능에 있어 중요한 역할을 담당하고 있으며, 이는 피부 층막 보습에 영향을 미치는 것으로 보고되었다.

대한민국 등록특허 제10-2127570호(2020.06.26. 등록)에는, 계요등 꽃 분획물을 유효성분으로 포함하는 피부 재생 및 상처 치료용 조성물이 기재되어 있다. 대한민국 등록특허 제10-1666151호(2016.10.07. 등록)에는, 20~60 kHz의 초음파 추출법에 의한 조밥나무 추출물의 항산화, 항염증, 아토피 피부 개선용 화장료 조성물에 대해 기술되어있다.

본 발명은 초음파에 의해 발생되는 마이크로버블을 이용하여 계요등으로부터 패데로시딕 에시드를 고수율로 추출하는 방법 및 추출된 패데로시딕 에시드를 유효성분으로 포함하여 피부장벽 강화 및 보습에 우수한 효과를 발휘하는 화장료 조성물을 개발하여 제공하고자 한다.

본 발명은 계요등에 추출용매를 첨가하고 초음파를 가하여 마이크로버블을 발생시켜 추출하는 것을 특징으로 하는 패데로시딕 에시드 (paederosidic acid)의 추출방법을 제공한다.

본 발명의 패데로시딕 에시드 (paederosidic acid)의 추출방법에 있어서, 상기 계요등은, 바람직하게 계요등에 에탄올을 첨가하여 추출한 추출물일 수 있다.

본 발명의 패데로시딕 에시드 (paederosidic acid)의 추출방법에 있어서, 상기 추출용매는, 바람직하게 정제수, 탄소수 1~4 개의 무수 또는 함수 저급 알코올, 아세톤, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 글리세린, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 디클로로메탄, 헥산 및 그의 혼합물로부터 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 계요등 추출물을 포함하는 피부장벽개선용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 피부장벽개선용 화장료 조성물에 있어서, 상기 계요등 추출물은, 바람직하게 패데로시딕 에시드 (paederosidic acid)를 포함하는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 패데로시딕 에시드 (paederosidic acid)를 포함하는 피부장벽개선용 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 계요등 추출물을 포함하는 피부보습용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 피부보습용 화장료 조성물에 있어서, 상기 계요등 추출물은, 바람직하게 패데로시딕 에시드 (paederosidic acid)를 포함하는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 패데로시딕 에시드 (paederosidic acid)를 포함하는 피부보습용 화장료 조성물을 제공한다.

한편, 상기 본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 상기 화장료 조성물은, 일 예로 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 크림, 에센스, 수중유(O/W)형 화장료, 유중수(W/O)형 화장료, 연고, 파운데이션, 스킨커버, 립스틱, 및 두피용 화장료로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 제형일 수 있다.

본 발명은 초음파에 의해 발생되는 마이크로버블을 이용하여 계요등으로부터 패데로시딕 에시드를 고수율로 추출하는 추출방법을 제공하며, 추출된 패데로시딕 에시드를 유효성분으로 포함하여 피부장벽 강화 및 보습에 우수한 효과를 나타내는 화장료 조성물을 제공한다.

도 1은 계요등 마이크로버블 추출물에서 패데로시딕 에시드를 분리하는 분리 모식도이다.
도 2는 계요등 마이크로버블 추출물에서 분리한 패데로시딕 에시드의 1H-NMR, 13C-NMR 그래프이다.
도 3은 계요등 마이크로버블 추출물에서 패데로시딕 에시드를 HPLC로 분석한 그래프이다.
도 4는 반응표면분석법을 통한 계요등으로부터 패데로시딕 에시드의 최적 추출 조건의 표면도이다.
도 5는 최적 추출 조건에서 추출한 계요등 마이크로버블 추출물의 패데로시딕 에시드를 HPLC로 분석한 그래프이다.
도 6은 계요등 마이크로버블 추출물의 세린-팔미토일 전이효소(Serine-palmitoyl transferase, SPT)의 발현을 통한 피부 장벽 기능 회복 효과를 확인한 결과이다.
도 7은 계요등 마이크로버블 추출물의 Claudin-1 발현 조절을 통한 피부 장벽 보습 효과를 확인한 결과이다.

계요등(Paederia scandens)은 꼭두서니과에 속하는 여러해살이풀로 제주를 비롯한 한국 여러 지역에 자생하며 전초의 크기는 5~7 m 가량이다. 산기슭의 양지바른 곳 또는 바닷가의 풀밭에서 자라며, 어린 가지에는 잔털이 나고 독특한 취를 가진다. 잎은 마주나고 달걀 모양 또는 달걀처럼 생긴 바소꼴이며 잎의 길이는 5~12 cm, 나비는 1~7 cm 이다. 잎의 끝 부분은 뾰족하고 밑 부분은 심장 모양이거나 수평 모양을 가진다. 꽃은 7~9월에 피며 흰색 바탕에 자줏빛 점이 있는 형태이다. 열매는 공 모양의 핵과로서 지름 5~6 mm이며 9~10월에 노란빛을 띤 갈색으로 익는다. 계요등은 관상용으로 심으며 한방과 민간에서 거담제, 거풍제, 신장염, 이질 등에 약재로 사용된다.

계요등에 대한 성분은 황이 함유된 독특한 이리도이드(iridoid) 배당체가 주성분으로 분리, 보고 되고 있으며, 이리도이드(iridoid) 배당체는 고미강장, 해열, 간세포 보호, 진정, 항균, 항암, 항염증 작용 등의 다양한 생리활성이 알려져 있다. 계요등의 이리도이드(iridoid) 배당체 중 패데로시딕 에시드 (paederosidic acid)와 패데로시드(Paederoside)가 주요성분으로 알려져 있다. 패데로시딕 에시드는 항암, 항경련, 진정작용에 대한 연구가 이루어져 있으나, 성분에 대한 연구가 미비하다. 패데로시딕 에시드는 아래의 화학식을 갖는다.

본 발명자들은 계요등으로부터 패데로시딕 에시드 (paederosidic acid)를 고수율로 추출할 수 있는 방법을 찾기 위해서 예의 노력하였고, 그 결과 초음파를 가하여 마이크로버블을 발생시켜 추출하는 것이 가장 효과적임을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

삭제

한편, 본 발명의 패데로시딕 에시드 (paederosidic acid)의 추출방법에 있어서, 상기 추출용매는, 바람직하게 정제수, 탄소수 1~4개의 무수 또는 함수 저급 알코올, 아세톤, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 글리세린, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 디클로로메탄, 헥산 및 그의 혼합물로부터 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다. 또는, 이들을 병용하여 혼합 사용할 수도 있다. 이때, 더욱 바람직하게는 상기 추출용매가 물인 것이 좋다.

한편, 본 발명은 계요등에 추출용매를 첨가하고 초음파를 가하는데, 본 발명의 마이크로버블 추출법은 액(추재+추출용매)에 초음파를 처리하면 초당 수백에서 수천만개의 마이크로버블이 생성과 소멸을 반복하면서, 온도와 압력을 발생시켜 조직에 침투함으로써 추출된다. 마이크로버블을 이용한 유효성분의 고수율 추출방법은 초음파 진동수(Hz), 추출온도, 추출시간 조건에 영향을 받는다. 본 발명에서는 바람직하게 30~70℃의 온도 (추출용매의 온도) 에서, 진동수 10~130 kHz, 시간 1~5시간 동안 초음파를 가하는 것이 패데로시딕 에시드 (paederosidic acid)의 수득율(수율)을 높일 수 있음을 확인할 수 있었다.

한편, 본 발명은 계요등 추출물을 포함하는 피부장벽개선용 화장료 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 계요등 추출물을 포함하는 피부보습용 화장료 조성물을 제공한다.

하기 본 발명의 실험에 의할 경우 계요등 추출물에는 패데로시딕 에시드 (paederosidic acid)가 포함되어 있는 것을 확인할 수 있었고, 이 계요등 추출물을 대상으로 하여 피부 기능성 실험을 해 본 결과, 피부장벽개선 또는 피부보습 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

더욱 구체적으로, 하기 실험에 의할 경우, 상기 피부장벽개선은, 피부장벽 기능의 회복에 연관된 세린-팔미토일 전이효소(Serine-palmitoyl transferase, SPT)의 발현을 증가시킴으로 말미암은 것임을 확인할 수 있었고, 피부 내부의 수분 손실에 관여하는 Claudin-1의 발현 증가를 통해 보습 효과를 확인할 수 있었다.

삭제

한편, 본 발명은 패데로시딕 에시드 (paederosidic acid)를 포함하는 피부장벽개선용 화장료 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 패데로시딕 에시드 (paederosidic acid)를 포함하는 피부보습용 화장료 조성물을 제공한다.

상기 패데로시딕 에시드 (paederosidic acid)는 화합물 형태로도 사용할 수 있으나, 바람직하게는 천연물인 계요등으로부터 추출 및 분리해서 사용하는 것이 좋다.

한편, 본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 상기 화장료 조성물은, 특정의 제형으로 반드시 한정되는 것은 아니며, 일 예로 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 크림, 에센스, 수중유(O/W)형 화장료, 유중수(W/O)형 화장료, 연고, 파운데이션, 스킨커버, 립스틱, 및 두피용 화장료로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 제형일 수 있다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 상기 계요등 추출물은, 화장료 조성물 총 중량 대비 0.001~30 중량%가 첨가되는 것이 좋다. 0.001 중량% 미만으로 포함되는 경우에는 본 발명에서 확인한 피부장벽강화 또는 피부보습 효과가 미미하고, 30.0 중량%를 초과하는 경우에는 재료 투입량 대비 효율성이 떨어져 경제적이지 못하다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물은 화장 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제 예컨대 친수성 또는 친유성 겔화제, 친수성 또는 친유성 활성제, 보존제, 항산화제, 용매, 방향제, 충전제, 차단제, 안료, 흡취제, 염료 등을 함유할 수 있다. 이들 다양한 보조제의 양은 당해 분야에서 통상적으로 사용되는 양이며, 예컨대 조성물 총 중량에 대해 0.001 내지 30 중량%이다. 다만, 어떠한 경우라도 보조제 및 그 비율은 본 발명에 따른 화장료 조성물의 바람직한 성질에 악영향을 미치지 않도록 선택될 것이다.

한편, 본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 하기의 정의를 가지며 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미에 부합된다. 또한, 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다.

용어 "약"이라는 것은 참조 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 정도로 변하는 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 의미한다.

본 명세서를 통해, 문맥에서 달리 필요하지 않으면, "포함하다" 및 "포함하는"이라는 말은 제시된 단계 또는 구성요소, 또는 단계 또는 구성요소들의 군을 포함하나, 임의의 다른 단계 또는 구성요소, 또는 단계 또는 구성요소들의 군이 배제되지는 않음을 내포하는 것으로 이해하여야 한다.

이하, 본 발명의 내용에 대해 하기 실시예 및 실험예를 통하여 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예 및 실험예에 대해서만 한정되는 것은 아니고, 이와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 모두 포함한다.

[실험예 1 : 계요등으로부터 패데로시딕 에시드의 분리]

세척하여 음건한 계요등을 분쇄하여 플라스크에 넣고, 70% 에탄올로 추출한 뒤, 여과하여 얻어진 여액을 감압농축하여 계요등추출물(122g)을 제조하였다.

수득한 계요등 추출물을 분획별로 추출하여 효능을 평가한 결과, 수층에서 가장 우수한 활성을 나타내, 수층에 유효성분이 있을 것으로 예상하였다. 액체 크로마토그래피를 통해 4개의 화합물(compound)을 확인하였고, 개방 원통 크로마토그래피(open column chromatography)를 통해 화합물 3 (compound 3)에서 패데로시딕 에시드를 분리하였다. 패데로시딕 에시드의 분리과정을 도 1에 나타냈다. 화합물의 구조를 규명하기 위해 1H-NMR과 13C-NMR 분석을 실시하였다.

각각의 신호를 통해 유추하였을 때 패데로시딕 에시드를 확인하였으며, 그 결과를 아래 표 1과 도 2에 나타내었다. 패데로시딕 에시드의 HPLC 분석 그래프는 도 3에 나타냈다.

Position	¹H(δ)	¹³C(δ)
1a	5.059(d)	101.319
3a	7.645(d)	155.303
4a	-	108.789
5a	3.029(ddd)	42.695
6a	4.833(dd)	75.089
7a	6.028(d)	132.602
8a	-	145.611
9a	2.620(dd)	46.404
10a	4.951(d)	66.441
	5.106(dd)	-
11a	-	171.14
12a	-	173
13a	2.348(s)	13.667
1a′	4.726(d)	100.775
2a′	3.279(dd)	75.504
3a′	3.377(t)	78.021
4a′	3.282(t)	71.718
5a′	3.310(m)	78.736
6a′	3.645dd	63.147
	3.849(br d)	-

[실시예 1 내지 15 : 계요등 마이크로버블 추출물의 제조]

유효성분인 패데로시딕 에시드를 고수율로 추출할 수 있는 마이크로버블 추출조건을 확립하기 위해, 초음파의 진동수(Hz), 추출온도, 추출시간의 조건을 달리하여 반응표면분석을 수행하였다. 계요등 전초를 세척하고, 음건하여 각각 파쇄 후 각 2 g을 정제수에 넣었다. 그 다음 진동수 10~130 kHz, 온도 30~70℃, 시간 1~5 시간을 조건으로 하여 3-level-3-factor의 박스-벤킨법(Box-Behnken design, BBD)으로 설계하여, 하기 표 2과 같이 처리하여 추출하였다. 수득한 추출물은 여과한 후, 농축하여 계요등 마이크로버블 추출물을 제조하였다.

조건	진동수 (kHz)	처리시간 (h)	온도(℃)
실시예 1	70	1	70
실시예 2	70	5	30
실시예 3	10	3	30
실시예 4	130	5	50
실시예 5	10	5	50
실시예 6¹⁾	70	3	50
실시예 7¹⁾	70	3	50
실시예 8	10	1	50
실시예 9	130	3	30
실시예 10	130	1	50
실시예 11	130	3	70
실시예 12¹⁾	70	3	50
실시예 13	10	3	70
실시예 14	70	5	70
실시예 15	70	1	30

주 1) 실험의 신뢰도 확인을 위해, 70 kHz, 3시간, 50℃ 조건은 3번 반복하여 실험함.

[비교예 1 : 계요등 열수 추출물의 제조]

계요등 전초를 세척하고, 음건하여 파쇄 후 분쇄물 2 g에 정제수 20 g을 넣고 100℃ 온도로 2시간 동안 가열하여 추출하였다. 상기 추출물을 여과지로 여과한 후, 농축하여 계요등 열수 추출물을 제조하였다.

[비교예 2 : 계요등 에탄올 추출물의 제조]

계요등 전초를 세척하고, 음건하여 파쇄 후 분쇄물 2 g에 70% 에탄올 20 g을 넣고 80℃ 온도로 2시간 동안 가열하여 추출하였다. 상기 추출물을 여과지로 여과한 후, 농축하여 계요등 에탄올 추출물을 제조하였다.

[실험예 2 : 마이크로추출 조건에 따른 패데로시딕 에시드 함량 측정]

상기 실시예 1 내지 15의 마이크로버블 추출 조건에 따라 제조된 추출물의 수율과 지표성분인 패데로시딕 에시드의 함량을 측정하여, 가장 효과적인 추출조건을 확립하고자 하였다.

측정 결과는 하기 표 3에 나타내었다.

조건	수득량 (mg)	패데로시딕 에시드 함량 (mg)	패데로시딕 에시드 수율 (%)¹⁾
실시예 1	378.4	33.9386	1.697
실시예 2	364.2	32.6662	1.633
실시예 3	381.0	34.1744	1.709
실시예 4	326.0	29.2418	1.462
실시예 5	376.4	34.1670	1.708
실시예 6	376.6	33.7883	1.689
실시예 7	374.0	33.5538	1.678
실시예 8	379.8	34.0780	1.704
실시예 9	324.4	29.1044	1.455
실시예 10	346.4	30.6790	1.534
실시예 11	346.2	31.0628	1.553
실시예 12	379.2	34.0231	1.701
실시예 13	387.2	34.7279	1.736
실시예 14	380.4	34.1178	1.706
실시예 15	368.2	33.0245	1.651
비교예 1	325.6	29.3548	1.468
비교예 2	355.0	33.1235	1.656

주 1) 페데로시딕 에시드 함량 / 원물 무게 * 100

실험 결과, 실시예 13 (진동수 10 kHz, 처리시간 3시간, 온도 70℃)이 가장 높은 페데로시딕 에시드 수율을 보였다.

[실시예 16 : 반응표면분석을 통한 추출조건 최적화]

상기 실시예 1 내지 15의 추출 조건별 패데로시딕 에시드 함량 결과 값에 따라 반응표면분석을 수행하였고, 추출수율과 패데로시딕 에시드의 최적 추출조건의 반응표면분석에 대한 표면도는 도 4에 나타내었다.

표면도에 따르면 진동수의 변화가 결과에 가장 큰 영향을 주었으며, 진동수가 100 kHz 이상이 되는 시점부터 추출수율과 패데로시딕 에시드의 함량이 현저히 떨어지는 것을 확인 할 수 있다. 온도와 시간의 경우 진동수에 비해 미비한 영향이지만, 온도가 증가할수록 추출수율과 함량이 증가하였고, 시간은 1~3 시간 부근에서 점차 증가하는 것을 알 수 있었다.

이를 바탕으로 최적 추출조건을 찾기 위한 반응표면분석을 수행하였으며, 그 결과를 나타낸 도 4에 따라 추출수율과 패데로시딕 에시드의 함량을 동시에 최대로 얻을 수 있는 최적화된 추출조건은 진동수 49.93 kHz, 추출 온도 70℃, 추출시간 1시간으로 확인되었다 (실제 실험한 표 2에 기재된 15개 조건의 결과-표 3-를 바탕으로 예측된 최적 추출 조건임).

상기 반응표면분석 결과의 구체적 확인 실험을 위해 계요등 2 g에 대해 진동수 50 kHz, 추출온도 70℃, 추출시간 1시간의 조건으로 추출을 수행하였다. 상기 추출물을 여과지로 여과한 후, 농축한 결과, 계요등으로부터 마이크로버블 추출물 343.5 mg을 제조할 수 있다.

보다 구체적인 패데로시딕 에시드 분석을 위해서 계요등 마이크로버블 추출물을 1000 ppm으로 패데로시딕 에시드는 고성능액체크로마토그래피(HPLC)를 사용하여 측정하였다. 칼럼은 OptimaPak C18 5 um 46 mm × 250 mm을 사용하였고, 이동상은 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid, TFA)과 아세토나이트릴(acetonitrile, ACN)을 사용하였고, 기울기(gradient)를 설정하였으며, 유속은 1 ml/min으로 하였다. 이동상 용매조성과 기울기(gradient) 조건은 표 4에 나타냈으며, 측정 결과는 표 5와 도 5에 나타냈다.

Time(min)	0.1% TFA	ACN
0.00	90%	10%
10.00	90%	10%
40.00	60%	40%
41.00	10%	90%
45.00	10%	90%
46.00	90%	10%
50.00	90%	10%

Sample	Name	RT	Area	Height	Amount	Units
계요등 마이크로버블 추출물 1000 ppm	패데로시딕 에시드	23.222	1198803	129399	100.695	ppm

반응표면분석으로 예측한 값과 실제 수득한 양을 확인한 결과는 하기 표 6에 나타내었다.

수득량
예측 값 (mg)	확인시험 결과값 (mg)
192.1	185.4
Paederosidic acid
예측 값 (mg)	확인시험 결과값 (mg)
34.408	34.591

[실험예 3 : 계요등 마이크로버블 추출물의 세린-팔미토일 전이효소 발현 효과]

상기 실시예 16의 계요등 마이크로버블 추출물의 피부장벽 기능의 회복 효과를 확인하기 위해 세린-팔미토일 전이효소(Serine-palmitoyl transferase, SPT)의 발현 효과를 확인하였다.

인간유래 각질형성세포(HaCaT)를 6 웰 플레이트(well plate)에 3 × 105 cells/well로 분주하고 37℃, 5% CO₂세포 배양기에서 하루 동안 세포를 안정화시켰다. 상기 실시예 16에서 제조한 계요등 마이크로버블 추출물을 농도별로 처리하고, 24시간 동안 반응시킨 후 스크래퍼(scraper)를 이용하여 세포를 수집하였다. 1 × 세포 용해 버퍼(cell lysis buffer)를 이용하여 단백질을 분리하고 BCA assay로 단백질을 정량한 후 일정량의 단백질을 10% SDS-PAGE 겔에서 전기영동 시켰다. 겔(Gel)상의 분리된 단백질을 PVDF 멤브레인에 전이(transfer)시키고 5% 스킴밀크(skim milk)를 이용하여 1시간 동안 블로킹(blocking)하였다. 이를 1 × TTBS 용액으로 3 회 세척하고 1차 항체(SPT, Abcam, USA)를 4℃에서 오버나잇(over night) 반응시킨 후, HRP가 결합된 2차 항체를 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 그 후, 1 × TTBS로 3 회 세척하고 ECL용액을 반응시켜 케미닥(Chemi Doc) 기기로 밴드를 검출하였다. 베타-액틴(β-actin)의 발현을 기준으로 정량하여 SPT 발현량을 계산하였으며 Image J 147 software를 이용하여 수치화하였으며, 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6에서 보듯이, 상기 실시예 16의 계요등 마이크로버블 추출물은 세린-팔미토일전이효소(Serine-palmitoyl transferase, SPT)의 발현을 촉진시키는 것으로 나타났다. 특히, 계요등 마이크로버블 추출물 300 ㎍/ml의 농도에서 음성 대조군 대비 48.36% 증가하는 것을 확인하였다.

[실험예 4 : 계요등 마이크로버블 추출물의 Claudin-1 발현 효과]

피부 내부의 수분 손실에 관여하는 Claudin-1에 대한 상기 실시예 16의 계요등 마이크로버블 추출물의 층막 보습 효과를 다음과 같은 방법으로 측정하였다.

HaCaT 세포를 6웰 플레이트에 분주하고 80% 정도 세포가 찼을 때 배지에 실시예 16에서 제조한 계요등 마이크로버블 추출물을 농도별로 처리하였다. 이후, 24시간 동안 배양시킨 뒤, 세포를 수집한 후 1× 세포 용해 버퍼(cell lysis buffer)를 이용하여 단백질을 분리하였다. 그 후, BCA assay로 단백질을 정량하여 일정량의 단백질을 10% SDS-PAGE 겔에서 전기영동 시켰다. 이후, PVDF 멤브레인에 전이(transfer)시켜 5% 스킴밀크(skim milk)를 이용하여 1시간 동안 블록킹(blocking)하였다. 1차 항체(Claudin-1, cell signaling, USA)를 4℃에서 오버나잇(over night) 반응시킨 후, HRP가 결합된 2차 항체를 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 그 후, TBS/T로 세척하고 ECL 반응 키트를 이용하여 케미닥(Chemi Doc) 기기로 밴드를 확인하였다. 각 밴드의 정량화는 베타-액틴(β-actin)의 발현을 기준으로 정량하여 Claudin-1 발현량을 계산하였다.

도 7에서 보듯이, 상기 실시예 16의 계요등 마이크로버블 추출물은 Claudin-1의 발현을 증가시는 것으로 나타났다. 특히, 계요등 마이크로버블 추출물 300 ㎍/ml의 농도에서 음성 대조군 대비 35.69% 증가하는 것을 확인하여, Claudin-1 발현 조절을 통한 피부 보습에 효과적임을 확인할 수 있었다.

[제형예 1: 계요등 마이크로버블 추출물을 함유하는 화장료 제조]

본 발명에 따른 조성물의 제형예를 상기 실시예 16이 5 중량% 포함된 피부 장벽 강화용 또는 보습용 화장료 조성물은 하기 표의 조성으로 설명하나, 여려가지 제형으로 응용 가능하며, 이는 본 발명을 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다. 본 제형예의 화장료 조성물은 아래 표 7의 함량에 따라 제조하였다.

구분	성분	제조예 1 (중량%)
A	실시예 16	5.0
	글리세린	3.0
	부틸렌글라이콜	5.0
	아데노신	0.04
	EDTA-2Na	0.02
	정제수	to 100
B	세토스테아릴알코올	2.0
	글리세릴스테아레이트	1.5
	마이크로크리스탈린	0.7
	스쿠알란	5.0
	유동파라핀	3.0
	트리옥타노인	5.0
	폴리솔베이트	1.2
	솔비탄스테아레이트	0.5
	토코페릴아세테이트	0.2
	사이클로메치콘	3.0
	BHT	0.05
C	향,방부제	적량

Claims

계요등에 정제수를 첨가하고 50~70℃의 온도에서 10~70 kHz의 진동수로 1~3시간 동안 초음파를 가하여 마이크로버블을 발생시켜 추출하는 것을 특징으로 하는 패데로시딕 에시드 (paederosidic acid)의 추출방법.
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계요등 추출물을 포함하며,
상기 계요등 추출물은 계요등에 정제수를 첨가하고 50~70℃의 온도에서 10~70 kHz의 진동수로 1~3시간 동안 초음파를 가하여 마이크로버블을 발생시켜 추출한 것으로 패데로시딕 에시드 (paederosidic acid)를 함유하여 세린-팔미토일 전이효소의 발현을 촉진하는 효과를 발휘하는 것을 특징으로 하는 피부장벽개선용 화장료 조성물.
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계요등 추출물을 포함하며,
상기 계요등 추출물은 계요등에 정제수를 첨가하고 50~70℃의 온도에서 10~70 kHz의 진동수로 1~3시간 동안 초음파를 가하여 마이크로버블을 발생시켜 추출한 것으로 패데로시딕 에시드 (paederosidic acid)를 함유하여 Claudin-1의 발현을 촉진하는 효과를 발휘하는 것을 특징으로 하는 피부보습용 화장료 조성물.
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제4항, 제7항 중 선택되는 어느 하나의 항에 있어서,
상기 화장료 조성물은,
화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 크림, 에센스, 수중유(O/W)형 화장료, 유중수(W/O)형 화장료, 연고, 파운데이션, 스킨커버, 립스틱, 및 두피용 화장료로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 제형인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.