KR20130049040A

KR20130049040A - 탁시폴린 배당체를 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물 및 작약 추출물의 추출방법

Info

Publication number: KR20130049040A
Application number: KR1020110114059A
Authority: KR
Inventors: 박안나; 홍연주; 김연준; 한상훈
Original assignee: (주)아모레퍼시픽
Priority date: 2011-11-03
Filing date: 2011-11-03
Publication date: 2013-05-13
Also published as: KR102002997B1

Abstract

본 발명은 탁시폴린 배당체를 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물 및 작약 추출물의 추출방법을 제공한다. 본 발명의 작약 추출물의 추출방법에 따르면 고함량의 탁시폴린 배당체, 구체적으로 탁시폴린-3-글루코사이드를 최적의 수율 및 대량으로 추출할 수 있고, 이를 포함하는 작약 추출물은 우수한 피부미백 효과, 주름개선 효과, 항염 효과, 항균 효과, 아토피 개선 및 자외선 보호 효과를 가지므로 기능성 화장료 조성물 및 피부 외용제로서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

탁시폴린 배당체를 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물 및 작약 추출물의 추출방법{COSMETIC COMPOSITION INCLUDING TAXIFOLIN GLUCOSIDES AND EXTRACTING METHOD OF PAEONIA LACTIFLORA EXTRACTS}

본 발명은 탁시폴린 배당체를 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물 및 작약 추출물의 추출방법에 관한 것이다.

작약(Paeonia lactiflora)이란 한국이 원산지인, 쌍떡잎식물 작약과 작약속의 여러해살이풀로 주로 산기슭이나 골짜기에서 자란다. 가지는 옆으로 길게 2 m 이상 뻗고 털이 없으나 갈고리 같은 가시가 있으며, 줄기는 여러 개가 한 포기에서 나와 곧게 서고 높이 60cm 정도이며 잎과 줄기에 털이 없다. 뿌리는 여러 개가 나오지만 가늘고 양끝이 긴 뾰족한 원기둥 모양으로 굵다. 잎은 어긋나고 밑부분의 것은 작은 잎이 3장씩 두 번 나오는 겹잎이다. 꽃은 5-6월에 줄기 끝에 1개가 피는데 크고 아름다우며 재배한 것은 지름 10cm 정도이다. 열매는 달걀 모양으로 끝이 갈고리 모양으로 굽으며 내봉선을 따라 갈라지고 종자는 구형이다. 꽃은 주로 원예용으로 쓰며 뿌리는 진통·복통·월경통·무월경·토혈·빈혈·타박상 등의 약재로 쓰인다. 한국·몽골·동시베리아 등지에 분포한다.

등록특허 제10-0804993호는 작약종자 추출물을 이용한 화장비누 제조법을, 공개특허 제2005-0118819호는 작약추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화, 보습용 세정제 조성물을 개시한 바 있으나, 종래 작약을 이용한 고함량의 탁시폴린-3-글루코사이드(taxifolin-3-glucoside)를 포함하는 작약 추출물 및 이를 함유하는 기능성 화장료에 대한 연구는 없었다.

대한민국 등록특허 제10-0804993호 대한민국 공개특허 제2005-0118819호

상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 본 발명은 천연 식물인 작약으로부터 고함량의 탁시폴린 배당체를 추출하는 방법으로서 용매추출, 농축, 분획 및 재결정화를 거치는 작약 추출물의 추출방법을 제공하고, 작약 추출물이 가지는 피부미백효과, 주름개선효과, 항염효과, 항균효과, 아토피 개선 및 자외선 보호 효과를 이용한 화장료 조성물을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

상기와 같은 목적을 해결하기 위하여 본 발명은 탁시폴린 배당체를 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 탁시폴린 배당체는 작약에서 추출한 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 탁시폴린 배당체는 탁시폴린-3-글루코사이드인 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 탁시폴린 배당체는 조성물 총 중량에 대하여 0.0001 내지 10중량% 함유되는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 피부미백, 주름개선, 항염, 항균, 아토피 개선 및 자외선 보호로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 기능을 가지는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 작약을 용매에 넣고 탁시폴린 배당체를 용출하는 단계;

용출된 추출물을 농축하는 단계;

농축된 추출물을 둘 이상의 용매에 넣고 분획시키는 단계;

분획된 층에서 얻어진 추출물을 컬럼에 통과시키는 단계; 및

컬럼 통과액을 침전시켜 재결정화하는 단계;를 포함하는 작약 추출물의 추출방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 분획 단계는 분획시킨 후 분획된 층의 용매를 제거하여 농축하는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 추출방법은 재결정화 이후에 재결정화된 추출물을 건조하여 수득하는 단계;를 더 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 용매추출시의 용매는 물, 에탄올, 메탄올, 부탄올, 에틸아세테이트, 에틸에테르, 클로로포름, 헥산으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 분획시의 용매는 물, 에탄올, 메탄올, 부탄올, 에틸아세테이트, 에틸에테르, 클로로포름, 헥산으로 이루어진 군으로부터 선택된 둘 이상인 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 컬럼의 레진은 엠버라이트 XAD 레진, 다우엑스 레진, 수페라이트 DAX 레진 및 다이아이온 HP-10, 20, 30, 40, 50 레진으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 레진인 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 재결정은 -300 내지 25℃ 및 0.5 내지 800MPa에서 수행되는 것일 수 있다.

본 발명의 작약 추출물의 추출방법에 따르면 고함량의 탁시폴린 배당체, 구체적으로 탁시폴린-3-글루코사이드를 최적의 수율 및 대량으로 추출할 수 있고, 이를 포함하는 작약 추출물은 우수한 피부미백 효과, 주름개선 효과, 항염 효과, 항균 효과, 아토피 개선 및 자외선 보호 효과를 가지므로 기능성 화장료 조성물 및 피부 외용제로서 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 작약 추출물의 추출방법에 대한 플로우차트이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 작약 추출물 중 탁시폴린-3-글루코사이드의 HPLC 크로마토그램이다.

이하에서는, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 본 발명을 용이하게 실시할 수 있도록 하기 위하여, 본 발명의 바람직한 실시예들에 관하여 상세히 설명하기로 한다.

본 발명은 탁시폴린 배당체를 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물을 제공한다.

상기 작약 추출물은 탁시폴린(taxifolin) 배당체를 함유한다. 구체적으로, 본 발명에서 탁시폴린 배당체는 탁시폴린-3-글루코사이드(taxifolin-3-glucoside)일 수 있다.

상기 탁시폴린 배당체는 조성물 총 중량에 대하여 0.0001 내지 10중량% 함유되는 것일 수 있다. 0.0001중량%보다 적으면 효능이 충분히 발휘되지 않고, 10중량%보다 많으면 함유량 증가에 따른 뚜렷한 효과의 증가가 나타나지 않고, 안전성에 문제가 있을 수 있기 대문이다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 피부미백, 주름개선, 항염, 항균, 아토피 개선 및 자외선 보호로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 기능을 가지는 것일 수 있다. 이는 후술할 시험예에서 확인할 수 있다.

상기 화장료 조성물은 제형이 특별히 한정되지 않으며, 목적하는 바에 따라 적절히 선택할 수 있다. 예를 들어, 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션 및 바디클린저로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 제형으로 제조될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

상기 유효 성분의 함량은 특별히 제한되지 않으나, 조성물 총 중량을 기준으로 0.0001 내지 10 중량%로 포함될 수 있다. 상기 유효 성분이 상기 함량을 만족하는 경우 부작용 없이 우수한 효능을 나타낼 수 있다.

상기 화장료 조성물에는 상기 제조된 작약 추출물 이외에 기능성 첨가물 및 일반적인 화장료 조성물에 포함되는 성분이 추가로 포함될 수 있다. 상기 기능성 첨가물로는 수용성 비타민, 유용성 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당, 스핑고 지질 및 해초 엑기스로 이루어진 군에서 선택된 성분을 포함할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물에는 또한, 상기 기능성 첨가물과 더불어 필요에 따라 일반적인 화장료 조성물에 포함되는 성분을 배합해도 된다. 이외에 포함되는 배합 성분으로서는 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면 활성제, 유기 및 무기 안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, 식물 추출물, pH 조정제, 알콜, 색소, 향료, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한(制汗)제, 정제수 등을 들 수 있다.

더욱이, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 피부 외용제에 관한 것으로, 상기 피부 외용제는 피부 외부에서 도포되는 어떠한 것이라도 포함될 수 있는 총칭이며, 다양한 제형의 화장품, 의약품이 여기에 포함될 수 있다. 상기 피부 외용제는 또한, 특별히 제한되지 않으나, 예를 들어 피부 노화 방지용 또는 피부 주름 개선용 피부 외용제일 수 있다.

또한, 본 발명은 작약으로부터 탁시폴린 배당체를 용출하는 단계를 포함하는 작약 추출물의 추출방법을 제공한다.

본 발명의 작약 추출물의 추출방법은, 작약을 용매에 넣고 탁시폴린 배당체를 용출하는 단계; 용출된 추출물을 농축하는 단계; 농축된 추출물을 둘 이상의 용매에 넣고 분획시키는 단계; 분획된 층에서 얻어진 추출물을 컬럼에 통과시키는 단계; 및 컬럼 통과액을 침전시켜 재결정화하는 단계;를 포함한다.

먼저, 작약으로부터 탁시폴린 배당체, 바람직하게 탁시폴린-3-글루코사이드(taxifolin-3-glucoside)를 용출시키게 된다. 바람직하게 이 용매추출 공정은 용매를 기준으로 0.5 내지 20.0중량%의 작약을 용매에 가하여 0.5 내지 5시간을 추출한다.

이 때 용매는 물, 에탄올, 메탄올, 부탄올, 에틸아세테이트, 에틸에테르, 클로로포름, 헥산으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것일 수 있다.

그 다음, 상기 추출공정을 통해 탁시폴린-3-글루코사이드가 용출된 작약 추출물은 용매 제거를 위해 1차 농축 공정을 거친다. 용출된 추출물의 농축은 종래 농축 방법으로 알려진 것이면 제한되는 것은 아니나, 가열건조, 감압건조, 분무건조 및 동결건조로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상으로 수행되는 것일 수 있다.

그 후, 상기 농축을 통해 농축된 추출물을 둘 이상의 용매에 넣고 분획시킨다. 이때 둘 이상의 용매는 서로 극성에 차이가 있는 용매이며, 바람직하게는 물, 에탄올, 메탄올, 부탄올, 에틸아세테이트, 에틸에테르, 클로로포름, 헥산으로 이루어진 군으로부터 선택된 둘 이상인 것일 수 있다. 극성이 다른 용매에 용해된 추출물 내에 존재하는 여러 화합물들은 극성에 따라 분리된다.

상기 분획 이후 분획된 층의 유기 용매를 제거하는 2차 농축 단계를 수행할 수 있다. 이 단계에서의 농축은 종래 농축 방법으로 알려진 것이면 제한되는 것은 아니나, 가열건조, 감압건조, 분무건조 및 동결건조로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상으로 수행되는 것일 수 있다.

그 후, 분획된 층에서 얻어진 추출물을 컬럼에 통과시킨다. 이때 컬럼은 제한되는 것은 아니나, 흡착수지를 이용한 레진 컬럼인 것이 바람직하다. 상기 레진은 엠버라이트 XAD 레진, 다우엑스 레진, 수페라이트 DAX 레진 및 다이아이온 HP-10, 20, 30, 40, 50 레진으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 레진인 것일 수 있다.

상기 컬럼 통과에 의하여, 분획 농축물(분획 농축 파우더)에서 색소 및 클로로필이 제거된다.

마지막으로, 컬럼 통과액을 침전시켜 재결정화한다. 이는 컬럼공정을 거친 컬럼 통과액에 압력 및 온도를 조절하여 침전시킴으로서 이루어진다. 이때 재결정은 -300 내지 25℃ 및 0.5 내지 800MPa에서 수행되는 것일 수 있다. 즉, 재결정은 초저온 및 초고압을 포함하는 조건하에서 이루어질 수 있는 것이다.

상기 추출방법은 재결정화 이후에 재결정화된 추출물을 건조하여 수득하는 단계;를 더 포함하는 것일 수 있다. 상기 수득 공정은 재결정화된 침전펠렛을 분무건조 또는 동결건조하여 파우더 형태의 고함량의 탁시폴린-3-글루코사이드를 얻는 것으로, 원심분리, 필터 및 진공농축법 등의 방법으로 농축하여 분말상의 탁시폴린-3-글루코사이드를 포함하는 작약 추출물을 얻을 수 있다.

본 발명에 따른 작약 추출물의 제조방법은 다단계의 연속 공정으로서, 상술한 바와 같이 추출, 농축, 분획, 컬럼 및 재결정화를 거치는 경우 가장 높은 수율로 탁시폴린 배당체를 얻을 수 있다.

이렇게 추출된 탁시폴린 배당체를 포함하는 작약 추출물은 뛰어난 미백효과, 주름개선효과, 항염, 항균, 자외선보호효과 그리고 아토피 개선효과를 나타낸다.

이하의 실시를 통하여 본 발명이 더욱 상세하게 설명된다. 단, 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로서 이들만으로 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

<비교예 1>

작약을 70% 에탄올 수용액에 10중량%로 가하여 냉각콘덴서가 달린 환류추출기에서 온도 80℃ 조건하에 2시간 동안 추출하였다. 그 후 80 메쉬(mesh) 필터와 1.2 ㎛ 필터를 이용, 여과하여 추출 여액을 얻었고, 수득된 추출여액을 진공농축기(Rotary Evaporator NE-series, Eyela, Japan)를 이용하여 65℃, 20 hPa 조건하에 1시간 동안 농축을 실시, 농축파우더를 얻었다. 이와 같이 수득된 것을 "시료 1"이라 하고, 하기 시험예에서 사용하였다.

<비교예 2>

작약을 70% 에탄올 수용액에 10중량%로 가하여 냉각콘덴서가 달린 환류추출기에서 온도 80℃ 조건하에 2시간 동안 추출하였다. 그 후 80 메쉬(mesh) 필터와 1.2 ㎛ 필터를 이용, 여과하여 추출 여액을 얻었고, 수득된 추출여액을 진공농축기(Rotary Evaporator NE-series, Eyela, Japan)를 이용하여 65℃, 20 hPa 조건하에 1시간 동안 농축을 실시, 농축파우더를 얻었다. 수득된 농축파우더에 10 배 중량의 증류수를 투입하여 고르게 분산한 뒤 분획여두를 사용하여 증류수와 같은 부피의 헥산을 투입, 분획하였고 차례로 에틸아세테이트, n-부탄올을 차례로 분획하여 최종적으로 에틸아세테이트층을 얻었다. 수득된 에틸아세테이트 분획여액을 진공농축기(Rotary Evaporator NE-series, Eyela, Japan)를 이용하여 65℃, 20 hPa 조건하에 1시간 동안 농축을 실시, 농축파우더를 얻었으며, 이와 같이 수득된 것을 "시료 2"라 하고, 하기 시험예에서 사용하였다.

<비교예 3>

작약을 70% 에탄올 수용액에 10중량%로 가하여 냉각콘덴서가 달린 환류추출기에서 온도 80℃ 조건하에 2시간동안 추출하였다. 그 후 80 메쉬(mesh) 필터와 1.2 ㎛ 필터를 이용, 여과하여 추출 여액을 얻었고, 수득된 추출여액을 진공농축기(Rotary Evaporator NE-series, Eyela, Japan)를 이용하여 65℃, 20 hPa 조건하에 1시간 동안 농축을 실시, 농축파우더를 얻었다. 수득된 농축파우더에 10 배 중량의 증류수를 투입하여 고르게 분산한 뒤 분획여두를 사용하여 증류수와 같은 부피의 헥산을 투입, 분획하였고 차례로 에틸아세테이트, n-부탄올을 차례로 분획하여 최종적으로 에틸아세테이트층을 얻었다. 수득된 에틸아세테이트 분획여액을 진공농축기(Rotary Evaporator NE-series, Eyela, Japan)를 이용하여 65℃, 20 hPa 조건하에 1시간 동안 농축을 실시, 농축파우더를 얻었으며, 농축파우더를 10 배 중량의 증류수에 다시 분산하여 다이아이온(Diaion) HP-20 컬럼에 투입, 증류수와 99.5% 에탄올을 사용한 기울기 용법으로 크로마토그래피를 수행하였고, 유속 20 ml/min 조건하에 최종적으로 70%-99.5% 에탄올 컬럼액을 받아 진공농축기(Rotary Evaporator NE-series, Eyela, Japan)를 이용하여 65℃, 20 hPa 조건하에 1시간 동안 농축을 실시, 농축파우더를 얻었고, 이와 같이 수득된 것을 "시료 3"이라 하고, 하기 시험예에서 사용하였다.

<실시예 1>

작약을 70% 에탄올 수용액에 10중량%로 가하여 냉각콘덴서가 달린 환류추출기에서 온도 80℃ 조건하에 2시간 동안 추출하였다. 그 후 80 메쉬(mesh) 필터와 1.2 ㎛ 필터를 이용, 여과하여 추출 여액을 얻었고, 수득된 추출여액을 진공농축기(Rotary Evaporator NE-series, Eyela, Japan)를 이용하여 65℃, 20 hPa 조건하에 1시간 동안 농축을 실시, 농축파우더를 얻었다. 수득된 농축파우더에 10 배 중량의 증류수를 투입하여 고르게 분산한 뒤 분획여두를 사용하여 증류수와 같은 부피의 헥산을 투입, 분획하였고 차례로 에틸아세테이트, n-부탄올을 차례로 분획하여 최종적으로 에틸아세테이트층을 얻었다. 수득된 에틸아세테이트 분획여액을 진공농축기(Rotary Evaporator NE-series, Eyela, Japan)를 이용하여 65℃, 20 hPa 조건하에 1시간 동안 농축을 실시, 농축파우더를 얻었으며, 농축파우더를 10 배 중량의 증류수에 다시 분산하여 Diaion HP-20 컬럼에 투입, 증류수와 99.5% 에탄올을 사용한 기울기 용법으로 크로마토그래피를 수행하였고, 유속 20 ml/min 조건하에 최종적으로 70%-99.5% 에탄올 컬럼액을 받아 초고압장치(TFS-2L, TOYO KOATSU CO., LTD., Japan)를 이용하여 100 MPa, 25 ℃, 1시간 동안 초고압 재결정화 처리 하였다. 이를 원심분리기(Supra 22K, Hanil, Korea)를 이용하여 8,000 rpm, 15℃ 조건으로 15분간 원심분리 하고, 1.2 ㎛ 필터로 여과를 수행, 최종적으로 Dryoven 60℃ 조건하에 1시간 동안 건조하여 파우더를 수득하였고, 이와 같이 수득된 것을 "시료 4"라 하고, 하기 시험예에서 사용하였다.

<실시예 2>

작약을 70% 에탄올 수용액에 10중량%로 가하여 냉각콘덴서가 달린 환류추출기에서 온도 80℃ 조건하에 2시간동안 추출하였다. 그 후 80 메쉬(mesh) 필터와 1.2 ㎛ 필터를 이용, 여과하여 추출 여액을 얻었고, 수득된 추출여액을 진공농축기(Rotary Evaporator NE-series, Eyela, Japan)를 이용하여 65℃, 20 hPa 조건하에 1시간 동안 농축을 실시, 농축파우더를 얻었다. 수득된 농축파우더에 10 배 중량의 증류수를 투입하여 고르게 분산한 뒤 분획여두를 사용하여 증류수와 같은 부피의 헥산을 투입, 분획하였고 차례로 에틸아세테이트, n-부탄올을 차례로 분획하여 최종적으로 에틸아세테이트층을 얻었다. 수득된 에틸아세테이트 분획여액을 진공농축기(Rotary Evaporator NE-series, Eyela, Japan)를 이용하여 65℃, 20 hPa 조건하에 1시간 동안 농축을 실시, 농축파우더를 얻었으며, 농축파우더를 10 배 중량의 증류수에 다시 분산하여 Diaion HP-20 컬럼에 투입, 증류수와 99.5% 에탄올을 사용한 기울기 용법으로 크로마토그래피를 수행하였고, 유속 20 ml/min 조건하에 최종적으로 70%-99.5% 에탄올 컬럼액을 받아 초저온장치(DF-9010, Ilshin, Korea)를 이용하여 -90℃, 2시간 동안 초저온 재결정화 처리 하였다. 이를 원심분리기(Supra 22K, Hanil, Korea)를 이용하여 8,000 rpm, 15℃ 조건으로 15분간 원심분리 하고, 1.2 ㎛ 필터로 여과를 수행, 최종적으로 Dryoven 60℃ 조건하에 1시간 동안 건조하여 파우더를 수득하였고, 이와 같이 수득된 것을 "시료 5"라 하고, 하기 시험예에서 사용하였다.

[시험예 1] HPLC를 이용한 탁시폴린-3-글루코사이드(taxifolin-3-glucoside)의 함량분석

본 발명의 탁시폴린-3-글루코사이드를 포함하는 작약 추출물의 제조방법 단계별에 따른 탁시폴린-3-글루코사이드의 함량변화를 확인하기 위하여, 실시예 별 시료의 HPLC를 이용한 함량분석을 하기와 같이 수행하였다.

상기 실시예를 통해 제조된 제조방법 단계별 시료의 탁시폴린-3-글루코사이드의 정성, 정량분석을 위하여 HPLC(High pressure liquid chromatography)를 이용해 분석을 수행하였다. 시료는 각 용매로 적당 농도를 제조 하여 0.2㎛ 필터에 여과, 전처리 후 기기에 주입하였다. 기기는 HPLC(Agilent 1200series system, Agilent, USA)를 사용하여 UV detector를 이용, UV 전영역에서 분석하였으며, C₁₈컬럼(Zorbax XDB-C₁₈ 4.6×250mm, Agilent, USA)을 사용하여 2% 정제수 및 아세트산 용매와 아세토니트릴 용매를 사용한 기울기 용법으로 분석하였다. 분석에 사용된 용매는 모두 HPLC급 시약을 사용하였으며, 표준곡선을 구한 후 정량분석을 수행하였다. 분석결과는 하기 표 1 및 도 2와 같다. 도 2는 추출, 농축, 분획, 컬럼, 초저온재결정 등 5단계 제조방법을 거친(시료5) 작약 추출물의 탁시폴린-3-글루코사이드의 HPLC 크로마토그램이다.

시료명	제조방법 단계	탁시폴린-3-글루코사이드 함량(%)
비교예 1	추출, 농축	2.5
비교예 2	추출, 농축, 분획	11.4
비교예 3	추출, 농축, 분획, 컬럼	32.9
실시예 1	추출, 농축, 분획, 컬럼, 초고압 재결정	97.4
실시예 2	추출, 농축, 분획, 컬럼, 초저온 재결정	99.3

상기 표 1에 나타난 바와 같이, 작약으로부터 추출, 농축, 분획, 컬럼, 재결정 공정을 거칠수록 탁시폴린-3-글루코사이드의 함량이 비약적으로 상승함을 확인할 수 있었으며, 재결정 공정을 통해 99%가 넘는 고함량의 탁시폴린-3-글루코사이드를 포함하는 작약 추출물을 제조 할 수 있음을 확인하였다.

[시험예 2]　 타이로시네이즈 활성저해 시험

본 발명의 탁시폴린-3-글루코사이드를 포함하는 작약 추출물의 미백효과를 검정하기 위해 타이로시네이즈(tyrosinase)라는 효소의 기능이 억제되는 정도를 평가하였다. 타이로시네이즈는 생체내에서 타이로신(tyrosine)이라는 물질의 산화과정을 촉진하여 멜라닌이 생성되게 도와주는 효소이다. 멜라닌이란 흑색의 고분자로서 생체내에서 상기와 같은 산화에 의해 멜라닌이 형성되어 피부 상층부로 이동하게 되면 피부가 검게 변하고 기미, 주근깨를 생성하게 된다. 이러한 타이로시네이즈의 작용을 억제하는 정도를 측정하여 미백효과를 검정하는 방법을 응용해 판정하였다. 시험방법은 하기와 같다.

시료 0.9 mL, 0.1 M 인산완충액(pH 6.8) 1.0 mL 및 1.5 mM L-타이로신 용액 1.0 mL을 넣은 후, 37℃에서 10분간 유지시켰다. 머쉬룸타이로시네이즈(1,500 units/mL) 0.1 mL를 첨가하여 37℃에서 10분간 반응시킨 후, UV-분광광도계(Smartspec Plus, Biorad, USA)를 사용하여 475 nm에서 흡광도를 측정하여 타이로시네이즈에 대한 저해율을 측정하였다.

상기 타이로시네이즈 활성저해시험을 위한 대조군은 시료액 대신 완충용액을 넣어 같은 방법으로 측정하였으며, 타이로시네이즈 대신 완충용액을 넣어 시료와 대조군에 대한 각각의 색 보정값을 얻은 경우로 설정하였다.

시험에 사용한 시료는 실시예 2(시료 5)에서 수득한 탁시폴린-3-글루코사이드를 포함하는 작약 추출물과 여러 연구결과에서 미백효과가 뛰어나다고 알려진 알부틴(arbutin)(Arbutin synthetic, Sigma)을 비교하였고, 하기 수학식 1을 이용하여 타이로시네이즈 저해율을 수치로 계산하여 하기 표 2에 나타내었다. 표 2에서, IC₅₀은 타이로시네이즈 활성을 50% 저해하는데 소요되는 시료의 농도이며, 값이 작을수록 저해율이 높음을 나타낸다.

[수학식 1]

타이로시네이즈 저해율(%) = 100-((시료의 흡광도/대조군의 흡광도)×100)

시료	타이로시네이즈 활성저해율, 　IC₅₀(mg/mL)
실시예 2	0.022
알부틴	0.032

표 2에 나타난 바와 같이, 실시예 2의 탁시폴린-3-글루코사이드를 포함하는 작약 추출물은 현재 미백효과가 뛰어나다고 알려진 알부틴과 비교하여 미백효과가 월등히 우수함을 확인하였다.

[시험예 3] 엘라스테이즈 활성저해시험

본 발명의 탁시폴린-3-글루코사이드를 포함하는 작약 추출물의 피부주름 억제 및 개선 효과를 검정하기 위하여 엘라스테이즈 활성저해시험(elastase inhibition activity test)을 실시하였다. 엘라스틴은 피부 진피 내 matrix층을 구성하는 성분으로 피부가 노화됨에 따라 엘라스틴이 분해되고 진피 내 matrix층이 무너지며 주름이 생기게 된다. 이러한 원리를 이용하여 엘라스틴(elastin)을 분해하는 효소인 엘라스테이즈의 활성을 측정하는 방법으로 엘라스테이즈 기질인 N-석시닐-(Ala)3 p-니트로아닐린(N-succinyl-(Ala)3 p-nitroaniline, Sigma)을 이용하여 p-니트로아닐린이 분해되면서 생기는 색의 변화를 405 nm의 파장에서 흡광도를 측정함으로써 엘라스테이즈 활성을 측정하는 방법이다. 완충액은 pH 8.0, 0.267 M Trizma-HCl (Sigma), 기질액은 8.8 mM N-석시닐-(Ala)3 p-니트로아닐린, 효소액은 돼지췌장 엘라스테이즈를 10 ㎍/mL (Sigma)의 농도로 사용하였다. 완충액 60 ㎕, 기질액 20 ㎕와 상기 실시예 2(시료 5)를 농도별로 3차 증류수에 희석한 시료액 100 ㎕를 섞은 후, 효소액 20 ㎕를 넣어 25℃ 항온수조에서 15분간 반응시켜 p-니트로아닐린의 생성량을 마이크로플레이트 리더(UVT-06685, Thermo max, USA)를 사용하여 파장 405 nm에서 측정하였다.

상기 엘라스테이즈 활성도를 측정하기 위한 대조군은 시료 대신 3차 증류수를 넣어 같은 방법으로 측정하였으며, 효소액 대신 3차 증류수를 넣어 각각에 대한 색 보정값을 얻은 경우를 설정하였다.

시험에 사용한 시료는 실시예 2(시료 5)에서 수득한 탁시폴린-3-글루코사이드를 포함하는 작약 추출물과 기존 주름개선효과가 뛰어나다고 알려진 레티놀(>99%, Sigma, USA)을 양성대조군으로 비교하여 실험하였고, 하기 수학식 2를 이용하여 엘라스테이즈 저해율을 수치로 계산하여 하기 표 3에 나타내었다. 표 3에서 IC₅₀은 엘라스테이즈 활성을 50 % 저해하기 위해 소요되는 시료의 농도이며, 값이 작을수록 저해율이 높음을 나타낸다.

[수학식 2]

엘라스테이즈활성저해율(%)= 100-((시료의흡광도)/대조군의 흡광도)×100)

시료	엘라스테이즈 활성저해율, 　IC₅₀(mg/mL)
실시예 2	0.20
레티놀	0.38

상기 표 3에 나타난 바와 같이, 실시예 2(시료 5)에서 수득한 탁시폴린-3-글루코사이드를 포함하는 작약 추출물은 기존 주름개선효과가 뛰어나다고 알려진 레티놀과 비교하여 엘라스테이즈 억제효과가 더 우수하였다.

[시험예 4] 콜라겐 합성 효과 시험

본 발명의 탁시폴린-3-글루코사이드를 포함하는 작약 추출물의 피부 주름개선 효과를 검정하기 위하여 콜라겐 합성능을 측정하였다. 콜라겐은 상기 엘라스틴과 함께 피부 내 진피 매트릭스 층을 이루는 구성성분으로서 피부가 서서히 노화 되어가며 진피 내 매트릭스 층을 이루고 있는 구성성분들이 분해되어 감으로 주름이 생성되는데, 진피 매트릭스 층의 구성성분인 콜라겐의 합성효과를 확인함으로써 피부 주름을 개선시키는 효과를 확인 할 수 있다. 시험 방법은 하기와 같이 진행한다.

사람의 정상 섬유아세포(human dermal fibroblast)를 24-웰 마이크로플레이트에 접종시키고(1×10⁵ 세포/웰) 37℃, 5 % 농도의 CO₂ 배양기에서 24시간 배양하였다. 각 시료들을 농도별로 첨가한 혈청이 함유되지 않은 DMEM배지에서 24시간 동안 배양하였다. 콜라겐 합성량은 효소면역측정법을 이용하여 다음과 같이 수행한다.

24시간 배양한 배지를 96-웰 마이크로플레이트에 분주하여 4℃에서 하룻밤 동안 코팅하였다. 세척 버퍼(PBS-T; 0.05 % Tween 20 in phosphate buffered saline)로 3회 세척하고 블로킹 용액(5 % skin milk, Fluka)을 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 블로킹하였다. 블로킹 용액을 버리고 세척 버퍼로 3회 세척하고, 일차항체(rabbit anti-collagen type I, Sigma)를 PBS-T에 희석하여 100 ㎕씩 가하여 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 세척 버퍼로 3회 세척한 다음, 이차 항체(anti-rabbit IgG alkaline phosphatase conjugate, Sigma)를 PBS-T에 희석하여 100 ㎕씩 첨가하여 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 세척 버퍼로 3회 세척 후, 기질용액(alkaline phosphatase substrate solution, Sigma)을 100 ㎕씩 넣고 항온 25℃에서 발색시킨 후, 마이크로플레이트 리더(UVT-06685, Termo max, USA)를 사용하여 405nm에서 흡광도를 측정하였다.

상기 콜라겐 합성효과를 측정하기 위한 대조군은 시료를 처리하지 않은 세포 배양액의 반응 흡광도이며, 콜라겐 합성효과를 판단하기 위해 아스코르빈산을 비교군으로 설정하여 각각 3회씩 실시, 평균값을 구하였다.

하기 수학식 3을 이용하여 콜라겐 합성효과를 수치로 계산하여 하기 표 4에 나타내었다.

[수학식 3]

콜 라 겐 합 성 효 과 (%)	시료	농도(㎍/mL)
	시료	0	1	10	100
	실시예 2	100.00	111.59	122.84	133.21
	아스코르빈산(vitamin-C)	100.00	108.45	123.57	131.58

표 4에 나타난 바와 같이, 실시예 2(시료 5)에서 수득한 탁시폴린-3-글루코사이드를 포함하는 작약 추출물은 기존 콜라겐합성효과가 우수하다고 알려진 아스코르빈산과 비교하였을때, 거의 대등한 콜라겐 합성효과를 나타냈다.

[시험예 5] 자외선 조사 후 MMP-1 발현억제 평가

본 발명의 탁시폴린-3-글루코사이드를 포함하는 작약 추출물의 자외선 조사 후 MMP-1 발현 억제를 평가하기 위해 UV 조사 및 시료 첨가 후 MMP-1 농도를 측정하는 효소면역분석법(ELISA)을 하기와 같이 실시하였다.

UV 챔버를 이용하여 인간 진피 섬유아세포에 UVA를 5 J/㎠의 에너지로 조사한다. 자외선 조사량과 배양시간은 예비 실험을 통하여 섬유아세포에서 MMP 발현량이 최대가 되는 조건을 확립하였다. 음성 대조군은 은박지로 매스킹 후 UVA의 환경에 같은 시간 유지하였다. UVA 방출량은 UV 라디오미터를 이용하여 측정하였고, UVA가 조사되는 동안의 세포는 이전에 분주된 배지 그대로이며 UVA를 조사 한 후 샘플이 들어간 배지로 교환하여 24시간 배양 후 배지를 회수, 96-웰에 코팅하였다. 일차항체(MMP-1 (Ab-5) 단일클론항체와 MMP-2(Ab-3) 단일클론항체)를 처리하고 37℃에서 60분 반응시키고, 이차항체인 안티마우스 IgG(whole mouse, alkaline phosphatase conjugated)를 다시 60분 정도 반응시킨 후, 알카린 포스파타제 기질 용액(1mg/ml p-nitrophenyl phosphate in diethanolamine 완충용액)을 상온에서 30분간 반응, 마이크로플레이트 리더로 405nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군으로는 시료를 첨가하지 않은 것을 사용하였다.

하기 표 5에서 볼 수 있듯이, 자외선 조사시에 발현이 유도되는 MMP-1에 대하여 시료를 처리하지 않은 대조군에 비하여 실시예 2(시료 5)는 48 % 이상의 억제율을 보였으며 이는 대조군으로 사용한 레티놀의 억제율보다 우수한 결과이다.

시험군	처리농도(%)	MMP-1 발현억제율(%)
실시예 2	0.1	48
레티놀	0.1	28

[시험예 6] B16F1 멜라노싸이트를 이용한 멜라닌 생성 억제효과 측정 실험

본 발명의 탁시폴린-3-글루코사이드를 포함하는 작약 추출물의 미백효과를 검정하기 위해 하기와 같이 B16F1 멜라노싸이트에 대한 멜라닌 생성 억제 정도를 보고 미백 효과를 판단한 것이다.

본 시험예에 사용된 B16F1 멜라노싸이트는 마우스에서 유래한 세포균주이며, 멜라닌이라는 흑색색소를 분비하는 세포이다. 이 세포의 인공배양중에 시료를 처리하여 멜라닌 흑색색소가 감소하는 정도를 비교 평가하였다. 본 시험예에 사용된 B16F1 멜라노싸이트는 ATCC (American Type Culture Collection, 기탁번호: 6323)로부터 분양받아 사용하였다.

B16F1 멜라노싸이트의 멜라닌 생합성 억제효과 측정은 다음과 같이 행하였다. B16F1 멜라노싸이트를 6 웰 플레이트에 각 웰당 2×10⁶ 농도로 분주하고 세포를 부착시킨 후 독성을 유발하지 않는 농도로 시료를 처리하여 72시간 동안 배양하였다. 72시간 배양 후 세포를 trypsin-EDTA로 떼어 낸 후 세포수를 측정한 다음 원심분리하여 세포를 회수하였다. 세포내 멜라닌의 정량은 로탄 (Lotan: Cancer Res ., 40: 3345-3350, 1980)의 방법을 약간 변형하여 실시하였다. 셀 펠릿을 PBS로 1회 세척한 후 균질화 버퍼액(50 mM 소듐 포스페이트, pH 6.8, 1 % Triton X-100, 2 mM PMSF) 1 ml를 첨가하여 5분간 와류하여 세포를 파쇄하였다. 원심분리 (3,000 rpm, 10분)하여 얻은 세포 여액에 1 N NaOH (10 % DMSO)를 첨가하여 추출된 멜라닌을 용해한 후 마이크로 플레이트 판독기로 405 nm에서 멜라닌의 흡광도를 측정한 다음 멜라닌을 정량하여 시료의 멜라닌 생성 저해율 (%)을 측정하였다. B16F1 멜라노싸이트의 멜라닌 생성 저해율 (%)은 하기 수학식 4에 의하여 계산하였으며, IC₅₀값은 멜라닌 생성을 50 % 저해하는 물질의 농도이다.

[수학식 4]

저해율 (%) = [(A-B)/A] × 100

A : 시료를 첨가하지 않은 웰의 멜라닌 양

B : 시료를 첨가한 웰의 멜라닌 양

하기 표 6에서 볼 수 있듯이, B16F1 멜라노싸이트의 멜라닌 생성 억제효과를 시험한 결과 실시예 2(시료 5)의 IC₅₀은 0.08 %로 기존의 미백제인 알부틴, 유용성 감초 추출물 등에 비해 유사하거나 우수한 효과를 나타내었다.

시료명	처리농도(%)	멜라닌 합성 저해효과(IC50)
실시예 2	0.1	0.08%
알부틴	0.1	0.21%
유용성 감초 추출물	0.1	0.03%

[시험예 7] 자외선조사에 의한 세포독성 완화 효과

본 발명의 탁시폴린-3-글루코사이드를 포함하는 작약 추출물의 자외선 조사에 의한 세포독성의 완화 효과를 평가하기 위하여 하기와 같이 실험을 실시하였다.

섬유아세포(fibroblast)를 24-웰 시험 플레이트에 1×10⁵개씩 넣고 24시간 동안 부착시켰다. 각 웰을 PBS로 1회 세척하고 각 웰에 500㎕의 PBS를 넣었다. 이 섬유아세포에 자외선 B(UVB) 램프(Model : F15T8, UV B 15W, Sankyo Dennki사, Japan)를 이용하여 자외선 10 mJ/㎠를 조사한 후 PBS를 덜어내고 세포배양 배지(DMEM에 10% FBS가 첨가된 것) 1 ㎖을 첨가하였다. 여기에 평가하고자 하는 실시예 2(시료 5)를 처리한 후 24시간동안 배양하였다. 24시간이 지나면 배지를 제거하고, 각 웰 당 세포배양 배지 500 ㎕ 배지와 MTT 용액(2.5㎎/㎖) 60 ㎕를 넣은 후 2시간동안 37℃ CO₂ 배양기에서 배양하였다. 배지를 제거하고 이소프로판올-HCl(0.04 N)을 500 ㎕씩 넣어주었다. 5분간 진탕하여 세포를 용해시키고 상등액 100 ㎕씩을 96-웰 시험 플레이트에 옮긴 후, 마이크로플레이트 판독기에서 565 nm 흡광도를 측정하였다. 하기 수학식 5에 의해 세포생존율(%)을 측정하고 자외선에 의한 세포독성 완화율은 하기 수학식 6에 의하여 계산하였다.

[수학식 5]

세포생존율(%) =〔(St-Bo)/(Bt-Bo)〕× 100

Bo : 세포배양배지 만을 발색 반응한 웰의 565 nm　 흡광도

Bt : 시료를 처리하지 않은 웰을 발색 반응한 웰의 565 nm　 흡광도

St : 시료를 처리한 웰을 발색 반응한 웰의 565 nm　 흡광도

[수학식 6]

자외선에 의한 세포독성 완화율(%) =〔1-(St-Bo)/(Bt-Bo)〕× 100

Bo : 자외선 조사하지 않고 시료 처리하지 않은 웰의 세포 생존율

Bt : 자외선 조사하고 시료를 처리하지 않은 웰의 세포생존율　　　　　

St : 자외선 조사하고 시료를 처리한 웰의 세포생존율　

실험결과 하기 표 7에서 볼 수 있듯이, 실시예 2(시료 5)는 자외선에 의한 세포 독성을 0.1% 농도에서 41%의 세포독성을 완화하여 자외선에 의한 세포독성을 효과적으로 방어함을 알 수 있었다. 상기 실험을 통해 자외선에 의한 세포손상을 낮은 농도에서 효과적으로 방어함을 알 수 있다.

시료명	처리농도(%)	세포독성 완화율(%)
실시예 2	0.1	41

[시험예 8] 자외선 조사에 의한 염증성 사이토카인 발현 억제효과

본 발명의 탁시폴린-3-글루코사이드를 포함하는 작약 추출물의 자외선 조사에 의해 발현되는 염증성 사이토카인 발현 억제효과를 평가하기 위하여 하기와 같이 실험을 수행하였다.

사람의 표피조직에서 분리한 섬유아세포(Fibroblast)를 24-웰 시험 플레이트에 5×10⁴개씩 넣고 24시간동안 부착시켰다. 각 웰을 PBS로 1회 세척하고 각 웰에 500 ㎕의 PBS를 넣었다. 이 섬유아세포에 자외선B(UVB) 램프(Model : F15T8, UV B 15W, Sankyo Dennki사, Japan)를 이용하여 자외선 10 mJ/㎠를 조사한 후 PBS를 덜어내고 세포배양 배지(DMEM에 FBS가 첨가되지 않은 배지) 350 ㎕를 첨가하였다. 여기에 평가하고자 하는 실시예 2(시료 5)를 처리한 후 5시간동안 배양하였다. 배양 상층액을 150 ㎕ 취하여 IL-1α를 정량함으로서 실시예 2(시료 5)의 염증성 사이토카인 발현억제효과를 판단하였다. IL-1α의 양은 효소면역분석법 (Enzyme-linked Immunosorbent Assay)를 이용하여 정량화하였으며, IL-1α의 생성율은 하기 수학식 7에 의해 계산하였다.

[수학식 7]

염증성 사이토카인 발현 억제율(%) =〔1-(St-Bo)/(Bt-Bo)〕× 100

Bo : 자외선 조사하지 않고 시료 처리하지 않은 웰의 IL-1α생성량

Bt : 자외선 조사하고 시료를 처리하지 않은 웰의 IL-1α생성량　　　

St : 자외선 조사하고 시료를 처리한 웰의 IL-1α생성량

실험결과 하기 표 8에서 볼 수 있듯이, 실시예 2(시료 5)는 자외선에 의한 염증성 사이토카인인 IL-1α의 생성을 0.1 % 농도에서 41 % 억제하여, 자외선에 의한 염증 발생을 낮은 농도에서 효과적으로 방어함을 알 수 있다.

시료명	처리농도(%)	염증성 사이토카인 발현 억제율(%)
실시예 2	0.05	25
실시예 2	0.1	41

[시험예 9] 항균 효과

본 발명의 탁시폴린-3-글루코사이드를 포함하는 작약 추출물(실시예 2)에 대한 항균력 효과 검정시험으로 고체 배양 희석법과 원형여과지법(Paper disc method)에 의하여 항균시험을 실시하였다. 실험균주는 한국생명공학연구원으로부터 분양 받았으며, 그람양성균으로 포도상구균(Staphylococcus aureus KCTC 6910), 그람음성균으로 녹농균(Pseudomonas aeruginosa KCTC 1637), 대장균(E. Coli KCTC 1039), 효모로는 캔디다 효모(Candida albicans KCTC 7965), 사상균으로 흑국균(Aspergillus niger KCTC 6910) 이상 총 4종의 균주를 사용하였으며, 실험 방법과 결과는 하기와 같다.

상기 탁시폴린-3-글루코사이드를 포함하는 작약 추출물의 항균력을 측정하기 위해 고체 배양 희석법(Agar Serial Dilution Method)을 이용하여 최소 저해 농도를 측정하였다.

세균류는 트립틱 소이 배지를 사용하였고, 배지에 균을 접종하여 37℃ 진탕 배양기에서 24시간동안 전배양하여 사용하였다. 효모의 배양에는 포테이토 덱스트로스 배지를 사용하였고 배지에 균을 접종하여 25℃ 진탕 배양기에서 2일간 전배양하여 사용하였다. 사상균의 배양에는 포테이토덱스트로스 한천배지를 사용하였고 배지에 균을 접종하여 25℃배양기에서 7일간 전배양하여 사용하였다.

보다 구체적인 항균시험은 먼저 세균의 경우, 트립틱소이 배지에 균을 접종하여 37℃에서 24시간 전배양하여 준비하고, 효모의 경우, 포테이토덱스트로스 배지에 균을 접종하여 25℃에서 2일간 전배양하며, 사상균은 포테이토 덱스트로스 한천배지에 균을 접종하여 25℃ 배양기에서 7일간 전배양한 후, 도말봉을 이용, 배지 표면에 형성된 사상균의 포자를 회수하여 멸균된 식염수에 희석하여 사용하였다.

멸균된 패트리 디쉬에 시료 및 실험균종 별로 5% 디메틸설폭사이드(Dimethylsulfoxide, DMSO) 생리식염수용액에 적절한 농도로 희석한 각각의 추출물을 2 mL씩 넣고, 대조군은 5% 생리식염수 용액에 적절한 농도로 희석한 각 시료 2 mL씩 넣고, 대조군은 5% DMSO 생리식염수용액 2 mL을 넣은 후, 각 패트리 디쉬에 멸균하고 48 ℃로 냉각한 트립틱소이 한천배지 및 포테이토덱스트로스 한천배지를 18 mL씩 첨가하여 교반 후 정치하여 응고시킨다.

이후 전배양시킨 각각의 시험균을 세균의 경우 최종농도 약 1×10⁶ CFU/mL 의 균농도로 각각의 페트리디쉬에 도말하고, 효모의 경우 1×10⁵ CFU/mL, 사상균의 경우 약 1×10⁴ CFU/mL의 균농도로 각각의 페트리디쉬에 도말한다. 각각의 페트리 디쉬는 세균은 37℃에서 24시간 배양하고 효모는 25℃에서 3일간 배양, 사상균은 25℃배양기에서 7일간 배양한 후 각 구획 안에 콜로니(Colony) 형성여부를 관찰하여 성장이 되지 않은 평판의 최소 시료 농도를 최소저해농도(MIC, Minimum inhibitory concentration)로 하며, 그 결과를 표 9에 나타내었다. 이때, 최소저해농도는 값이 작을수록 항균효과가 높음을 의미한다.

균주	최소저해농도(MIC, ㎍/mL)
S. aureus	50
P. aeruginosa	21
E. Coli	12
C. albicans	110
A. niger	140

표 9에 나타난 바와 같이, 탁시폴린-3-글루코사이드를 포함하는 작약 추출물은 4종의 세균, 효모, 사상균에 대하여 모두 월등한 항균력 효과를 나타내었다.

또한, 탁시폴린-3-글루코사이드를 포함하는 작약 추출물의 항균력 효과를 검정하기 위해 원형여과지법(Paper disc method)에 의하여 다음와 같이 실험 하였다. 평판 배지에 배양된 각 균주를 1 백금이량 취해서 액체 배지 10 mL에서 24시간 배양하여 활성화시킨 후 다시 액체 배지 10 mL에 균액을 0.1 mL 접종하여 6시간배양한 후 평판배지 1개당 균액을 약 10⁷ cfu/mL이 되게 접종하여 멸균된 도발봉으로 균일하게 도말하였다. 그 후 멸균된 원형여과지 (6 mm, Satorius, Germany)를 고체 평판 배지에 올려놓은 다음 용매에 녹인 시료 5를 0.05 ml/disk가 되도록 흡수시켜 배양하였다.　 포도상구균(Staphylococcus aureus ), 녹농균(Pseudomonas aeruginosa), 대장균(E. Coli )은 37℃, 진균 종류인 캔디다 효모(Candida albicans), 흑국균(Aspergillus niger)은 27℃에 각각 24시간, 120시간 배양하여 여과지 주위 투명존의 직경을 측정하였다. 비교군으로 항균활성이 강력하다고 알려진 메틸 파라벤(methyl paraben)을 사용하였으며, 결과는 하기 표 10에 나타내었다. 이 때, 여과지주위의 투명존은 해당 균주에 대해 증식억제 정도의 지표이며, 직경이 클수록 해당 균주에 대해 항균력 효과가 높음을 의미한다.

균주	추출방법	투명존 직경(mm)
S. aureus	실시예 2	13
S. aureus	메틸 파라벤	11
P. aeruginosa	실시예 2	15
P. aeruginosa	메틸 파라벤	12
E. Coli	실시예 2	24
E. Coli	메틸 파라벤	18
C. albicans	실시예 2	17
C. albicans	메틸 파라벤	13
A. niger	실시예 2	25
A. niger	메틸 파라벤	24

표 10에 나타난 바와 같이, 탁시폴린-3-글루코사이드를 포함하는 작약 추출물은 강력한 항균제로 알려진 메틸 파라벤보다 4종의 세균, 효모, 사상균에 대해 더 강력한 항균활성을 나타내었다.

[제형실시예 1 및 제형비교예 1]

상기 실시예 2(시료 5)에 따른 탁시폴린-3-글루코사이드를 포함하는 작약 추출물을 함유하는 영양크림의 성분구성을 하기 표 11과 같이 구성하여 제조하였다.

번호	성 분	제형 비교예 1	제형 비교예 1
1	친유형 모노스테아린산글리세린	2.0	2.0
2	스테아린산	1.5	1.5
3	세테아릴 알콜	2.2	2.2
4	밀납	1.0	1.0
5	스쿠알란	3.0	3.0
6	경화식물유	1.0	1.0
7	소르비탄 스테아레이트	0.6	0.6
8	광물유	5.0	5.0
9	폴리솔베이트 60	1.5	1.5
10	디메치콘	1.0	1.0
11	트리옥타노인	5.0	5.0
12	베타인	3.0	3.0
13	트리에탄올아민	1.0	1.0
14	글리세린	5.0	5.0
15	소듐히아루로네이트	3.0	3.0
16	실시예 2의 작약 추출물	1.0	-
17	증류수	잔량	잔량
18	방부제, 향, 색소	미량	미량

상기 표 11의 조성으로 구성된 성분 중에서 먼저 원료 12 내지 15 및 17의 수성성분을 80℃로 가온하여 완전 용해시킨 다음, 원료 1 내지 11 및 16을 80℃로 가온하여 상기 원료 12 내지 15 및 17의 용액에 투입하고 호모믹서(Homo Mixer Mark Ⅱ, Primix, JPN)를 이용하여 3,000rpm에서 15분간 유화시켰다. 그 후, 원료 18를 투입하여 5분간 교반 시킨 후 실온으로 냉각하였다.

[시험예 10] 제형 적용 미백효과 측정

상기 제형 실시예1 및 제형 비교예1에서 제조된 영양크림의 미백효과를 측정하기 위하여 다음과 같은 방법을 통하여 측정하였다. 기미, 주근깨 및 색소 침착증을 갖고 있는 25세 이상 여성 30명을 대상으로 상기 제형 실시예1 및 제형 비교예1의 영양크림을 12주간 사용하게 한 후 피부색의 변화를 색도계(Chromameter)(CR-410, Minolta, Japan)를 이용하여 색의 밝기 변화 (ΔL)을 측정하였다. 총 30명의 평균값을 통하여 계산하였으며, 밝기 변화 값이 높을수록 미백효과가 높음을 의미한다. 실험 결과는 하기 표 12과 같다.

	평균값
	제형 실시예1	제형 비교예1
피부색 밝기 변화(ΔL)	6.19	0.22

상기 표 12와 같이 실시예 2(시료 5)가 첨가된 제형 실시예 1의 영양크림은 실시예 2(시료 5)가 첨가되지 않은 제형 비교예 1의 영양크림과 비교하였을 때, 미백효과가 월등히 우수함을 확인하였다.

[시험예 11] 제형 적용 주름개선효과 측정

상기 제형 실시예 1 및 제형 비교예 1에서 제조된 영양크림의 주름개선효과를 측정하기 위하여 다음과 같은 방법을 통하여 측정하였다. 피부노화가 진행중인 30대이 상 여성 10명을 대상으로 상기 제형 실시예 1 및 제형 비교예 1의 영양크림을 12주간 양쪽 눈가주름(crow feets)부위에 사용하게 한 후 4주, 8주, 12주 간격으로 눈가 주름 주형(replica)을 영상분석법으로 피부노화측정기(Skin visiometer)(SV-600, C+K, Germany)를 이용하여 주름의 깊이(㎛)를 측정하고, 그 결과를 하기 표 13에 나타내었다.

	평균값
	제형 실시예1	제형 비교예1
도포 전	329 ± 13	326 ± 12
도포 12주 후	255 ± 11	320 ± 22
주름깊이 감소율(%)	22.5	1.8

상기 결과와 같이 실시예 2(시료 5)가 첨가된 제형 실시예 1의 영양크림은 실시예 2(시료 5)가 첨가되지 않은 제형 비교예 1의 영양크림과 비교하였을 때, 주름개선효과가 월등히 우수함을 확인하였다.

[시험예 12] 제형 적용 아토피 개선효과 측정

상기 제형 실시예 1 및 제형 비교예 1에서 제조된 영양크림의 아토피 개선효과를 측정하기 위하여 다음과 같은 방법을 통하여 측정하였다. 피부장벽 손상방법으로 아세톤을 도포하였다. 8-12주령의 무모생쥐의 배부에 아세톤을 점적하여 경피수분손실량(TEWL; transepidermal water loss)이 4.0 g/m²/h에 도달하면 상기제형 비교예 1 및 제형 비교예 1의 영양크림을 도포하였다. TEWL은 C+K사(Cologne, Germany)의 증발계인 Tewameter 210으로 측정하였다. 도포 6시간 경과후에 TEWL을 측정하여 TEWL이 감소되는 정도를 측정하여 TEWL이 감소되는 정도를 평가함으로써 피부장벽기능이 회복되는 정도를 측정하였다. 효능평가에 사용된 회복율의 계산은 하기 수학식 8과 같이 계산하였고 그 결과를 하기 표 14에 나타내었다.

[수학식 8]

Br(Barrier Recovery, 피부장벽 회복율)= (1-(B_t ₌₆- B_t ₌₀)/(B_t _=d - B_t ₌₀))×100

　B_t ₌₆ : 피부장벽 손상 후 6시간 경과후의 TEWL 측정값

　B_t ₌₀ : 피부장벽 손상 이전의 TEWL 측정값

　B_t _=d : 피부장벽 손상 직후의 TEWL 측정값

회복율(%)	평균값
회복율(%)	제형 실시예1	제형 비교예1
6시간 경과 회복율 (초기TEWL기준)	39	12

상기 결과와 같이 실시예 2(시료 5)가 첨가된 제형 실시예 1의 영양크림은 실시예 2(시료 5)가 첨가되지 않은 제형 비교예 1의 영양크림과 비교하였을 때, 피부장벽 손상후 회복 효과가 상승하는 것으로 나타났다.

이하, 본 발명의 제형예로서 유연 화장수, 수렴화장수, 영양 화장수, 마사지 크림, 에센스 및 팩을 예시하나 본 발명의 화장료 조성물의 제형은 이에 제한되는 것으로 해석해서는 안 되며, 본 발명의 범위 내에서 당업자의 통상적인 변화가 가능하다.

[제형예 1] 유연화장수

번호	성 분	함량(%)
1	글리세린	5.00
2	1,3-부틸렌 글라이콜	3.00
3	PEG 1500	1.00
4	알란토인	0.10
5	DL-판테놀	0.30
6	EDTA-2Na	0.02
7	벤조페논-9	0.04
8	에탄올	10.00
9	옥틱도데세스-16	0.20
10	폴리솔베이트 20	0.20
11	실시예 1의 작약 추출물	5.0
12	방부제, 향, 색소	미량
13	증류수	잔량

[제형예 2] 수렴화장수

번호	성 분	함량(%)
1	글리세린	2.00
2	1,3-부틸렌 글라이콜	2.00
3	알란토인	0.10
4	DL-판테놀	0.30
5	EDTA-2Na	0.02
6	벤조페논-9	0.04
7	에탄올	15.00
8	폴리솔베이트 20	0.20
9	실시예 2의 작약 추출물	1.0
10	구연산	미량
11	방부제, 향, 색소	미량
12	증류수	잔량

[제형예 3] 영양화장수

번호	성 분	함량(%)
1	세테아릴 알콜	1.00
2	글리세릴스테아레이트	0.50
3	폴리소르베이트 60	1.00
4	소르비탄세스퀴올리에이트	0.30
5	세틸옥타노에이트	6.00
6	스쿠알란	4.00
7	샤플라워오일	4.00
8	부틸렌글라이콜	4.00
9	글리세린	4.00
10	카보머	0.10
11	트리에탄올아민	0.10
12	실시예 1의 작약 추출물	1.00
13	방부제, 향, 색소	미량
14	증류수	잔량

[제형예 4] 에센스

번호	성 분	함량(%)
1	글리세린	10.00
2	베타인	5.00
3	PEG 1500	2.00
4	알란토인	0.10
5	DL-판테놀	0.30
6	EDTA-2Na	0.02
7	벤조페논-9	0.04
8	히드록시에틸 셀룰로오스	0.10
9	카르복시비닐 폴리머	0.20
10	트리에탄올아민	0.18
11	옥틸도데칸올	0.30
12	옥틸도데세스-16	0.40
13	에탄올	6.00
14	실시예 2의 작약 추출물	1.00
15	방부제, 향, 색소	미량
16	증류수	잔량

[제형예 5] 팩

번호	성 분	함량(%)
1	폴리비닐 알콜	15.00
2	셀룰로오스 검	0.15
3	글리세린	3.00
4	PEG 1500	2.00
5	시이크데스트린	0.15
6	DL-판테놀	0.30
7	알란토인	0.10
8	글리시리진산 모노암모늄	0.20
9	니코틴 아미드	0.40
10	에탄올	5.00
11	PEG 40 경화피마자유	0.30
12	실시예 1의 작약 추출물	1.00
13	방부제, 향, 색소	미량
14	증류수	잔량

Claims

탁시폴린 배당체를 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 탁시폴린 배당체는 작약에서 추출한 것인 화장료 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 탁시폴린 배당체는 탁시폴린-3-글루코사이드인 것인 화장료 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 탁시폴린 배당체는 조성물 총 중량에 대하여 0.0001 내지 10중량% 함유되는 것인 화장료 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 조성물은 피부미백, 주름개선, 항염, 항균, 아토피 개선 및 자외선 보호로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 기능을 가지는 것인 화장료 조성물.
작약을 용매에 넣고 탁시폴린 배당체를 용출하는 단계;
용출된 추출물을 농축하는 단계;
농축된 추출물을 둘 이상의 용매에 넣고 분획시키는 단계;
분획된 층에서 얻어진 추출물을 컬럼에 통과시키는 단계; 및
컬럼 통과액을 침전시켜 재결정화하는 단계;를 포함하는 것인 작약 추출물의 추출방법.
제 6항에 있어서,
상기 분획 단계는 분획시킨 후 분획된 층의 용매를 제거하여 농축하는 것인 작약 추출물의 추출방법.
제 6항에 있어서,
상기 추출방법은 재결정화 이후에 재결정화된 추출물을 건조하여 수득하는 단계;를 더 포함하는 것인 작약 추출물의 추출방법.
제 6항에 있어서,
상기 탁시폴린 배당체는 탁시폴린-3-글루코사이드인 것인 작약 추출물의 추출방법.
제 6항에 있어서,
상기 용출 단계의 용매는 물, 에탄올, 메탄올, 부탄올, 에틸아세테이트, 에틸에테르, 클로로포름, 헥산으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것인 작약 추출물의 추출방법.
제 6항에 있어서,
상기 용출된 추출물의 농축 단계는 가열건조, 감압건조, 분무건조 및 동결건조로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상으로 수행되는 것인 작약 추출물의 추출방법.
제 6항에 있어서,
상기 분획 단계의 용매는 물, 에탄올, 메탄올, 부탄올, 에틸아세테이트, 에틸에테르, 클로로포름, 헥산으로 이루어진 군으로부터 선택된 둘 이상인 것인 작약 추출물의 추출방법.
제 6항에 있어서,
상기 컬럼 통과 단계의 컬럼은 레진 컬럼인 것인 작약 추출물의 추출방법.
제 13항에 있어서,
상기 레진은 엠버라이트 XAD 레진, 다우엑스 레진, 수페라이트 DAX 레진 및 다이아이온 HP-10, 20, 30, 40, 50 레진으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 레진인 것인 작약 추출물의 추출방법.
제 6항에 있어서,
상기 재결정화 단계는 -300 내지 25℃ 및 0.5 내지 800MPa에서 수행되는 것인 작약 추출물의 추출방법.