KR101395213B1

KR101395213B1 - 레몬버베나 유래 루테오닌７디글루쿠로니드 함유 추출물 및 이를 포함하는 기능성 화장료 조성물

Info

Publication number: KR101395213B1
Application number: KR1020120010710A
Authority: KR
Inventors: 주철규; 이근하; 박청; 조영롱; 이재성; 김고운; 주일우; 정용철
Original assignee: (주)모아캠
Priority date: 2012-02-02
Filing date: 2012-02-02
Publication date: 2014-05-16
Also published as: KR20130089385A

Abstract

본 발명은 레몬버베나 유래 루테오닌-7-디글루쿠로니드(luteolin-7-diglucuronide) 함유 추출물 및 상기 추출물을 포함하는 기능성 화장료 조성물에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 특정 연속 공정 제조방법을 통하여 고함량의 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 함유하는 레몬버베나 추출물을 제조하는 방법, 상기 방법으로 제조된 고함량의 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 함유하는 레몬버베나 추출물 및 이를 포함하는 기능성 화장료 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 화장용 조성물은 약용식물인 레몬버베나로부터 용매 추출, 농축, 용매 분획 및 재결정화를 거쳐 분리 정제한 고순도의 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 유효성분으로 함유하고 있으며 항산화, 미백, 주름개선, 항염, 항균, 아토피 개선 및 자외선보호 등의 효과가 우수한 화장용 조성물로서 제조 및 응용될 수 있다.

Description

레몬버베나 유래 루테오닌７디글루쿠로니드 함유 추출물 및 이를 포함하는 기능성 화장료 조성물{Extract Containing Luteolin７diglucuronide Derived from Lippia citriodora and Cosmetic Composition Containing the Same}

본 발명은 레몬버베나 유래 루테오닌-7-디글루쿠로니드(luteolin-7-diglucuronide) 함유 추출물 및 상기 추출물을 포함하는 기능성 화장료 조성물에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 특정 연속 공정 제조방법을 통하여 고함량의 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 함유하는 레몬버베나 추출물을 제조하는 방법, 상기 방법으로 제조된 고함량의 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 함유하는 레몬버베나 추출물 및 이를 포함하는 기능성 화장료 조성물에 관한 것이다.

사람의 피부는 노화 과정에서 다양한 물리화학적인 변화가 일어나며 그 원인으로는 크게 내적인 노화(intrinsic aging)와 광노화(photo-aging)로 구분되며 이에 관한 연구가 활발히 이루어져 왔다. 자외선, 스트레스, 질병상태, 환경인자, 상처, 나이가 들어감에 따라 프리라디칼이 활성화되어 야기될 수 있으며, 이런 상태가 심화 될 경우 생체 내에 존재하는 항산화 방어망을 파괴하고, 세포 및 조직을 손상시켜 성인병 및 노화를 촉진하게 된다. 즉, 피부의 주요 구성물질인 지질, 단백질, 다당류 및 핵산 등이 산화되어 피부 세포 및 조직이 파괴되고, 결국 피부노화 현상이 생겨나는 것이다. 특히 단백질의 산화는 피부의 결합조직인 콜라겐(collagen), 히알루론산(hyaluronic acid), 엘라스틴(elastin), 프로테오글리칸(proteoglycan) 및 피브로넥틴(fibronectin) 등이 절단되어 심한 과다 염증반응과 피부의 탄력에 지장을 주게 되고 이것이 더 심해질 경우 DNA의 변이에 의해 돌연변이, 암의 유발 및 면역기능 저하의 사태에 이르게 된다. 그러므로 신체의 대사 과정 중 발생하는 프리라디칼이나 자외선 조사, 염증반응에 의해 매개되는 프리라디칼을 소거하여 세포막을 보호하고, 또 이미 손상 받은 세포는 활발한 신진대사에 의해 재생화시켜서 세포를 증식시켜야 피부는 빠르게 회복되고 건강한 피부를 유지할 수 있다.

노화에는 프리라디칼 뿐만 아니라 MMP라는 효소가 관여하는데 생체 내에서 콜라겐과 같은 세포외기질의 합성과 분해는 적절하게 조절되나 노화가 진행되면서 그 합성이 감소하며 콜라겐을 분해하는 효소인 기질 금속단백질 분해효소(MMP)의 발현이 촉진되어 피부의 탄력이 저하되고 주름이 형성된다. 또한 자외선 조사에 의해 이러한 분해효소가 활성화되기도 한다.

따라서 미백, 노화방지, 주름제거 및 항산화효과를 가진 물질들에 관한 연구가 활발히 진행되었으나, 기존의 화학물질들은 독성, 저활성, 용도의 한계성, 과량복용에 따른 부작용 등의 여러 가지 문제로 사용에 제한을 받고 있어 부작용 가능성이 적은 소재를 개발하려는 일환으로 천연 식물에서의 유효 성분 추출하는 연구가 활발하다. 하지만 천연물 경우에도 안전성, 안정성 변색 가능성 등의 측면에서 화장품이나 의약품에 유효농도 이상으로 사용하는 데는 많은 문제점이 있으며, 만족할 만한 효과를 내지 못하는 실정이다. .

한편, 레몬버베나(Lippia citriodora)는 방취목[防臭木]이라고도 불리며, 남아메리카 원산지인, 쌍떡잎식물 통화식물목 마편초과 허브로서, 높이 60~150cm 정도 자라는 비내한성 낙엽 소저목이다. 전체에 강한 레몬향을 지닌다. 잎의 길이는 7~12cm로 긴 피침형으로 끝은 뾰족하다. 잎은 3~4개가 줄기에 윤생(輪生)한다. 꽃은 여름에 흰색 또는 연보라색으로 작은 것이 밀집하여 원추화서(圓錐花序)로 달린다.

루테오닌-7-디글루쿠로니드는 플라보노이드(flavonoid)에 속하는 화합물로 레몬버베나가 속하는 마편초과 식물들의 주요 구성 물질로 알려져 있으며, 이미 항산화, 항염, 항균 및 진정효과 등 여러 가지 생리활성이 보고되어있다. 종래기술에서는 레몬의 향기를 레몬버베나 잎에 압착시켜 그 향미가 오래 지속되는 액상 침출차 및 그 제조방법(한국등록특허 제10-0899890) 등이 있으나, 종래의 선행기술 어디에도 레몬버베나를 이용한 고함량의 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 포함하는 레몬버베나 추출물을 제조하는 방법과 이를 함유하는 기능성 화장료 조성물에 대한 개시가 없었다.

이에, 본 발명자들은 이제까지 알려지지 않은 여러 천연물 추출물 중 피부노화, 미백 등의 효능을 가지는 천연물 추출물을 개발하고자 예의 노력한 결과, 레몬버베나로부터 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 함유하는 추출물을 분리하고, 상기 추출물이 항산화, 미백, 주름개선, 항염, 항균, 아토피 개선 및 자외선 보호 등의 효과를 가진다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 항산화, 미백, 주름개선, 항염, 항균, 아토피 개선 및 자외선 보호 등의 효과가 뛰어난 레몬버베나유래 고함량의 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 함유하는 레몬버베나 추출물 및 이를 함유하는 화장용 조성물을 제공하는데 있다.

상기목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 레몬버베나에 용매를 가하여 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 추출한 다음, 농축하는 단계; (b) 상기 (a)단계의 농축된 추출물에 물, 에탄올, 메탄올, 부탄올, 에틸아세테이트, 에틸에테르, 클로로포름 및 헥산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 2종 이상의 용매를 가하여 루테오닌-7-디글루쿠로니드 분획을 수득하는 단계; (c) 상기 (b)단계의 유기용매를 제거하고 2차 농축하여 분획농축 파우더를 제조하는 단계; (d) 상기 (c)단계의 분획농축 파우더를 용매에 가용시킨 후, 컬럼을 이용하여 색소 및 클로로필을 제거하는 단계; (e) 색소 및 클로로필이 제거된 추출액에 압력 및 온도를 조절하여 침전시켜 재결정화시키는 단계 및 (f) 상기 재결정화단계를 통해 침전된 펠렛을 분무건조 또는 동결 건조하여 파우더형태의 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 수득하는 단계를 포함하는 고함량의 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 함유하는 레몬버베나 추출물의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한 상기의 제조방법으로 제조되고, 고함량의 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 함유하는 레몬버베나 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장용 조성물을 제공한다.

본 발명의 화장용 조성물 내에는 최적의 제조 수율과 제조공정으로 고함량 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 함유하는 레몬버베나 추출물을 유효성분으로 포함하고 있으며, 레몬버베나유래 고함량 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 함유하는 레몬버베나 추출물은 항산화효과, 미백효과, 주름개선효과, 항염효과, 항균효과 및 아토피 개선효과가 우수한 화장용 조성물로서 제조 및 응용될 수 있다.

도 1은 레몬버베나 유래 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 함유하는 레몬버베나 추출물의 제조방법 Flow chart에 관한 것이다.
도 2은 레몬버베나 유래 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 함유하는 레몬버베나 추출물의 HPLC 크로마토그래피에 관한 것이다.
도 3은 레몬버베나 유래 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 함유하는 레몬버베나 추출물의 UV 스펙트럼에 관한 것이다.
도 4은 레몬버베나 유래 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 함유하는 레몬버베나 추출물의 In vitro SPF 측정 크로마토그래피에 관한 것이다.
도 5은 레몬버베나유래 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 함유하는 레몬버베나 추출물의 HPLC/MS 측정 크로마토그램 및 화합물 동정에 관한 것이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

일 관점에서, 본 발명은 (a) 레몬버베나에 용매를 가하여 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 추출한 다음, 농축하는 단계; (b) 상기 (a)단계의 농축된 추출물에 물, 에탄올, 메탄올, 부탄올, 에틸아세테이트, 에틸에테르, 클로로포름 및 헥산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 2종 이상의 용매를 가하여 루테오닌-7-디글루쿠로니드 분획을 수득하는 단계; (c) 상기 (b)단계의 유기용매를 제거하고 2차 농축하여 분획농축 파우더를 제조하는 단계; (d) 상기 (c)단계의 분획농축 파우더를 용매에 가용시킨 후, 컬럼을 이용하여 색소 및 클로로필을 제거하는 단계; (e) 색소 및 클로로필이 제거된 추출액에 압력 및 온도를 조절하여 침전시켜 재결정화시키는 단계 및 (f) 상기 재결정화단계를 통해 침전된 펠렛을 분무건조 또는 동결 건조하여 파우더형태의 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 수득하는 단계를 포함하는 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 함유하는 레몬버베나 추출물의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명의 일 양태에서 추출단계를 통해 레몬버베나로부터 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 용출시키게 되는데, 본 발명에 의한 최적의 추출단계는 0.5~20.0%의 비율로 레몬버베나 중량을 물, 에탄올, 메탄올, 부탄올, 에틸아세테이트, 에틸에테르, 클로로포름 및 헥산 등의 용매에 가하여 0.5~5시간을 추출한다. 상기 추출단계를 통해 루테오닌-7-디글루쿠로니드가 용출된 레몬버베나 추출물은 용매제거를 위해 1차 농축단계를 거치게 되는데, 가열건조, 감압건조, 분무건조 및 동결건조 등 여러 가지 방법으로 응용될 수 있다.

상기 1차 농축단계를 통해 수득된 레몬버베나 추출물은 극성에 따라 화합물을 나누어 분리하는 분획단계를 거치게 되는데, 물, 에탄올, 메탄올, 부탄올, 에틸아세테이트, 에틸에테르, 클로로포름 및 헥산 등의 용매를 이용한다. 상기 분획단계를 거친 후 분획물은 유기용매의 제거를 위해 2차 농축단계를 거치게 되는데, 가열건조, 감압건조, 분무건조 및 동결건조 등 여러 가지 방법으로 응용될 수 있다.

상기 2차 농축단계를 거친 후 분획농축파우더는 색소 및 클로로필을 제거하는 컬럼단계를 거치게 되는데, 흡착수지를 이용한 레진 컬럼에 적합하며 상기 레진은 엠버라이트 XAD 레진, 다우엑스 레진, 수페라이트 DAX 레진, 다이아이온 HP-10, HP-20, HP-30, HP-40 및 HP-50 레진 등을 이용할 수 있다. 상기 컬럼단계를 거친 후 컬럼 통과액에 압력 및 온도를 조절하여 침전시키는 재결정화 단계를 거치게 되는데, -300~25℃ 및 0.5~800MPa을 포함하는 초저온, 초고압 조건하에 재결정화하였다. 상기 재결정화된 침전펠렛은 분무건조 또는 동결건조하여 파우더형태의 고함량의 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 포함하는 레몬버베나 추출물을 얻는 수득단계를 거치게 되는데, 원심분리, 필터 및 진공농축법으로 농축하여 사용할 수 있으며, 분무건조, 동결건조를 이용하여 분말상의 고함량 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 함유하는 레몬버베나 추출물을 수득하였다.

본 발명의 다른 양태에서 수득한 고함량 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 함유하는 레몬버베나 추출물은 제조방법 단계별 시료의 루테오닌-7-디글루쿠로니드의 정성, 정량분석을 위하여 고속액체 크로마토그래피(High pressure liquid chromatography; HPLC)를 이용해 분석을 실시하였다. 그 결과, 레몬버베나로부터 추출, 농축, 분획, 컬럼, 재결정 단계를 거칠수록 루테오닌-7-디글루쿠로니드의 함량이 상승함을 확인할 수 있었으며, 초저온 및 초고압 재결정단계를 통해 99%가 넘는 고함량의 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 함유하는 레몬버베나 추출물을 제조할 수 있음을 확인할 수 있었다.

본 발명에 있어서, 상기(a)의 추출단계는 0.5~20.0% 비율의 레몬버베나를 0.5~5시간 추출하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 (a)단계의 수용액은 물, 에탄올, 메탄올, 부탄올, 에틸아세테이트, 에틸에테르, 클로로포름 및 헥산으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 용액인 것을 특징으로 할 수 있다.

*본 발명에 있어서, 상기(a)와 (c)의 농축단계에서 가열건조, 감압건조, 분무건조 및 동결건조 등의 방법을 이용하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 (b)단계에서 수득한 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 포함하는 분획은 부탄올 분획인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 (d)단계는 흡착 수지를 이용한 레진 컬럼을 이용하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 (d)단계의 레진은 엠버라이트 XAD 레진, 다우엑스 레진, 수페라이트 DAX 레진, 다이아이온 HP-10, HP-20, HP-30, HP-40 및 HP-50 레진으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 레진인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 (e)단계는 -300~25℃ 및 0.5~800MPa을 포함하는 초저온, 초고압 조건하에 재결정화하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 (f)단계의 침전된 고함량의 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 함유하는 레몬버베나 추출물을 수득하기 위하여 원심분리, 필터 및 진공농축법으로 농축 후 분무건조 또는 동결건조를 이용하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기의 제조방법으로 수득한 루테오닌-7-디글루쿠로니드는 638.1g의 분자량인 것 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 일 실시 예에서 레몬버베나를 20% 에탄올 수용액에 10%중량으로 온도 80℃ 조건하에 2시간 동안 추출한 후, 80 mesh필터와 1.2㎛ 필터를 이용하여 추출 여액을 얻었다. 수득된 추출여액을 65℃, 20hPa 조건하에 1시간 동안 농축하여, 수득된 농축파우더에 10 배 중량의 증류수를 투입하여 고르게 분산한 뒤 분획여두를 사용하여 헥산, 에틸아세테이드, n-부탄올을 차례로 분획하여 최종적으로 n-부탄올층을 얻었다. 수득된 n-부탄올 분획여액을 65℃, 20hPa 조건하에 1시간 동안 농축하여, 수득된 농축파우더를 10 배 중량의 증류수에 다시 분산시켜 다이아이온 HP-20 컬럼을 이용하여 최종적으로 10% ~20% 에탄올 컬럼액을 얻었으며, -90℃조건하에서 2시간 동안 초저온 재결정화 처리하였다. 이를 원심분리기를 이용하여 8,000rpm, 15℃ 조건하에 15분간 원심분리 하고, 1.2㎛ 필터로 여과를 수행, 최종적으로 60℃ 조건하에 1시간 동안 건조하여 고함량의 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 함유하는 레몬버베나 추출물 파우더를 수득하였다.

다른 관점에서, 본 발명은 상기의 제조방법으로 제조되고, 고함량의 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 함유하는 레몬버베나 추출물에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 양태에서 고함량의 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 함유하는 레몬버베나 추출물에 대한 피부 노화개선 효과 검정시험으로 항산화 효과를 확인하기 위하여 자유라디칼 소거시험과 활성산소소거시험을 실시하였다. 결과적으로, 수득한 고함량의 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 함유하는 레몬버베나 추출물은 강력한 합성 항산화제인 L-아스코르브산(L-ascorbic acid)과 거의 유사한 항산화 능력을 나타내었으며, 자유라디칼 소거율 50%의 농도는 4㎍/㎖, 활성산소소거율 50%농도는 6㎍/㎖으로 미량의 농도에서 항산화 효능이 매우 우수함을 확인할 수 있었다.

본 발명의 또 다른 양태에서 고함량의 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 함유하는 레몬버베나 추출물의 미백효과를 검정하기 위해서 타이로시네이즈(tyrosinase) 활성저해 시험을 실시하였다. 결과적으로, 수득한 고함량의 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 함유하는 레몬버베나 추출물은 미백효과가 뛰어나다고 알려진 알부틴(arbutin)과 거의 유사한 미백효과를 나타내었으며, 타이로시네이즈 활성저해율 50%의 농도는 0.031mg/㎖으로 미량의 농도에서 미백 효과가 우수함을 확인할 수 있었다. 또한, B16F1 멜라노싸이트의 멜라닌 생합성 억제효과 측정 시험을 실시한 결과, 고함량의 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 함유하는 레몬버베나 추출물의 멜라닌 합성 저해효과 50%의 농도는 0.12%로 기존의 미백제로 알려진 알부틴보다는 낮지만, 유용성 감초 추출물에 비해 우수함을 확인할 수 있었다.

본 발명의 또 다른 양태에서 고함량의 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 함유하는 레몬버베나 추출물의 피부주름 억제 및 개선 효과를 검정하기 위해서, 엘라스테이즈 활성저해시험을 실시한 결과, 수득한 고함량의 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 함유하는 레몬버베나 추출물의 엘라스테이즈 활성저해율 50%의 농도는 0.28㎎/㎖로 주름개선효과가 뛰어나다고 알려진 레티놀(retinol) 0.38㎎/㎖ 보다 엘라스타아제 억제효과가 우수함을 확인할 수 있었다. 또한, 고함량의 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 함유하는 레몬버베나 추출물의 피부 주름개선 효과를 검정하기 위하여 콜라겐 합성효과를 측정한 결과, 수득한 고함량의 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 함유하는 레몬버베나 추출물은 콜라겐합성효과가 우수하다고 알려진 아스코르빈산과 거의 유사한 콜라겐 합성효과를 나타내어, 고함량의 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 포함하는 레몬버베나 추출물의 우수한 피부 주름억제 및 개선효과를 확인할 수 있었다.

본 발명의 또 다른 양태에서 고함량의 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 함유하는 레몬버베나 추출물의 UV 조사 및 시료 첨가 후 MMP-1 농도를 측정하는 효소면역분석법(ELISA)을 하기와 같이 실시하였다. 자외선 조사시에 발현이 유도되는 MMP-1에 대하여 시료를 처리하지 않은 대조군에 비하여 65% 이상의 억제율을 보였으며 이는 대조군으로 사용한 레티놀의 억제율보다 우수하였고, 고함량의 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 함유하는 레몬버베나 추출물의 자외선 조사에 의한 세포독성의 완화 효과를 평가한 결과, 고함량의 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 함유하는 레몬버베나 추출물은 0.1% 농도에서 45%의 세포독성 완화율을 보여 자외선에 의한 세포독성을 효과적으로 방어함을 알 수 있었다. 고함량의 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 함유하는 레몬버베나 추출물의 자외선 조사에 의해 발현되는 염증성 사이토카인 발현 억제효과를 평가한 결과, 고함량의 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 함유하는 레몬버베나 추출물은 자외선에 의한 염증성 사이토카인인 IL-1α의 생성을 0.1% 농도에서 52%로 억제하여, 자외선에 의한 염증 발생을 낮은 농도에서 효과적으로 방어함을 알 수 있었다. 또한, 고함량의 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 함유하는 레몬버베나 추출물에 대한 자외선 차단 효과 검정시험으로 in vitro SPF 분석기(Optometrics SPF-290S)를 이용하여 자외선 차단효과를 측정한 결과, 고함량의 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 함유하는 레몬버베나 추출물은 강력한 합성 유기 자외선차단제인 OMC보다 효과적인 자외선 차단능(SPF, PA value)을 확인할 수 있었다.

본 발명의 고함량의 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 함유하는 레몬버베나 추출물에 대한 항균력 효과 검정시험으로 고체 배양 희석법(agar serial dilution method)과 원형여과지법(paper disc method)에 의하여 항균시험을 실시하였다. 그 결과, 고함량의 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 함유하는 레몬버베나 추출물은 강력한 합성 방부제인 메칠파라벤(methyl paraben)보다 4종의 세균, 효모, 사상균에 대해 우수한 항균활성을 확인할 수 있었다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 고함량의 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 함유하는 레몬버베나 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 양태에서 고함량의 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 함유하는 레몬버베나 추출물을 포함한 영양크림 및 고함량의 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 포함하는 레몬버베나 추출물을 포함하지 않은 영양크림을 제조하고, 제조된 영양크림의 미백효과를 기미, 주근깨 및 색소 침착증을 갖고 있는 25세 이상 여성 30명을 대상으로 각각 제조한 영양크림을 12주간 사용하게 한 후 피부색의 변화를 크로머메터(Chromameter)를 이용하여 색의 밝기 변화(ΔL)를 측정하였다. 측정한 결과, 고함량의 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 포함하는 레몬버베나 추출물이 첨가된 영양크림은 고함량의 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 함유하는 레몬버베나 추출물이 첨가되지 않은 영양크림과 비교하였을 때 우수한 미백효과를 확인할 수 있었다.

본 발명의 또 다른 양태에서 고함량의 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 함유하는 레몬버베나 추출물을 포함한 영양크림 및 고함량의 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 함유하는 레몬버베나 추출물을 포함하지 않은 영양크림을 이용하여 주름개선효과를 측정하기 위하여 30대 이상 여성 10명을 대상으로 각각 제조한 영양크림을 12주간 양쪽 눈가주름위에 사용하게 한 후 4주, 8주, 12주 간격으로 눈가 주름 주형을 영상분석법으로 주름의 깊이(㎛)를 측정하였다. 측정한 결과, 고함량의 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 함유하는 레몬버베나 추출물이 첨가된 영양크림은 고함량의 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 함유하는 레몬버베나 추출물이 첨가되지 않은 영양크림과 비교하였을 때 우수한 주름개선효과를 확인할 수 있었다.

본 발명의 또 다른 양태에서 고함량의 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 함유하는 레몬버베나 추출물을 포함한 영양크림 및 고함량의 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 함유하는 레몬버베나 추출물을 포함하지 않은 영양크림을 이용하여 아토피 개선효과를 측정하였다. 그 결과, 고함량의 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 함유하는 레몬버베나 추출물이 첨가된 영양크림은 고함량의 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 함유하는 레몬버베나 추출물이 첨가되지 않은 영양크림과 비교하였을 때, 피부장벽 손상 후 회복 효과가 상승하는 것을 확인할 수 있었다.

본 발명의 화장료 조성물에 있어 상기 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 함유하는 레몬버베나 추출물의 함량은 화장료 조성물 전체 중량 대비 0.0005 내지 10% 중량인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 화장용 조성물은 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 크림, 에센스, 수중유(O/W)형 또는 유중수(W/O)형의 제형 중에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 고함량의 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 함유하는 레몬버베나 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부외용제 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 상기 특정 연속 공정으로 얻어진 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 함유하는 레몬버베나 추출물 및 이를 함유하는 화장료 조성물은 뛰어난 항산화효과, 미백효과, 주름개선효과, 항염, 항균, 자외선보호효과 그리고 아토피 개선효과를 나타낸다. 또한 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 함유하는 레몬버베나 추출물을 포함하는 화장료 조성물은 화장수류, 에센스류, 크림류, 팩류, 패치류, 피부접착용 겔류, 파운데이션류, 메이크업베이스류 등의 다양한 제형으로 제조될 수 있고, 통상적인 화장료 제조법에 적용시킬 수 있다. 구체적으로 액상, 크림상, 페이스트상 및 고체상 등 다양한 성상으로 적용이 가능하며, 이들 각 제형에 적합하고 당업계에 주지된 각종의 통상적인 보조제와 담체를 포함할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1 : 레몬버베나로부터 루테오닌 -7- 디글루쿠로니드의 수득

레몬버베나를 20% 에탄올 수용액에 10% 중량으로 가하여 냉각콘덴서가 달린 환류추출기에서 온도 80℃ 조건하에 2시간 동안 추출한 후, 80 mesh 필터와 1.2㎛ 필터로 여과하여 추출 여액을 얻었다. 수득된 추출여액을 진공농축기(Rotary Evaporator NE-series, Eyela, 일본)를 이용하여 65℃, 20hPa 조건하에 1시간 동안 농축하여, 농축파우더를 얻었다. 이와 같이 수득된 것을 "시료 1"이라 하고, 일부 시험예에서 사용하였다.

실시예 2 : 레몬버베나로부터 루테오닌 -7- 디글루쿠로니의 수득

레몬버베나를 20% 에탄올 수용액에 10% 중량으로 가하여 냉각콘덴서가 달린 환류추출기에서 온도 80℃ 조건하에 2시간 동안 추출한 후, 80 mesh 필터와 1.2㎛ 필터로 여과하여 추출 여액을 얻었다. 수득된 추출여액을 진공농축를 이용하여 65℃, 20hPa 조건하에 1시간 동안 농축하여, 수득된 농축파우더에 10배 중량의 증류수를 투입하여 고르게 분산한 뒤 분획여두를 사용하여 증류수와 같은 부피의 헥산, 에틸아세테이트, n-부탄올을 차례로 분획하여 최종적으로 n-부탄올층을 얻었다. 수득된 n-부탄올 분획여액을 진공농축기를 이용하여 65℃, 20hPa 조건하에 1시간 동안 농축하여, 농축파우더를 얻었으며, 이와 같이 수득된 것을 "시료 2"라 하고, 일부 시험예에서 사용하였다.

실시예 3 : 레몬버베나로부터 루테오닌 -7- 디글루쿠로니의 수득

레몬버베나를 20% 에탄올 수용액에 10% 중량으로 가하여 냉각콘덴서가 달린 환류추출기에서 온도 80℃ 조건하에 2시간 동안 추출한 후, 80 mesh 필터와 1.2㎛ 필터로 여과하여 추출 여액을 얻었다. 수득된 추출여액을 진공농축기를 이용하여 65℃, 20hPa 조건하에 1시간 동안 농축하여, 수득된 농축파우더에 10배 중량의 증류수를 투입하여 고르게 분산한 뒤 분획여두를 사용하여 증류수와 같은 부피의 헥산, 에틸아세테이트, n-부탄올을 차례로 분획하여 최종적으로 n-부탄올층을 얻었다. 수득된 n-부탄올 분획여액을 진공농축기를 이용하여 65℃, 20hPa 조건하에 1시간 동안 농축하여, 수득된 농축파우더를 10 배 중량의 증류수에 다시 분산시켜 다이아이온 HP-20 컬럼에 충진하고, 증류수와 99.5% 에탄올을 사용한 기울기 용법으로 크로마토그래피를 수행하였다. 유속 20㎖/min 조건하에 최종적으로 10%~20% 에탄올 컬럼액을 받아 진공농축기를 이용하여 65℃, 20 hPa 조건하에 1시간 동안 농축을 실시, 농축파우더를 얻었고, 이와 같이 수득된 것을 "시료 3"이라 하고, 일부 시험예에서 사용하였다.

실시예 4 : 레몬버베나로부터 루테오닌 -7- 디글루쿠로니의 수득

레몬버베나를 20% 에탄올 수용액에 10% 중량으로 가하여 냉각콘덴서가 달린 환류추출기에서 온도 80℃ 조건하에 2시간 동안 추출한 후, 80 mesh 필터와 1.2㎛ 필터로 여과하여 추출 여액을 얻었다. 수득된 추출여액을 진공농축기를 이용하여 65℃, 20hPa 조건하에 1시간 동안 농축하여, 수득된 농축파우더에 10배 중량의 증류수를 투입하여 고르게 분산한 뒤 분획여두를 사용하여 증류수와 같은 부피의 헥산, 에틸아세테이트, n-부탄올을 차례로 분획하여 최종적으로 n-부탄올층을 얻었다. 수득된 n-부탄올 분획여액을 진공농축기를 이용하여 65℃, 20hPa 조건하에 1시간 동안 농축하여, 수득된 농축파우더를 10 배 중량의 증류수에 다시 분산시켜 다이아이온 HP-20 컬럼에 충진하고, 증류수와 99.5% 에탄올을 사용한 기울기 용법으로 크로마토그래피를 수행하였다. 유속 20㎖/min 조건하에 최종적으로 10%~20% 에탄올 컬럼액을 받아 초고압장치(TFS-2L, TOYO KOATSU CO., LTD., 일본)를 이용하여 100MPa, 25℃ 조건하에 1시간 동안 초고압 재결정화 처리하였다. 이를 원심분리기(Supra 22K, Hanil, 한국)를 이용하여 8,000rpm, 15℃ 조건으로 15분간 원심분리 하고, 1.2㎛ 필터로 여과를 수행, 최종적으로 드라이오븐에서 60℃ 조건하에 1시간 동안 건조하여 파우더를 수득하였고, 이와 같이 수득된 것을 "시료 4"라 하고, 일부 시험예에서 사용하였다.

실시예 5 : 레몬버베나로부터 루테오닌 -7- 디글루쿠로니의 수득

레몬버베나를 20% 에탄올 수용액에 10% 중량으로 가하여 냉각콘덴서가 달린 환류추출기에서 온도 80℃ 조건하에 2시간 동안 추출한 후, 80 mesh 필터와 1.2㎛ 필터로 여과하여 추출 여액을 얻었다. 수득된 추출여액을 진공농축기를 이용하여 65℃, 20hPa 조건하에 1시간 동안 농축하여, 수득된 농축파우더에 10배 중량의 증류수를 투입하여 고르게 분산한 뒤 분획여두를 사용하여 증류수와 같은 부피의 헥산, 에틸아세테이트, n-부탄올을 차례로 분획하여 최종적으로 n-부탄올층을 얻었다. 수득된 n-부탄올 분획여액을 진공농축기를 이용하여 65℃, 20hPa 조건하에 1시간 동안 농축하여, 수득된 농축파우더를 10 배 중량의 증류수에 다시 분산시켜 다이아이온 HP-20 컬럼에 충진하고, 증류수와 99.5% 에탄올을 사용한 기울기 용법으로 크로마토그래피를 수행하였다. 유속 20㎖/min 조건하에 최종적으로 10%~20% 에탄올 컬럼액을 받아 초저온장치(DF-9010, Ilshin, 한국)를 이용하여 -90℃조건하에서 2시간 동안 초저온 재결정화 처리하였다. 이를 원심분리기를 이용하여 8,000rpm, 15℃ 조건으로 15분간 원심분리 하고, 1.2㎛ 필터로 여과를 수행, 최종적으로 드라이오븐에서 60℃ 조건하에 1시간 동안 건조하여 파우더를 수득하였고, 이와 같이 수득된 것을 "시료 5"라 하고, 일부 시험예에서 사용하였다.

시험예 1: HPLC 를 이용한 루테오닌 -7- 디글루쿠로니의 함량분석

본 발명의 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 함유하는 레몬버베나 추출물의 제조방법 단계별에 따른 루테오닌-7-디글루쿠로니드의 함량변화를 확인하기 위하여, 실시예 별 시료의 HPLC를 이용한 함량분석을 하기와 같이 수행하였다.

상기 실시예를 통해 제조된 제조방법 단계별 시료의 루테오닌-7-디글루쿠로니드의 정성, 정량분석을 위하여 고속액체 크로마토그래피(High pressure liquid chromatography; HPLC)를 이용해 분석을 수행하였다. 시료는 각 용매로 적당 농도를 제조하여 0.2㎛ 필터에 여과, 전처리 후 기기에 주입하였다. 기기는 HPLC(Agilent 1200series system, Agilent, 미국)를 사용하여 UV 탐지기를 이용, UV 전 영역에서 분석하였으며, C₁₈컬럼(Zorbax XDB-C₁₈ 4.6 x 250mm, Agilent, 미국)을 사용하여 2% 아세트산을 함유하는 물과 아세토니트릴(acetonitrille)을 용매로 사용한 기울기 용법으로 분석하였다. 분석에 사용된 용매는 모두 HPLC급 시약을 사용하였으며, 표준곡선을 구한 후 정량분석을 수행하였다. 결과적으로, 레몬버베나로부터 추출, 농축, 분획, 컬럼, 재결정 단계를 거칠수록 루테오닌-7-디글루쿠로니드의 함량이 상승함을 확인할 수 있었으며, 초저온 및 초고압 재결정단계를 통해 99%가 넘는 고함량의 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 함유하는 레몬버베나 추출물을 제조할 수 있음을 확인하였다.

HPLC를 이용한 함량분석

제조방법 단계	시료명	루테오닌-7-디글루쿠로니드 함량(%)
추출, 농축	시료1	3.1
추출, 농축, 분획	시료2	15.8
추출, 농축, 분획, 컬럼	시료3	48.6
추출, 농축, 분획, 컬럼, 초고압재결정	시료4	99.8
추출, 농축, 분획, 컬럼, 초저온재결정	시료5	99.6

시험예 2: 항산화 효과 측정

본 발명의 실시예(시료 5)에서 수득한 고함량의 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 함유하는 레몬버베나 추출물에 대한 피부 노화개선 효과 검정시험으로 항산화 효과를 확인하기 위하여 자유라디칼소거시험과 활성산소소거시험을 실시하였다.

자유라디칼 소거시험은 안정한 DPPH의 흡광도가 540nm에서 최대 흡광도를 나타는 것을 이용하고, 자유라디칼인 DPPH가 시료에 의해 소거되어 보라색에서 투명한 색이 될수록, 자유라디칼 소거율이 증가될수록 상기 540nm파장에서 흡광도가 줄어들게 됨을 응용하여 검정시험방법에 의해 진행하였다.

0.1mM DPPH(2,2-diphenyl-1-picryl-hydrazyl radical, Sigma)용액 1㎖에 상기의 실시예 5에서 수득한 고함량의 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 함유하는 레몬버베나 추출물을 메탄올에 적당한 농도로 희석하여 1㎖를 혼합하고, 37℃에서 15분간 방치한 후, 마이크로플레이트 리더(microplate reader, UVT-06685, Thermo max, 미국)를 이용하여 540nm파장에서 흡광도를 측정하였다.

상기 자유라디칼 소거시험에서 대조군은 DPPH 1㎖과 메탄올 1㎖를 넣어 같은 방법으로 측정하였으며(표 2), 메탄올 1㎖과 시료 1㎖를 넣어 시료와 대조군에 대한 각각의 색 보정값을 얻었다. SC₅₀은 자유라디칼을 50% 소거하기 위해 소요되는 시료의 농도이며, 값이 작을수록 항산화활성이 높음을 나타낸다.

활성산소 소거시험은 잔틴/잔틴옥시데이즈(xanthine/xanthine oxidase, Sigma)의 효소반응에 의한 활성산소 발생을 이용하여 활성산소에 의한 니트로블루 테트라졸리움(nitroblue tetrazolium, NBT)의 산화를 이용한 흡광도 변화를 측정함으로써 활성 산소의 소거능을 알 수 있다.

탄산나트륨(Na₂CO₃) 2.4㎖, 잔틴(xanthine, Sigma) 0.1㎖, 에틸렌디아민테트라아세트산(ethylenediamine tetraacetic acid, EDTA) 0.1㎖, 소혈청알부민(bovine serum albumin, BSA, Sigma) 0.1㎖, NBT 0.1㎖ 및 시료 0.1㎖을 넣고 볼텍서 믹서(vortex mixer, Type 37600 Mixer, Mini mix, 미국)를 이용하여 voltexing 후 25℃에서 10분간 방치한 후, 잔틴산화효소(xanthine oxidase) 0.1㎖을 넣고 25℃에서 20분간 반응시킨 후, 6mM CuCl₂를 넣어 반응을 정지, 마이크로플레이트 리더를 이용하여 540㎚파장에서 흡광도를 측정하였다(표 2).

상기 활성산소소거활성시험에서의 대조군은 시료용액 대신 3차 증류수를 넣어 같은 방법으로 측정하였으며, 잔틴산화효소 용액 대신 3차 증류수를 넣어 추출 시료와 대조군에 대한 각각의 색 보정값을 얻는 것으로 설정하였다.

결과적으로, 수득한 고함량의 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 함유하는 레몬버베나 추출물은 강력한 합성 항산화제인 아스코르브산(L-ascorbic acid)과 거의 유사한 항산화 능력을 나타내었으며, 자유라디칼 소거율 50%의 농도는 4㎍/㎖, 활성산소소거율 50%농도는 6㎍/㎖으로 미량의 농도에서 항산화 효능이 매우 우수함을 확인할 수 있었다.

[수학식 1]

자유라디칼 소거율(%)= 100-((시료의 흡광도/대조군의 흡광도)x100)

[수학식 2]

활성산소 소거율(%)= 100-((시료의 흡광도/대조군의 흡광도)x100)

고함량의 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 함유하는 레몬버베나 추출물의 항산화효과

시료명	항산화 효과
시료명	자유라디칼소거율 SC₅₀(ug/㎖)	활성산소소거율 IC₅₀(ug/㎖)
시료5	4	6
아스코르브산 (L-Ascorbic acid)	5	7

시험예 3: 타이로시네이즈 활성저해 시험

본 발명의 실시예(시료 5)에서 수득한 고함량의 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 함유하는 레몬버베나 추출물의 미백효과를 검정하기 위해 타이로시네이즈(tyrosinase)라는 효소의 기능이 억제되는 정도를 평가하였다. 타이로시네이즈는 생체내에서 타이로신(tyrosine)이라는 물질의 산화과정을 촉진하여 멜라닌이 생성되게 도와주는 효소이다. 멜라닌이란 흑색의 고분자로서 생체내에서 상기와 같은 산화에 의해 멜라닌이 형성되어 피부 상층부로 이동하게 되면 피부가 검게 변하고 기미, 주근깨를 생성하게 된다. 이러한 타이로시네이즈의 작용을 억제하는 정도를 측정하여 미백효과를 검정하는 방법(Pomerantz S. H., J. Biochem., 24:161-168, 1966)을 응용해 실시하였다.

시료 0.9㎖, 0.1M 인산완충액(pH 6.8) 1.0㎖ 및 1.5mM L-타이로신 용액 1.0㎖을 넣은 후, 37℃에서 10분간 유지시켰다. 머쉬룸타이로시네이즈(1,500 units/㎖) 0.1㎖을 첨가하여 37℃에서 10분간 반응시킨 후, UV-비스스펙트로포토미터(Smartspec Plus, Biorad, 미국)를 사용하여 475nm에서 흡광도를 측정하여 타이로시네이즈에 대한 저해율을 측정하였다(표 3).

상기 타이로시네이즈 활성저해시험을 위한 대조군은 시료액 대신 완충용액을 넣어 같은 방법으로 측정하였으며, 타이로시네이즈 대신 완충용액을 넣어 시료와 대조군에 대한 각각의 색 보정값을 얻은 경우로 설정하였고, 시료는 실시예 5(시료 5)에서 수득한 고함량의 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 함유하는 레몬버베나 추출물과 미백효과가 뛰어나다고 알려진 알부틴(arbutin synthetic, Sigma)을 비교군으로 설정하였고, 하기 수학식 3을 이용하여 타이로시네이즈 저해율을 수치로 계산하였다. IC₅₀은 타이로시네이즈 활성을 50% 저해하는데 소요되는 시료의 농도이며, 값이 작을수록 저해율이 높음을 나타낸다.

결과적으로, 수득한 고함량의 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 함유하는 레몬버베나 추출물은 미백효과가 뛰어나다고 알려진 알부틴(arbutin)과 거의 유사한 미백효과를 나타내었으며, 타이로시네이즈 활성저해율 50%의 농도는 0.028㎎/㎖으로 미량의 농도에서 미백 효과가 우수함을 확인할 수 있었다.

[수학식 3]

타이로시네이즈저해율(%)=100-((시료의 흡광도/대조군의 흡광도)x100)

고함량의 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 함유하는 레몬버베나 추출물의 타이로시네이즈 활성저해율

시료	타이로시네이즈 활성저해율, IC₅₀(㎎/㎖)
시료 5	0.028
알부틴	0.032

시험예 4: B16F1 멜라노싸이트를 이용한 멜라닌 생성 억제효과 측정 실험

본 발명의 실시예 5(시료 5)에서 수득한 고함량의 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 함유하는 레몬버베나 추출물의 미백효과를 검정하기 위해 하기와 같이 B16F1 멜라노싸이트에 대한 멜라닌 생성 억제 정도를 측정하였다.

사용된 B16F1 멜라노싸이트는 마우스에서 유래한 세포균주이며, 멜라닌이라는 흑색색소를 분비하는 세포이다. 이 세포에 시료를 처리하여 멜라닌 흑색색소가 감소하는 정도를 비교 평가하였다. 본 시험예에 사용된 B16F1 멜라노싸이트는 ATCC (American Type Culture Collection, 기탁번호 : 6323)로부터 분양받아 사용하였다.

B16F1 멜라노싸이트의 멜라닌 생합성 억제효과 측정은 다음과 같이 행하였다. B16F1 멜라노싸이트를 6-웰 플레이트에 각 웰당 2x10⁶ 농도로 분주하고 세포를 부착시킨 후 독성을 유발하지 않는 농도로 시료를 처리하여 72시간 동안 배양하였다. 72시간 배양 후 세포를 trypsin-EDTA로 떼어낸 후 세포수를 측정한 다음 원심분리하여 세포를 회수하고, 세포내 멜라닌의 정량은 로탄 (Lotan : Cancer Res ., 40: 3345-3350, 1980)의 방법을 약간 변형하여 실시하였다. 셀 펠릿을 PBS로 1회 세척한 후 균질화 버퍼액(50mM 소듐 포스페이트, pH 6.8, 1% Triton X-100, 2mM PMSF) 1㎖를 첨가하여 5분간 와류하여 세포를 파쇄하였다. 원심분리(3,000rpm, 10분)하여 얻은 세포 여액에 10%DMSO 수산화나트륨(1N NaOH)을 첨가하여 추출된 멜라닌을 용해한 후 마이크로 플레이트 리더로 405nm에서 멜라닌의 흡광도를 측정한 다음 멜라닌을 정량하여 시료의 멜라닌 생성 저해율(%)을 측정하였다. B16F1 멜라노싸이트의 멜라닌 생성 저해율(%)은 수학식 6에 의하여 계산하였으며, IC₅₀값은 멜라닌 생성을 50% 저해하는 물질의 농도이다.

B16F1 멜라노싸이트의 멜라닌 생성 억제효과를 시험한 결과 실시예 5(시료 5)의 IC₅₀은 0.12%로 기존의 미백제인 알부틴, 유용성 감초 추출물 등에 비해 유사하거나 우수한 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

[수학식 4]

저해율(%) = [(A-B)/A]x 100

A : 시료를 첨가하지 않은 웰의 멜라닌 양

B : 시료를 첨가한 웰의 멜라닌 양

고함량의 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 함유하는 레몬버베나 추출물의 멜라닌 생성 억제효과

시료명	처리농도(%)	멜라닌 생성 저해효과(IC₅₀)
시료 5	0.1	0.12%
알부틴	0.1	0.21%
유용성 감초 추출물	0.1	0.09%

시험예 5: 엘라스테이즈 활성저해시험

본 발명의 실시예 5(시료 5)에서 수득한 고함량의 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 함유하는 레몬버베나 추출물의 피부주름 억제 및 개선 효과를 검정하기 위하여 엘라스테이즈 활성저해시험(elastase inhibition activity test)을 실시하였다. 엘라스틴은 피부 진피 내 매트릭스 층을 구성하는 성분으로 피부가 노화됨에 따라 엘라스틴이 분해되고 진피 내 매트릭스 층이 무너지며 주름이 생기게 된다. 이러한 원리를 이용하여 엘라스틴(elastin)을 분해하는 효소인 엘라스테이즈의 활성을 측정하는 방법으로 엘라스테이즈 기질인 N-석시닐-(Ala)3 p-니트로아닐린(N-succinyl-(Ala)3 p-nitroaniline, Sigma)을 이용하여 p-니트로아닐린이 분해되면서 생기는 색의 변화를 405㎚의 파장에서 흡광도를 측정함으로써 엘라스테이즈 활성을 측정하는 방법을 이용하였다.

엘라스테이즈 활성도를 측정하기 위한 대조군은 시료 대신 3차 증류수를 넣어 같은 방법으로 측정하였으며, 효소액 대신 3차 증류수를 넣어 각각에 대한 색 보정값을 얻은 경우를 설정하였으며, 시료는 실시예 5(시료 5)에서 수득한 고함량의 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 포함하는 레몬버베나 추출물과 기존 주름개선효과가 뛰어나다고 알려진 레티놀(retinol, >99%, Sigma, 미국)을 양성대조군으로 비교하여 실험하였고, 하기 수학식 5를 이용하여 엘라스테이즈 저해율을 수치로 계산하였다. IC₅₀은 엘라스테이즈 활성을 50% 저해하기 위해 소요되는 시료의 농도이며, 값이 작을수록 저해율이 높음을 나타낸다.

결과적으로, 수득한 고함량의 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 함유하는 레몬버베나 추출물의 엘라스테이즈 활성저해율 50%의 농도는 0.28㎎/㎖로 주름개선효과가 뛰어나다고 알려진 레티놀 0.38㎎/㎖ 보다 엘라스타아제 억제효과가 높아, 고함량의 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 포함하는 레몬버베나 추출물의 우수한 주름개선효과를 확인할 수 있었다.

[수학식 5]

엘라스테이즈활성저해율(%)=100-((시료의흡광도)/대조군의 흡광도)x100)

고함량의 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 함유하는 레몬버베나 추출물의 엘라스테이즈 활성저해율

시료명	엘라스테이즈 활성저해율, IC₅₀(㎎/㎖)
시료 5	0.28
레티놀	0.38

시험예 6: 콜라겐 합성 효과 시험

본 발명의 실시예 5(시료 5)에서 수득한 고함량의 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 함유하는 레몬버베나 추출물의 피부 주름개선 효과를 검정하기 위하여 콜라겐 합성능을 측정하였다. 콜라겐은 상기 엘라스틴과 함께 피부 내 진피 매트릭스 층을 이루는 구성성분으로서 피부가 서서히 노화 되어가며 진피 내 매트릭스 층을 이루고 있는 구성성분들이 분해되어 감으로 주름이 생성되는데, 진피 매트릭스 층의 구성성분인 콜라겐의 합성효과를 확인함으로써 피부 주름을 개선하는 효과를 확인할 수 있다.

사람의 정상 섬유아세포(human dermal fibroblast)를 24-웰 마이크로플레이트에 접종시키고(1x10⁵ 세포/웰) 37℃, 5% 농도의 CO₂ 배양기에서 24시간 배양하였다. 각 시료들을 농도별로 첨가한 혈청이 함유되지 않은 DMEM배지에서 24시간 동안 배양하였고, 콜라겐 합성량은 효소면역측정법을 이용하여 수행하였다.

24시간 배양한 배지를 96-웰 마이크로플레이트에 분주하여 4℃에서 하룻밤 동안 코팅하였다. 세척 버퍼(PBS-T; 0.05% Tween 20 in phosphate buffered saline)로 3회 세척하고 블로킹 용액(5% skin milk, Fluka)을 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 블로킹하였다. 블로킹 용액을 버리고 세척 버퍼로 3회 세척하고, 일차항체(rabbit anti-collagen type I, Sigma)를 PBS-T에 희석하여 100㎕씩 가하여 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 세척 버퍼로 3회 세척한 다음, 이차 항체(anti-rabbit IgG alkaline phosphatase conjugate, Sigma)를 PBS-T에 희석하여 100㎕씩 첨가하여 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 세척 버퍼로 3회 세척 후, 기질용액(alkaline phosphatase substrate solution, Sigma)을 100㎕씩 넣고 항온 25℃ 에서 발색시킨 후, 마이크로플레이트 리더를 사용하여 405㎚에서 흡광도를 측정하였다(표 6).

상기 콜라겐 합성효과를 측정하기 위한 대조군은 시료를 처리하지 않은 세포 배양액의 반응 흡광도이며, 콜라겐 합성효과를 판단하기 위해 아스코르빈산을 비교군으로 설정하여 각각 3회씩 실시, 평균값을 구하였다. 하기 수학식 4를 이용하여 콜라겐 합성효과를 수치로 분석하였다. 그 결과, 실시예 5에서 수득한 고함량의 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 함유하는 레몬버베나 추출물은 콜라겐 합성효과가 우수한 아스코르빈산(vitamin-C)와 유사한 뛰어난 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

[수학식 6]

콜라겐 합성효과(%) = 100+((대조군의 흡광도-시료의 세포배양액 흡광도)/대조군의 흡광도)x100

고함량의 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 함유하는 레몬버베나 추출물의 콜라겐 합성 효과

시료의 농도(㎍/㎖)	0	1	10	100
시료 5	100.00	112.24	126.48	137.66
아스코르빈산(vitamin-C)	100.00	108.45	123.57	131.58

시험예 7: 자외선 조사 후 MMP -1 발현억제 평가

본 발명의 실시예 5(시료 5)에서 수득한 고함량의 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 함유하는 레몬버베나 추출물의 UV 조사 및 시료 첨가 후 MMP-1 농도를 측정하기 위해서 효소면역분석법(ELISA)를 실시하였다.

UV 챔버를 이용하여 인간 진피 섬유아세포에 UVA를 5J/㎝²의 에너지로 조사한다. 자외선 조사량과 배양시간은 예비 실험을 통하여 섬유아세포에서 MMP 발현량이 최대가 되는 조건을 확립하였으며, 음성 대조군은 은박지로 싸서 UVA의 환경에 같은 시간 유지하였다. UVA 방출량은 UV 라디오 미터를 이용하여 측정하였다. UVA가 조사되는 동안의 세포는 이전에 분주된 배지 그대로이고 UVA를 조사한 후 샘플이 들어간 배지로 교환하여 24시간 배양 후 배지를 회수하여 96-웰 마이크로플레이트에 코팅하였다. 일차항체(MMP-1(Ab-5) 단일클론항체, MMP-2(Ab-3) 단일클론항체)를 처리하고 37℃에서 60분 동안 반응시켰고, 이차항체인 안티마우스 IgG(whole mouse, alkaline phosphatase conjugated)를 다시 60분 정도 반응시킨 후, 알카린 포스파타제 기질 용액(1㎎/㎖-nitrophenyl phosphate in diethanolamine 완충용액)을 상온에서 30분간 반응시키고 마이크로플레이트 리더로 405㎚에서 흡광도를 측정하였다. 대조군으로는 시료를 첨가하지 않은 것을 사용하였다.

자외선 조사시에 발현이 유도되는 MMP-1에 대하여 시료를 처리하지 않은 대조군에 비하여 실시예 5(시료 5)는 65% 이상의 억제율을 보였으며 이는 대조군으로 사용한 레티놀의 억제율보다 우수하였다.

고함량의 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 함유하는 레몬버베나 추출물의 MMP-1 발현억제율

	처리농도(%)	MMP-1 발현억제율(%)
시료 5	0.1	65
레티놀	0.1	28

시험예 8: 자외선조사에 의한 세포독성 완화 효과

본 발명의 실시예 5(시료 5)에서 수득한 고함량의 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 포함하는 레몬버베나 추출물의 자외선 조사에 의한 세포독성의 완화 효과를 평가하기 위하여 하기와 같이 실험을 실시하였다.

섬유아세포(fibroblast)를 24-웰 시험 플레이트에 1x10⁵개씩 넣고 24시간 동안 부착시켰다. 각 웰을 PBS로 1회 세척하고 각 웰에 500㎕의 PBS를 넣었다. 이 섬유아세포에 자외선 B(UVB) 램프(Model : F15T8, UV B 15W, Sankyo Dennki, 일본)를 이용하여 자외선 10mJ/㎠를 조사한 후 PBS를 덜어내고 세포배양 배지(DMEM에 10 % FBS가 첨가된 것) 1㎖을 첨가하였고, 여기에 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 함유하는 레몬버베나 추출물을 처리한 후 24시간 동안 배양하였다. 24시간이 지나면 배지를 제거하고, 각 웰 당 세포배양 배지 500㎕ 배지와 MTT 용액(2.5㎎/㎖) 60㎕를 넣은 후 2시간 동안 37℃ CO₂ 배양기에서 배양하였다. 배지를 제거하고 이소프로판올-HCl(0.04N)을 500㎕씩 넣어주었다. 5분간 진탕하여 세포를 용해시키고 상등액 100㎕씩을 96-웰 시험 플레이트에 옮긴 후, 마이크로플레이트 리더로 565㎚에서 흡광도를 측정하였고, 세포생존율(%) 및 자외선에 의한 세포독성 완화율을 측정하였다. 그 결과, 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 포함하는 레몬버베나 추출물은 0.1% 농도에서 45%의 세포독성 완화율을 보여 자외선에 의한 세포독성을 효과적으로 방어함을 알 수 있었다.

[수학식 7]

세포생존율(%) =〔(St-Bo)/(Bt-Bo)〕X 100

Bo : 세포배양배지 만을 발색 반응한 웰의 565 nm 흡광도

Bt : 시료를 처리하지 않은 웰을 발색 반응한 웰의 565 nm 흡광도

St : 시료를 처리한 웰을 발색 반응한 웰의 565 nm 흡광도

[수학식 8]

자외선에 의한 세포독성 완화율(%) =〔1-(St-Bo)/(Bt-Bo)〕X 100

Bo : 자외선 조사하지 않고 시료 처리하지 않은 웰의 세포 생존율

Bt : 자외선 조사하고 시료를 처리하지 않은 웰의 세포생존율

St : 자외선 조사하고 시료를 처리한 웰의 세포생존율

고함량의 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 함유하는 레몬버베나 추출물의 세포독성 완화율

시료명	처리농도(%)	세포독성 완화율(%)
시료 5	0.1	45

시험예 9: 자외선 조사에 의한 염증성 사이토카인 발현 억제효과

본 발명의 실시예 5(시료 5)에서 수득한 고함량의 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 함유하는 레몬버베나 추출물의 자외선 조사에 의해 발현되는 염증성 사이토카인 발현 억제효과를 평가하기 위하여, 사람의 표피조직에서 분리한 섬유아세포(fibroblast)를 24-웰 시험 플레이트에 5x10⁴개씩 넣고 24시간 동안 부착시켰다. 각 웰을 PBS로 1회 세척하고 각 웰에 500㎕의 PBS를 넣었다. 이 섬유아세포에 자외선B(UVB) 램프(Model: F15T8, UV B 15W, Sankyo Dennki, 일본)를 이용하여 자외선 10mJ//㎝²를 조사한 후 PBS를 덜어내고 세포배양 배지(DMEM에 FBS가 첨가되지 않은 배지) 350㎕를 첨가하였다. 여기에 평가하고자 하는 고함량의 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 포함하는 레몬버베나 추출물을 처리한 후 5시간 동안 배양하였다. 배양 상층액을 150㎕ 취하여 IL-1α를 정량함으로서 실시예 시료의 염증성 사이토카인 발현억제효과를 판단하였다. IL-1α의 양은 효소면역분석법 (Enzyme-linked Immunosorbent Assay)를 이용하여 정량화하였으며, IL-1α의 생성율은 수학식 9에 의해 계산하였다. 실험결과 실시예 5(시료 5)는 자외선에 의한 염증성 사이토카인인 IL-1α의 생성을 0.1% 농도에서 52%로 억제하여, 자외선에 의한 염증 발생을 낮은 농도에서 효과적으로 방어함을 알 수 있었다.

[수학식 9]

염증성 사이토카인 발현 억제율(%) =〔1-(St-Bo)/(Bt-Bo)〕X 100

Bo : 자외선 조사하지 않고 시료 처리하지 않은 웰의 IL-1α생성량

Bt : 자외선 조사하고 시료를 처리하지 않은 웰의 IL-1α생성량

St : 자외선 조사하고 시료를 처리한 웰의 IL-1α생성량

고함량의 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 함유하는 레몬버베나 추출물의 염증성 사이토카인 발현 억제율

시료처리농도(%)	염증성 사이토카인 발현 억제율(%)
0.05	33
0.1	52

시험예 10: 항균 효과

본 발명의 실시예 5(시료 5)에서 수득한 고함량의 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 포함하는 레몬버베나 추출물에 대한 항균력 효과 검정시험으로 고체 배양 희석법(agar serial dilution method)과 원형여과지법(paper disc method)에 의하여 항균시험을 실시하였다. 실험균주는 한국생명공학연구원으로부터 분양받았으며, 그람양성균으로 포도상구균(Staphylococcus aureus KCTC 6910), 그람음성균으로 녹농균(Pseudomonas aeruginosa KCTC 1637), 대장균(E. coli KCTC 1039), 효모로는 캔디다 효모(Candida albicans KCTC 7965), 사상균으로 흑국균(Aspergillus niger KCTC 6910) 이상 총 4종의 균주를 사용하였다.

상기 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 포함하는 레몬버베나 추출물의 항균력을 측정하기 위해 고체 배양 희석법을 이용하여 최소 저해 농도를 측정하였다(표10).

트립틱소이 배지에 균을 접종하여 37℃에서 24시간 전배양하여 준비하고, 효모의 경우, 포테이토덱스트로스 배지에 균을 접종하여 25℃에서 2일간 전배양하였으며, 사상균은 포테이토 덱스트로스 한천배지에 균을 접종하여 25℃ 배양기에서 7일간 전배양한 후, 도말봉을 이용하여, 배지 표면에 형성된 사상균의 포자를 회수하여 멸균된 식염수에 희석하여 사용하였다.

*멸균된 패트리 디쉬에 시료 및 실험균종 별로 5% 다이메틸설폭시화물(DMSO) 생리식염수용액에 적절한 농도로 희석한 각각의 추출물을 2㎖씩 넣고, 대조군은 5% 생리식염수 용액에 적절한 농도로 희석한 각 시료 2㎖씩 넣고, 대조군은 5% DMSO 생리식염수용액 2㎖을 넣은 후, 각 패트리 디쉬에 멸균하고 48℃로 냉각한 트립틱소이 한천배지 및 포테이토덱스트로스 한천배지를 18㎖씩 첨가하여 교반 후 정치하여 응고시킨다.

이후 전배양시킨 각각의 시험균을 세균의 경우 최종농도 약 1 X 10⁶ CFU/㎖ 의 균농도로 각각의 페트리디쉬에 도말하고, 효모의 경우 1 X 10⁵ CFU/㎖, 사상균의 경우 약 1 X 10⁴ CFU/㎖의 균농도로 각각의 페트리디쉬에 도말한다. 각각의 페트리 디쉬는 세균은 37℃에서 24시간 배양하고 효모는 25℃에서 3일간 배양, 사상균은 25℃배양기에서 7일간 배양한 후 각 구획 안에 Colony 형성여부를 관찰하여 성장이 되지 않은 평판의 최소 시료 농도를 최소저해농도(MIC, minimum inhibitory concentration)로 하며, 최소저해농도는 값이 작을수록 항균효과가 높음을 의미한다. 그 결과, 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 함유하는 레몬버베나 추출물은 4종의 세균, 효모, 사상균에 대하여 모두 우수한 항균력 효과를 나타내었다.

또한, 실시예 5(시료 5)에서 수득한 고함량의 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 함유하는 레몬버베나 추출물의 항균력 효과를 검정하기 위해 원형여과지법에 의하여 다음과 같이 실시하였다. 평판 배지에 배양된 각 균주를 1 백금이량 취해서 액체 배지 10㎖에서 24시간 배양하여 활성화시킨 후 다시 액체 배지 10㎖에 균액을 0.1㎖ 접종하여 6시간 배양한 후 평판배지 1개당 균액을 약 10⁷ cfu/㎖이 되게 접종하여 멸균된 도발봉으로 균일하게 도말하였다. 그 후 멸균된 paper disc(6mm, Satorius, 독일)를 고체 평판 배지에 올려놓은 다음 용매에 녹인 시료를 0.05㎖/disk가 되도록 흡수시켜 배양하였다. 포도상구균(Staphylococcus aureus), 그람음성균으로 녹농균(Pseudomonas aeruginosa ),대장균(E. coli)는 37℃, 진균 종류인 캔디다 효모(Candida albicans), 사상균으로 흑국균(Aspergillus niger)는 27℃에 각 각 24시간, 120시간 배양하여 disc 주위 투명존의 직경을 측정하였다. 비교군으로 항균활성이 강력한 합성 방부제인 메칠파라벤(methyl paraben)을 사용하였으며, disc주위의 투명존은 해당 균주에 대해 증식억제 정도의 지표이며, 직경이 클수록 해당 균주에 대해 항균력 효과가 높음을 의미한다. 그 결과, 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 함유하는 레몬버베나 추출물은 강력한 합성 방부제로 알려진 메칠파라벤보다 4종의 세균, 효모, 사상균에 대해 우수한 항균활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

고함량의 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 함유하는 레몬버베나 추출물의 항균효과

균주	추출방법	최소저해농도(MIC, ㎍/㎖)
S. aureus	시료 5	130
P. aeruginosa	시료 5	10
E. Coli	시료 5	60
C. albicans	시료 5	80
A. niger	시료 5	120

균주	추출방법	투명존 직경(mm)
S. aureus	시료 5	10
S. aureus	메칠파라벤	11
P. aeruginosa	시료 5	17
P. aeruginosa	메칠파라벤	12
E. coli	시료 5	20
E. coli	메칠파라벤	18
C. albicans	시료 5	20
C. albicans	메칠파라벤	13
A. niger	시료 5	27
A. niger	메칠파라벤	24

시험예 10: 자외선 차단 효과

본 발명의 실시예 5(시료 5)에서 수득한 고함량의 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 함유하는 레몬버베나 추출물에 대한 자외선 차단 효과 검정시험으로 in vitro SPF 분석기 (Optometrics SPF-290S)를 이용하여 자외선 차단효과를 측정하였다. 양성 대조군으로는 현재 자외선 차단 화장품에 가장 많이 사용되는 유기 자외선차단제인 옥틸메톡시신나메이트(Octyl methoxycinnamate; OMC)를 사용하여 비교 평가하기 위해. 표 12와 같은 방법으로 실시하였다(도 4). 그 결과, 고함량의 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 포함하는 레몬버베나 추출물은 강력한 합성 유기 자외선차단제인 OMC보다 우수한 자외선 차단능(SPF, PA value)을 확인할 수 있었다.

레몬버베나로부터 고함량의 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 함유하는 레몬버베나 추출물의 In vitro SPF 측정방법

시스템	SPF-290S 분석기(Optomerics, 미국)
기질	Transpore tape(3M, 미국)
측정기준	US FDA
파장범위	290~400nm
샘플 로딩	2㎎/㎠
스캔 수	6 번, Legacy

제형예 1및 제형 비교예 1: 고함량의 루테오닌 -7- 디글루쿠로니드를 함유하는 레몬버베나 추출물을 포함한 영양크림의 성분구성

상기 실시예 5(시료5)에 따른 고함량의 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 함유하는 레몬버베나 추출물을 포함하는 영양크림의 성분구성을 하기 표 13과 같이 구성하여 제조하였다.

고함량의 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 함유하는 레몬버베나 추출물을 포함하는 영양크림의 성분

번호	성 분	제형 실시예 1	제형 비교예 1
1	친유형 모노스테아린산글리세린	2.0	2.0
2	스테아린산	1.5	1.5
3	세테아릴 알콜	2.2	2.2
4	밀납	1.0	1.0
5	스쿠알란	3.0	3.0
6	경화식물유	1.0	1.0
7	소르비탄 스테아레이트	0.6	0.6
8	광물유	5.0	5.0
9	폴리솔베이트 60	1.5	1.5
10	디메치콘	1.0	1.0
11	트리옥타노인	5.0	5.0
12	베타인	3.0	3.0
13	트리에탄올아민	1.0	1.0
14	글리세린	5.0	5.0
15	소듐히아루로네이트	3.0	3.0
16	시료 5	1.0	-
17	증류수	잔량	잔량
18	방부제, 향, 색소	미량	미량

상기 표 13의 조성으로 구성된 성분 중에서 먼저 원료 12 내지 15 및 17의 수성성분을 80℃로 가온하여 완전 용해시킨 다음, 원료 1 내지 11 및 16을 80℃로 가온하여 상기 원료 12 내지 15 및 17의 용액에 투입하고 호모믹서(Homo Mixer Mark Ⅱ, Primix, 일본)를 이용하여 3,000rpm에서 15분간 유화시켰다. 그 후, 원료 18를 투입하여 5분간 교반 시킨 후 실온으로 냉각하였다.

시험예 11: 제형 적용 미백효과 측정

상기 제형 실시예 1 및 제형 비교예 1에서 제조된 영양크림의 미백효과를 측정하기 위하여 다음과 같은 방법을 통하여 측정하였다. 기미, 주근깨 및 색소 침착증을 갖고 있는 25세 이상 여성 30명을 대상으로 상기 제형 실시예 1 및 제형 비교예 1의 영양크림을 12주간 사용하게 한 후 피부색의 변화를 크로머메터(CR-410, Minolta, 일본)를 이용하여 색의 밝기 변화 (ΔL)을 측정하였다(표 14). 총 30명의 평균값을 통하여 계산하였으며, 밝기 변화 값이 높을수록 미백효과가 높음을 의미한다. 그 결과, 수득한 고함량의 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 함유하는 레몬버베나 추출물이 첨가된 제형 실시예 1의 영양크림은 첨가되지 않은 제형 비교예 1의 영양크림과 비교하였을 때, 우수한 미백효과를 확인하였다.

제형의 미백효과 측정

	평균값
	제형 실시예1	제형 비교예1
피부색 밝기 변화(L)	5.89	0.22

시험예 12: 제형 적용 주름개선효과 측정

상기 제형예 1의 제형 실시예 1 및 제형 비교예 1에서 제조된 영양크림의 주름개선효과를 측정하기 위하여 다음과 같은 방법을 통하여 측정하였다. 피부노화가 진행중인 30대 이상 여성 10명을 대상으로 상기 제형 실시예 1 및 제형 비교예 1의 영양크림을 12주간 양쪽 눈가주름(crow feets)부위에 사용하게 한 후 4주, 8주, 12주 간격으로 눈가 주름 주형(replica)을 영상분석법으로 Skin visiometer(SV-600, C+K, 독일)를 이용하여 주름의 깊이(㎛)를 측정하였다. 그 결과, 고함량의 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 함유하는 레몬버베나 추출물이 첨가된 제형 실시예 1의 영양크림은 첨가되지 않은 제형 비교예1의 영양크림과 비교하였을 때, 우수한 주름개선효과를 확인하였다.

제형의 주름개선효과 측정

	평균값
	제형 실시예1	제형 비교예1
도포 전	331 ±10	326 ±12
도포 12주후	243 ±12	320 ±22
주름깊이 감소율(%)	26.5	1.8

시험예 13: 제형 적용 아토피 개선효과 측정

제형 실시예 1 및 제형 비교예 1에서 제조된 영양크림의 아토피 개선효과를 측정하기 위하여, 피부장벽 손상방법으로 아세톤을 도포하였다. 8~12주령의 무모 생쥐의 배부에 아세톤을 점적하여 경피수분손실량(TEWL; transepidermal water loss)이 4.0g/m²/h에 도달하면 상기 제형 실시예 1 및 제형 비교예 1의 영양크림을 도포하였다. TEWL은 C+K사(Cologne, 독일)의 증발계인 Tewameter 210으로 측정하였다. 도포 6시간 경과 후에 TEWL을 측정하여 TEWL이 감소되는 정도를 측정하여 TEWL이 감소되는 정도를 평가함으로써 피부장벽기능이 회복되는 정도를 측정하였다. 그 결과, 고함량의 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 함유하는 레몬버베나 추출물이 첨가된 제형 실시예 1의 영양크림은 첨가되지 않은 제형 비교예 1의 영양크림과 비교하였을 때, 피부장벽 손상 후 회복 효과가 상승하는 것을 확인하였다.

[수학식 10]

Br(Barrier Recovery)= (1-(B_t ₌₆- B_t ₌₀)/(B_t _=d - B_t ₌₀))*100

B_t ₌₆ : 피부장벽 손상후 6시간 경과후의 TEWL 측정값

B_t ₌₀ : 피부장벽 손상이전의 TEWL 측정값

B_t _=d : 피부장벽손상직후의 TEWL 측정값

아토피 개선효과 분석

회복율(%)	평균값
회복율(%)	제형 실시예1	제형 비교예1
6시간 경과 회복율 (초기TEWL기준)	48	12

제형예 2: 고함량의 루테오닌 -7- 디글루쿠로니을 함유하는 레몬버베나추출물을 포함한 화장용 조성물의 구성성분

2-1: 유연화장수

유연화장수의 구성성분

번호	성 분	함량(%)
1	글리세린	5.00
2	1,3-부틸렌 글라이콜	3.00
3	PEG 1500	1.00
4	알란토인	0.10
5	DL-판테놀	0.30
6	EDTA-2Na	0.02
7	벤조페논-9	0.04
8	에탄올	10.00
9	옥틱도데세스-16	0.20
10	폴리솔베이트 20	0.20
11	시료 5	5.0
12	방부제, 향, 색소	미량
13	증류수	잔량

2-2: 수렴화장수

수렴화장수의 구성성분

번호	성 분	함량(%)
1	글리세린	2.00
2	1,3-부틸렌 글라이콜	2.00
3	알란토인	0.10
4	DL-판테놀	0.30
5	EDTA-2Na	0.02
6	벤조페논-9	0.04
7	에탄올	15.00
8	폴리솔베이트 20	0.20
9	시료 5	1.0
10	구연산	미량
11	방부제, 향, 색소	미량
12	증류수	잔량

2-3: 영양화장수

영양화장수의 구성성분

번호	성 분	함량(%)
1	세테아릴 알콜	1.00
2	글리세릴스테아레이트	0.50
3	폴리소르베이트 60	1.00
4	소르비탄세스퀴올리에이트	0.30
5	세틸옥타노에이트	6.00
6	스쿠알란	4.00
7	샤플라워오일	4.00
8	부틸렌글라이콜	4.00
9	글리세린	4.00
10	카보머	0.10
11	트리에탄올아민	0.10
12	시료 5	1.00
13	방부제, 향, 색소	미량
14	증류수	잔량

2-4: 에센스

에센스의 구성성분

번호	성 분	함량(%)
1	글리세린	10.00
2	베타인	5.00
3	PEG 1500	2.00
4	알란토인	0.10
5	DL-판테놀	0.30
6	EDTA-2Na	0.02
7	벤조페논-9	0.04
8	히드록시에틸 셀룰로오스	0.10
9	카르복시비닐 폴리머	0.20
10	트리에탄올아민	0.18
11	옥틸도데칸올	0.30
12	옥틸도데세스-16	0.40
13	에탄올	6.00
14	시료 5	1.00
15	방부제, 향, 색소	미량
16	증류수	잔량

2-5: 팩

팩의 구성성분

번호	성 분	함량(%)
1	폴리비닐 알콜	15.00
2	셀룰로오스 검	0.15
3	글리세린	3.00
4	PEG 1500	2.00
5	시이크데스트린	0.15
6	DL-판테놀	0.30
7	알란토인	0.10
8	글리시리진산 모노암모늄	0.20
9	니코틴 아미드	0.40
10	에탄올	5.00
11	PEG 40 경화피마자유	0.30
12	시료 5	1.00
13	방부제, 향, 색소	미량
14	증류수	잔량

이상으로, 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

다음 단계를 포함하는 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 함유하는 레몬버베나 추출물의 제조방법:
(a) 레몬버베나에 용매를 가하여 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 추출한 다음, 농축하는 단계;
(b) 상기 (a)단계의 농축된 추출물에 물, 에탄올, 메탄올, 부탄올, 에틸아세테이트, 에틸에테르, 클로로포름 및 헥산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 2종 이상의 용매를 가하여 루테오닌-7-디글루쿠로니드 분획을 수득하는 단계;
(c) 상기 (b)단계의 유기용매를 제거하고 2차 농축하여 분획농축 파우더를 제조하는 단계;
(d) 상기 (c)단계의 분획농축파우더를 용매에 가용시킨 후, 컬럼을 이용하여 색소 및 클로로필을 제거하는 단계;
(e) 색소 및 클로로필이 제거된 추출액에 압력 및 온도를 조절하여 침전시켜 재결정화시키는 단계 및
(f) 상기 재결정화단계를 통해 침전된 펠렛을 분무건조 또는 동결 건조하여 파우더형태의 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 수득하는 단계.
제1항에 있어서, 상기 (a)단계의 용매는 물, 에탄올, 메탄올, 부탄올, 에틸아세테이트, 에틸에테르, 클로로포름 및 헥산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 용매인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 (b)단계에서 수득된 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 포함하는 분획은 부탄올 분획인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 (d)단계의 컬럼은 엠버라이트 XAD 레진, 다우엑스 레진, 수페라이트 DAX 레진, 다이아이온 HP-10, HP-20, HP-30, HP-40 및 HP-50 레진으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 레진을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 (f)단계의 조건은 -300~25℃ 및 0.5~800MPa의 조건에서 재결정화하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 5항 중 어느 한 항의 방법으로 제조되고, 항산화, 주름개선, 미백, 자외선에 의한 피부손상 억제 또는 자극완화, 항염, 항균 및 아토피 개선으로 구성된 군에서 선택되는 용도를 가지는 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 함유하는 레몬버베나 추출물.
제 6항의 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 함유하는 레몬버베나 추출물을 유효성분으로 포함하고, 노화방지용, 미백용 및 자외선에 의한 피부손상 억제 또는 자극완화용으로 구성된 군에서 선택되는 용도를 가지는 화장료 조성물.
제 7항에 있어서, 화장수, 젤, 수용성리퀴드, 크림, 에센스, 수중유(O/W)형 및 유중수(W/O)형으로 구성된 군에서 선택되는 제형인 것을 특징으로 하는 기능성 화장료 조성물.
제 6항의 루테오닌-7-디글루쿠로니드를 함유하는 레몬버베나 추출물을 유효성분으로 포함하고, 항염용, 항균용 및 아토피 개선용으로 구성된 군에서 선택되는 용도를 가지는 피부외용제 조성물.