JP6655189B2

JP6655189B2 - ブドウ種子抽出物、バレリアン抽出物及びベニバナ種子抽出物を含有する女性更年期症状予防及び改善用食品組成物

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Publication number: JP6655189B2
Application number: JP2018535896A
Authority: JP
Inventors: フンキム，ジ; ジンシム，テ
Original assignee: Frombio Co Ltd
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Priority date: 2016-01-12
Filing date: 2016-03-07
Publication date: 2020-02-26
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Description

本発明は、ブドウ種子抽出物、バレリアン抽出物及びベニバナ種子抽出物を含有する女性更年期症状の予防及び改善用の食品組成物に関する。

女性は年を取るにつれて卵巣の機能が低下し、それによってエストロゲンの分泌が大きく減少する。このため、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）及び黄体形成ホルモン（ＬＨ）に対する反応が減少し、プロゲステロンの生成も減少する。特に、５０代前後で、卵巣の機能が完全に止まる閉経が発生する確率が非常に増加するのであるが、閉経期に入りかけてから完全に閉経した以降の時期に、ホルモンのバランスが崩れることで身体に様々な症状が引き起こされる時期を、通常、更年期という。また、卵巣除去術、子宮摘出術などの理由で早期閉経となる場合にも更年期症状を感じることがある。

すなわち、女性の更年期とは、内分泌症候群の一種であり、卵巣機能の老化によって女性ホルモンであるエストロゲンが減少し、生理的機能及び性機能が減少又は消失する時期を意味する。かかる更年期の症状には、顔面紅潮、頻脈、発汗、又は頭痛といった血管性の変化による症状があり、筋肉痛、関節痛及び腰痛といった筋骨格系の変化による症状があり、頻尿又は尿失禁といった泌尿生殖器の変化による症状があり、また、記憶力減退、うつ症状、集中力減退及び目眩といった脳神経系の変化による症状がある。これに加え、視力減退と皮膚及び毛髪の変化といった症状が発生し、ホルモン変化による骨多孔症（骨そしょう症）や心血管系の疾患などの、女性の健康に致命的な疾患が発生することもある。

近年、文明の発達と科学の進歩により、現代人の寿命は延びる一方であり、女性の場合、２００２年における平均寿命は８０．４歳となっている。したがって、更年期症状が現れ始める４０代以降から３０〜４０余年間における女性の健康な暮らしに対する特別な関心が必要である。

更年期症状の最大の原因がエストロゲン不足とされており、エストロゲン代替療法が女性更年期症状改善のための治療法として主に用いられてきている。しかし、更年期症状を有する女性の３５〜４０％だけがエストロゲン代替療法を使用し、これらの女性さえもほとんどはこの方法を使用し続けるのを忌避している（Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．１９９９．１３０：５４５−５５３）。エストロゲン代替療法は、人為的なホルモン投与を基盤とするので、それ自体に対する拒否反応と、副作用を伴うからである。エストロゲン代替療法の副作用として、子宮出血、脳卒中、心臓発作、乳癌、子宮癌の発生の危険が高まり得ることに関する、多くの研究結果が報告されている（Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．１９９８．９１：６７８−６８４，ＮｅｗＥｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．１９９５．３３２：１５８９−１５９３）。

このような問題点から、エストロゲン療法を、食品の形態で摂取する、自然な方法に代えようとする関心が高まっているのであり、副作用がなく、更年期の症状を緩和させる効果に優れた、新しい更年期症状改善剤の開発が望まれている。そこで、合成エストロゲンの代替物として、植物性エストロゲンといった天然植物性成分を見出そうとする研究が活発に行われている。

本発明は、ブドウ種子抽出物、バレリアン抽出物及びベニバナ種子抽出物で組成された複合物を有効成分として含有し、女性更年期症状予防及び改善効果に優れた食品組成物を開発して提供することを目的とする。

上記目的を達成するために、本発明は、ブドウ種子抽出物、バレリアン抽出物及びベニバナ種子抽出物で組成された複合物を有効成分として含有することを特徴とする女性更年期症状予防及び改善用食品組成物を提供する。

本発明の女性更年期症状予防及び改善用食品組成物において、上記複合物は、好ましくは、ブドウ種子抽出物１０〜４０重量％、バレリアン抽出物１５〜５０重量％及びベニバナ種子抽出物３０〜７０重量％で組成されるとよい。この範囲に収まる場合、優れたエストロゲン受容体活性増加効果、破骨細胞分化抑制効果、造骨細胞活性増進効果、ＩＧＦ−１及びオステオカルシン（ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ）の発現増加効果を発揮することができる。また、ブドウ種子抽出物、バレリアン抽出物及びベニバナ種子抽出物で組成された複合物は、単一抽出物に比べて、より優れた女性更年期症状予防及び改善効果を奏する。

更年期には、卵巣における卵胞の枯渇により、エストロゲンの分泌が減少し、末梢組織においてアンドロゲンからエストロンへの変換が増加する。また、エストロゲンレベルが減少することで、視床下部−脳下垂体軸の陰性フィードバック機転によって卵胞刺激ホルモンと黄体形成ホルモンの分泌が増加することが特徴である。エストロゲン信号伝達はエストロゲン受容体を介して起きるが、エストロゲン受容体には、核に位置しているエストロゲン受容体−α（ｅｓｔｒｏｇｅｎｒｅｃｅｐｔｏｒ−α）及びエストロゲン受容体−β（ｅｓｔｒｏｇｅｎｒｅｃｅｐｔｏｒ−β）と、細胞膜に位置しているＧＰＲ３０（Ｇｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄｒｅｃｅｐｔｏｒ３０）とがある。

エストロゲン受容体の分布は組織によって異なり、様々な組織に分布している。したがって、更年期にエストロゲンが減少することで、エストロゲン受容体が分布している様々な組織で症状が現れる。女性の更年期症状を改善させる機能性原料には殆ど植物性エストロゲン成分が含まれているが、植物性エストロゲンは、エストロゲンに類する構造を有しており、エストロゲン受容体と結合してエストロゲン活性を示す。

このように、女性更年期症状の予防及び改善の効果を得るためには、エストロゲン受容体活性増加効果に優れ、毒性がなく、植物性エストロゲンが豊富な食品の開発が必要である。

そこで、本発明は、毒性及び副作用のない天然物質からの、エストロゲン受容体発現増加効果を発揮する新しい食品原料に対して研究した結果、ブドウ種子抽出物、バレリアン抽出物及びベニバナ種子抽出物の最適配合比を導出し、ブドウ種子抽出物１０〜４０重量％、バレリアン抽出物１５〜５０重量％及びベニバナ種子抽出物３０〜７０重量％で組成された複合物が、女性更年期症状の予防及び改善の効果に優れることを確認した。

本発明の女性更年期症状の予防及び改善用の食品組成物において、上記ブドウ種子抽出物、バレリアン抽出物及びベニバナ種子抽出物は、好ましくは、水、炭素数１〜４の低級アルコール、又はこれらの混合物を抽出溶媒として抽出したものがよい。より好ましくは、水、７０％エタノール、又はこれらの混合物とすることがよい。

本発明の女性更年期症状予防及び改善用食品組成物において、上記ブドウ種子抽出物、バレリアン抽出物及びベニバナ種子抽出物の抽出方法は、例えば、熱水抽出、冷浸抽出、還流冷却抽出、又は超音波抽出とすることができる。

本発明の女性更年期症状の予防及び改善用の食品組成物において、上記抽出物は、好ましくは、抽出の後、ろ過して減圧濃縮又は真空濃縮して得られた濃縮物を含み、凍結乾燥、熱風乾燥又は噴霧乾燥によって得られた粉末状のものがよい。

本発明の女性更年期症状の予防及び改善用の食品組成物において、上記複合物は、食品組成物全体に０．０１〜５０重量％で含まれることがよい。０．０１重量％未満であれば、女性更年期症状予防及び改善効果がわずかであり、５０重量％を超えると、使用量の増加による効果の増加がわずかであるため、不経済的である。

本発明の女性更年期症状の予防及び改善用の食品組成物は、好ましくは、肉類、穀類、カフェイン飲料、一般飲料、チョコレート、パン類、スナック類、菓子類、ピザ、ゼリー、麺類、ガム類、アイスクリーム類、ビタミン複合剤及びその他の健康補助食品類から選ばれるいずれか一つがよいが、必ずしもこれに限定されない。

本発明の女性更年期症状の予防及び改善用の食品組成物は、好ましくは、食品の製造に通常使用する適切な担体、賦形剤及び希釈剤をさらに含むことがよい。例えば、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシアガム、アルジネート、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、蜂蜜、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、ステアリン酸マグネシウム及び鉱油を挙げることができる。製剤化する場合、普通使用する充填剤、重量剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤、界面活性剤から選ばれる一つ以上の希釈剤又は賦形剤を用いて調製することができる。

一方、経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤から選ばれる一つ以上が含まれ、このような固形製剤は、例えば、澱粉、炭酸カルシウム、スクロース又はラクトース、ゼラチンから選ばれる一つ以上の賦形剤を混ぜて調製する。また、単純な賦形剤の他に、ステアリン酸マグネシウムといった潤滑剤も使用することができる。

また、経口投与のための液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤から選ばれる一つ以上を使用することができ、単純希薄剤である水、リキッドパラフィンに加えて、種々の賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、補助剤をさらに含有することができる。

本発明の女性更年期症状予防及び改善効果を有する食品組成物は、添加剤をさらに含有することができ、例えば、栄養剤、ビタミン、鉱物（電解質）、合成風味剤及び天然風味剤、着色剤及び充填剤（チーズ、チョコレート）、ペクチン酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に使用される炭酸化剤から選ばれる一つ以上を含有することができる。その他にも、天然果物ジュース、果物飲料及び野菜飲料の製造のための果肉を含有することができる。このような成分は、独立して又は組み合わせて使用することができる。このような添加剤の割合は、本発明の複合物１００重量部に対して０〜５０重量部の範囲にするのが一般的であるが、必ずしもこれに限定されない。

本発明の女性更年期症状予防及び改善効果を有する食品組成物において、「女性更年期症状」とは、閉経期の女性にホルモン生産の減少によって発生する症状を意味し、更年期又は閉経期の症状は、例えば、顔面紅潮、発汗、寝汗、皮膚乾燥、膣乾燥症、膣萎縮、下部尿道萎縮、性交痛、膣炎、膀胱炎、排尿痛、尿意切迫感、集中力障害、短期記憶障害、不安、神経過敏、記憶力減少、性欲減退、筋肉痛、関節痛又は骨多孔症のうち少なくとも一つであり得る。

一方、ブドウ（ＶｉｔｉｓｖｉｎｉｆｅｒａＬ）は、世界で最も広範囲に裁培されている、つる性の果樹であり、クロウメモドキ目（Ｒｈａｍｎａｌｅｓ）、ブドウ科（Ｖｉｔａｃｅａｅ）に属し、ヨーロッパブドウとアメリカブドウとに大別される。ブドウの果実は炭水化物の含有量が多く、そのうち、糖分としてはブドウ糖が主に含まれ、その他の糖類はごく少ない。それ以外には、ビタミンＢ及びビタミンＣが少量含まれている。果汁には酒石酸、リンゴ酸、クエン酸、ブドウ酸、サリチル酸が含まれていている。ブドウは、健胃、利尿、強壮、止渇に効果がある。ブドウの重量の３〜５％を占めるブドウ種子は、加工後の副産物であって、フェノール化合物とカテキン成分などの生理活性物質を含有していると報告されている。特に、最近ではカテキンの活性酸素消去に関する研究が報告され、天然抗酸化剤としての利用への関心が高まっている。

一方、バレリアン（Ｖａｌｅｒｉａｎａｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）は、セイヨウカノコソウともいい、オミナエシ科に属する多年生植物であり、高さ１〜２ｍ程度の濃い青色の葉と、白色又はピンク色の花が咲く。主としてヨーロッパや北アジア地域で発見され、古代から薬草として既に使用されてきており、その根は紀元前から使用されてきたことが知られている。この植物の根や根茎（ｒｈｉｚｏｍｅｓ）の抽出物は、様々な効能を有することが知られているが、その代表として睡眠補助（ｓｌｅｅｐａｉｄ）、鎮静（ｓｅｄａｔｉｖｅ）、不安除去（ａｎｘｉｏｌｙｔｉｃ）、抗けいれん（ａｎｔｉ−ｃｏｎｖｕｌｓａｎｔ）及び鎮痛作用（ｐａｉｎｒｅｌｉｅｖｅ）を挙げることができる。

一方、ベニバナ（ｓａｆｆｌｏｗｅｒ）（Ｃａｒｔｈａｍｕｓｔｉｎｃｔｏｒｉｓ）は、末摘花ともいうキク科の一年生草木であり、韓国、日本、中国などで薬用を主目的に裁培されてきた。ベニバナの種子には脂肪が多量含有されており、特に、リノール酸（ｌｉｎｏｌｅｉｃａｃｉｄ）の含有量が高くて、血中コレステロール低下作用を有すると報告されている。

本発明のブドウ種子抽出物、バレリアン抽出物及びベニバナ種子抽出物で組成された複合物は、優れた破骨細胞分化抑制、造骨細胞活性増進、エストロゲン受容体発現増加、ＩＧＦ−１及びオステオカルシン（ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ）発現増加に優れ、女性更年期症状の予防及び改善の効果を発揮する。また、本発明は、毒性がなく、副作用がなく、人体に無害な天然抽出物で組成された複合物を、有効成分として含有する、女性更年期症状予防及び改善効果に優れた食品組成物を提供することができる。

本発明のブドウ種子抽出物、バレリアン抽出物及びベニバナ種子抽出物で組成された複合物が破骨細胞の形成に及ぶ影響を確認するためにＴＲＡＰを確認した実験結果を示すグラフである（Ｐ＜０．０５）。本発明のブドウ種子抽出物、バレリアン抽出物及びベニバナ種子抽出物で組成された複合物が破骨細胞の形成に及ぶ影響を確認するためにＲＡＮＫＬを確認した実験結果を示すグラフである（Ｐ＜０．０５）。本発明のブドウ種子抽出物、バレリアン抽出物及びベニバナ種子抽出物で組成された複合物が造骨細胞活性に及ぶ影響を確認するために塩基性リン酸分解酵素（ＡＬＰ）の活性を測定した実験結果を示すグラフである（Ｐ＜０．０５）。本発明のブドウ種子抽出物、バレリアン抽出物及びベニバナ種子抽出物で組成された複合物が造骨細胞活性に及ぶ影響を確認するために塩基性リン酸分解酵素（ＡＬＰ）の発現を測定した実験結果を示すグラフである（Ｐ＜０．０５）。本発明のブドウ種子抽出物、バレリアン抽出物及びベニバナ種子抽出物で組成された複合物がＩＧＦ−１遺伝子発現に及ぶ影響を確認した実験結果のグラフである。本発明のブドウ種子抽出物、バレリアン抽出物及びベニバナ種子抽出物で組成された複合物がエストロゲン受容体の発現に及ぶ影響を確認した実験結果を示すグラフである（Ｐ＜０．０５）。本発明のブドウ種子抽出物、バレリアン抽出物及びベニバナ種子抽出物で組成された複合物がオステオカルシン発現に及ぶ影響を確認した実験結果を示すグラフである（Ｐ＜０．０５）。

以下、本発明の構成を下記の実施例を用いて具体的に説明する。ただし、本発明の権利範囲が下記の実施例に限定されるものではなく、それと同等な技術的思想の変形も含む。

［製造例１：ブドウ種子抽出物の製造］
ブドウ種子１ｋｇを乾燥後に摩砕して得た粉末３００ｇを集気瓶に入れた後、７０％エタノール１．８Ｌを入れ、８５℃で３時間ずつ２回反復抽出してブドウ種子抽出液を得た。その後、ろ紙（ｗｈａｔｍａｎ(商標) Ｎｏ．１、イギリス）で減圧ろ過した後、真空回転濃縮器でもって、６０℃で減圧濃縮したのち、噴霧乾燥してブドウ種子抽出物を製造した。

［製造例２：バレリアン抽出物の製造］
バレリアンの根１ｋｇを乾燥後に摩砕して得た粉末３００ｇを集気瓶に入れた後、７０％エタノール１．５Ｌを入れ、７０℃で６時間ずつ３回反復抽出してバレリアン抽出液を得た。その後、ろ過紙（ｗｈａｔｍａｎ(商標) Ｎｏ．１、イギリス）で減圧ろ過した後、真空回転濃縮器でもって、６０℃で減圧濃縮したのち、噴霧乾燥してバレリアン抽出物を製造した。

［製造例３：ベニバナ種子抽出物の製造］
ベニバナ種子１ｋｇを乾燥後に摩砕して得た粉末３００ｇを集気瓶に入れた後、水３Ｌを入れ、９０℃で６時間ずつ３回反復抽出してベニバナ種子抽出液を得た。その後、ろ過紙（ｗｈａｔｍａｎ(商標) Ｎｏ．１、イギリス）で減圧ろ過した後、真空回転濃縮器でもって、６０℃で減圧濃縮したのち、熱風乾燥してベニバナ種子抽出物を製造した。

［実施例１〜４：複合物の製造］
上記製造例１〜３で製造したブドウ種子抽出物、バレリアン抽出物、ベニバナ種子抽出物の配合比（重さ比）を、次表１のように別々にして複合物を製造した。

［実験例１：複合物が骨多孔症の指標であるＴＲＡＰ（Ｔａｒｔｒａｔｅ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔａｃｉｄｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）活性に及ぶ影響の確認］
この実験例では、製造例１〜３で製造した単一抽出物、及び実施例１〜４で製造した複合物がＴＲＡＰ（Ｔａｒｔｒａｔｅ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔａｃｉｄｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）活性に及ぶ影響を確認しようとした。

ＴＲＡＰ（Ｔａｒｔｒａｔｅ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔａｃｉｄｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）は破骨細胞の指標であり、ＴＲＡＰの低い活性は、破骨細胞の分化が抑制されたことを示す。

ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を破骨細胞に分化させる目的で、７週齢のＣ５７ＢＬ／６雌マウスの大腿骨骨髄（ｆｅｍｏｒａｌｂｏｎｅｍａｒｒｏｗ）細胞を摘出し、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞と共にＭＥＭ培養液（１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン及び１００ｇ／ｍｌストレプトマイシンを含む最小必須培養液）で培養した。

ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞（１．５×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）と、骨髄（ｂｏｎｅｍａｒｒｏｗ）細胞（５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）を２４ウェルプレート（ｗｅｌｌｐｌａｔｅ）にシーディング（ｓｅｅｄｉｎｇ）し、ＭＥＭ培養液にて１０^−８Ｍ１，２５（ＯＨ）_２ビタミンＤ_３、１０^−７Ｍデキサメタゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）とすると共に、試料（製造例１〜３、実施例１〜４）を５０μｇ／ｍｌ濃度としてそれぞれ処理した。培養液は３日ごとに入れ替え、細胞は７日間培養した。

７日間培養後、ＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒｓａｌｉｎｅ）で細胞を２回洗浄してから、細胞溶解緩衝液（ｌｙｓｉｓｂｕｆｆｅｒ）を用い、細胞をかき取って（ｓｃｒａｐｅ）収集した後、１０秒間隔で超音波処理（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）を４回施行して「細胞溶解物（ｃｅｌｌｌｙｓａｔｅ）」を得た。

ＴＲＡＰ活性度（ＴＲＡＰａｃｔｉｖｉｔｙ）測定キット（ｋｉｔ）は、「ＬｉｆｅｓｐａｎＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ」社から「ＥＬＩＳＡｋｉｔ」を購入したのであり、メーカーの方法によって４５０ｎｍで測定した。

「１，２５（ＯＨ）_２ビタミンＤ_３」で処理しなかった群を一般群とし、「１，２５（ＯＨ）_２ビタミンＤ_３」で処理した後、試料で処理しなかった群を対照群とし、その結果は次表２に示した。実験群間の有意差は「ＡＮＯＶＡ」で分析し、ｐ＜０．０５を有意差ありとした。

実験の結果、単一抽出物（ブドウ種子抽出物、バレリアン抽出物、ベニバナ種子抽出物）に比べて、ブドウ種子抽出物、バレリアン抽出物及びベニバナ種子抽出物で組成された複合物が低いＴＲＡＰ活性を示すことが確認できた。また、複合物の中でも実施例１（ブドウ種子抽出物２０重量％、バレリアン抽出物３０重量％、ベニバナ種子抽出物５０重量％）が最低のＴＲＡＰ活性を示すことが確認できた。

下記の実験例では、最も優れた効果を示した実施例１を用いて実験を行った。

［実験例２：複合物の濃度が骨多孔症の指標であるＴＲＡＰ（Ｔａｒｔｒａｔｅ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔａｃｉｄｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）活性に及ぶ影響確認］
この実験例では、複合物の濃度によってＴＲＡＰ活性に及ぶ影響を確認しようとした。

ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞（１．５×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）と、骨髄（ｂｏｎｅｍａｒｒｏｗ）細胞（５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）を２４ウェルプレートにシーディングし、ＭＥＭ培養液にて１０^−８Ｍ１，２５（ＯＨ）_２ビタミンＤ_３、１０^−７Ｍデキサメタゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）とすると共に、複合物（実施例１）を０、２０、５０、１００μｇ／ｍｌの濃度としてそれぞれ処理した。培養液は３日ごとに入れ替え、細胞は７日間培養した。

７日間培養後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、細胞溶解緩衝液を用いて、細胞をかき取って（ｓｃｒａｐｅ）収集した後、１０秒間隔で超音波処理を４回施行して「細胞溶解物」を得た。

ＴＲＡＰ活性度（ＴＲＡＰａｃｔｉｖｉｔｙ）測定キット（ｋｉｔ）は、「ＬｉｆｅｓｐａｎＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ」社から「ＥＬＩＳＡｋｉｔ」を購入し、４５０ｎｍで測定した。１，２５（ＯＨ）_２ビタミンＤ_３で処理しなかった群を一般群とし、複合物で処理しなかった群を対照群とした。

実験の結果、複合物（実施例１）を５０μｇ／ｍｌと、１００μｇ／ｍｌの濃度として処理したとき、濃度依存的にＴＲＡＰの活性が有意に抑制されることが確認できた。

この結果から、複合物の濃度に依存して、破骨細胞分化抑制効果が向上することが確認できた（図１）。図１は、本発明のブドウ種子抽出物、バレリアン抽出物及びベニバナ種子抽出物で組成された複合物（実施例１）が破骨細胞の形成に及ぶ影響を確認するためにＴＲＡＰを確認した実験結果を示すグラフである（Ｐ＜０．０５）。

［実験例３：複合物が破骨細胞分化に及ぶ影響確認（ＲＡＮＫＬ発現量測定）］
この実験例では、複合物の破骨細胞分化抑制効果を確認するためにＲＡＮＫＬ（ＲｅｃｅｐｔｏｒａｃｔｉｖａｔｏｒｏｆＮＦ−κＢｌｉｇａｎｄ）発現量を測定しようとした。

ＲＡＮＫＬは、「ＴＮＦｆａｍｉｌｙ」の一員であり、破骨細胞分化においてＮＦ−κＢとＭＡＰＫｓ（ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄｋｉｎａｓｅ）によって活性化し（Ｊ．ＢｏｎｅＭｉｎｅｒＭｅｔａｂ．２０１４．３２：５９８−６０４）、破骨細胞分化の標示因子として知られている。

ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞（１．５×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）と、骨髄（ｂｏｎｅｍａｒｒｏｗ）細胞（５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）を２４ウェルプレートにシーディングし、ＭＥＭ培養液にて１０^−８Ｍ１，２５（ＯＨ）_２ビタミンＤ_３、１０^−７Ｍデキサメタゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）とすると共に、複合物（実施例１）を０、２０、５０、１００μｇ／ｍｌの濃度としてそれぞれ処理した。培養液は３日ごと入れ替え、細胞は７日間培養した。

７日間培養後、細胞の培地を除去し、「ＱｕａｎｔｉｋｉｎｅＭｍｏｕｓｅＲＡＮＫＬｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｋｉｔ（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍ社、ＵＳＡ）」を使用して、メーカーの方法に従って実験した。各ウェルは４０分以内に、「ＥＬＩＳＡｒｅａｄｅｒ」を用いて４５０ｎｍで測定した。１，２５（ＯＨ）_２ビタミンＤ_３で処理しなかった群を一般群とし、複合物で処理しなかった群を対照群とした。

実験の結果、複合物（実施例１）を５０μｇ／ｍｌと１００μｇ／ｍｌとして処理したとき、ＲＡＮＫＬの発現量が濃度依存的に減ったことが確認できた。

この結果から、複合物の破骨細胞分化抑制効果が確認できた（図２）。図２は、本発明のブドウ種子抽出物、バレリアン抽出物及びベニバナ種子抽出物で組成された複合物（実施例１）が破骨細胞の形成に及ぶ影響を確認するためにＲＡＮＫＬを確認した実験結果を示すグラフである（Ｐ＜０．０５）。

［実験例４：塩基性リン酸分解酵素（Ａｌｋａｌｉｎｅｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ；ＡＬＰ）活性測定］
造骨細胞は細胞膜に塩基性リン酸分解酵素（ＡＬＰ）を有するが、この酵素は、細胞の外膜と石灰化組織において高い濃度で発見され、石灰化過程において運搬、細胞分裂及び分化の調節作用をし、造骨細胞の活性標示因子として知られている（ＩｎｔＲｅｖＣｙｔｏｌ．１９９５．２６５−３５８）。

したがって、この実験例では、複合物が造骨細胞の活性に及ぶ影響を確認するために、塩基性リン酸分解酵素（ＡＬＰ）の活性を測定しようとした。

ＡＬＰ活性の測定のために、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞株をＭＥＭ培養液、１０ｍＭベータ−グリセロリン酸（ｂｅｔａ−ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）及び５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸（ａｓｃｏｒｂｉｃａｃｉｄ）で６日間処理し、造骨細胞に分化させた。分化した細胞を２４ウェルプレートにシーディングした後、複合物（実施例１）を０、２０、５０、１００μｇ／ｍｌとしてそれぞれ処理して３日間培養した。

培養後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、細胞溶解緩衝液を用いて、細胞をかき取って（ｓｃｒａｐｅ）収集した後、１０秒間隔で超音波処理を４回施した。各ウェルに１ｍｌの「反応混合物（ｒｅａｃｔｉｏｎｍｉｘｔｕｒｅ）（アルカリ性緩衝液：保存基質（Ｓｔｏｃｋｓｕｂｓｔｒａｔｅ）＝１：１）」を添加し、３７℃で３０分間培養（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）した。測定のために「ａｂｃａｍｐｒｏｔｏｃｏｌ」に従って実験し、最終的に１ＮＮａＯＨを各ウェルに１２μｌ添加した後、４０５ｎｍでＥＬＩＳＡｒｅａｄｅｒ（ＶＥＲＳＡＭＡＸＳＬ−２０ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ，Ｓｅｏｕｌ，Ｋｏｒｅａ）を用いて吸光度を測定した。

実験の結果、複合物で処理しなかった対照群に比べて、複合物で濃度別に処理した細胞において高いＡＬＰ活性を示し、特に、２０、５０、１００μｇ／ｍｌで処理するにしたがって濃度依存的にＡＬＰ活性が高くなることが確認できた。

この結果から、複合物の造骨細胞活性促進効果が確認できた（図３）。図３は、本発明のブドウ種子抽出物、バレリアン抽出物及びベニバナ種子抽出物で組成された複合物（実施例１）が造骨細胞活性に及ぶ影響を確認するために塩基性リン酸分解酵素（ＡＬＰ）の活性を測定した実験結果を示すグラフである（Ｐ＜０．０５）。

［実験例５：複合物が塩基性リン酸分解酵素（ＡＬＰ）、ＩＧＦ−１、エストロゲン受容体（Ｅｓｔｒｏｇｅｎｒｅｃｅｐｔｏｒ）、オステオカルシン（Ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ）の遺伝子発現に及ぶ影響確認］
ＩＧＦ−１（Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒ−１）は、成長ホルモン（ｇｒｏｗｔｈｈｏｒｍｏｎｅ）と深く関連している成長因子であり、成長ホルモンの刺激を受けた脳下垂体前葉から分泌する。ＩＧＦ−１は、軟骨組織において軟骨細胞の成長と分化を促進させ、骨格成長を促進する機能を有するものと知られている（ＮａｔＭｅｄ．２００３．９：１０３３−１０３８）。

エストロゲン受容体（Ｅｓｔｒｏｇｅｎｒｅｃｅｐｔｏｒ）はエストロゲンを受容する蛋白質群であり、各組織の核や細胞内に存在し、エストロゲン信号伝達の役目を担う。したがって、更年期にエストロゲンが減少しながら、エストロゲン受容体の分布している様々な組織で諸症状が現れるわけである。エストロゲン受容体の遺伝子発現程度を測定して、複合物のエストロゲン活性（ｅｓｔｒｏｇｅｎｉｃａｃｔｉｖｉｔｙ）を評価する。

オステオカルシン（ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ）は造骨細胞によって合成され、骨形成の程度を示す指標として用いられる。すなわち、血清中のオステオカルシン（ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ）の濃度は、造骨細胞の活性度を直接反映していると見ることができる。

したがって、この実験例では、複合物が塩基性リン酸分解酵素（ＡＬＰ）、ＩＧＦ−１、エストロゲン受容体（Ｅｓｔｒｏｇｅｎｒｅｃｅｐｔｏｒ）、オステオカルシン（Ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ）の遺伝子発現に及ぶ影響を確認するために、実時間重合酵素連鎖反応（Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅＰＣＲ）を実施した。

ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞株を、ＭＥＭ培養液、１０ｍＭベータ−グリセロリン酸、５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸を６日間処理し、造骨細胞に分化させた。分化した細胞を２４ウェルプレートにシーディングした後、複合物（実施例１）を０、２０、５０、１００μｇ／ｍｌとしてそれぞれ処理して３日間培養した。

３日間培養した細胞を０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ（ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ）で収集し、「ＲＮｅａｓｙｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ，ＵＳＡ）」を用いて、メーカーの方法にしたがって総（ｔｏｔａｌ）ＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡの合成のために、「ｉＳｃｒｉｐｔＴＭＳｅｌｅｃｔｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓＫｉｔ（ＢＩＯ−ＲＡＤ，ＵＳＡ）」を用いて５μｇの総ＲＮＡに「５×ｉＳｃｒｉｐｔｓｅｌｅｃｔｒｅａｃｔｉｏｎｍｉｘ」４μｌ、「ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）ｐｒｉｍｅｒｓｅｔ」２μｌ、ＲＮＡサンプル（ｓａｍｐｌｅ）５μｌ、「ｎｕｃｌｅａｓｅｆｒｅｅｗａｔｅｒ」８μｌをそれぞれ入れ、最後に「ｉＳｃｒｉｐｔＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ」１μｌを入れ、ピペット（ｐｉｐｅｔ）で縦揺れ（ｕｐ＆ｄｏｗｎ）して均一に混合した。

４２℃で６０分、８５℃で５分間反応させた後、合成されたｃＤＮＡをＰＣＲ反応に使用した。リアルタイムＰＣＲ実験の際に使用した機械は「ＳｔｅｐＯｎｅＲｅａｌ−ＴｉｍｅＰＣＲｓｙｓｔｅｍ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ）」であり、「ｉＱＳＹＢＲＧｒｅｅｎＳｕｐｅｒｍｉｘ（ＢＩＯ−ＲＡＤ，ＵＳＡ）」の方法によって行った。

ＰＣＲのための混合液の最終濃度は、ｃＤＮＡ２μｌ（１０〜１００ｎｇ）、「２×ｉＱＳＹＢＲＧｒｅｅｎＳｕｐｅｒｍｉｘ」１０μｌ、「ｆｏｒｗａｒｄ＆ｒｅｖｅｒｓｅｐｒｉｍｅｒ」各１μｌ（２５０ｎＭ）、Ｈ_２Ｏ７μｌとなるようにした。９５℃で１０分間ホットスタート（ｈｏｔｓｔａｒｔ）した後、９５℃で１５秒間、５５℃で１５秒、７２℃で３０秒間の４０サイクリング（ｃｙｃｌｉｎｇ）でＰＣＲを行った後、最後に９５℃で１５秒、６０℃で１分、９５℃１５秒間の仕上げ過程を経てＰＣＲ分析を行った。反応に使用したプライマー（ｐｒｉｍｅｒ）は、次表３のとおりである。

塩基性リン酸分解酵素（ＡＬＰ）発現量測定の結果、対照群に比べて、複合物を５０μｇ／ｍｌと１００μｇ／ｍｌとして処理した細胞において濃度依存的に有意に増加したことが確認できた（図４）。図４は、本発明のブドウ種子抽出物、バレリアン抽出物及びベニバナ種子抽出物で組成された複合物（実施例１）が、造骨細胞活性に及ぼす影響を確認するために、塩基性リン酸分解酵素（ＡＬＰ）の発現を測定した実験結果を示すグラフである（Ｐ＜０．０５）。

ＩＧＦ−１発現量の測定の結果、対照群に比べて、複合物を５０μｇ／ｍｌと１００μｇ／ｍｌとして処理した細胞において、濃度依存的に有意に増加したことが確認できた（図５）。図５は、本発明のブドウ種子抽出物、バレリアン抽出物及びベニバナ種子抽出物で組成された複合物（実施例１）が、ＩＧＦ−１遺伝子発現に及ぼす影響を確認した実験結果のグラフである。

エストロゲン受容体発現量の測定の結果、対照群に比べて、複合物を５０μｇ／ｍｌと１００μｇ／ｍｌとして処理した細胞において、濃度依存的に有意に増加したことが確認できた（図６）。図６は、本発明のブドウ種子抽出物、バレリアン抽出物及びベニバナ種子抽出物で組成された複合物（実施例１）がエストロゲン受容体の発現に及ぼす影響を確認した実験結果を示すグラフである（Ｐ＜０．０５）。

オステオカルシン（Ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ）発現量の測定の結果、対照群に比べて、複合物を２０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌとして処理した時細胞において、濃度依存的に有意に増加したことが確認できた（図７）。図７は、本発明のブドウ種子抽出物、バレリアン抽出物及びベニバナ種子抽出物で組成された複合物（実施例１）が、オステオカルシン発現に及ぼす影響を確認した実験結果を示すグラフである（Ｐ＜０．０５）。

このような結果から、複合物は造骨細胞活性促進効果に優れ、優れたエストロゲン活性を有することが確認できた。

［実施例５：女性更年期症状予防及び改善効果を有する食品組成物の製造］
本実施例では、下記のように、女性更年期症状の予防及び改善の効果を有する食品組成物を製造した。

（１）禅食の製造
玄米、大麦、もち米、ハト麦を公知の方法でアルファ化させて乾燥したものを焙煎した後、粉砕機で粒度６０メッシュの粉末として用意した。黒大豆、黒ゴマ及びエゴマのそれぞれを公知の方法で蒸して乾燥させた後、焙煎及び粉砕して粒度６０メッシュの粉末として用意した。その後、玄米３０重量％、ハト麦１５重量％、大麦２０重量％、もち米９重量％，エゴマ７重量％、黒大豆８重量％、黒ゴマ７重量％、本発明のブドウ種子抽出物、バレリアン抽出物及びベニバナ種子抽出物で組成された複合物（実施例１）３重量％、霊芝０．５重量％、及び地黄０．５重量％を混合して禅食を製造した。

（２）チューインガムの製造
ガムベース２０重量％、砂糖７６．９重量％、香料１重量％、水２重量％、及び本発明のブドウ種子抽出物、バレリアン抽出物及びベニバナ種子抽出物で組成された複合物（実施例１）０．１重量％を配合し、通常の方法でチューインガムを製造した。

（３）キャンディの製造
砂糖６０重量％、水飴３９．８重量％、香料０．１重量％、及び本発明のブドウ種子抽出物、バレリアン抽出物及びベニバナ種子抽出物で組成された複合物（実施例１）０．１重量％を配合し、通常の方法でキャンディを製造した。

（４）ビスケットの製造
薄力１等粉２５．５９重量％、中力１等粉２２．２２重量％、精白糖４．８０重量％、食塩０．７３重量％、ブドウ糖０．７８重量％、パームショートニング１１．７８重量％、アンモニウム１．５４重量％、重曹０．１７重量％、重亜硫酸ナトリウム０．１６重量％、米粉１．４５重量％、ビタミンＢ０．０００１重量％、ビタミンＢ０．０００１重量％、ミルク香料０．０４重量％、水２０．６９９８重量％、全脂粉乳１．１６重量％、代用粉乳０．２９重量％、第一リン酸カルシウム０．０３重量％、散布塩０．２９重量％、噴霧乳７．２７重量％、及び本発明のブドウ種子抽出物、バレリアン抽出物及びベニバナ種子抽出物で組成された複合物（実施例１）１重量％を配合し、通常の方法でビスケットを製造した。

（５）健康飲料の製造
蜂蜜０．２６重量％、チオクト酸アミド０．０００２重量％、ニコチン酸アミド０．０００４重量％、リン酸リボフラビンナトリウム０．０００１重量％、塩酸ピリドキシン０．０００１重量％、イノシトール０．００１重量％、オロト酸０．００２重量％、水９８．７３６２重量％、及び本発明のブドウ種子抽出物、バレリアン抽出物及びベニバナ種子抽出物で組成された複合物（実施例１）１重量％を配合し、通常の方法で健康飲料を製造した。

（６）ソーセージの製造
豚肉６５．１８重量％、鶏肉２５重量％、澱粉３．５重量％、大豆蛋白１．７重量％、食塩１．６２重量％、ブドウ糖０．５重量％、グリセリン１．５重量％、及び本発明のブドウ種子抽出物、バレリアン抽出物及びベニバナ種子抽出物で組成された複合物（実施例１）１重量％を配合し、通常の方法でソーセージを製造した。

（７）健康補助食品の製造
本発明のブドウ種子抽出物、バレリアン抽出物及びベニバナ種子抽出物で組成された複合物（実施例１）５０重量％、グアーガム酵素分解物１６重量％、ビタミンＢ塩酸塩０．０１重量％、ビタミンＢ６塩酸塩０．０１重量％、ＤＬ−メチオニン０．２３重量％、ステアリン酸マグネシウム０．７重量％、乳糖３１．２重量％、及びとうもろこし澱粉１．８５重量％を配合し、通常の方法で錠剤型の健康補助食品を製造した。

Claims

ブドウ種子抽出物２０重量％、バレリアン抽出物３０重量％及びベニバナ種子抽出物５０重量％で組成された複合物を有効成分として含有することを特徴とする女性更年期症状の予防及び改善用の食品組成物。
前記の女性更年期症状の予防及び改善が、更年期骨粗しょう症、または、エストロゲンの発現に関連したものであることを特徴とする、請求項１に記載の女性更年期症状の予防及び改善用の食品組成物。
上記ブドウ種子抽出物、バレリアン抽出物及びベニバナ種子抽出物は、
水、炭素数１〜４の低級アルコール又はこれらの混合物を抽出溶媒として抽出されたことを特徴とする、請求項１に記載の女性更年期症状の予防及び改善用の食品組成物。
上記複合物は、
食品組成物全体に０．０１〜５０重量％で含まれることを特徴とする、請求項１に記載の女性更年期症状の予防及び改善用の食品組成物。