KR101653678B1

KR101653678B1 - 포도씨 추출물, 발레리안 추출물 및 홍화씨 추출물을 함유하는 여성 갱년기 증상 예방 및 개선용 식품 조성물

Info

Publication number: KR101653678B1
Application number: KR1020160003956A
Authority: KR
Inventors: 김지훈; 심태진
Original assignee: 주식회사 프롬바이오
Priority date: 2016-01-12
Filing date: 2016-01-12
Publication date: 2016-09-02
Also published as: EP3403511A4; JP2019505208A; CN108471795A; WO2017122868A1; US20190022163A1; EP3403511A1; JP6655189B2

Abstract

본 발명은 포도씨 추출물, 발레리안 추출물 및 홍화씨 추출물을 함유하는 여성 갱년기 증상 예방 및 개선용 식품 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 포도씨 추출물, 발레리안 추출물 및 홍화씨 추출물로 조성된 복합물은 우수한 파골세포 분화 억제, 조골세포 활성 증진, 에스트로겐 수용체 발현 증가, IGF-1 및 오스테오칼신(osteocalcin) 발현 증가가 우수하여, 여성 갱년기 증상 예방 및 개선 효과를 발휘한다. 또한, 본 발명은 독성이 없고, 부작용이 없으며, 인체에 무해한 천연 추출물로 조성된 복합물을 유효성분으로 함유하는 여성 갱년기 증상 예방 및 개선 효과가 우수한 식품 조성물을 제공할 수 있다.

Description

포도씨 추출물, 발레리안 추출물 및 홍화씨 추출물을 함유하는 여성 갱년기 증상 예방 및 개선용 식품 조성물 {Food composition with Vitis vinifera seed extract, Valeriana officinalis extract, Carthamus tinctorius extract for prevention and relieving of menopausal symptoms}

본 발명은 포도씨 추출물, 발레리안 추출물 및 홍화씨 추출물을 함유하는 여성 갱년기 증상 예방 및 개선용 식품 조성물에 관한 것이다.

여성은 나이가 들면서 난소의 기능이 저하되고, 이로 인해 에스트로겐의 분비가 크게 감소한다. 이에 따라, 난포자극호르몬(FSH) 및 황체형성호르몬(LH)에 대한 반응이 감소되고, 프로게스테론의 생성도 감소된다. 특히 50대 전후로 난소의 기능이 완전히 멈추는 폐경이 발생할 확률이 매우 높아지는데, 폐경기에 접어들기 시작하면서부터 완전한 폐경 이후의 시기에 호르몬 균형이 깨지면서 신체에 각종 증상이 야기되는 시기를 흔히 갱년기라 한다. 또한 난소 제거술, 자궁 적출술 등의 이유로 조기 폐경을 맞게 되는 경우에도 갱년기 증상을 느낄 수 있다.

즉, 여성의 갱년기란 내분비 증후군의 일종으로 난소 기능의 노화로 인해 여성호르몬인 에스트로겐이 감소하게 되어 생리적 기능 및 성기능이 감소 내지 소실되는 시기를 의미한다. 이러한 갱년기의 증상으로는 안면홍조, 빈맥, 발한, 또는 두통과 같은 혈관성 변화에 의한 증상이 있고, 근육통, 관절통 및 요통과 같은 근골격계 변화에 의한 증상이 있으며, 빈뇨 또는 요실금과 같은 비뇨생식기 변화에 의한 증상과 함께 기억력 감퇴, 우울증, 집중력 감퇴 및 현기증과 같은 뇌신경계 변화에 의한 증상이 있다. 이 외에도 시력감퇴 및 피부와 모발이 변화되는 증상들이 발생되며, 호르몬 변화로 인한 골다공증이나 심혈관계 질환 등 여성의 건강에 치명적인 질환이 발생하기도 한다.

최근 문명의 발달과 과학의 진보로 현대를 살아가는 인간은 그 수명이 점차 연장되어 여성의 경우, 2002년에 평균수명이 80.4세로, 갱년기 증상이 서서히 시작되는 40대 이후부터 30~40여 년 동안 여성의 건강한 삶에 대한 특별한 관심이 필요하다.

갱년기 증상의 가장 큰 원인이 에스트로겐 부족 때문이므로, 치료법으로는 에스트로겐 대체요법이 여성갱년기 증상 개선을 위해 주로 사용되어 졌다. 그러나, 갱년기 증상을 갖는 여성의 35~40%만이 에스트로겐 대체요법을 사용하며, 이들조차도 대부분 이 방법을 지속적으로 사용하는 것을 기피한다 (Ann. Intern. Med. 1999. 130:545-553). 에스트로겐 대체요법은 인위적인 호르몬 투여를 기반으로 하기 때문에 그 자체에 대한 거부반응과 부작용이 따르기 때문이다. 에스트로겐 대체요법의 부작용으로 자궁출혈, 뇌졸중, 심장발작, 유방암, 자궁암 발생 위험이 증가될 수 있음에 대한 많은 연구결과들이 보고되고 있다 (Obstet. Gynecol. 1998. 91:678-684, New Engl. J. Med. 1995. 332:1589-1593).

이러한 문제점 때문에 식품형태로 섭취하는 자연적인 방법으로 에스트로겐 요법을 대체하고자 하는 관심이 높아지고 있으며, 부작용이 없으면서도 갱년기의 증상을 완화시키는 효과가 우수한 새로운 갱년기 증상 개선제의 개발이 요구되고 있어, 합성 에스트로겐의 대체물로서 식물성 에스트로겐과 같은 천연식물성 성분을 찾고자 하는 연구가 활발히 진행되고 있다.

대한민국 등록특허 제10-0718559호 (등록일자: 2007.05.09.)에는, 황기 추출물, 결명자 추출물, 칡 추출물, 대두 추출물을 주성분으로 함유하는 식품으로서 여성 갱년기 증상에 우수한 효과를 갖는 식품과 그 조성물에 대한 기술이 기재되어 있다. 대한민국 등록특허 제10-0734942호 (등록일자: 2007.06.27.)에는, 다량의 이소플라본을 함유하고 있는 대두 배아와 붉은 토끼풀, 석류 추출물, 동의보감 등에 자양강장약으로 전신쇠약, 병후쇠약 및 설사멎이에 유효한 것으로 알려진 산마, 보혈, 혈압강화 및 항균작용이 뛰어난 치자, 당귀, 작약을 함유함을 특징으로 하는 여성갱년기 증후군의 개선효과를 지닌 건강기능식품 조성물에 대한 기술이 기재되어 있다. 대한민국 등록특허 제10-1272602호 (등록일자: 2013.05.29.)에는, 엘라그산을 고함량으로 포함하여 석류 추출물의 여성 갱년기 증상 개선 효과를 향상시키는 방법에 대한 기술이 기재되어 있다.

본 발명은 포도씨 추출물, 발레리안 추출물 및 홍화씨 추출물로 조성된 복합물을 유효성분으로 함유하여 여성 갱년기 증상 예방 및 개선 효과가 우수한 식품 조성물을 개발하여 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하고자, 본 발명은 포도씨 추출물, 발레리안 추출물 및 홍화씨 추출물로 조성된 복합물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 여성 갱년기 증상 예방 및 개선용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 여성 갱년기 증상 예방 및 개선용 식품 조성물에 있어서, 상기 복합물은 바람직하게 포도씨 추출물 10~40중량%, 발레리안 추출물 15~50중량% 및 홍화씨 추출물 30~70중량%로 조성되는 것이 좋다. 상기와 범위를 만족할 경우, 우수한 에스트로겐 수용체 활성 증가 효과, 파골세포 분화 억제 효과, 조골세포 활성 증진 효과, IGF-1 및 오스테오칼신(osteocalcin) 발현 증가 효과를 발휘할 수 있다. 또한, 포도씨 추출물, 발레리안 추출물 및 홍화씨 추출물로 조성된 복합물은 단일 추출물 보다 더욱 우수한 여성 갱년기 증상 예방 및 개선 효과를 나타낸다.

갱년기에는 난소에서 난포의 고갈로 인해, 에스트로겐의 분비가 감소하게 되고, 말초조직에서 안드로겐으로부터 에스트론으로의 변환이 증가하게 된다. 또한, 에스트로겐 수준이 감소하면서 시상하부-뇌하수체 축의 음성 피드백 기전에 의해 난포자극호르몬과 황체형성 호르몬의 분비가 증가하는 것이 특징이다. 에스트로겐 신호전달은 에스트로겐 수용체를 매개하여 일어나는데, 에스트로겐 수용체에는 핵에 위치하고 있는 에스트로겐 수용체-α(estrogen receptor-α)와 에스트로겐 수용체-β(estrogen receptor-β), 세포막에 위치한 GPR30(G protein-coupled receptor 30)가 있다.

에스트로겐 수용체의 분포는 조직에 따라 다르며 다양한 조직에 분포되어 있다. 따라서 갱년기에 에스트로겐이 감소하면서 에스트로겐 수용체가 분포되어 있는 다양한 조직에서 증상들이 나타나게 되는 것이다. 여성의 갱년기 증상을 개선시키는 기능성 원료에는 대부분 식물성 에스트로겐 성분이 함유되어 있는데, 식물성 에스트로겐은 에스트로겐과 유사한 구조를 가지고 있어 에스트로겐 수용체와 결합하여 에스트로겐 활성을 나타내게 된다.

이와 같이, 여성 갱년기 증상 예방 및 개선 효과를 나타내기 위해서는 에스트로겐 수용체 활성 증가 효과가 우수하며 독성이 없고, 식물성 에스트로겐이 풍부한 식품의 개발이 요구되고 있다.

이에, 본 발명은 독성 및 부작용이 없는 천연물질로부터 에스트로겐 수용체 발현 증가 효과를 발휘하는 새로운 식품 원료에 대해 연구한 결과, 포도씨 추출물, 발레리안 추출물 및 홍화씨 추출물의 최적 배합비를 도출하였고, 포도씨 추출물 10~40중량%, 발레리안 추출물 15~50중량% 및 홍화씨 추출물 30~70중량%로 조성된 복합물이 여성 갱년기 증상 예방 및 개선 효과가 우수함을 확인하였다.

본 발명의 여성 갱년기 증상 예방 및 개선용 식품 조성물에 있어서, 상기 포도씨 추출물, 발레리안 추출물 및 홍화씨 추출물은 바람직하게 물, 탄소수가 1 내지 4의 저급 알코올 또는 이의 혼합물을 추출 용매로 하여 추출된 것이 좋다. 더욱 바람직하게는 물 또는 70% 에탄올 또는 이의 혼합물인 것이 좋다.

본 발명의 여성 갱년기 증상 예방 및 개선용 식품 조성물에 있어서, 상기 포도씨 추출물, 발레리안 추출물 및 홍화씨 추출물의 추출방법은 일 예로, 열수 추출, 냉침 추출, 환류냉각 추출 또는 초음파 추출일 수 있다.

본 발명의 여성 갱년기 증상 예방 및 개선용 식품 조성물에 있어서, 상기 추출물은 바람직하게 추출 후, 여과하여 감압 농축 또는 진공 농축하여 수득된 농축물을 포함하며, 동결 건조, 열풍 건조 또는 분무 건조를 통해 수득된 분말 형태인 것이 좋다.

본 발명의 여성 갱년기 증상 예방 및 개선용 식품 조성물에 있어서, 상기 복합물은 바람직하게 식품 조성물 전체 중 0.01~50중량% 포함되는 것이 좋다. 0.01중량% 미만이면 여성 갱년기 증상 예방 및 개선 효과가 미미하며, 50중량%를 초과하면 사용량 대비 효과 증가가 미미하여 경제적이지 못하다.

본 발명의 여성 갱년기 증상 예방 및 개선용 식품 조성물은, 바람직하게 육류, 곡류, 카페인 음료, 일반음료, 초콜렛, 빵류, 스넥류, 과자류, 피자, 젤리, 면류, 껌류, 아이스크림류, 비타민 복합제 및 그 밖의 건강보조식품류 중 선택되는 어느 하나인 것이 좋으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 여성 갱년기 증상 예방 및 개선용 식품 조성물은, 바람직하게 식품 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함하는 것이 좋다. 일 예로, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케니트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 톨리돈, 물, 꿀, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유일 수 있다. 제제화할 경우 보통 사용하는 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 중 선택되는 하나 이상의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.

한편, 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 중 선택되는 하나 이상이 포함되며, 이러한 고형제제는 일 예로, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로즈 또는 락토오즈, 젤라틴 중 선택되는 하나 이상의 부형제가 섞여 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트 같은 윤활제가 사용될 수 있다.

또한, 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 중 선택되는 하나 이상이 사용될 수 있으며, 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보조제가 추가로 더 포함될 수 있다.

본 발명의 여성 갱년기 증상 예방 및 개선 효과를 갖는 식품 조성물은 첨가제를 추가로 함유할 수 있으며, 일 예로, 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제, 착색제 및 충진제(치즈, 초콜렛), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 중 선택되는 하나 이상을 함유할 수 있다. 그 밖에도, 천연 과일 쥬스 및 과일 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 본 발명의 복합물 100중량부 대비 0~50중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 여성 갱년기 증상 예방 및 개선 효과를 갖는 식품 조성물에 있어서, 상기 "여성 갱년기 증상"은 폐경기 여성에게서 호르몬 생산의 감소로 인하여 발생하는 증상을 의미하고, 갱년기 또는 폐경기 증상은 일 예로, 안면홍조, 발한, 수면 중 발한, 피부 건조, 질 건조증, 질 위축, 하부 요도 위축, 성교 통, 질염, 방광염, 배뇨통, 급뇨, 집중장애, 단기 기억장애, 불안, 신경과민, 기억력 감소, 성욕 감퇴, 근육통, 관절통 또는 골다공증 중 선택되는 하나 이상일 수 있다.

한편, 포도(Vitis vinifera L)는 세계에서 가장 광범위하게 재배되는 덩굴성의 과수로 갈대나무목(Rhamnales), 포도과(Vitaceae)에 속하며, 유럽 포도와 아메리카 포도로 대별된다. 포도 열매는 탄수화물의 함량이 많으며, 그 중 당분으로서는 포도당이 주이고, 그 밖의 당류는 매우 적다. 그 외에, 비타민 B, C가 소량 함유되어 있다. 과즙에는 주석산, 능금산, 구연산, 포도산, 사루칠산이 함유되어 있다. 포도는 건위, 이뇨, 강장, 지갈에 효과가 있다. 포도 중량의 3~5%를 차지하는 포도씨는 가공 후 부산물로서, 페놀 화합물과 카테킨 성분 등 생리활성물질을 함유하고 있다고 보고되어 있다. 특히 카테킨의 활성산소 소거에 대한 연구가 최근 보고되어 천연 항산화제로서의 이용에 대한 관심이 높아지고 있다.

한편, 발레리안(Valeriana officinalis)은 서양쥐오줌풀이라고 하며, 마타리과에 속하는 다년생 식물로서, 높이 1~2미터 정도의 짙은 청색잎과, 흰색 또는 핑크색의 꽃을 피운다. 주로 유럽과 북아시아 지역에서 발견되며 이미 고대로부터 약초로 사용되어 왔으며, 그 뿌리는 기원전부터 사용된 것으로 나타나 있다. 이 식물의 뿌리나 근경(rhizomes) 추출물은 여러 가지 효능을 나타내는 것으로 알려져 있는데 그 대표적인 경우를 보면 수면보조(sleep aid), 진정(sedative), 불안제거(anxiolytic), 항경련(anti-convulsant) 및 진통작용(pain relieve)을 들 수 있다.

한편, 홍화(safflower, Carthamus tinctoris)는 잇꽃이라 하는 국화과에 속하는 일년생 초목으로 한국, 일본, 중국 등지에서 약용을 주목적으로 재배해 왔다. 홍화씨에는 지방이 다량 함유되어 있는데, 특히 리놀레산(linoleic acid)의 함량이 높아 혈중 콜레스테롤 저하 작용을 나타낸다고 보고되어 있다.

본 발명의 포도씨 추출물, 발레리안 추출물 및 홍화씨 추출물로 조성된 복합물은 우수한 파골세포 분화 억제, 조골세포 활성 증진, 에스트로겐 수용체 발현 증가, IGF-1 및 오스테오칼신(osteocalcin) 발현 증가가 우수하여, 여성 갱년기 증상 예방 및 개선 효과를 발휘한다. 또한, 본 발명은 독성이 없고, 부작용이 없으며, 인체에 무해한 천연 추출물로 조성된 복합물을 유효성분으로 함유하는 여성 갱년기 증상 예방 및 개선 효과가 우수한 식품 조성물을 제공할 수 있다.

도 1은 본 발명의 포도씨 추출물, 발레리안 추출물 및 홍화씨 추출물로 조성된 복합물이 파골세포의 형성에 미치는 영향을 확인하고자 TRAP를 확인한 실험 결과 그래프이다 (P<0.05).
도 2는 본 발명의 포도씨 추출물, 발레리안 추출물 및 홍화씨 추출물로 조성된 복합물이 파골세포의 형성에 미치는 영향을 확인하고자 RANKL을 확인한 실험 결과 그래프이다 (P<0.05).
도 3은 본 발명의 포도씨 추출물, 발레리안 추출물 및 홍화씨 추출물로 조성된 복합물이 조골세포 활성에 미치는 영향을 확인하고자 염기성 인산분해효소(ALP)의 활성을 측정한 실험 결과 그래프이다 (P<0.05).
도 4는 본 발명의 포도씨 추출물, 발레리안 추출물 및 홍화씨 추출물로 조성된 복합물이 조골세포 활성에 미치는 영향을 확인하고자 염기성 인산분해효소(ALP)의 발현을 측정한 실험 결과 그래프이다 (P<0.05).
도 5는 본 발명의 포도씨 추출물, 발레리안 추출물 및 홍화씨 추출물로 조성된 복합물이 IGF-1 유전자 발현에 미치는 영향을 확인한 실험 결과 그래프이다.
도 6은 본 발명의 포도씨 추출물, 발레리안 추출물 및 홍화씨 추출물로 조성된 복합물이 에스트로겐 수용체의 발현에 미치는 영향을 확인한 실험 결과 그래프이다 (P<0.05).
도 7은 본 발명의 포도씨 추출물, 발레리안 추출물 및 홍화씨 추출물로 조성된 복합물이 오스테오칼신 발현에 미치는 영향을 확인한 실험 결과 그래프이다 (P<0.05).

이하, 본 발명의 구성을 하기 실시예를 통해 구체적으로 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.

[ 제조예 1: 포도씨 추출물의 제조]

포도씨 1 kg을 건조 후, 마쇄하여 얻은 분말 300 g을 집기병에 담은 후, 70% 주정 1.8 ℓ를 넣고, 85℃에서 3시간으로 2회 반복 추출하여 포도씨 추출액을 수득하였다. 그 후, 여과지(whatman No.1, England)로 감압 여과한 후, 진공회전농축기로 60℃에서 감압 농축한 다음 분무 건조하여 포도씨 추출물을 제조하였다.

[제조예 2: 발레리안 추출물의 제조]

발레리안 뿌리 1 kg을 건조 후, 마쇄하여 얻은 분말 300 g을 집기병에 담은 후, 70% 주정 1.5 ℓ를 넣고, 70℃에서 6시간으로 3회 반복 추출하여 발레리안 추출액을 수득하였다. 그 후, 여과지(whatman No.1, England)로 감압 여과한 후, 진공회전농축기로 60℃에서 감압 농축한 다음 분무 건조하여 발레리안 추출물을 제조하였다.

[제조예 3: 홍화씨 추출물의 제조]

홍화씨 1 kg을 건조 후, 마쇄하여 얻은 분말 300 g을 집기병에 담은 후, 물 3 ℓ를 넣고, 90℃에서 6시간으로 3회 반복 추출하여 홍화씨 추출액을 수득하였다. 그 후, 여과지(whatman No.1, England)로 감압 여과한 후, 진공회전농축기로 60℃에서 감압농축한 다음 열풍 건조하여 홍화씨 추출물을 제조하였다.

[실시예 1 내지 4: 복합물의 제조]

상기 제조예 1 내지 3에서 제조한 포도씨 추출물, 발레리안 추출물, 홍화씨 추출물을 무게비로 하기 표 1과 같이 배합비를 달리하여 복합물을 제조하였다.

	포도씨 추출물 (중량%)	발레리안 추출물 (중량%)	홍화씨 추출물 (중량%)
실시예 1	20	30	50
실시예 2	30	30	40
실시예 3	10	50	30
실시예 4	30	40	30

[ 실험예 1: 복합물이 골다공증의 지표인 TRAP( Tartrate -resistant acid phosphatase) 활성에 미치는 영향 확인]

본 실험예에서는 제조예 1 내지 3에서 제조한 단일추출물과, 실시예 1 내지 4에서 제조한 복합물이 TRAP(Tartrate-resistant acid phosphatase) 활성에 미치는 영향을 확인하고자 하였다.

TRAP(Tartrate-resistant acid phosphatase)은 파골세포의 지표로 TRAP의 낮은 활성은 파골세포 분화가 억제되었음을 나타낸다.

MC3T3-E1 세포를 파골세포로 분화시킬 목적으로 7주령 C57BL/6 암컷 마우스의 대퇴골 골수(femoral bone marrow) 세포를 적출하여, MC3T3-E1 세포와 함께 MEM 배양액(minimum essential medium, 10% FBS, 100 U/ml peniciline과 100 g/ml streptomycin)으로 배양하였다.

MC3T3-E1 세포(1.5×10⁴ cells/well)와, 골수(bone marrow) 세포(5×10⁵ cells/well)를 24 웰 플레이트(well plate)에 시딩(seeding)하고, MEM 배양액에 10^-8 M 1,25(OH)₂ vitamin D_3, 10^-7 M 덱사메타손(dexamethasone)과 함께 시료(제조예 1 내지 3, 실시예 1 내지 4)를 50 ㎍/ml 농도로 각각 처리해주었다. 배양액은 3일마다 교체하였고, 세포는 7일간 배양하였다.

7일간 배양 후, PBS(phosphate buffer saline)으로 세포를 두 번 세척하고, 세포용해 완충액(lysis buffer)을 이용하여, 세포를 긁어(scrap) 수집한 후, 10초 간격으로 초음파처리(sonication)를 4회 시행하여 'cell lysate'를 수득하였다.

TRAP 활성도(TRAP activity) 측정 키트(kit)는 'Lifespan Biosciences'로부터 'ELISA kit'를 구입하여, 제조사의 방법에 따라 450 nm에서 측정하였다.

'1,25(OH)₂ vitamin D₃'를 처리하지 않은 군을 일반군으로 하였으며, '1,25(OH)₂ vitamin D₃'를 처리한 후, 시료를 처리하지 않은 군을 대조군으로 하여, 그 결과는 하기 표 2에 나타내었다. 실험군간의 유의차는 'ANOVA' 분석을 사용하였으며, 유의성 평가는 p<0.05로 하였다.

	TRAP(% of control)
일반군	11±11.4^d
대조군	100.2±2.86^a
실시예 1	81.6±4.51^c
실시예 2	82.2±3.03^c
실시예 3	89.6±4.28^b
실시예 4	85.4±2.61^bc
제조예 1	93.6±3.43^ab
제조예 2	97.8±2.77^a
제조예 3	94.6±2.61^a

실험결과, 단일 추출물(포도씨 추출물, 발레리안 추출물, 홍화씨 추출물)보다, 포도씨 추출물, 발레리안 추출물 및 홍화씨 추출물로 조성된 복합물이 낮은 TRAP 활성을 나타냄을 확인할 수 있었다. 또한, 복합물 중 실시예 1(포도씨 추출물 20중량%, 발레리안 추출물 30중량%, 홍화씨 추출물 50중량%)이 가장 낮은 TRAP 활성을 나타냄을 확인할 수 있었다.

하기 실험예에서는 효과가 가장 우수한 것으로 나타난 실시예 1을 이용하여 실험을 진행하였다.

[ 실험예 2: 복합물의 농도가 골다공증의 지표인 TRAP( Tartrate -resistant acid phosphatase) 활성에 미치는 영향 확인]

본 실험예에서는 복합물의 농도에 따라, TRAP 활성에 미치는 영향을 확인하고자 하였다.

MC3T3-E1 세포 (1.5×10⁴ cells/well)와, 골수(bone marrow) 세포 (5×10⁵ cells/well)를 24 웰 플레이트(well plate)에 시딩(seeding)하고, MEM 배양액에 10^-8 M 1,25(OH)₂ vitamin D₃, 10^-7 M 덱사메타손(dexamethasone)과 함께 복합물(실시예 1)을 0, 20, 50, 100 ㎍/ml의 농도로 각각 처리해주었다. 배양액은 3일마다 교체하고, 세포는 7일간 배양하였다.

7일간 배양 후, 세포를 PBS로 두 번 세척하고, 세포용해 완충액(lysis buffer)을 이용하여, 세포를 긁어(scrap) 수집한 후, 10초 간격으로 초음파처리(sonication)를 4회 시행하여 'cell lysate'를 수득하였다.

TRAP 활성도(TRAP activity) 측정 키트(kit)는 'Lifespan Biosciences'로부터 'ELISA kit'를 구입하여 450 nm에서 측정하였다. 1,25(OH)₂vitamin D₃를 처리하지 않은 군을 일반군으로 하였으며, 복합물을 처리하지 않은 군을 대조군으로 하였다.

실험결과, 복합물(실시예 1)을 50 ㎍/ml와, 100 ㎍/ml 농도로 처리하였을 때, 농도 의존적으로 TRAP의 활성이 유의성 있게 억제되는 것을 확인할 수 있었다.

이와 같은 결과로부터, 복합물의 농도에 의존적으로, 파골세포 분화억제 효과가 향상되는 것을 확인할 수 있었다 (도 1). 도 1은 본 발명의 포도씨 추출물, 발레리안 추출물 및 홍화씨 추출물로 조성된 복합물(실시예 1)이 파골세포의 형성에 미치는 영향을 확인하고자 TRAP를 확인한 실험 결과 그래프이다 (P<0.05).

[ 실험예 3: 복합물이 파골세포 분화에 미치는 영향 확인 ( RANKL 발현양 측정)]

본 실험예에서는 복합물의 파골세포 분화억제 효과를 확인하고자 RANKL(Receptor activator of NF-κB ligand) 발현양을 측정하고자 하였다.

RANKL은 'TNF family'의 일원으로 파골세포 분화에서 NF-κB와 MAPKs(mitogen-activated kinase)에 의해 활성화되어(J. Bone Miner Metab. 2014. 32: 598-604), 파골세포 분화의 표지인자로 알려져 있다.

MC3T3-E1 세포(1.5×10⁴ cells/well)와, 골수(bone marrow) 세포(5×10⁵ cells/well)를 24 웰 플레이트(well plate)에 시딩(seeding)하고, MEM 배양액에 10^-8 M 1,25(OH)₂ vitamin D_3, 10^-7 M 덱사메타손(dexamethasone)과 함께 복합물(실시예 1)을 0, 20, 50, 100 ㎍/ml의 농도로 각각 처리해주었다. 배양액은 3일마다 교체하였고, 세포는 7일간 배양하였다.

7일간 배양 후, 세포의 배지를 제거하고, 'Quantikine M mouse RANKL immunoassay kit (R&D System, USA)'를 사용하여 제조사의 방법을 따라 실험하였다. 각 웰(well)은 40분 이내에, 'ELISA reader'를 이용하여, 450 nm에서 측정하였다. 1,25(OH)₂ vitamin D₃를 처리하지 않은 군을 일반군으로 하였으며, 복합물을 처리하지 않은 군을 대조군으로 하였다.

실험결과, 복합물(실시예 1)을 50 ㎍/ml와 100 ㎍/ml로 처리하였을 때 RANKL의 발현양이 농도 의존적으로 줄었음을 확인할 수 있었다.

이와 같은 결과로부터, 복합물의 파골세포 분화억제 효과를 확인할 수 있었다 (도 2). 도 2는 본 발명의 포도씨 추출물, 발레리안 추출물 및 홍화씨 추출물로 조성된 복합물(실시예 1)이 파골세포의 형성에 미치는 영향을 확인하고자 RANKL을 확인한 실험 결과 그래프이다 (P<0.05).

[ 실험예 4: 염기성 인산분해효소(Alkaline phosphatase , ALP) 활성 측정]

조골세포는 세포막에 염기성 인산분해효소(ALP)를 가지고 있는데, 이 효소는 세포의 외막과 석회화 조직에서 높은 농도로 발견되어 석회화 과정 동안 운반, 세포 분열 및 분화의 조절 작용을 하며 조골세포의 활성 표지인자로 알려져 있다 (Int Rev Cytol. 1995. 265-358).

따라서, 본 실험예에서는 복합물이 조골세포의 활성에 미치는 영향을 확인하고자 염기성 인산분해효소(ALP)의 활성을 측정하고자 하였다.

ALP 활성 측정을 위해 MC3T3-E1 세포주를 MEM 배양액과 10 mM 베타-글리세로포스파트(beta-glycerophosphate) 및 50 ㎍/ml 아스코르브산(ascorbic acid)을 6일간 처리하여, 조골세포로 분화시켰다. 분화된 세포를 24 웰 플레이트(well plate)에 시딩(seeding) 한 후, 복합물(실시예 1)을 0, 20, 50, 100 ㎍/ml로 각각 처리하여 3일간 배양하였다.

배양 후, 세포를 PBS로 두 번 세척하고, 세포용해 완충액(lysis buffer)을 이용하여, 세포를 긁어(scrap) 수집한 후, 10초 간격으로 초음파처리(sonication)를 4회 시행하였다. 각 웰(well)에 1 ml의 'reaction mixture (alkaline buffer:stock substration, 1:1)'를 첨가하고, 37℃에서 30분간 배양(incubation)하였다. 측정을 위해 'abcam protocol'을 따라 실험하였으며 최종적으로 1N NaOH를 각 웰(well)에 12 ㎕ 첨가한 후, 405 nm에서 ELISA reader(VERSAMAXSL-20 Molecular Devices, Seoul, Korea)를 이용하여 흡광도를 측정하였다.

실험결과, 복합물을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 복합물을 농도별로 처리한 세포에서 ALP활성이 높게 나타났으며, 특히 20, 50, 100 ㎍/ml 처리함에 따라 농도 의존적으로 ALP활성이 높게 나타남을 확인할 수 있었다.

이와 같은 결과로부터, 복합물의 조골세포 활성 촉진 효과를한 확인할 수 있었다 (도 3). 도 3은 본 발명의 포도씨 추출물, 발레리안 추출물 및 홍화씨 추출물로 조성된 복합물(실시예 1)이 조골세포 활성에 미치는 영향을 확인하고자 염기성 인산분해효소(ALP)의 활성을 측정한 실험 결과 그래프이다 (P<0.05).

[ 실험예 5: 복합물이 염기성 인산분해효소(ALP), IGF -1, 에스트로겐 수용체(Estrogen receptor), 오스테오칼신(Osteocalcin)의 유전자 발현에 미치는 영향 확인]

IGF-1(Insulin-like Growth Factor-1)은 성장호르몬(growth hormone)과 관련 깊은 성장인자로 성장호르몬의 자극을 받은 뇌하수체 전엽에서 분비한다. IGF-1은 연골조직에서 연골세포의 성장과 분화를 촉진시켜 주며 뼈 골격 성장을 촉진하는 기능이 있는 것으로 알려져 있다 (Nat Med. 2003. 9:1033-1038).

에스트로겐 수용체(Estrogen receptor)는 에스트로겐을 수용하는 단백질군으로 각 조직의 핵이나, 세포내 존재하며, 에스트로겐 신호전달 역할을 수행한다. 따라서 갱년기에 에스트로겐이 감소하면서 에스트로겐 수용체가 분포되어 있는 다양한 조직에서 증상들이 나타나게 되는 것이다. 에스트로겐 수용체의 유전자 발현정도를 측정하여 복합물의 에스트로겐 활성(estrogenic activity)을 평가한다.

오스테오칼신(osteocalcin)은 조골세포에 의해 합성되며 골형성 정도를 나타내는 지표로 사용된다. 즉, 혈청 중 오스테오칼신(osteocalcin)의 농도는 조골세포의 활성도를 직접적으로 반영한다고 볼 수 있다.

따라서, 본 실험예에서는 복합물이 염기성 인산분해효소(ALP), IGF-1, 에스트로겐 수용체(Estrogen receptor), 오스테오칼신(Osteocalcin)의 유전자 발현에 미치는 영향을 확인하기 위하여 실시간 중합효소 연쇄반응(Real-time PCR)을 실시하고자 하였다.

MC3T3-E1 세포주를 MEM 배양액과 10 mM 베타-글리세로포스파트(beta-glycerophosphate)와 50 ㎍/ml 아스코르브산(ascorbic acid)을 6일간 처리하여, 조골세포로 분화시켰다. 분화된 세포를 24 웰 플레이트(well plate)에 시딩(seeding) 한 후, 복합물(실시예 1)을 0, 20, 50, 100 ㎍/ml로 각각 처리하여 3일간 배양하였다.

3일간 배양한 세포를 0.25% 트립신-EDTA(trypsin-EDTA)로 수집하여 'RNeasy extraction kit(QIAGEN,USA)'로 제조사의 방법을 따라 총(total) RNA를 추출하고, cDNA의 합성을 위해 'iScriptTMSelect cDNA Synthesis Kit(BIO-RAD, USA)'를 이용하여 5 ㎍ 의 총(total) RNA에 '5×iScript select reaction mix' 4 ㎕, 'oligo(dT) primer set' 2 ㎕, RNA 샘플(sample) 5 ㎕, 'nuclease free water' 8 ㎕를 각각 넣고, 마지막에 'iScript Reverse Transcriptase' 1 ㎕를 넣어 피펫(pipet)으로 'up & down' 하여 골고루 섞어 주었다.

42℃에서 60분, 85℃에서 5분간 반응시킨 후, 합성된 cDNA를 PCR 반응에 사용하였다. Real-time PCR 실험 시 사용한 기계는 'Step One Real-Time PCR system (Applied Biosystems, USA)'이며, 'iQ SYBR Green Supermix (BIO-RAD, USA)'의 방법을 따라 수행하였다.

PCR을 위한 혼합액 최종 농도는 cDNA 2 ㎕ (10~100 ng), '2×iQ SYBR Green Supermix' 10 ㎕, 'forward & reverse primer' 각 1 ㎕(250 nM), H₂O 7 ㎕가 되도록 하였다. 95℃에서 10분간 핫 스타트(hot start) 한 후, 95℃에서 15초간, 55℃에서 15초, 72℃에서 30초간 40 사이클링(cycling)으로 PCR을 수행한 후, 마지막으로 95℃에서 15초, 60℃에서 1분, 95℃ 15초간 마무리 과정을 거쳐 PCR 분석을 시행하였다. 반응에 사용한 프라이머(primer)는 하기 표 3과 같았다.

ALP	forward	5‘-AAC CCA GAC ACA AGC ATT CC-3'
ALP	reverse	5'-GAG ACA TTT TCC CGT TCA CC-3'
IGF-1	forward	5'-ABA CAG GCA TTG TGG ATG AG-3'
IGF-1	reverse	5'-TGA GTC TTG GGC ATG TCA GT-3'
estrogen receptor	forward	5'-GTC TCC GAG CCC GCT GAT GCT ACT GCA C-3'
estrogen receptor	reverse	5'-CGG ATG CCC CTC CAC GGC TAG TGG-3'
osteocalcin	forward	5'-GCA ATA AGG TAG TGA ACA GAC TCC-3'
osteocalcin	reverse	5'-GTT TGT AGG CGG TCT TCA AGC-3'

염기성 인산분해효소(ALP) 발현량 측정결과, 대조군과 비교하여, 복합물을 50 ㎍/ml와 100 ㎍/ml로 처리한 세포에서 농도 의존적으로 유의성 있게 증가한 것을 확인할 수 있었다 (도 4). 도 4는 본 발명의 포도씨 추출물, 발레리안 추출물 및 홍화씨 추출물로 조성된 복합물(실시예 1)이 조골세포 활성에 미치는 영향을 확인하고자 염기성 인산분해효소(ALP)의 발현을 측정한 실험 결과 그래프이다 (P<0.05).

IGF-1 발현량 측정결과, 대조군과 비교하여, 복합물을 50 ㎍/ml와 100 ㎍/ml로 처리한 세포에서, 농도 의존적으로 유의성 있게 증가한 것을 확인할 수 있었다(도 5). 도 5는 본 발명의 포도씨 추출물, 발레리안 추출물 및 홍화씨 추출물로 조성된 복합물(실시예 1)이 IGF-1 유전자 발현에 미치는 영향을 확인한 실험 결과 그래프이다.

에스트로겐 수용체 발현량 측정결과, 대조군과 비교하여, 복합물을 50 ㎍/ml와 100 ㎍/ml로 처리한 세포에서, 농도 의존적으로 유의성 있게 증가한 것을 확인할 수 있었다 (도 6). 도 6은 본 발명의 포도씨 추출물, 발레리안 추출물 및 홍화씨 추출물로 조성된 복합물(실시예 1)이 에스트로겐 수용체의 발현에 미치는 영향을 확인한 실험 결과 그래프이다 (P<0.05).

옥스테오칼신(Osteocalcin) 발현량 측정결과, 대조군과 비교하여, 복합물을 20 ㎍/ml, 50 ㎍/ml, 100 ㎍/ml로 처리했을 때 세포에서, 농도 의존적으로 유의성 있게 증가한 것을 확인할 수 있었다 (도 7). 도 7은 본 발명의 포도씨 추출물, 발레리안 추출물 및 홍화씨 추출물로 조성된 복합물(실시예 1)이 오스테오칼신 발현에 미치는 영향을 확인한 실험 결과 그래프이다 (P<0.05).

이와 같은 결과로부터, 복합물은 조골세포 활성 촉진 효과가 우수하며, 우수한 에스트로겐 활성을 갖고 있음을 확인할 수 있었다.

[ 실시예 5: 여성 갱년기 증상 예방 및 개선 효과를 갖는 식품 조성물의 제조]

본 실시예에서는 하기와 같이 여성 갱년기 증상 예방 및 개선 효과를 갖는 식품 조성물을 제조하였다.

(1) 선식 제조

현미, 보리, 찹쌀, 율무를 공지의 방법으로 알파화시켜 건조시킨 것을 배전한 후, 분쇄기로 입도 60메쉬의 분말로 준비하였다. 검정콩, 검정깨 및 들깨 각각을 공지의 방법으로 쪄서 건조시킨 후, 배전 및 분쇄하여 입도 60메쉬의 분말로 준비하였다. 이후, 현미 30 중량%, 율무 15 중량%, 보리 20 중량%, 찹쌀 9 중량%, 들깨 7 중량%, 검정콩 8 중량%, 검정깨 7 중량%, 본 발명의 포도씨 추출물, 발레리안 추출물 및 홍화씨 추출물로 조성된 복합물(실시예 1) 3 중량%, 영지 0.5 중량% 및 지황 0.5 중량%을 혼합하여 선식을 제조하였다.

(2) 츄잉껌 제조

껌 베이스 20 중량%, 설탕 76.9 중량%, 향료 1 중량%, 물 2 중량% 및 본 발명의 포도씨 추출물, 발레리안 추출물 및 홍화씨 추출물로 조성된 복합물(실시예 1) 0.1 중량%를 배합하여 통상의 방법으로 츄잉껌을 제조하였다.

(3) 캔디 제조

설탕 60 중량%, 물엿 39.8 중량%, 향료 0.1 중량% 및 본 발명의 포도씨 추출물, 발레리안 추출물 및 홍화씨 추출물로 조성된 복합물(실시예 1) 0.1 중량%를 배합하여 통상의 방법으로 캔디를 제조하였다.

(4) 비스킷 제조

박력 1급 25.59 중량%, 중력 1급 22.22 중량%, 정백당 4.80 중량%, 식염 0.73 중량%, 포도당 0.78 중량%, 팜쇼트닝 11.78 중량%, 암모니움 1.54 중량%, 중조 0.17 중량%, 중아황산나트륨 0.16 중량%, 쌀가루 1.45 중량%, 비타민 B0.0001 중량%, 비타민 B0.0001 중량%, 밀크향 0.04 중량%, 물 20.6998 중량%, 전지분유 1.16 중량%, 대용분유 0.29 중량%, 제일인산칼슘 0.03 중량%, 살포염 0.29 중량% 및 분무유 7.27 중량%와 본 발명의 포도씨 추출물, 발레리안 추출물 및 홍화씨 추출물로 조성된 복합물(실시예 1) 1 중량%를 배합하여 통상의 방법으로 비스킷을 제조하였다.

(5) 건강음료 제조

꿀 0.26 중량%, 치옥토산아미드 0.0002 중량%, 니코틴산아미드 0.0004 중량%, 염산리보플라빈나트륨 0.0001 중량%, 염산피리독신 0.0001 중량%, 이노시톨 0.001 중량%, 오르트산 0.002 중량%, 물 98.7362 중량% 및 본 발명의 포도씨 추출물, 발레리안 추출물 및 홍화씨 추출물로 조성된 복합물(실시예 1) 1 중량%를 배합하여 통상의 방법으로 건강 음료를 제조하였다.

(6) 소시지 제조

돈육 65.18 중량%, 계육 25 중량%, 전분 3.5 중량%, 대두단백 1.7 중량%, 식염 1.62 중량%, 포도당 0.5 중량% 및 글리세린 1.5 중량%와 본 발명의 포도씨 추출물, 발레리안 추출물 및 홍화씨 추출물로 조성된 복합물(실시예 1) 1 중량%를 배합하여 통상의 방법으로 소시지를 제조하였다.

(7) 건강보조식품 제조

본 발명의 포도씨 추출물, 발레리안 추출물 및 홍화씨 추출물로 조성된 복합물(실시예 1) 50 중량%, 구아검효소 분해물 16 중량%, 비타민 B염산염 0.01중량%, 비타민 B6 염산염 0.01 중량%, DL-메티오닌 0.23 중량%, 스테아린산 마그네슘 0.7 중량%, 유당 31.2 중량% 및 옥수수전분 1.85 중량%를 배합하여 통상의 방법으로 정제형 건강보조식품을 제조하였다.

Claims

포도씨 추출물 20중량%, 발레리안 추출물 30중량%, 홍화씨 추출물 50중량%로 조성된 복합물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 여성 갱년기 증상 예방 및 개선용 식품 조성물.
삭제
제1항에 있어서,
상기 포도씨 추출물, 발레리안 추출물 및 홍화씨 추출물은,
물, 탄소수가 1 내지 4의 저급 알코올 또는 이의 혼합물을 추출 용매로 하여 추출된 것을 특징으로 하는 여성 갱년기 증상 예방 및 개선용 식품 조성물.
제1항에 있어서,
상기 복합물은,
식품 조성물 전체 중 0.01~50중량% 포함되는 것을 특징으로 하는 여성 갱년기 증상 예방 및 개선용 식품 조성물.