CN101112551A - 含有对于炎症和血液循环疾病显示治疗和预防活性的竹提取物以及由其分离出来的化合物的组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于预防和治疗炎症或血液循环疾病的包含竹植物提取物的组合物。该竹植物提取物通过抑制NO生成而具有强效的抗炎活性，并通过抑制弹性酶活性、愈合血管内皮细胞的伤口、激活u－PA表达并抑制PAI－1表达、减少胆固醇沉积并抑制新内膜形成而具有改善血液循环的活性，因而其可用作治疗和预防炎症或血液循环疾病的治疗剂或保健食品。

Description

含有对于炎症和血液循环疾病显示治疗和预防活性的竹提取物以及由其分离出来的化合物的组合物
本发明是申请日为2004年3月27日的中国专利申请200480001584.9的分案申请，原申请的发明名称为“含有对于炎症和血液循环疾病显示治疗和预防活性的竹提取物以及由其分离出来的化合物的组合物”。
技术领域
本发明涉及竹提取物以及由其分离出来的对于炎症和血液循环疾病显示治疗和预防活性的化合物。
背景技术
血液循环障碍是由血管上沉积的胆固醇和增加的血栓引起的血流堵塞以及血管壁弹力减弱而引发的。血液循环障碍的代表性症状是手足麻木、颈肩痛挛、记忆衰退、昏睡、注意力减弱、眩晕和慢性疲劳等，其通常给正常的生活带来困难。高脂血症是血液中血脂参数升高的病情，其是血液循环障碍的一个例子。这一病情表明血液中脂肪浓度异常地高。循环血中脂质成分为总胆固醇、低密度脂蛋白、极低密度脂蛋白或甘油三酯。
外在污染物例如细菌、真菌、病毒、包括对其产生炎性应答和生物物理过程的各种变异原的侵入引发了炎症。炎性应答的特征症状是系列和复杂的生理应答如酶活性增强、炎症介质释放、流体浸润、细胞移动、组织破裂以及伴随外在症状如红斑、水肿、发热、疼痛等。
NO(一氧化一氮)，由NOS(一氧化一氮合酶)形成的炎性应答因子，作用于L-精氨酸通过一种中间体(羟基精氨酸)形成终产物，即，NO和瓜氨酸。底物的分子量较小且已发现其作用于血管系统诱导血管舒张、血小板凝集和粘连、神经元传递(neuronal transmission)、胃肠运动并在控制代谢路径和生理反应如神经元传递、凝血、血压调节和对癌细胞的免疫等中起重要作用。因为其游离基结构且在空气中易于转变为稳定的终产物即NO3和NO2因而是高毒性的(Snyder S.H.等，Scientific American，May pp28-35，1992)。
根据对于钙离子或钙调节素的依赖性，NOS可分为cNOS(组成性NOS)和iNOS(可诱导NOS)；其中依赖于钙离子或钙调节素的cNOS主要存在于脑、上皮细胞、中性粒细胞、胃粘液细胞等；其中不依赖于钙离子或钙调节素的iNOS主要存在于巨嗜细胞、肝细胞、癌细胞等并被几种因子例如细胞因子如IL-1β，IFN-γ，TNF-α或内毒素如细菌LPS(Dinerman，J.L.等，Circ.Res.，73，pp217-222，1993)诱导。iNOS表达与COX-2表达紧密相关，因此形成的NO可影响COX-2的表达(Robert C.等，J.Immunol.，165，pp1582-1587，2000；DanielaS.，等，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA，90，pp7240-7244，1993)。
此外，已有许多关于由iNOS引起的NO生成与各种炎性疾病如动脉粥样硬化、关节炎、胃炎、结肠炎、肾炎、肝炎、癌症或各种退行性疾病之间关联的报道(Gobert A.P.等，J.Immunol.168(12)，pp6002-6006，2002；Dijkstra G.等，Scand.J.Gastroenterol.，37(5)pp546-554，2002；Sakac V.and Sakac M.Med.Pregl.，53，pp463-474，2000；Albrecht E.W.等，Am.J.Transplant，29(5)，pp448-453，2002；Ramachandran A.等，Free Radical Biol.Med.，33(11)，pp1465-1474，2002；Sartor L.等，Biochemical Pharmacol.，64，pp229-237，2002；Sadowska Krowicka H.等，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.，217(3)，pp351-357 1998；Lo A.H.等，Carcinogenesis，23(6)pp983-991，2002)。
因此，已有的研究通过发现对于由iNOS引起NO的生成的有效抑制剂，开发了药物、保健食品或食品添加剂治疗和预防上述各种炎症疾病。
属于Bambusaceae或Poaceae的竹分布于亚洲各国包括韩国和日本。全世界大约有1259种竹。其中，属于Bambusaceae的代表性竹是桂竹(Phyllostachys bambusoides SIEB.Et Zucc)、紫竹(Phyllostachys nigra MUNRO)、淡竹(Phyllostachys nigra MUNROvar.henonis STAPF)和毛竹(Phyllostachys pubescens MAZEL exH.de LEH)，属于另一种Poaceae的代表性竹是Sase borealisMakino、Sasa coreana Nakai、Sase japonica Makino、Sase borealisvar.gracilis、Sasa palmata Nakai、Setaria viridis BEAUV和Oryza sativa L.
已有一些报道关于竹提取物的应用，例如韩国专利公开号10-2001-69130公开了从Sasa japonica Makino中制备叶子提取物的方法并利用其抗微生物活性将其用作食品防腐剂；美国专利号3418311公开了从竹中分离的多糖具有抗癌活性。
但是，在上面引用的任一文献中都没有关于竹提取物以及从中分离的化合物治疗炎症或血液循环疾病的报道或公开，上述文献在此引入作为参考。
为了通过几种生化试验研究证明竹提取物以及从中分离的化合物对炎症或血液循环疾病的治疗或预防作用，本发明的发明者深入进行了几种生理试验即对LPS活化的巨嗜细胞诱导NO或PLA2生成的体外抑制测验以及对几种在溶栓活性、控制血液流动和血管中细胞生长中起重要作用的基因如u-PA、eNOS和VEGF表达的作用，同时进行了细胞毒试验以及使用LDL受体缺陷小鼠和正常小鼠的动物模型试验，最终证实了提取物和从中分离的化合物对炎症或血液循环疾病具有治疗和预防活性，从而完成了本发明。
本发明的这些以及其它目的将明显体现在此后提供的本发明详细描述中。
发明详述
本发明提供了一种包含竹提取物或从中分离的化合物作为活性成分的药物组合物，其量可有效治疗和预防由NO过度生成引起的炎性疾病。
本发明提供了一种包含竹提取物或从中分离的化合物作为活性成分的药物组合物，其量可有效治疗和预防血液循环疾病。
本发明还提供了上述提取物或化合物用于制备治疗和预防炎性疾病和血液循环疾病的药物组合物的应用。
本发明还提供了包含上述提取物或化合物的卫生保健食品，它用于通过抑制NO生成和血液循环疾病而预防或缓解炎性疾病。
因此，本发明的目的在于提供包含竹植物粗提取物、可溶于极性溶剂或非极性溶剂的提取物作为治疗和预防心血管疾病活性成分的药物组合物。
本发明的目的在于提供包含竹植物粗提取物、可溶于极性溶剂或非极性溶剂的提取物作为治疗和预防血液循环疾病活性成分的药物组合物，其通过抑制弹性蛋白酶活性、愈合血管内皮细胞伤口、激活u-PA表达、抑制PAI-1表达、降低胆固醇沉积和抑制新内膜形成而起作用。
本发明的目的在于提供包含竹植物粗提取物、可溶于极性溶剂或非极性溶剂的提取物通过抑制NO生成和磷脂酶A2表达而作为治疗和预防炎症活性成分的药物组合物。
此处公开的术语“粗提取物”包含使用水，低级醇如甲醇、乙醇，优选甲醇等，或者其混合物提取植物原料而制备的提取物。
此处公开的术语“可溶于极性溶剂的提取物”可使用极性溶剂例如水，低级醇如甲醇、乙醇，优选丁醇等，或者其混合物提取上述粗提取物而制备。
此处公开的术语“可溶于非极性溶剂的提取物”可使用非极性溶剂例如己烷、乙酸乙酯或二氯甲烷优选乙酸乙酯提取上述粗提取物而制备。
因此，本发明的另一目的在于提供包含从竹植物提取物中分离的麦黄酮和对香豆酸作为治疗和预防心血管疾病活性成分的药物组合物。
本发明的另一目的在于提供包含从竹植物提取物中分离的麦黄酮和对香豆酸作为治疗和预防血液循环疾病活性成分的药物组合物，其通过抑制弹性蛋白酶活性、愈合血管内皮细胞伤口、增加VEGF、u-PA和eNOS基团表达而起作用。
本发明的另一目的在于提供包含从竹植物提取物中分离的麦黄酮和对香豆酸通过抑制NO生成而作为治疗和预防炎症活性成分的药物组合物。
此处公开的术语“竹“包括属于Bambusaceae或Poraceae的竹的茎或叶。优选属于Bambusaceae的植物是桂竹(Phyllostachysbambusoides SIEB.Et Zucc)、紫竹(Phyllostachys nigra MUNRO)、淡竹(Phyllostachys nigra MUNRO var.henonis STAPF)和毛竹(Phyllostachys pubescens MAZEL ex H.de LEH)并更优选淡竹(Phyllostachys nigra MUNRO var.henonis STAPF)。优选属于Poaceae的竹是Sasa borealis Makino、Sasa coreana Nakai、Sasajaponica Makino、Sasa borealis var.Gracilis、Sasa palmataNakai、Setaria viridis BEAUV和Oryza sativa L，并更优选Sasaborealis Makino。
此处公开的术语“u-PA”是尿激酶型纤溶酶原活化子基因(纤维蛋白溶解因子)，“PLA2”是磷脂酶A2基因，“VEGF”是血管内皮生长因子基因，“eNOS”是内皮一氧化一氮合酶基因以及“PAI-1”是纤溶酶原活化子抑制剂1基因。
本发明的目的在于提供竹植物的粗提取物、可溶于极性溶剂或非极性溶剂的提取物用于制备治疗和预防炎性疾病的药物的用途，其通过在人或哺乳动物体内抑制NO生成和PLA2表达而起作用。
本发明的目的在于提供竹植物的粗提取物、可溶于极性溶剂或非极性溶剂的提取物用于制备治疗和预防血液循环疾病的药物的用途，其通过抑制弹性蛋白酶活性、愈合血管内皮细胞伤口、激活u-PA表达、抑制PAI-1表达、降低胆固醇沉积和抑制新内膜形成而其作用。
本发明的目的在于提供一种在哺乳动物体内通过抑制NO生成而治疗和预防炎症的方法，包括给予所述哺乳动物有效量的竹提取物的粗提取物、可溶于极性溶剂或非极性溶剂的提取物以及药物学可接受的载体。
本发明的目的在于提供一种在哺乳动物体内通过抑制弹性蛋白酶活性、愈合血管内皮细胞伤口、降低胆固醇沉积和抑制新内膜形成而治疗和预防血液循环疾病的方法，包括给予所述哺乳动物有效量的竹提取物的粗提取物、可溶于极性溶剂或非极性溶剂的提取物以及药物学可接受的载体。
本发明的另一目的在于提供一种保健食品，包括上述提取物或化合物以及饮食学上可接受的添加剂，用于通过抑制NO生成和PLA表达预防和缓解炎性疾病和血液循环疾病。
此处公开的术语“心血管疾病”包括各种心血管疾病如高血压、心脏病、脑中风、外周血液疾病、高脂血症、动脉硬化、狭窄、血栓形成或心脏梗塞等。
此处公开的术语“炎性疾病”包括各种炎性疾病如动脉粥样硬化、关节炎、胃炎、结肠炎、肾炎、肝炎、癌症或各种退行性疾病。
本发明的药物组合物可包含基于该组合物总重约0.1～70重量％的上述提取物或化合物。
本发明的保健食品包含基于该组合物总重0.01至80％、优选1至60重量％的上述提取物或化合物。
上述保健食品可含于保健食品、保健饮料中；并可用作为粉末、颗粒、片剂、咀嚼片、胶囊、饮料。
一种创造性的从竹植物中分离的提取物或化合物可根据下面优选的实施方案制备。
此后，对本发明进行了详细描述。
通过下述方法可制备一种具有创造性的竹植物提取物。
创造性的淡竹(Phyllostachys nigra MUNRO var.henonisSTAPF)或Sasa borealis Makino提取物可如下制备；淡竹(Phyllostachys nigra MUNRO var.henonis STAPF)或Sasa borealisMakino经干燥、切割、碾碎并与5至25倍、优选约10倍体积的蒸馏水、低级醇如甲醇、乙醇、丁醇等或其混合物相混合，优选与甲醇混合；该溶液经20至100℃、优选60至100℃的热水处理1至24小时，其提取方法为使用热水、冷水、回流提取或超声提取1至5次、优选2至3次；过滤残留物得到上清液，并在20至100℃、优选50至70℃经旋转蒸发器浓缩，然后经真空冷冻干燥、热空气干燥或喷雾干燥得到干燥的淡竹(Phyllostachys nigra MUNRO var.henonis STAPF)或Sasa borealis Makino粗提取物粉末，其可溶于水、低级醇或其混合物。
此外，可本发明可溶于极性溶剂和非极性溶剂的提取物可通过下列方法制备：将上步制备的粗提取物悬浮于水中，然后与1至100倍、优选1至5倍体积的非极性溶剂如乙酸乙酯、氯仿、己烷等混合；收集可溶于非极性溶剂层以获得本发明可溶于非极性溶剂的提取物，并收集残余的可溶于极性溶剂层以获得本发明可溶于极性溶剂的提取物，其可溶于水、低级醇或其混合物中。此外，通过本领域公知的常规方法可以对上述方法进行修饰或使其进一步分馏或分离更有效的组分或化合物，例如，这样的方法已公开在文献中(Harborne J.B.Phytochemical methods：A guide to modern techniques of plantanalysis，3rd Ed.pp6-7，1998)。
为了研究竹植物提取物对炎症和血液循环的作用，并证明粗提取物和可溶于非极性溶剂的提取物是否在抑制NO生成和炎症的主因以及改善血液循环方面起重要作用，进行了几种生化试验，并且证实粗提取物、可溶于极性溶剂、非极性溶剂的提取物抑制NO生成、iNOS基因表达、弹性蛋白酶活性和PAI-1基因表达，促进u-PA基因表达并在体外显示愈合伤口、形成导管活性以及抑制胆固醇沉积和新内膜形成。
根据本发明的另一方面，提供了包含由上述制备方法制备的淡竹(Phyllostachys nigra MUNRO var.henonis STAPF)或Sasa borealisMakino粗提取物、可溶于极性溶剂或非极性溶剂作为活性成分的药物组合物，用于通过抑制NO生成治疗和预防炎症。
在本发明的另一方面提供了一种治疗和预防的方法，包括将包含由上述制备方法制备的所述提取物的药物组合物给予包括人的哺乳动物以治疗炎症或血液循环疾病。
用于通过抑制NO生成治疗和预防炎症并改善血液循环的创造性的组合物可包含基于组合物总重0.1～70重量％的上述提取物。
根据本领域公知的使用方法，该创造性的组合物还可包含常规载体、辅料或稀释剂。优选但非限定性的，根据用途和应用方法使用合适物质作为载体。合适的稀释剂列于Remington’s PharmaceuticalScience(Mack Publishing co，Easton PA)著作中。
此后，下面的配制方法和赋形剂仅是例示性的说明而决非对本发明的限制。
根据本发明的组合物可以是包含药学上可接受载体、辅料或稀释剂的药物组合物，这些载体、辅料或稀释剂例如乳糖，葡萄糖，蔗糖，山梨糖醇，甘露糖醇，木糖醇，赤藓糖醇，麦芽糖醇，淀粉，阿拉伯胶橡胶，褐藻酸盐，明胶，磷酸钙，硅酸钙，纤维素，甲基纤维素，聚乙烯基吡咯烷酮，水，羟基苯甲酸甲酯，羟基苯甲酸丙酯，滑石粉，硬脂酸镁或矿物油。该制剂还可以包括填料，抗凝聚剂，润滑剂，润湿剂，调味剂，乳化剂，防腐剂等等。本发明的组合物可以经配制以在通过使用本领域公知的任何方法给予患者后提供活性成分的快速、持续或延迟释放。
例如，本发明组合物可溶于油类、丙二醇或其它通常用于制备注射剂的溶剂中。载体的合适例子包括生理盐水，聚乙二醇，乙醇，植物油，十四烷酸异丙酯，等等，但是不局限于此。对于局部给药，本发明的提取物可被配制为软膏剂和乳剂的形式。
包含本组合物的药物制剂可以被制备为任何形式，如口服剂型(散剂，片剂，胶囊剂，软胶囊剂，含水药剂，糖浆剂，酏剂、丸剂，散剂，香袋，颗粒剂)或局部制剂(乳剂，软膏剂，洗剂，凝胶剂，香膏，贴剂，糊剂，喷雾溶液，气雾剂等)或可注射的制剂(溶液剂，混悬剂，乳剂)。
药物剂型中的本发明组合物可以使用其药学上可接受的盐的形式，也可以单独使用或用于与其它药学上活性化合物适当结合或联合。
本发明的提取物或化合物所需剂量的变化取决于患者的病情和体重、严重程度、药物形式、途径和给药期，并可以由本领域技术人员进行选择。但是，为了获得预期效果，通常推荐给药量在10g/kg、优选1至3g/kg体重/天的本发明的创造性提取物或化合物。该剂量可以在每天单次给予或分成若干次给予。就组合物而言，创造性提取物的量应该在基于该组合物总重的0.01至70重量％、优选0.5至50重量％。
本发明的药物组合物可以通过各种的途径给予受试动物如哺乳动物(大鼠，小鼠，家畜或人类)。包括所有的给药方式，例如，可通过口服、直肠或通过静脉注射、肌肉注射、皮下注射、皮内、鞘内的、硬膜外的或脑室内注射给药。
在此公开的术语“保健食品”包括营养增补剂，营养制品，食品或食品添加剂。
此外，本发明提供一种用于炎症或血液循环预防或改善的保健食品饮料组合物，添加了0.01至80重量％的上述提取物，0.001至5重量％的氨基酸，0.001至2重量％的维生素，0.001至20重量％的糖，0.001至10重量％的有机酸，适当量的甜味剂和调味剂。
上述竹植物提取物可加入饮食中用于炎症或血液循环的预防和改善。
为了开发保健食品，包含本发明上述提取物的可添加食品的例子是各种的食品、饮料、口香糖、维生素复合物、改善健康的食品等等，并可用作粉剂、颗粒剂、片剂、咀嚼片剂、胶囊或饮料等等。
此外，将本发明的提取物加入儿童和婴儿食品如改良奶粉、用于生长期的改良奶粉以及用于生长期的改良食品而预防和改善变态反应性疾病和非变应性炎症疾病。
上述组合物可以加入到食品、辅料(additive)或饮料中，其中上述提取物在食品或饮料中的量通常为用于保健食品组合物的食品总重的约0.1至80w/w％、优选1至50w/w％范围内，以及每100ml该健康饮料组合物中为1至30g、优选3至1g。
假定本发明的健康饮料组合物中包含指定比例的作为必要成分的上述提取物，但没有对其它液体成分进行特殊的限定，其中其它成分可以是各种除臭剂或天然碳水化合物如常规饮料。前述天然碳水化合物的例子包括单糖如葡萄糖、果糖等；二糖如麦芽糖、蔗糖等；常规的糖如糊精、环糊精；以及糖醇如木糖醇和赤藻糖醇等。除前述除臭剂外，天然除臭剂如taumatin、stevia提取物如levaudioside A、甘草酸等，以及合成除臭剂如糖精、天冬甜素等均可合意地使用。每100ml本发明饮料组合物中上述天然碳水化合物的量一般在约1至20g范围内，优选5至12g。
前述组分外的其它成分为各种营养剂、维生素、矿物质或电解质、合成的芳香剂、干酪巧克力等矫色剂或改善剂、果胶酸及其盐、藻酸及其盐、有机酸、保护性胶体粘合剂、pH值控制剂、稳定剂、防腐剂、甘油、醇、用于碳酸饮料的碳化剂等等。前述外的其它成分可以是用于制备天然果汁的果汁、果汁饮料和蔬菜饮料，其中成分可单独或组合使用。各成分的比例并不重要，但一般在约0至20w/w％每100w/w％本发明的组合物。包含前述提取物的可添加食品的例子是各种食品、饮料、口香糖、维生素复合物、改善健康的食品等等。
该创造性的组合物还包含一种或多种有机酸、如柠檬酸，富马酸，己二酸，乳酸，苹果酸；磷酸盐，如磷酸盐，磷酸钠，磷酸钾，酸焦磷酸盐，多磷酸盐；天然的抗氧化剂，如多酚，儿茶素，α-生育酚，迷迭香提取物，维生素C，绿茶提取物，甘草根提取物，壳聚糖，鞣酸，植酸，等等。
上述竹植物提取物可包括20至90％高浓度液体、粉剂或颗粒形式。
相似地，上述竹植物提取物还可包括一种或多种乳糖，酪蛋白，右旋糖，葡萄糖，蔗糖和山梨糖醇。
因此本发明的创造性提取物无毒副作用，它们可安全使用。
显然，本领域技术人员可不偏离本发明精神而对本发明的组合物、应用和制剂进行修改和变化。
附图说明
本发明的上述和其它目的、特征以及其它优势将根据下面结合附图的详细描述进行清楚地说明，其中；
附图1和2代表麦黄酮和对香豆酸的HPLC分析数据，附图1a代表标准组，附图2代表创造性的竹提取物；
附图3和4表明各种浓度的竹粗提取物和从其分离的组分对NO的抑制作用，附图3代表50μg/ml治疗组，附图4代表100μg/ml治疗组，其中
A：粗提取物，                  B：可溶于正己烷的提取物，
C：可溶于二氯甲烷的提取物，    D：可溶于正丁醇的提取物，
E：可溶于乙酸乙酯的提取物，    F：可溶于水的提取物；
附图5表明竹提取物、麦黄酮和对香豆酸在HUVEC中的细胞毒作用，其中图形条上的数字表示所处理样品的浓度(μg/ml)；
附图6表明竹提取物在HUVEC中的细胞增殖作用；
附图7至9表明竹提取物、麦黄酮和对香豆酸在含有完全培养基的HUVEC中对mRNA表达的作用，附图7代表VEGF表达，附图8代表u-PA表达且附图9代表eNOS表达，其中图形条上的数字表示所处理样品的浓度(μg/ml)；
附图10至12表明使用HUVEC的体外伤口愈合测验中创造性竹提取物的伤口愈合作用，附图10代表对照组，附图11代表10μg/ml竹提取物治疗组且附图12代表50μg/ml竹提取物治疗组；
附图13至15表明使用HUVEC的体外血管形成测验中创造性竹提取物的血管形成，附图13代表对照组，附图14代表10μg/ml竹提取物治疗组且附图15代表100μg/ml竹提取物治疗组；
附图16表明使用或不使用竹提取物治疗16周(50和100mg/kg)和20周(500mg/kg)的高胆固醇饮食诱导的动脉粥状硬化症小鼠的体重改变；
附图17和18表明在高胆固醇饮食诱导的动脉粥状硬化症小鼠中使用或不使用竹提取物治疗16周(50和100mg/kg)和20周(500mg/kg)，借助计算机辅助成像分析得到的油红0染色的主动脉瓣损伤区域的形态测定。
附图17代表主动脉瓣损伤的冷冻切片的油红0染色照片，其中左图为对照组，中间为使用洛伐他汀治疗的阳性对照组，右图为竹提取物治疗组，附图18代表借助计算机辅助成像分析得到的主动脉瓣损伤区域的形态测定结果。
最佳方式
显然，本领域技术人员可不偏离本发明精神而对本发明的组合物、应用和制剂进行修改和变化。
本发明通过下面的实施例进行更加具体的解释。但是，应理解为本发明不以任何方式限于这些实施例。
实施例
下面的参考实施例、实施例和试验性实施例意在进一步说明本发明而不是限制其范围。
实施例1.竹植物粗提取物的制备
Sasa borealis Makino，Sasa coreana Nakai，Sasa japonicaMakino，Sasa borealis var.gracilis，Sasa palmata Nakai，淡竹(Phyllostachys nigra MUNRO var.henonis STAPF)，桂竹(Phyllostachys bambusoides SIEB.Et Zucc.)，紫竹(Phyllostachys nigra MUNRO)，和毛竹(Phyllostachys pubescensMAZEL ex H.de LEH)植物经洗涤，并室温干燥10天。
将10kg的干燥竹叶子或竹茎切成小片，与100L的70％乙醇混合并将该混合物在80℃加热7小时，重复3次。使用滤纸(Whatman Co.，U.S.A.)过滤提取物。合并滤液并在55～65℃经旋转蒸发器(N-1000，Eyela Co.Japan)减压浓缩并使用冷冻干燥器(Speed Spec 3000，Bio-Rad，U.S.A.)干燥以获得各种竹植物的干燥粗提取物。(参见表1).
[表1]
竹叶 竹茎
Sasa borealis Makino 880g 880g
Sasa coreana Nakai 850g 640g
Sasa japonica Makino 750g 550g
Sasa borealis var.gracilis 810g 760g
Sasa palmata Nakai 9070g 790g
淡竹(Phyllostachys nigra MUNRO var.henonis STAPF) 810g 740g
桂竹(Phyllostachys bambusoides SIEB.Et Zucc.) 1030g 870g
紫竹(Phyllostachys nigra MUNRO) 840g 870g
毛竹(Phyllostachys pubescens MAZEL ex H.de LEH) 1160g 840g
实施例2.可溶于极性溶剂和非极性溶剂的Phyllostachys nigra提取物
2-1.可溶于正己烷的提取物的制备
在实施例1中制备的50g Phyllostachys nigra粗提取物悬浮于1升的蒸馏水中，将该悬浮液与1升正己烷剧烈混合并分离为可溶于正己烷的部分和可溶于水的部分。收集可溶于正己烷的部分，并将残留溶液再次使用正己烷提取。重复上述方法3次。真空蒸发可溶于正己烷的部分，得到9.1g可溶于正己烷的Phyllostachys nigra提取物。
2-2.可溶干二氯甲烷的提取物的制备
在实施例2-1中制备的可溶于水的Phyllostachys nigra部分与等体积二氯甲烷剧烈混合以分成可溶于二氯甲烷的部分和可溶于水的部分。收集可溶于二氯甲烷的部分并将残留溶液再次使用二氯甲烷提取。重复上述方法3次。真空蒸发可溶于二氯甲烷的部分，得到4.6g可溶于二氯甲烷的Phyllostachys nigra提取物。
2-3.可溶于乙酸乙酯的提取物的制备
实施例2-2中可溶于水的Phyllostachys nigra部分与等体积乙酸乙酯剧烈混合以分成可溶于乙酸乙酯的部分和可溶于水的部分。收集可溶于乙酸乙酯的部分并将残留溶液再次使用乙酸乙酯提取。重复上述方法3次。真空蒸发可溶于乙酸乙酯的部分，得到4.3g可溶于乙酸乙酯的Phyllostachys nigra提取物。
2-4.可溶于正丁醇和水的提取物的制备
实施例2-3中可溶于水的Phyllostachys nigra部分与等体积正丁醇剧烈混合以分成可溶于正丁醇的部分和可溶于水的部分。收集可溶于正丁醇的部分并将残留溶液再次使用正丁醇提取。重复上述方法3次。分别真空蒸发可溶于正丁醇和可溶于水的部分得到7.1g可溶于正丁醇和25.1g可溶于水的Phyllostachys nigra提取物。
实施例3.可溶于极性溶剂和非极性溶剂的Sasa borealis提取物(1)
如表2所示，根据如上面实施例2中公开的同样方法制备各种可溶于极性溶剂和非极性溶剂的提取物。
[表2]
    量
粗提取物     57g
可溶于正己烷的提取物     9.5g
可溶于二氯甲烷的提取物     4.1g
可溶于乙酸乙酯的提取物     4.8g
可溶于正丁醇的提取物     27.9g
可溶于水的提取物     27.9g
实施例4.可溶于极性溶剂和非极性溶剂的Sasa borealis提取物(2)
实施例1中制备的来自Sasa borealis Makino茎的干燥提取物经如下方法分馏。
100g实施例1中得到的粗提取物悬浮于1000ml蒸馏水中。通过单独的漏斗向其中加入1000ml氯仿并剧烈振荡以分成可溶于氯仿的层和可溶于水的层。收集可溶于氯仿的部分并再次将残留溶液使用氯仿提取。
重复上述方法3次分离可溶于氯仿的成分，收集可溶于氯仿的部分并减压干燥，得到17.8g可溶于氯仿的部分。
上述可溶于水的部分与等体积乙酸乙酯混合，分成可溶于乙酸乙酯的部分和可溶于水的部分。该分配过程重复三次。
通过旋转蒸发器浓缩上述可溶于乙酸乙酯层，减压干燥获得15.4g可溶于乙酸乙酯的提取物。
最后，还得到可溶于水层，用作下面试验的样品。
实施例5.麦黄酮和对香豆酸的分离
实施例4中制备的10g可溶于乙酸乙酯的部分经硅胶柱色谱而分离麦黄酮和对香豆酸。
将10g乙酸乙酯部分装填于硅胶柱上并逐步使用含有线性梯度的氯仿：丙酮(100∶1→1∶1)的溶剂混合物洗脱得到7个亚部分。在7个部分中，第4个部分经甲醇重结晶从中分离出26mg黄色结晶。
使用TLC板(硅胶60 F254板，层厚度0.2mm，20×20，MerckCo，Germany)对上述制备的黄色结晶进行薄层色谱并使用氯仿∶甲醇(20∶1)混合物作为展开剂。TLC结果表明，该结晶在茴香醛-H2SO4处理中被检测为黄色斑点，并在365nm UV光(Power wave-XS，Bio-Tek，USA)下被检测为深棕色斑点，Rf为0.4(溶剂系统：CHCl3∶MeOH＝20∶1)。
NMR光谱仪(1H：300MHz，13C：75MHz，DRX 300，Bruker，Germany)的1H和13C-NMR数据结果表明该黄色结晶被鉴定为麦黄酮，光谱数据如下所示。
麦黄酮：C17H14O7
1H-NMR(300MHz，d6-DMSO)：δ12.96(5-OH，1H，s)，7.33(H-2′，H-6′，2H，s)，6.97(H-3，1H，s)，6.56(H-8，1H，d，J＝2.0Hz)，6.21(H-6，1H，d，J-2.0Hz)，3.89(-OCH3，6H，s).
13C-NMR(75MHz，d6-DMSO)：δ182.66(C-4)，164.96(C-2)，164.53(C-7)，162.26(C-5)，158.21(C-9)，149.07(C-3′，5′)，140.74(C-4′)，121.30(C-1′)，105.32(C-3)，104.61(C-2′，6′)，104.46(C-10)，99.69(C-6)，95.04(C-8)，57.26(-OCH3)
在7个部分中，第7个部分经制备HPLC得到4.2mg苯丙酸样(phenyl propanoid)化合物，所分离的苯丙酸样化合物经下列的NMR光谱仪(1H：300MHz，13C：75MHz，DRX 300，Bruker，Germany)的1H-NMR光谱结果被鉴定为对香豆酸衍生物，HPLC分析的保留时间与购自Sigma公司的对香豆酸标准品数据相当(参见附图.1和2)。
对香豆酸：C9H8O3
1H-NMR(300MHz，d6-DMSO)：δ7.5(H-2，H-6，2H，d.，J＝8.4Hz)，7.48(H-γ，1H，d.，J＝16.2Hz，6.79(H-3，H-5，2H，d.，J＝8.4Hz)，6.285(H-β，1H，d.，J＝16.2Hz).
实施例6.麦黄酮和对香豆酸的含量分析
Sasa borealis Makino，Sasa coreana Nakai，Sasa japonicaMakino，Sasa borealis var.gracilis，Sasa palmata Nakai，淡竹(Phyllostachys nigra MUNRO var.henonis STAPF)，桂竹(Phyllostachys bambusoides SIEB.Et Zucc.)，紫竹(Phyllostachys nigra MUNRO)或毛竹(Phyllostachys pubescensMAZEL ex H.de LEH)茎和竹叶提取物各10g通过HPLC(Hitachi Co.L-7000 model)用于分析麦黄酮和对香豆酸在植物不同部位的含量。在表3中所示条件下进行HPLC分析。
[表3]
时间(min) A* B**     C***
0 100 0     0
30 0 100     0
60 0 100     0
65 0 0     100
75 0 0     100
80 100 0     0
85 100 0     0
A*溶液：含0.1％H3PO4的ACN∶H2O(1∶9)溶液B**溶液：含0.1％H3PO4的ACN∶H2O(25∶75)溶液C***溶液：100％CAN条件：固定相(phenomenex C18，4.6×250mm，5μm)于35℃，检测器波长(330nm)，以50000ppm注射10μl的样品。
麦黄酮和对香豆酸在各种竹叶提取物和竹茎提取物中的含量分别示于表4和表5中。
[表4]
叶(70％乙醇提取物)
麦黄酮 对香豆酸
Sasa borealis Makino 13mg 26mg
Sasa coreana Nakai 15mg 34mg
Sasa japonica Makino 14mg 5mg
Sasa borealis var.gracilis 5mg 7mg
Sasa palmata Nakai 3mg 1.3mg
淡竹(Phyllostachys nigra MUNRO var.henonisSTAPF) 18mg 34mg
桂竹(Phyllostachys bambusoides SIEB.EtZucc.) 5mg 1.5mg
紫竹(Phyllostachys nigra MUNRO) 5mg 39mg
毛竹(Phyllostachys pubescens MAZEL ex H.deLEH) 3mg 2.1mg
[表5]
    茎(70％乙醇提取物)
    麦黄酮     对香豆酸
Sasa borealis Makino     18mg     52mg
Sasa coreana Nakai     28mg     83mg
Sasa japonica Makino     23mg     16mg
Sasa borealis var.gracilis     7mg     17mg
Sasa palma ta Nakai     5mg     11mg
淡竹(Phyllostachys nigra MUNROvar.henonis STAPF)     26mg     33mg
桂竹(Phyllostachys bambusoidesSIEB.Et Zucc.)     12mg     32mg
紫竹(Phyllostachys nigra MUNRO)     13mg     58mg
毛竹(Phyllostachys pubescensMAZEL ex H.de LEH)     23mg     41mg
参考实施例1.细胞培养和试剂
1-1细胞培养
在37℃ 5％CO2和95％空气的加湿孵育箱中，鼠源巨嗜细胞系RAW264.7细胞(ATCC，Rockville，Maryland，USA)在补充有2.0mM L-精氨酸，100μg/ml青霉素-链霉素和10％胎牛血清的DMEM(Gibco BRLCo.，Ltd.，USA)中生长。每周使用10ml新鲜的DMEM更换培养基4次，每周细胞传代2次。
HUVEC(人脐静脉内皮细胞)培养于覆盖有0.2％明胶瓶(MTT Co.)上的补充有20％FBS、100×抗生素和200×ECGF的EGM-2培养基(Clonetics Co.)中，传代3至5次的细胞用于下面的试验中。
1-2试剂和仪器
使用位于韩国的韩国基础科学院的离心机(Hanil CentrifugeCo.Ltd，Korea)、NMR波谱仪(1H；300MHz，13C；75MHz，DRX 300，Bruker Germany)和UV波谱仪(Power wave-XS model，Bio-Tek Co.Ltd，USA)，硅胶60H(230-400目，Merck，Germany)用作柱层析的吸附剂且硅胶60 F254板(薄层厚度0.2mm，20×2 cm，Art.5554，Merck，Germany)用作TLC板。茴香醛-硫酸试剂用作展开剂并且所有有机溶剂购自韩国的Duksan Chemical.Co.Ltd.。
试验实施例1.动物模型试验
1-1.试验动物
为了评价竹提取物保护血管和改善血液循环的效力，本试验使用了动脉粥状硬化的小鼠模型。
在试验前一周通过给予购自Jackson Co.Ltd.(USA)的六周龄雄性LDL受体缺陷小鼠(B6.129S7-LdlrtmlHer)不断增加脂肪比例的饲料使其适应试验环境，即逐步增加正常饲料的脂肪比例直至高脂肪饲料(第二天为7∶3，第四天为5∶5，第六天为3∶7)。在试验过程中，鼠笼的环境维持在23±2℃的温度以及55±10℃的相对湿度且人工光照至少12小时，每一鼠笼中至少饲养五只小鼠，其能自由进水(消毒的蒸馏水)和进食正常的脂肪饲料(Harlan 2018S，Indianapolis USA)。8周后，只提供高脂肪饲料(Harlan TD88051，动脉粥状硬化饮食，全部脂肪含量约15.8％，胆固醇水平为1.25％，胆酸钠为0.5％，约4kcal/g且35％的热量来自脂肪。约一半的脂肪来自加入的可可脂，另一半来自食物。
1-2.分组和给药期
将蓄积了高脂肪饲料的八周龄雄性LDL受体缺陷小鼠分成两个剂量的给药组和一个高剂量组，各组由六只小鼠组成。注射用蒸馏水用作阴性对照组，以4mg/kg体重的量给予公知的治疗动脉粥状硬化的药物洛伐他汀作为对照组。称量体重后通过强制口服的方式分别以50和100mg/kg体重的量给予两治疗组竹提取物，并且给予高剂量治疗组500mg/kg体重的量，每天两次，持续20周。(参见表6).
[表6]试验组
组别 饮食   动物数
对照组 高脂饮食     6
阳性对照组 高脂饮食+洛伐他汀4mg/kg     6
竹-50 高脂饮食+样品剂量50mg/kg     6
竹-100 高脂饮食+样品剂量100mg/kg     6
竹-500 高脂饮食+样品剂量500mg/kg     6
1-3.试验动物
为了评价竹提取物保护血管和改善血液循环的效力，本试验使用了动脉粥状硬化的小鼠模型。
在试验前一周通过给予购自Jackson Co.Ltd.(USA)的六周龄雄性C57BL/J6小鼠不断增加脂肪比例的饲料使其适应试验环境，即逐步增加正常饲料的脂肪比例直至高脂肪饲料(第二天为7∶3，第四天为5∶5，第六天为3∶7)。在试验过程中，鼠笼的环境维持在23±2℃的温度以及55±10℃的相对湿度且人工光照至少12小时，每一鼠笼中至少饲养五只小鼠，其能自由进水(消毒的蒸馏水)和进食正常的脂肪饲料(Harlan 2018S，Indianapolis USA)。8周后，只提供高脂肪饲料(Harlan TD88051，动脉粥状硬化饮食，全部脂肪含量约15.8％，胆固醇水平为1.25％，胆酸钠为0.5％，约4kcal/g且35％的热量来自脂肪。约一半的脂肪来自加入的可可脂，另一半来自食物。
1-4.分组和给药期
将蓄积了高脂肪饲料的八周龄雄性C57 BL/J6小鼠分成由六只小鼠组成的两个剂量的给药组。注射用蒸馏水用作阴性对照组，称量体重后通过强制口服的方式分别以50和100mg/kg体重的量给予两治疗组竹，每天两次，持续6个月。(参见表7)。
[表7]试验组
组别 饮食   动物数
对照 高脂饮食     6
竹-50 高脂饮食+样品剂量50mg/kg     6
竹-100 高脂饮食+样品剂量100mg/kg     6
试验性实施例2.竹提取物和从中分离的化合物对NO生成的作用
为了测验竹提取物及从中分离的化合物对一氧化氮(NO)(其是一种炎症因子)的抑制活性，在使用本发明提取物或化合物处理的细胞中测定了NO的增加。
将200μl的RAW 264.7细胞(1×106cells/ml)播种于96孔微量板(Nunc，Sweden)的各孔中并在包含10％FBS的DMEM培养基中孵育3小时。更新DMEM培养基后，使用1μg/ml的LPS和50μg/ml或100μg/ml的实施例1-5中制备的竹提取物或麦黄酮处理细胞，并在5％CO2孵育箱中于37℃培养20小时。
然后将各孔中100μl的细胞上清液转移至新的96孔板中，向其中加入50μl的Griess试剂(0.1％N-(1-萘基)乙二胺2HCl，含1％磺胺的5％H3PO4的水溶液)，然后室温孵育10分钟。使用ELISA计数器(Power wave-XS，Bio-Tek，USA)于540或550nm处测量吸光度。
如表8和附图3所示，证明了使用100和50μg/ml的竹提取物的样品处理组分别抑制了90％和50％的NO生成，因此，与对照组相比，竹提取物处理组以剂量依赖的方式有效地进行抑制。可溶于非极性溶剂提取物处理组显示较可溶于极性提取物处理组更高的NO抑制率。
[表8]
在从非极性有机溶剂中寻找活性成分时，我们发现实施例5制备的麦黄酮是活性化合物，其在25、12.5和6.5μg/ml显示了强的NO抑制率，此浓度下没有显示毒性(参见表9)
[表9]
麦黄酮的浓度(μg/ml) NO抑制率(％) 细胞生存能力(％)
    50 49.7±0.007     49
    25 74.6±0.009     80
    12.5 71.2±0.003     92
    6.5 52.0±0.015     96
    3.25 38.1±0.005     99
    1.625 25.9±0.006     126
试验实施例2.竹提取物对弹性蛋白酶活性的作用
为了测验竹提取物对血管的作用，使用弹性蛋白酶处理创造性的竹提取物，弹性蛋白酶可降解负责维持血管弹性和强度的弹性蛋白。
将实施例1-5制备的各竹提取物或部分稀释成20、2和0.2mg/ml并向96孔板的各孔中等分加入50μl。向其中加入浓度为0.15U/ml的商购的弹性蛋白酶(Molecula probe Co.)并还加入浓度为50μg/ml的弹性蛋白。为了测定酶的活性，使用ELISA计数器检测吸光度。
在表10的结果中，P.nigra和S.borealis的创造性提取物在2mg/ml的浓度抑制弹性蛋白酶活性，可溶于二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇的竹提取物部分显示了更强的弹性蛋白酶抑制活性。
[表10]
Figure A20071013733200251
试验实施例3.竹提取物对血管内皮壁伤口愈合的作用
3-1.体内伤口愈合试验
HUVEC在覆盖0.2％明胶的12孔板上融合生长，然后使用细胞刮棒刮伤形成最初的伤口。细胞使用10μg/ml或50μg/ml的竹提取物处理并在5％CO2孵育器中培养。通过照片观察细胞的移动。
在附图10a至12的结果中，使用10-50μg/ml竹提取物处理的HUVEC的移动与对照组相比明显增加，这证实竹提取物显示了对血管内皮细胞的伤口愈合作用。
3-2.体外血管形成试验
用培养基稀释(1∶2)的200μl/孔的基质胶置于24孔板上，于37℃孵育至少30分钟以聚合，并在其上播种1000细胞/孔HUVEC。
使用10μg/ml或50μg/ml竹提取物处理该细胞并在5％CO2孵育器中培养。以固定的时间间隔通过显微镜观察HUVEC的形态改变并拍照。
如附图13至15所示，观察到使用10-50μg/ml竹提取物处理的HUVEC的血管形成与对照组相比明显增加，其证实竹提取物具有潜在的改善血液循环的作用。
试验实施例4.竹提取物和麦黄酮化合物对基因表达的作用
为了研究对基因表达的抑制作用，使用本发明的提取物或化合物处理细胞并将从中提取的RNA用于RT-PCR以评价定量的基因表达。
4-1.竹提取物对iNOS基因表达的作用
为了观察竹提取物对iNOS基因表达的作用，用LPS和各种浓度的(0.032～65μg/ml)Phyllostachys nigra或Sasa borealis创造性提取物或者姜黄素处理1×106的RAW 264.7细胞并孵育24小时。通过常规提取方法使用Trizol试剂(Gibco BRL)提取RNA并用于下面的逆转录聚合酶链反应中。
根据本领域公知的RT反应(25℃ 10分钟，48℃ 30分钟，95℃ 5分钟，4℃ 10分钟，1周期)和后续PR方法(50℃ 2分钟，95℃ 10分钟，95℃ 15秒，60℃ 1分钟，40周期)进行RT-PCR。
作为内标，使用18S核糖体RNA。
如表11所示，通过真时间-基因表达分析可知，iNOS基因表达被抑制90％的浓度对于姜黄素为4μg/ml，对于紫竹(Phyllostachysnigra)为62.5μg/ml，对于Sasa borealis为65μg/ml。
[表11]
  浓度(μg/ml) 基因表达抑制率(％)
LPS 姜黄素 紫竹(P.nigra)   S.borealis
  0.032 40％
  0.16 40％
  0.625 60％   40％
  0.8 40％
  1.25 45％   40％
  4 100％ 90％
  6.25 80％   58％
  12.5 90％ 70％   60％
  25 70％   75％
  62.5 90％   85％
  65   90％
基于上表11的结果，计算了各样品对于iNOS基因表达的IC50并列于下表12中。
[表12]
样品 比较的iNOS表达(％对照，DMSO) ICH(μg/ml)
Conc.(μg/ml)
0.032 0.16 0.625 0.8 1.25 2.5 4 6.25 12.5 20 25 62.5 125 250 625 1250 2500
姜黄素 80.5 75.7 64.4 49.9 1.3 5.3
P.nigra 115.6 125.9 118.5 125 114.1 49.6 31.6 27.2 25.4 23.6 30.2 25.1 25
S.borealis 100 111 105 92 87 44 25 23.1 22 18 21 15 30
4-2.竹提取物对PLA2基因表达的作用
为了观察竹提取物对PLA2酶的作用，与炎症应答相关的炎症因子、1×106个RAW 264.7细胞用LPS和各种浓度的(0.032～65μg/ml)的创造性提取物或者姜黄素处理并孵育24小时。通过常规提取方法使用Trizol试剂(Gibco BRL)提取RNA并用于下面的逆转录聚合酶链反应中。
经分光光度计测定的提取RNA的OD260/OD280值高于1.7并使用变性琼脂糖凝胶电泳确认RNA的纯度。根据本领域公知的RT反应(25℃10分钟，48℃ 30分钟，95℃ 5分钟，4℃ 10分钟，1周期)和后续PCR方法(50℃ 2分钟，95℃ 10分钟，95℃ 15秒，60℃ 1分钟，40周期)进行RT-PCR。
作为内标，使用18S核糖体RNA。
如表13所示，与对照组相比，证实竹提取物以剂量依赖的方式抑制PLA2基因表达。
[表13]
mRNA水平 对照组 相对率 LPS 竹提取物浓度(μg/ml)
0.625  1.25  2.5  6.25  12.5  25
PLA2 1 x 1.8 1.8  1.8  1.8  1.5  1.2  0.9
4-3.竹提取物对u-PA，PAI-1基因表达的作用
根据试验性实施例4-1中描述的方法进行RNA的提取和RT-PCR。
在表14和15的结果中，证实Phyllostachys nigra和Sasaborealis提取物增加了与血栓相关的u-PA(尿激酶型纤溶酶原活化因子)基因的表达，而那些降低的PAI-1基因的表达抑制了纤溶酶原活化因子活性。
[表14]
u-PA(倍数) PAI-1(倍数)
DMSO处理的对照组 1 1
LPS 3.65(诱导) 4.3(诱导)
P.nigra(10μg/ml) 11.58(诱导) 9.56(诱导)
[表15]
u-PA(倍数) PAI-1(倍数)
    DMSO处理组 1 1
    LPS 3.81(诱导) 4.7(诱导)
    S.borealis(10μg/ml) 8.7(诱导) 7.5(诱导)
4-4.麦黄酮时VEGF、u-PA和eNOS基因表达的作用
根据制造商的说明使用Rneasy微试剂盒(cat#74103，QiagenCo.)从HUVEC细胞中分离RNA。使用定量PCR方法(SDS7700，Appliedbiosystems Co.，U.S.A.)进行RT-PCT反应。
将逆转录(RT)获得5μl的cDNA产物等分置于96孔板的各孔中，然后向其中加入含有5.6mM MgCl2、1×PCR缓冲液、2mM dNTP、0.05％明胶、1μM一对各靶基因引物或0.16μM持家基因(housekeeping gene)引物、0.5μM靶基因探针或0.025μM持家基因探针、1.25U的Taq聚合酶的混合物进行聚合酶链反应(PCR)(50℃ 2分钟，95℃ 10分钟，95℃ 15秒，60℃ 1分钟，40周期)。
结果，计数并计算最终的cT值。
在表16和附图7～9的结果中，麦黄酮化合物处理HUVEC增加了VEGF(血管内皮生长因子)、u-PA基因和eNOS(内皮一氧化一氮合酶)的表达，其对萎缩的血管其扩张作用。
[表16]
基因     mRNA表达(倍数)
    对照   0.5μg/ml麦黄酮 1.0μg/ml麦黄酮 5.0μg/ml麦黄酮
u-PA     1   1.619 1.103 2.962
VEGF     1   2.046 1.469 1.545
eNOS     1   3.024 4.711 0.452
试验性实施例5.竹提取物对LDL缺陷小鼠的一般症状和体重变化的作用
为了研究对LDL缺陷小鼠的一般症状和体重变化的作用，在治疗期间每天至少观察一次一般症状的变化并在分组时、样品治疗时刻和试验完成后对小鼠错位时测定体重的变化。结果，我们没有发现小鼠死亡以及诸如外观改变或异常行为等特殊临床症状(参见附图16)。此外，在试验期间没有观察到体重变化，各组的平均体重均增加约2.00±0.6g。
试验性实施例6.竹提取物对LDL缺陷小鼠的血脂变化的作用
为了研究竹提取物对LDL缺陷小鼠血脂变化的作用，进行了下面的试验。
在试验末期，使用0.12％的阿佛丁麻醉所有小鼠并使用肝素处理的毛细管从眶下静脉丛放血。然后在11,000g转速下离心10分钟分离血浆，保存在-70℃备用。在韩国的KRIBB通过三种物质即TC(总胆固醇)、HDLC-C(高密度脂蛋白胆固醇)和TG(甘油三酯)测定血脂值。
如表17所示，结果表明与对照组相比使用50、100和500μg/ml的竹提取物处理的样品处理组以剂量依赖的方式降低了所有的TC(总胆固醇)、HDLC-C(高密度脂蛋白胆固醇)和TG(甘油三酯)值。
[表17]
组别   TG   TC   LDL-C     HDL-C
NC   285±119.02   3207.5±562.64   3125±533.26     25±10.00
洛伐他汀   300.00±14.14   3750.00±42.43   3485.00±304.06     25.00±7.07
竹50   313.33±130.51   3063.33±166.23   2963.33±189.30     40.00±26.46
竹100   240.00±36.06   3000.67±219.62   2903.33±205.02     23.33±5.77
竹500   186.67±32.15   2930.00±278.39   2870.00±278.39     23.33±5.77
试验性实施例7.竹提取物对C57BL/6J小鼠血脂变化的作用
为了研究竹提取物对C57BL/6J小鼠血脂变化的作用，进行了下面的试验。
在试验末期，使用0.12％的阿佛丁麻醉所有小鼠并使用肝素处理的毛细管从眶下静脉丛放血。然后在11,000g转速下离心10分钟分离血浆，保存在-70℃备用。在韩国的KRIBB通过三种物质即TC(总胆固醇)、HDLC-C(高密度脂蛋白胆固醇)和TG(甘油三酯)测定血脂值。
如表18所示，结果表明与对照组相比使用50、100μg/ml的竹提取物处理的样品处理组以剂量依赖的方式降低了所有的TC(总胆固醇)、HDLC-C(高密度脂蛋白胆固醇)和TG(甘油三酯)值。
[表18]
总胆固醇 甘油三酯 HDL-C LDL-C
对照组 366.20±71.06 73.80±19.52 56.00±8.34 84.80±20.04
竹50 282.60±35.52 64.80±15.55 47.40±7.89 62.40±8.62
竹100 285.00±12.25 52.50±9.26 54.25±8.42 57.75±2.36
试验性实施例8.竹提取物对LDL缺陷小鼠动脉硬化的抑制作用
为了研究竹提取物对LDL缺陷小鼠动脉硬化的发生以及损伤进程的抑制作用，进行了下面的试验。
在试验末期，放血后的心脏用溶于0.1M磷酸缓冲液(pH7.4)的4％聚甲醛固定并除去残余血液且使用10％中性福尔马林固定。然后植入OCT化合物，切成0.6μm厚的切片，使用油红O染色并使用Harris苏木精反染色以观察损伤。
通过对位于第三颈血和主动脉瓣之间形成的损伤进行染色并影印计算损伤面积，然后通过计算机辅助形态测定法(TDI显微镜图像分析仪，USA)计算损伤面积，并与对照组进行比较。
结果，与对照组相比样品治疗组抑制约17％的动脉硬化的形成，而作为阳性对照组使用洛伐他汀抑制了约47％，并预防新内膜的形成。
(参见附图17和18)。
试验性实施例9.细胞毒性试验和细胞增殖试验
使用改进的MTT法(J.Immunological Methods，119，pp203-210，1989)测试了实施例5的麦黄酮化合物的细胞毒性。
用制备的各种浓度的麦黄酮处理平底96孔微量板(Nunc，Sweden)上的200μl的HUVEC(2×105细胞/ml)并在37℃培养24小时。
向各孔中加入50μl的MTT溶液(1mg/ml)并在37℃孵育4小时。
然后除去上清液。
为了检测甲结晶，向各孔中再加入100μl DMSO，并使用微板计数器(Power wave-XS，Bio-Tek，USA)进行产色分析(colorigenicanalysis)。
结果，该创造性的麦黄酮化合物在5μg/ml下显示51％的强细胞毒性，但是，竹提取物和对香豆酸没有细胞毒性(参见附图5).
使用细胞增殖ELISA BrdU色度试剂盒(Roche)进行竹提取物的细胞增殖测验。HUVEC被播种于96孔板中，5×103细胞/孔。使用ELISA计数器测定三份平行的细胞板。
结果，竹提取物以剂量依赖的方式增强了强效细胞增殖作用(参 见附图6)
试验性实施例10.动物毒性测验
方法(1)
使用实施例1的提取物对ICR小鼠(平均体重25±5g)和Sprague-Dawley大鼠(235±10g，Jung-Ang Lab Animal Inc.)进行急性毒性试验。由10只小鼠或大鼠组成的四个组分别口服腹膜内给予250mg/kg，500mg/kg，1000mg/kg和5000mg/kg试验样品或溶剂(0.2ml，i.p.)，观察2周。
方法(2)
使用实施例1的提取物对ICR小鼠和Sprague-Dawley大鼠进行急性毒性试验。由10只小鼠或大鼠组成的四个组分别腹膜内给予25mg/kg，250mg/kg，500mg/kg和725mg/kg试验样品或溶剂(0.2ml，i.p.)，并观察24小时。
结果
在任何组或任何性别中没有任何与治疗相关的死亡、临床征兆、体重变化以及其它肉眼可见的改变。这些结果表明本发明制备的提取物是安全有效的。
在下文中，将描述配制方法和各种赋形剂，但本发明不限于此。
代表性的制剂实施例描述如下。
粉剂的制备
实施例1的干燥粉末  50mg
乳糖               100mg
滑石粉             10mg
通过混合上述成分并装填入封闭包装中制备粉剂。
片剂的制备
实施例1的干燥粉末  50mg
玉米淀粉           100mg
乳糖               100mg
硬脂酸镁           2mg
通过混合上述成分并成片制备成片剂。
胶囊的制备
实施例1的干燥粉末  50mg
玉米淀粉           100mg
乳糖               100mg
硬脂酸镁           2mg
通过混合上述成分并通过常规明胶制剂的方法填充明胶胶囊制备片剂。
注射液的制备
实施例1的干燥粉末  50mg
注射用蒸馏水       最佳量
PH控制剂           最佳量
通过常规注射剂制备方法溶解活性成分、控制pH约7.5并然后将所有成分装填入2ml安瓿中并灭菌从而制备注射剂。
液体制剂 
实施例1的干燥粉末  0.1～80g
糖                 5～10g
柠檬酸             0.05～0.3％
焦糖               0.005～0.02％
维生素C            0.1～1％
蒸馏水             79～94％
CO2气体            0.5～0.82％
通过常规液体制剂的方法溶解活性成分、装填所有成分并灭菌制备液体制剂。
保健食品的制备
实施例1的提取物    1000mg
维生素混合物       最佳量
维生素A乙酸酯      70μg
维生素E            1.0mg
维生素B1           0.13mg
维生素B2           0.15mg
维生素B6           0.5mg
维生素B12          0.2μg
维生素C            10mg
生物素                        10μg
烟酰胺(Amide nicotinic acid)  1.7mg
叶酸                          50μg
泛酸钙                        0.5mg
矿物质混合物                  最佳量
硫酸亚铁                      1.75mg
氧化锌                        0.82mg
碳酸镁                        25.3mg
磷酸二氢钾                    15mg
磷酸二钙                      55mg
柠檬酸钾                      90mg
碳酸钙                        100mg
氯化镁                        24.8mg
上述维生素和矿物质混合物可以有较大的变化。这样的变化不应被认为偏离了本发明的精神和范围。
保健饮料的制备
实施例1的提取物1000mg
柠檬酸          1000mg
寡糖            100g
杏浓缩物        2g
牛磺酸          1g
蒸馏水          900ml
保健饮料可通过下面的常规方法制备：溶解活性成分，混合，于85℃搅拌1小时，过滤后将所有成分装填入1000ml安瓿中灭菌。
上面描述了本发明，显然其可以以许多方式进行变化。这样的变化不应认为偏离了本发明的精神和范围，并且对本领域技术人员而言是显而易见的所有这样修饰意在包括在随后的权利要求的范围中。
工业实用性
如本发明所述，竹植物提取物和其中的麦黄酮化合物通过抑制NO生成和PLA表达而具有强效抗炎活性，通过抑制弹性酶活性、愈合血管内皮细胞伤口、激活u-PA表达和抑制PAI-1表达、降低胆固醇沉积以及抑制新内膜形成而具有改善循环的活性，因此，其可用作治疗和预防炎症和血液循环疾病的治疗剂、保健食品。

Claims (8)

1.用于治疗和预防心血管疾病的包含竹植物的粗提取物或可溶于非极性溶剂的提取物作为活性成分的药物组合物。
2.根据权利要求1的药物组合物，其中所述粗提取物用选自水、低级醇和其混合物的溶剂提取。
3.根据权利要求1的药物组合物，其中所述可溶于非极性溶剂的提取物用选自己烷、乙酸乙酯、氯仿和二氯甲烷的非极性溶剂提取。
4.根据权利要求1-3中任一项的药物组合物，其中所述竹属于Sasa属或Phyllostachys属。
5.根据权利要求4的药物组合物，其中所述的竹选自Sasaborealis Makino，Sasa coreana Nakai，Sasa japonica Makino，Sasaborealis var.gracilis和Sasa palmata Nakai。
6.根据权利要求4的药物组合物，其中所述的竹植物选自桂竹(Phyllostachys bambusoides SIEB.Et Zucc)，紫竹(Phyllostachysnigra MUNRO)，淡竹(Phyllostachys nigra MUNRO var.henonisSTAPF)和毛竹(Phyllostachys pubescens MAZEL ex H.de LEH)。
7.根据权利要求1的药物组合物，其中所述提取物包含麦黄酮或对香豆酸。
8.根据权利要求1的药物组合物，其中所述的心血管疾病包括各种心血管疾病如高血压、心脏病、脑中风、外周血液疾病、血栓形成、狭窄、高脂血、动脉硬化或心肌梗塞。
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