CN102040578B - 从竹叶中制备高纯度苜蓿素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了从竹叶中制备高纯度苜蓿素的方法。该方法包括以下步骤：(a)使干燥竹叶用95％乙醇提取，用石油醚萃取，水相浓缩成浸膏；(b)使浸膏上AB-8大孔树脂柱，先用纯水洗脱，再用80％乙醇洗脱，将洗脱液浓缩并干燥；(c)向步骤(b)干燥产物中加入盐酸甲醇溶液，加热进行酸解处理；(d)使步骤(c)所得酸解液上C₁₈柱层析洗脱，收集苜蓿素级分，浓缩；(e)使步骤(d)所得浓缩物上凝胶分离柱，用纯甲醇作流动相洗脱，收集苜蓿素级分，浓缩到干燥，即得苜蓿素。本发明以一种简便的方法以高收率获得了高纯度的苜蓿素。

Description

从竹叶中制备高纯度苜蓿素的方法

技术领域

本发明属于天然产物化学领域，涉及一种天然产物苜蓿素的制备方法，特别涉及一种从竹叶中制备天然产物苜蓿素的方法，更特别涉及一种从竹叶中制备高纯度天然产物苜蓿素的方法。本发明还涉及由本发明方法获得的苜蓿素，以及苜蓿素在制备抗肿瘤药物中的用途。

背景技术

苜蓿素(tricin)又称小麦黄素、麦黄酮。苜蓿素为黄色针状结晶(醋酸-水)，黄色粉末(氯仿-甲醇)，熔点291-292℃。苜蓿素存在于禾本科植物芒(Miscanthus sinensis Anderss.)的茎、叶中，豆科植物紫苜蓿(Medicagosativa L.)，菊科植物等植物中。苜蓿素对离体豚鼠肠管有松弛作用，有轻度抗氧化作用，可防止肾上腺素氧化，并有轻度雌激素样作用。可用作染料中间体。

目前，市场上售苜蓿素相关产品大多从紫苜蓿中制备而来，且资源有限，工艺复杂、成本高、产品纯度低，售价高。

尽管我国竹叶资源丰富，但我国竹叶资源在大部分竹产区被弃用，所以，如何充分利用我国丰富的竹叶资源，开发出高附加值的竹叶化学成分产品是当前科研工作者研究热点之一。

竹叶作为一种“药食两用的天然植物”已被广大消费者所接受，竹叶提取物主要功能性成分为竹叶黄酮糖苷，具有抗氧化和抑菌活性，可以作为一种生物黄酮类保健营养素进行开发，前景广阔。目前，以竹叶为原料，利用硅胶柱层析、大孔树脂柱层析、有机溶剂液液萃取等方法制备的竹叶黄酮粉产品已经上市，而且把竹叶黄酮粉在食品、保健品、化妆品、药物等领域的开发应用也很多，但很少有分离制备黄酮单体纯品，应用于抗肿瘤药物，且大部分产品生产工艺复杂、成本高、产品的总黄酮含量大多在40％以下，并且黄酮得率低，这直接导致了产品售价较高。虽然从竹叶这种资源广泛的材料中提取各种类型的黄酮已有许多文献报道，但从竹叶或其粗制提取物中制备高纯度苜蓿素尚未见有报道。

因此，寻找一种从竹叶中高效率制备高纯度天然产物苜蓿素的方法，填补市场空白，仍是本领域技术人员为之努力的方向。

发明内容

本发明的目的是为制备高纯度苜蓿素而提供一种简便的从竹叶中提取高纯度苜蓿素的方法。本发明人令人意外地发现，通过对竹叶粗提，然后进行酸解，再进一步进行C₁₈柱层析分离，最后通过凝胶分离纯化，可以获得纯度在99％以上的苜蓿素纯品。本发明基于上述发现而得以完成。

发明概述

为此，本发明第一方面提供了一种从竹叶中制备高纯度苜蓿素的方法，其包括以下步骤：(a)使干燥竹叶用95％乙醇提取，用石油醚萃取，水相浓缩成浸膏；(b)使浸膏上AB-8大孔树脂柱，先用纯水洗脱，再用80％乙醇洗脱，将洗脱液浓缩并干燥；(c)向步骤(b)干燥产物中加入盐酸甲醇溶液，加热进行酸解处理；(d)使步骤(c)所得酸解液上C₁₈柱层析洗脱，收集苜蓿素级分，浓缩；(e)使步骤(d)所得浓缩物上凝胶分离柱，用纯甲醇作流动相洗脱，收集苜蓿素级分，浓缩到干燥，即得苜蓿素。

本发明第二方面提供一种竹叶提取物，其中包含纯度大于95wt％的苜蓿素。

本发明第三方面提供苜蓿素或包含苜蓿素的提取物在制备抗肿瘤的药物中的用途。

发明详述

本发明第一方面提供了一种从竹叶中制备高纯度苜蓿素的方法，其包括以下步骤：

(a)使干燥竹叶用95％乙醇在60℃回流提取三次，将合并的提取液浓缩至无醇味，再用石油醚萃取，水相浓缩成浸膏；

(b)使浸膏用少量95％乙醇溶解后上AB-8大孔树脂柱，先用纯水洗脱，再用80％乙醇洗脱，将洗脱液浓缩并干燥；

(c)向步骤(b)干燥产物中加入盐酸甲醇溶液，加热进行酸解处理，处理完毕后用用稀NaOH溶液中和；

(d)使步骤(c)所得酸解液与样品同等重量的C₁₈填料混合，浓缩拌样干燥，再使干燥的C₁₈填料拌样固体上样，按1∶10的样品和填料比例上C₁₈柱层析，先用20％甲醇水溶液洗脱，再用60％甲醇水溶液洗脱，收集苜蓿素级分，浓缩；

(e)使步骤(d)所得浓缩物用甲醇溶解，按1∶10的样品和填料比例，上凝胶分离柱，用纯甲醇作流动相洗脱，收集苜蓿素级分，浓缩到干燥，即得苜蓿素。

在本发明第一方面所述方法的一个实施方案中，其中在步骤(a)中，所述三次回流提取的料液比分别是1/10、1/8、1/5，回流提取时间分别为3h、2h、2h。

在本发明第一方面所述方法的一个实施方案中，其中在步骤(a)中，所述石油醚萃取是萃取三次，并且每次石油醚体积大约为浓缩液体积的1/3。

在本发明第一方面所述方法的一个实施方案中，其中在步骤(c)中，所述盐酸甲醇溶液是甲醇与25％盐酸的混合物。在一个实施方案中，所述甲醇与25％盐酸的混合物是二者以体积比(2～6)∶1、(2～5)∶1、或约4∶1的混合物，优选是约4∶1的混合物。

在本发明第一方面所述方法的一个实施方案中，其中在步骤(c)中，所述加热是在沸水浴中加热。在一个实施方案中，所述加热是在沸水浴中回流。

在本发明第一方面所述方法的一个实施方案中，其中在步骤(c)中，所述酸解处理的时间为1～3小时。在一个实施方案中，所述酸解处理的时间为1.5～2.5小时。在一个实施方案中，所述酸解处理的时间为约2小时。

在本发明第一方面所述方法的一个实施方案中，其中在步骤(c)中，所述步骤(b)干燥产物与盐酸甲醇溶液的比为50mg∶(10ml～50ml)。在一个实施方案中，所述步骤(b)干燥产物与盐酸甲醇溶液的比为50mg∶(15ml～40ml)、50mg∶(20ml～30ml)、或约50mg∶25ml，优选的比为约50mg∶25ml。

本领域技术人员理解，根据所述步骤(b)干燥产物中的苜蓿素的含量不同，所述步骤(b)干燥产物与盐酸甲醇溶液的比可以作适当的改变，以获得较佳的酸解效果；类似地，其它因素亦可作适当改变。在一个实施方案中，在步骤(c)中，所述盐酸甲醇溶液是甲醇与25％盐酸二者以体积比约4∶1的混合物，所述加热是在沸水浴中回流，所述酸解处理的时间为约2小时，所述步骤(b)干燥产物与盐酸甲醇溶液的比为约50mg∶25ml。

在本发明第一方面所述方法的一个实施方案中，其中在步骤(d)和步骤(e)中，各步骤在洗脱时是通过HPLC监控并收集苜蓿素级分的。在一个实施方案中，所述HPLC监控各自独立地是采用包括以下的色谱条件：色谱柱、流动相、包括等度和/或梯度的洗脱程序、以及装配有二极管阵列检测器或紫外检测器的色谱仪。在一个实施方案中，所述色谱柱是ODS柱。在一个实施方案中，所述色谱柱是5μm粒度填料的ODS柱。在一个实施方案中，所述色谱柱是5μm粒度填料的ODS柱。在一个实施方案中，所述色谱柱是5μm粒度填料的YMC-Pack ODS AQ型色谱柱。在一个实施方案中，所述色谱柱是5μm粒度填料的YMC-Pack ODS AQ型(4.6mmx 250mm)色谱柱，或者是具有在本发明所述色谱条件下与该5μm粒度填料的YMC-Pack ODS AQ型(4.6mm x 250mm)色谱柱分离效果相当的色谱柱。在一个实施方案中，所述流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A是乙腈，所述流动相B是0.5％(V/V)磷酸水溶液。在一个实施方案中，所述流动相是乙腈：0.5％(V/V)磷酸水溶液以体积比为(10～50)∶(90～50)比例的混合物，优选是(10～45)∶(90～55)比例的混合物，优选是(15～30)∶(85～70)比例的混合物。在一个实施方案中，所述洗脱程序是以0.5～2ml/min(优选约1ml/min)的流速，在第一洗脱时间段内以包含10～15％流动相A和加至100％流动相B的混合液中进行等度洗脱，然后在第一洗脱时间段内从上述混合液经线性梯度变化到包含40～50％流动相A和加至100％流动相B的混合液中进行梯度洗脱。在一个实施方案中，所述第一洗脱时间段使用的洗脱液是包含约12％流动相A和约88％流动相B(本领域技术人员理解，(1)二者之和为100％，和/或(2)两种流动相的比例可作适当调整以获得更佳的分离效果；此(1)和(2)在其它情况下亦是适用的)的混合液。在一个实施方案中，所述第二洗脱时间段使用的梯度洗脱液是包含约12％流动相A和约88％流动相B的混合液经线性梯度变化到包含约45％流动相A和约55％流动相B的混合液。在一个实施方案中，所述第一洗脱时间段为30～60min，优选35～55min，优选40～50min，优选约45min。在一个实施方案中，所述第二洗脱时间段为30～60min，优选35～55min，优选40～50min，优选约45min。本领域技术人员理解，在优选的情况下，所述第一洗脱时间段洗脱操作完毕后，即刻开始所述第二洗脱时间段。在一个实施方案中，所述色谱系统设定的检测波长为320～380nm，优选330～370nm，优选340～360nm，优选约350nm。在一个实施方案中，所述色谱柱的柱温控制在15～45℃，优选20～40℃，优选25～35℃，优选约30℃。

在第一方面所述方法的一个实施方案中，该方法包括以下步骤：

(1)提取：称取一定量原料，用95％乙醇，温度60℃，回流提取三次，料液比分别是1/10，1/8，1/5，回流提取时间分别为3h，2h，2h；

(2)浓缩：使以上提取液浓缩至无醇味；

(3)萃取：使以上浓缩得到的无醇味浓缩液，若溶解不好，可适当加温和加入少量乙醇辅助溶解，然后用石油醚萃取三次，每次石油醚体积大约为浓缩液体积的1/3，石油醚相弃去，水相浓缩成浸膏；

(4)初步分离纯化：原料提取物浸膏用尽量少的95％乙醇溶解后上AB-8大孔树脂柱，先用纯水洗脱，再用80％乙醇洗脱，收集洗脱液，把80％乙醇洗脱液浓缩干燥成粉末，备用。

(5)酸解：称取干燥的样品50.0mg，置于50mL平底烧瓶中，先加入20mL甲醇，测其PH值后再加入25％盐酸5mL，装好冷凝回流玻璃装置，在沸水浴中加热酸解2小时，迅速冷却后，备用；

(6)浓缩拌样：把酸解后的溶液，用稀NaOH溶液调节PH值到酸解前PH值数值后，加入和样品同等重量的C₁₈填料，浓缩拌样干燥后备用；

(7)C₁₈柱层析分离：把干燥的C₁₈填料拌样，固体上样，按1∶10的样品和填料比例，上C₁₈柱层析，先用20％的甲醇水溶液洗脱杂质，再用60％的甲醇水溶液洗脱并收集苜蓿素级分；

(8)凝胶分离纯化：把C₁₈柱层析分离后的样品用甲醇溶解，按1∶10的样品和填料比例，上凝胶分离柱，用纯甲醇作流动相洗脱，按一定的体积分别收集苜蓿素级分

(9)浓缩干燥：将合并的纯苜蓿素收集液进行浓缩干燥，即得。

在本发明第一方面所述方法的一个实施方案中，该方法的收率为50wt％以上，优选收率为60wt％以上，优选收率为70wt％以上，以干燥竹叶计。

在本发明第一方面所述方法的一个实施方案中，该方法所得苜蓿素的纯度大于95wt％，优选纯度大于96wt％，优选纯度大于98wt％，优选纯度大于99wt％。

本发明第二方面涉及一种竹叶提取物，其中包含纯度大于95wt％的苜蓿素，优选纯度大于96wt％，优选纯度大于98wt％，优选纯度大于99wt％。

在本发明第二方面所述提取物的一个实施方案中，其中该提取物中通过本发明第一方面任一项所述方法获得的。

在本发明第二方面所述提取物的一个实施方案中，其中该提取物是基本上纯净的苜蓿素。

在本发明第二方面所述提取物的一个实施方案中，其中该提取物是苜蓿素纯品。

本发明第三方面涉及苜蓿素或包含苜蓿素的提取物(例如包含苜蓿素的竹叶提取物，例如本发明第二方面所述竹叶提取物)在制备抗肿瘤的药物中的用途。

在本发明第三方面所述用途的一个实施方案中，其中所述肿瘤是肺癌或肝癌。

本发明第一方面所述方法的各个实施方案可以与一个或多个其它实施方案进行任意组合，只要这种组合不会出现矛盾。当然在相互之间组合时，必要的话可对相应特征作适当修饰。对于本发明的其它方面的各个实施方案亦可以类似地进行任意组合。

本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。

如本文使用的，术语“竹叶提取物(bamboo leaves extract)”，是指以竹叶为原料，用一定的提取、初步分离方法而得到竹叶的粗提物或进一步精制的精提物的统称，其中包含竹叶黄酮类化合物，例如本发明所述苜蓿素等。

如本文使用的，术语“酸解”，亦可称为“酸水解”。

在本发明中，术语“％”时，如基础物质是液态并且分散于该基础物质中的物质是固体，则该％是重量/体积表示的百分数。其它情况下使用％亦具有类似含义。

为了克服现有的从苜蓿中制备天然产物苜蓿素工艺复杂、成本高、纯度低、得率低的不足，改变市场没有苜蓿素纯品的现状，本发明的第一方面的目的是提供一种竹叶天然产物苜蓿素纯品，该天然产物苜蓿素纯品的纯度明显高于现有的苜蓿素产品。本发明的第二方面目的是提供一种制备竹叶天然产物苜蓿素纯品的方法，本发明第三方面的目的是提供所述竹叶天然产物苜蓿素纯品的用途。

本发明结合溶剂提取、酸解和色谱层析的组合，可以从具有丰富来源的竹叶中以较高收率提取高纯度苜蓿素。

附图说明

图1描绘了酸解时间对苜蓿素含量的影响。

图2是60％的甲醇水溶液洗脱苜蓿素收集液检测图。

图3是凝胶分离纯化后纯苜蓿素收集液检测图。

图4是苜蓿素质谱图。

图5是苜蓿素红外光谱图。

图6是苜蓿素紫外光谱图。

图7是苜蓿素碳谱图。

图8是苜蓿素氢谱图。

图9是苜蓿素DEPT135谱图。

图10是苜蓿素DEPT90谱图。

图11是苜蓿素HMBC谱图。

图12是苜蓿素HSQC谱图。

具体实施方式

下面通过具体的实施例/实验例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例和实验例仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。

本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。本领域技术人员清楚，在下文中，如果未特别说明，本发明所用材料和操作方法是本领域公知的。

实施例一、苜蓿素的制备

1.制备工艺

(1)提取工艺的选择

①水提法以纯水进行提取，设不同提取时间和不同提取温度；

②醇提取法用醇(如50～98％的乙醇)进行提取，设不同提取时间和不同提取温度；

③有机溶剂提取法用有机溶剂，如乙酸乙酯、丙酮、乙醇、甲醇等进行提取，设不同提取时间和不同提取温度。

利用液-质联用仪、高效液相色谱仪等分析检测提取物中黄酮等活性物质的得率，核算成本，对以上①～③的提取技术进行优化。

本发明人发现，用以下工艺提取，可获得最佳的产品收率，即热回流提取法：称取干燥竹叶原料10kg，用95％乙醇，温度60℃，回流提取三次，料液比分别是1/10，1/8，1/5，回流提取时间分别为3h，2h，2h。

(2)浓缩

把以上提取液浓缩至无醇味。

(3)萃取

把以上浓缩得到的无醇味浓缩液，若溶解不好，可适当加温和加入少量乙醇辅助溶解，然后用石油醚萃取三次，每次石油醚体积大约为浓缩液体积的1/3，石油醚相弃去，水相浓缩成浸膏。

(4)初步分离纯化

考察以下方法进行分离纯化：

①柱层析法用聚酰胺柱层析法、硅胶柱层析法、葡聚糖凝胶柱层析法、大孔树脂柱层析法；

②膜分离法用超滤、微滤、纳滤和反渗透方法；

③高效制备液相法用高效制备液相色谱方法。

利用液-质联用仪、高效液相色谱仪等分析检测黄酮等活性物质的纯度，核算成本，对分离制备技术进行优化。本发明人发现，采用以下分离纯化工艺可以获得最佳的分离纯化效果：原料提取物浸膏用尽量少的95％乙醇溶解后上AB-8大孔树脂柱，先用纯水洗脱去除糖类、蛋白质等杂质后，再用80％乙醇洗脱，收集洗脱液，把80％乙醇洗脱液浓缩干燥成粉末，备用。

(5)酸解

①初步确定的酸解方法

称取干燥的样品50.0mg，置于50mL平底烧瓶中，先加入20mL甲醇，测其PH值后再加入25％盐酸5mL，装好冷凝回流玻璃装置，在沸水浴中加热进行酸解。

②酸解时间的确定

称取干燥的样品50.0mg，置于50mL平底烧瓶中，先加入20mL甲醇，再加入25％盐酸5mL，装好冷凝回流玻璃装置，在沸水浴中分别加热酸解20min，迅速冷却后，倒入50mL容量瓶中，用甲醇定容，待测。重复上述步骤八次，酸解时间分别为30、50、60、90、120、150、180、240min。

对酸解后样品测定结果显示，样品中苜蓿素含量随酸解时间变化明显(见图1)。从图1可以看出：样品酸解20min，苜蓿素含量均为最低，随着酸解时间的增加，苜蓿素含量逐渐增加，样品酸解120min，苜蓿素含量达到最高值，酸解时间超过120min后，随酸解时间的增加，苜蓿素含量略有下降且渐趋稳定。因此，样品酸解120min为最佳酸解时间。

③最终确定的酸解方法

称取干燥的样品50.0mg，置于50mL平底烧瓶中，先加入20mL甲醇，测其PH值后再加入25％盐酸5mL，装好冷凝回流玻璃装置，在沸水浴中加热酸解2小时，迅速冷却后，备用。

此方法可按同比进行放大。

(6)浓缩拌样

把酸解后的溶液，用稀NaOH溶液调节PH值到酸解前PH值数值后，加入和样品同等重量的C₁₈填料，浓缩拌样干燥后备用。

(7)C₁₈柱层析分离

把干燥的C₁₈填料拌样，固体上样，按1∶10的样品和填料比例，上C₁₈柱层析，先用20％的甲醇水溶液洗脱杂质，再用60％的甲醇水溶液洗脱苜蓿素并收集(见图2)，浓缩备用。洗脱过程中使用紫外检测器进行监控，检测波长为：350nm。

(8)凝胶分离纯化

把C₁₈柱层析分离后的样品用甲醇溶解，按1∶10的样品和填料比例，上凝胶分离柱，用纯甲醇作流动相洗脱，按一定的体积分别收集，备用。洗脱过程中使用紫外检测器进行监控，检测波长为：350nm。

(9)HPLC检测

把凝胶分离纯化后按一定的体积分别收集的待测液，用液相色谱检测(见图3)，根据HPLC检测结果合并纯苜蓿素收集液。

(10)浓缩干燥

把根据检测结果合并的纯苜蓿素收集液进行浓缩，干燥，即得苜蓿素20克。

(11)纯度和收率测定

根据以下色谱条件测定本实施例所得苜蓿素：

(i)、色谱条件

使用YMC-Pack ODS-AQ不锈钢色谱柱(5μm，4.6mm×250mm)；以乙腈作为流动相A，0.5％(V/V)的磷酸水溶液作为流动相B。

洗脱程序为：以12％流动相A/88％流动相B的混合液为流动相平衡色谱柱；将样品或标准品注入液相色谱仪后，以12％流动相A/88％流动相B的混合液作为洗脱溶液等度洗脱45min；然后使洗脱溶液从上述混合液开始，在45分钟时间内线性梯度变化到45％流动相A/55％流动相B的混合液进行洗脱。

柱温：30℃。

进样量：10μL。

检测波长：350nm。

(ii)纯度结果：通过面积归一化法计算纯度，为99.48％，并且通过上述色谱条件，采用二极管阵列检测器在200-400nm的波长范围内扫描，未见有其它杂质。

(iii)收率结果，采用本发明制备方法所得酸解液测定其中苜蓿素含量，换算为投料竹叶中苜蓿素总含量，此总含量除根据本发明制备方法获得的终产物量，算得苜蓿素收率为77.2％。

实施例二、结构鉴定

利用上述实施例一制备的苜蓿素，利用液-质联用仪、高效液相色谱仪、核磁共振波谱仪等对其进行了结构鉴定。

(1)理化性状

苜蓿素为橙黄色粉末，熔程为(mp)为251.2～252.1℃，不易溶于甲醇。

(2)质谱(ESIMS)

苜蓿素质谱图见图4。由图4可知，负模式ESIMS(m/z)：329.1[M-H]^-，681.0[2M-2H+Na]^-，其中329.1[M-H]^-为准分子离子峰，苜蓿素的分子量为330.1。

(3)红外光谱(FTIR)

苜蓿素的红外光谱图见图5。黄酮的羰基吸收峰大约在1649cm^-1；酚羟基、糖基上的羟基在3200～3650cm^-1范围吸收峰；苯环骨架振动在～1450cm^-1、～1500cm^-1、～1580cm^-1、～1600cm^-1有吸收峰；氧杂环在～1400cm^-1、～1500cm^-1、～1600cm^-1有吸收峰。由图4可知，FTIR(KBr)υmax(cm^-1)：3422.7，1654.6，1612.4，1578.5，1507.7，1465.5，1433.3，1359.2，1337.4，1306.3，1263.5，1182.3，1169.1，1118.6，837.1，与黄酮类化合物吸收峰一致，可以判断苜蓿素为黄酮类化合物。

(4)紫外光谱(UV)

苜蓿素的紫外光谱图见图6。黄酮母体的甲醇溶剂紫外数据为：250，294，307sh；由图5可知，带I在352.2nm，在300～400nm的范围内，带II在270.1nm，在240～280nm的范围内，可以判断苜蓿素为黄酮类化合物。

(5)核磁共振谱(NMR)

苜蓿素的碳谱(¹³C NMR)见图7。从图7可知，从碳谱可知该化合物有17个C，其中δ＝181.889ppm处黄酮4位羰基碳，δ＝139.781～166.401ppm为黄酮骨架和氧相连接的碳，δ＝94.872～121.239ppm黄酮骨架不和氧相连接的碳，δ＝148.725ppm为两个碳叠加峰，且为季碳(黄酮B环3’，5’)，δ＝104.812ppm为两个碳叠加峰(黄酮B环2’，6’)，δ＝56.789ppm为两个连接在3’和5’碳上两个甲氧基的CH₃的碳叠加峰。

苜蓿素的氢谱(¹H NMR)见图8。从图8可知，从氢谱可明显看到11个氢，有3个羟基活泼氢不出峰；根据碳和氢的数量以及分子量推算出含有氧的个数。

苜蓿素的¹H NMR、¹³C NMR、DEPT、HSQC、HMBC波谱数据见表1(DEPT135、DEPT90、HMBC、HSQC图谱见图9、图10、图11、图12)。从表1可知，根据DEPT谱判断每个所有21个C的类型，即为C、CH、CH₂、CH₃，确定每个C连接H的个数。根据苜蓿素的碳氢相关关系HSQC和HMBC，可分别确定每个碳和氢相连接的位置和关系。

表1苜蓿素的¹H NMR、¹³C NMR、DEPT、HSQC、HMBC波谱数据(300MHz，DMSO-d₆，δppm)

综合该天然产物的各种图谱，初步鉴定该天然产物为5，7，4’-三羟基-3’，5’-二甲氧基黄酮后，再对该天然产物结构的各个C和H在碳谱和氢谱上进行指认，指认结果见表1。确认该天然产物为：苜蓿素；分子量：330.1；分子式：C₁₇H₁₄O₇；分子结构式如下：

苜蓿素

三、苜蓿素的抗肿瘤活性测定(体外抗肿瘤活性试验)

1、实验原理

四氮唑[MTT，3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyl-tetrazoliumbromide]是一种能接受氢原子的染料。活细胞线粒体中与NADP相关的脱氢酶在细胞内可将黄色的MTT转化成不溶性的蓝紫色的formazon，而死细胞则无此功能。用DMSO溶解formazon后，在一定波长下用酶标仪测定光密度值，既可定量测出细胞的存活率。

2、实验方法和结果

1)选用对数生长期的贴壁肿瘤细胞，用胰酶消化后，用10％小牛血清的RPMI1640培养液配成5000个/ml的细胞悬液，接种在96孔培养板中，每孔接种100ul，37℃，5％CO2培养24h。

2)实验组加样品(来自实施例1的苜蓿素)10ul，每孔终体积为200ul，用1640培养液补足。37℃，5％CO₂培养3d。

3)弃上清液，每孔加入100ul新鲜配制的0.5mg/ml MTT的无血清培养液，37℃继续培养4h。小心弃上清，并加入200ulDMSO溶解MTTformazon沉淀，用微型超声振荡器混匀，在酶标仪上测定波长544nm处的光密度值。

实验用肿瘤细胞：A-549(人肺癌细胞)；BEL-7402(人肝癌细胞)；HCT-8(人结肠癌细胞)。

结果评定：以下式计算肿瘤细胞生长抑制率(％)

测定结果如下：

结果显示苜蓿素对A-549(人肺癌细胞)和BEL-7402(人肝癌细胞)有一定的抑制效果，且对BEL-7402(人肝癌细胞)抑制效果较好。

虽然本发明结合实验例进行了详细的说明，然而，本领域技术人员理解，本发明的精神和范围不应限于这些实施例，还应包括本发明权利要求所限定的范围及其等同方案。

Claims (3)

1.一种从竹叶中制备高纯度苜蓿素的方法，其包括以下步骤：

(a)使干燥竹叶用95％乙醇在60℃回流提取三次，将合并的提取液浓缩至无醇味，再用石油醚萃取，水相浓缩成浸膏；

(b)使浸膏用少量95％乙醇溶解后上AB-8大孔树脂柱，先用纯水洗脱，再用80％乙醇洗脱，将洗脱液浓缩并干燥；

(c)向步骤(b)干燥产物中加入盐酸甲醇溶液，加热进行酸解处理，处理完毕后用稀NaOH溶液中和；其中，所述盐酸甲醇溶液是甲醇与25％盐酸二者以体积比4∶1的混合物，所述加热是在沸水浴中回流，所述酸解处理的时间为2小时，所述步骤(b)干燥产物与盐酸甲醇溶液的比为50mg∶25ml；

(d)使步骤(c)所得酸解液与样品同等重量的C₁₈填料混合，浓缩拌样干燥，再使干燥的C₁₈填料拌样固体上样，按1∶10的样品和填料比例上C₁₈柱层析，先用20％甲醇水溶液洗脱，再用60％甲醇水溶液洗脱，收集苜蓿素级分，浓缩；

(e)使步骤(d)所得浓缩物用甲醇溶解，按1∶10的样品和填料比例，上凝胶分离柱，用纯甲醇作流动相洗脱，收集苜蓿素级分，浓缩到干燥，即得苜蓿素。

2.根据权利要求1的方法，其中在步骤(a)中，所述三次回流提取的料液比分别是1/10、1/8、1/5，回流提取时间分别为3h、2h、2h。

3.根据权利要求1的方法，其中在步骤(a)中，所述石油醚萃取是萃取三次，并且每次石油醚体积为浓缩液体积的1/3。

Images