CN103951645B - 长白落叶松提取物的制备方法及医药用途 - Google Patents

长白落叶松提取物的制备方法及医药用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种利用长白落叶松根部提取二氢槲皮素，从特定的树种，即长白落叶松（Larix olgensis）树根提取二氢槲皮素的方法，包括原料选取、酶解处理、提取、浓缩、水解、萃取、重结晶、喷雾干燥等多个步骤。应用液质联用议确认了长白落叶松提取物中黄酮类化合物的组成，即以二氢槲皮素为主，其他包括：香橙素、圣草酚、槲皮素和山奈酚。体外实验证明长白落叶松二氢槲皮素提取物对酪氨酸酶活性有较强的抑制作用，具有清除DPPH自由基的作用。动物体内实验证明：对于由四氯化碳引起的肝损伤有良好的恢复作用。

Description

长白落叶松提取物的制备方法及医药用途
技术领域
本发明涉及一种长白落叶松提取物的制备方法及医药用途，该提取物以二氢槲皮素为主要成分，具有较好的医药保健方面的用途。
背景技术
落叶松是我国东北、内蒙古、华北和西南高山针叶林区的森林中主要组成树种。我国境内有10种落叶松，广泛分布于吉林、黑龙江、辽宁、山西、陕西、河北、甘肃、新疆、四川、云南、西藏等省区，落叶松是东北地区主要三大针叶用材树种之一。落叶松是一个寒温带及温带生长的树种，在针叶树种中最为耐寒，垂直分布能够达到森林分布的最上限。落叶松在中国北方地区天然分布和人工栽培的种类主要有华北落叶松（Larix.principis—rupprechtii)、长白山落叶松（Larix.olgensis）、日本落叶松(Larix.kaempferi)、兴安落叶松（Larix.gmelini）和朝鲜落叶松(Larix.olgensis var．koreana）。
长白山落叶松Larix olgensis Henry var.koreana Nakai为松科（Pinaceae）落叶松属（Larix）植物，为落叶乔木，叶子在短枝上簇生，长枝上呈螺旋状散生，长约1-2.5厘米。雌雄同株植物，球花生于短枝的顶端，球果幼时为淡红紫色，成熟后为淡褐色或褐色，树皮为褐色。分布于我国吉林省长白山区及黑龙江省牡丹江流域。
二氢槲皮素（dihydroquercetin）也称花旗松素（taxifolin）、紫杉叶素、黄杉素、双氢栎精或(2R,3R)-二氢槲皮素,化学名为5,7,3′,4′-四羟基二氢黄酮醇。其分子式为C15H12O7,分子量为304.25,二氢槲皮素为淡黄色粉末，在50%乙醇中可结晶为白色针状结晶，其熔点为240℃，易溶于乙醇、乙酸、沸水等溶剂，稍溶于冷水，几乎不溶于苯[1]。花旗松素在室温下水中溶解度仅为0.1%，在60℃时溶解度为1.0%，在90℃时水中溶解度可达到3.0-5.3%，沸水中的溶解度更是高达9.3%，在乙醇中溶解度为18%，乙酸乙酯的最大溶解度为28%，花旗松素不溶于氯仿及乙醚当中[2]。
二氢槲皮素是自然界中广泛存在的一种二氢黄酮醇类的化合物，属于维生素p（生物类黄酮）。花旗松素最早是美国学者E.F.Kurth[3]从花旗松树(Douglas fir)树皮中率先提取出来，也有一说是由日本学者Fukui[4-6]从针叶植物Chamaecyparis obtusa(Sieb.et Zucc.)Endl.的叶子中提取分离出来的一种葡萄糖苷的苷元。此后,随着学者们对花旗松素研究的深入，证明花旗松素作为一种重要的黄酮类化合物存在于多种植物当中[7]。近年来，在一些水果中也发现有花旗松素，尤其在葡萄、橘子、西柚和苹果当中[1,8-11]。
二氢槲皮素目前被发现分布在50多种植物当中，其主要以苷元和糖苷两种形式存在于植物当中。如在落叶松[12]、鬼箭羽[13]、水红花子（红蓼果实）[14-16]、水飞蓟[17]、樟子松[18]等植物当中以苷元形式存在。在刺玫蔷薇[19]、观赏向日葵（花旗松素-3-葡糖苷）[20]、桂火绳（反式-花旗松素-3-O-α-阿拉伯糖甙；顺式-花旗松素-3-O-α-阿拉伯糖甙；反式-花旗松素-3-O-β-吡喃葡萄糖甙）[21]等植物中以糖苷的形式存在。在土茯苓[(2R,3R)-花旗松素-3'-O-β-D-吡喃葡萄糖苷][22]、菝葜（花旗松素-3-O-葡萄糖苷）[23,24]、西南金丝梅[25]、仙鹤草[(2S,3S)-(-)-花旗松素；（2S,3S）-（-）-花旗松素-3-O-β-D一葡萄吡喃糖苷；（2R,3R）-（+）-花旗松素-3-葡萄糖苷][26-29]等植物中以苷元及糖苷两种形式存在。此外，二氢槲皮素的衍生物还被广泛发现存在于植物当中，如在白鲜皮（3′-O-甲基花旗松素）[30]、艾纳香（花旗松素-7,4′-二甲醚；花旗松素-4′-甲醚）[31]、Genista corsica（5-methoxytaxifolin；6-methoxytaxifolin）[32]等植物中。
据俄罗斯文献报道[33]，兴安落叶松（Larix.gmelini）提取物中，除了含有二氢槲皮素外，还含有香橙素、圣草酚、槲皮素、柚皮素、山奈酚、松属素等黄酮类物质。对于长白落叶松中黄酮类物质分析尚未见报道。本专利应用液相-质谱联用仪对长白落叶松的黄酮类物质进行了分析，它们所含的黄酮类化合物基本一致，但也稍有区别。
花旗松素独有的五羟基结构使其具有众多的生物学活性，如抗病毒、抗氧化、抗炎、抑制恶性肿瘤细胞生长、调节酶活性等，因此被广泛应用于食品、药品、化妆品、工业、农业等多个领域。
花旗松素属于强抗氧化剂，Yan Wei[34]等人使用了DPPH法测定花旗松素的抗氧化活性,结果表明在IC50浓度为4.11μmol/L的情况下花旗松素具有非常强的抗氧化活性。Yun[35]通过质谱,紫外,核磁共振等分析认为花旗松素能够有效的抑制小鼠肝微粒体的脂质过氧化反应。Haraguchi[36]等通过研究发现花旗松素能够保护线粒体以免受过氧化基团导致的损伤,而对酶活性并无影响。还能够保护红细胞,具有防止氧化溶血的作用。Sugihara[37]等在研究分析被不同浓度(20～500μmol/L)的金属粒子Fe,Cu,V,Cd所诱导的依赖于脂质过氧化的肝细胞中α-亚麻酸(LNA)的脂羟基过氧化(LOOH)反应的过程中,发现花旗松素存在铁离子浓度依赖的抵抗或进一步被氧化的活性,但对于其他的金属离子只表现出了抗氧化的活性。赵钟祥[38]等采用TEAC(trolox equivalent antioxidant capacity)法对花旗松素进行体外抗氧化活性评价，花旗松素显示了较强的抗氧化性，其TEAC值为1.81mmol/L。
抗癌作用：Kandaswami[39]等研究结果发现花旗松素能够轻度的抑制磷状细胞癌(HTB43)的生长(8mg/mL)。在浓度范围2～8mg/mL内能够和缓地抑制HTB43细胞的生长。Kawaii[40]等人发现使用花旗松素处理HL-60细胞后，HL-60细胞能够分化成成熟的单核/巨噬细胞。翟延君[41]等通过结晶紫染色法发现花旗松素具有较好的体外抑制人宫颈癌Hela细胞增殖活性;花旗松素诱导Hela细胞死亡的原因与细胞凋亡相关，其分子机制可能与升高P53和P21mRNA表达有关，而与Bcl-2和Bax的蛋白转录无关。2012年[42]，翟延君还发现花旗松素能够抑制人胃癌MGC细胞、人肝癌HepG-2细胞和人盲肠癌Hce-8693细胞的增殖。
对心脑血管系统的影响：甘春丽[43]等研究了五种黄酮醇物质对大鼠心肌细胞内游离钙离子的影响，发现花旗松素对氯化钾介导的高钙有明显抑制作用(P<0.05)。王秋红[44]等研究二氢槲皮素对异丙肾上腺素导致大鼠心肌缺血的保护作用，发现花旗松素能改善大鼠ECG的J点位移，显著降低心肌缺血大鼠血清中CK，CK-MB，LDH的含量，升高心肌组织匀浆中SOD活力，降低心肌组织匀浆中脂质过氧化产物MDA的含量。能有效抑制ISO所导致心肌组织缺血，保护心肌细胞免受损伤，从而起到治疗冠心病的作用。
抗病毒作用:Chu[45]等研究了几种黄酮类化合物对Moloney鼠的白血球增多症病毒(moloney murine leukemia virus)的反转录酶活性的作用。发现花旗松素对该病毒反转录酶表现出了非常高的抑制作用。通过结构-活性关系分析后发现，3位和4′位的自由羟基的存在能够促进反转录酶的抑制作用。Vladimir Zarubaev[46]等研究结果发现花旗松素对流感病毒也有抑制的作用。1987年,Biziagos[47]等人采用人工培养的肝炎A病毒(HAV)cF53,研究了包括花旗松素在内的数种物质对该病毒感染和细胞抗体的作用,在花旗松素等加入到感染细胞15天内,引起了浓度依赖性的HAV感染抗体的减少。
抗炎作用
Kwon[48]等自黄榆根分离得到花旗松素-葡萄糖苷，并通过实验表明其可以抑制iNOS（诱生型一氧化氮激酶）表达，具有抗炎作用。伍春莲[49]发现花旗松素单体可以抑制iNOS在人表皮角质细胞HaCaT中表达，可用来治疗皮肤炎症。
其它作用：MIYAZAWA M[50]和TAMURA N研究了花旗松素抑制酪氨酸酶的作用，发现其作用要好于一直被用作化妆品添加剂的熊果苷，并指出花旗松素B环的邻苯二羟基是其抑制酪氨酸酶的关键结构。花旗松素可能具有潜在的降糖[51]、抑制前列腺增生等作用。以上研究报告均为兴安落叶松提取物或纯二氢槲皮素为样本进行的研究，以长白落叶松提取物进行的生物活性研究尚未见报道。
关于以二氢槲皮素为主的提取物方面的专利，目前已经有很多专利，如，一种从黄杞叶中提取落新妇甙的方法[P],CN1733795A.2005-9；一种从黄杞叶中提取分离二氢槲皮素的方法[P],CN101054369A.2007-10-17；一种二氢槲皮素单体的分离纯化方法[P],CN101781277 A.2010-07-21；一种从水红花子中制备花旗松素的方法[P],CN101805322A2010-04-27；从落叶松木屑中提取二氢槲皮素的方法[P],CN101993429A.2011-03-30；一种从落叶松加工剩余物粗提物中分离纯化紫杉叶素的方法[P],CN101830880A.2010-09-05；一种酶诱导高效提取落叶松加工剩余物中紫杉叶素的方法[P],CN101830881A.2010-09-15；一种落叶松木片提取二氢槲皮素的方法[P],CN101863869A.2010-10-20；落叶松中萃取二氢槲皮素的方法[P],CN101333203.2008-12-31；一种从落叶松中提取二氢槲皮素的方法[P],CN1844095.2006-10-11等。美国专利：US2744919，（Producing pure dihydroquercetin）；俄罗斯专利：RU2184561c1（Using deciduous pine wood powder as raw material extracting hydrogenquercetin method of the wood）。
从长白落叶松树根中提取二氢槲皮素，以及利用含有90%二氢槲皮素的长白落叶松提取物所进行的生物学活性研究尚未见文献报告；本专利应用液相-质谱联用仪对长白落叶松的黄酮类物质进行了分析，揭示了长白落叶松提取物中黄酮类化合物的组成。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从长白落叶松根部制备提取物的方法，该方法公开了从长白落叶松树根中提取二氢槲皮素以及长白落叶松提取物的工艺，同时揭示了长白落叶松提取物的黄酮类化合物的组成，揭示了长白落叶松提取物清除DPPH自由基、抑制酪氨酸酶活性、对四氯化碳诱导的肝损伤的肝保护活性。
本发明的目的是这样实现的：该方法包括以下步骤:
1、原材料选定：国家计划择伐及皆伐的人工林长白落叶松树根。原材料中花旗松素含量测定：2%--4.5%为可用标准。原材料前处理：将侧根与主根分割归类，用清水洗净泥沙后风干；去除树皮及毛根，切成片后粉碎成木屑（0.4×0.4×8mm）。
2、酶解：按物料重量半纤维素酶用量为0.4‰—0.6‰，纯化水的加入量是物料重量的2.3—2.5倍，在提取罐中加热至55-60℃保温1.5-2h。
3、提取、浓缩：酶解过程完成后，将物料重量3.5—3.8倍乙醇（95%）加入提取罐，升温至80℃--90℃，恒温1小时，然后进行热回流提取、浓缩，时间为2.5—3.5小时。浓缩时真空度为0.08MPa，当浓缩液经过取样比重达到1:1.08时收膏。
4、水沉：在60±1℃条件下，稀释浓缩液，浓缩液与纯化水之比为1:2.8—3.2，静沉30min，去除松香结晶物。
5、萃取：将水沉上清液泵入萃取罐中，在40℃--43℃条件下加入甲基叔丁基醚，上清液与甲基叔丁基醚之比为1:0.18—0.25。混合液在罐中循环40min，静止3h。
初结晶：将萃取罐中有机相导入夹层式蒸发罐中，加热至56℃--58℃，蒸除甲基叔丁基醚，罐中液体入转移桶，桶入水浴箱，3℃-5℃条件下静止46h。
6、重结晶：将初结晶物与纯化水（结晶物与纯化水之比为1:4.5—5.5）混合倒入加热罐中搅拌2.5h，温度为95℃，罐中液体入转移桶，桶入水浴箱，3℃-5℃条件下静止96h。
7、喷雾干燥：将重结晶物与纯化水（结晶物与纯化水之比为1:3.5—4.5）混合倒入加热罐中搅拌,1.5h，温度为95℃时入喷雾干燥塔，塔内风温142℃。
本发明可以以单一或组合物的形式通过口服给药方式施用于健康或非健康人群，达到抗氧化、抗衰老之功效。也可以制成饮品、糕点、罐头、饮料、冲剂等一切具有预防治疗保健作用的心血管等疾病、糖尿病、高血压等的药品、食品、健康功能性食品。
上述工艺制得的提取物以二氢槲皮素为主，其他包括：香橙素、圣草酚、槲皮素和山奈酚。
本发明的服用量可根据给药途径及组合情况，年龄、体重、疾病和患病程度等变化，长白落叶松二氢槲皮素提取物（纯度＞90%）日剂量成人为20-90mg/天。
本发明揭示了长白落叶松提取物对于DPPH自由基具有很好的清除作用，说明长白落叶松二氢槲皮素提取物是很强的抗氧化剂；本发明揭示了长白落叶松提取物能够有效地抑制酪氨酸酶活性，说明长白落叶松提取物具有美白作用；本发明揭示了长白落叶松提取物对四氯化碳诱导的肝损伤具有很好的修复作用。
因此，长白落叶松提取物在保健方面有着可观的开发和应用价值。
本发明的积极效果在于：首次公开长白落叶松二氢槲皮素提取物的提取方法；应用液相-质谱联用仪对长白落叶松的黄酮类物质进行了分析，揭示了长白落叶松提取物主要由二氢槲皮素其他还有香橙素、圣草酚、槲皮素、山奈酚等黄酮类物质组成；揭示了长白落叶松提取物对于DPPH自由基具有很好的清除作用，说明长白落叶松二氢槲皮素提取物是很强的抗氧化剂；本发明揭示了长白落叶松提取物能够有效地抑制酪氨酸酶活性，说明长白落叶松提取物具有美白作用；本发明揭示了长白落叶松提取物对四氯化碳诱导的肝损伤具有很好的修复作用。
附图说明
图1为长白落叶松提取物中二氢槲皮素高效液相色谱图。
图2为长白落叶松提取物（二氢槲皮素含量92.3%）酪氨酸酶抑制作用(EC50)实验结果。
具体实施方式
实施例1
1）原料处理：取人工种植长白落叶松根部，首先分解整理，清水清洗泥沙，风干，去除树皮和毛根，旋切成片，然后粉碎成木屑（0.4×0.4×8mm）；
2）提取:物料：半纤维素酶：纯化水（pH=5）：乙醇（95%）=400:0.2:960：1440，以上为重量比；具体流程如下：
a酶解：400kg物料投入3m3热回流提取罐中，将调配好的酶液加入纯化水中混合均匀投入提取罐中，加热至55-60℃保温1.5-2h；b）酶解过程完成后，将提取罐加入1440kg乙醇（95%），加热至85℃，保温1h，然后开启提取罐出口阀门，使800L提取液在真空（-0.08MPa）条件下，进入单效蒸发器进行浓缩，20min后，将蒸发器受液罐中的溶媒用泵打入提取罐，重复此过程10次后，将提取罐中的提取液全部吸入蒸发器，当浓缩液经过取样比重达到1:1.08时，停止浓缩，得浓缩液133.9kg；
3）水沉：将浓缩液在热的状态下倒入沉降罐，同时加入401.7kg纯化水，温度控制在60±1℃，静止30min，待松香沉淀后，取上清液共计503.46kg导入恒温罐中，此工艺旨在去除提取浓缩液中的松香；
4）萃取：将503.46kg水沉上清液在恒温罐中冷却至40-43℃，均匀导入3台萃取罐中（每台萃取罐均设有液位表），然后向萃取罐中加入40L甲基叔丁基醚，在屏蔽泵的作用下，使上清液和甲基叔丁基醚混合液在萃取罐中循环40min，结束后静止3h；
5）萃取液浓缩：将萃取罐中分层的上部分萃取液（有机相）放入夹层式蒸发罐中，加热至56℃，甲基叔丁基醚开始蒸发，2次醚蒸汽经冷凝，冷却入甲基叔丁基醚储罐，以备循环使用，当蒸发罐内温度显示为70℃时，说明甲基叔丁基醚已蒸发完毕，在热状态下罐底放料，得二氢槲皮素粗品9.3kg（水溶液）；
6）粗结晶:将盛有9.3kg二氢槲皮素水溶液的转移桶放入水浴箱内，温度4℃，静止46h，完成二氢槲皮素初结晶，弃除上部液体，得结晶物2.98kg，纯度83.13%（干燥）；
7）重结晶：将以上初结晶物加入14.9kg纯化水入搅拌罐内，加热搅拌2.5h，温度为95℃时，放入转移桶中置水浴箱内，温度4℃，静止96h，重结晶结束后，弃除上部液体，得结晶物2.67kg，纯度92.3%（干燥）； 
8）喷雾干燥：上述2.67kg结晶物加入10.68kg纯化水后，入搅拌罐，加热搅拌1.5h， 温度升至95℃时，进入喷雾干燥塔，塔内风温142℃。
实施例2
1）原料处理：取人工种植长白落叶松根部，首先分解整理，清水清洗泥沙，风干，去除树皮和毛根，旋切成片，然后粉碎成木屑（0.4×0.4×8mm）；
2）提取:物料：半纤维素酶：纯化水（pH=6）：乙醇（95%）=400:0.2:960：1440，以上为重量比；具体流程如下：
a酶解：400kg物料投入3m3热回流提取罐中，将调配好的酶液加入纯化水中混合均匀投入提取罐中，加热至55-60℃保温1.5-2h；b）酶解过程完成后，将提取罐加入1440kg乙醇（95%），加热至85℃，保温1h，然后开启提取罐出口阀门，使800L提取液在真空（-0.08MPa）条件下，进入单效蒸发器进行浓缩，20min后，将蒸发器受液罐中的溶媒用泵打入提取罐，重复此过程10次后，将提取罐中的提取液全部吸入蒸发器，当浓缩液经过取样比重达到1:1.08时，停止浓缩，得浓缩液156.7kg；
3）水沉：将浓缩液在热的状态下倒入沉降罐，同时加入470.1kg纯化水，温度控制在60±1℃，静止30min，带松香沉淀后，取上清液共计585.3kg导入恒温罐中，此工艺旨在去除提取浓缩液中的松香；
4）萃取：将585.3kg水沉上清液在恒温罐中冷却至40-43℃，均匀导入3台萃取罐中（每台萃取罐均设有液位表），然后向萃取罐中加入40L甲基叔丁基醚，在屏蔽泵的作用下，使上清液和甲基叔丁基醚混合液在萃取罐中循环40min，结束后静止3h；
5）萃取液浓缩：将萃取罐中分层的上部分萃取液（有机相）放入夹层式蒸发罐中，加热至56℃，甲基叔丁基醚开始蒸发，2次醚蒸汽经冷凝，冷却入甲基叔丁基醚储罐，以备循环使用，当蒸发罐内温度显示为70℃时，说明甲基叔丁基醚已蒸发完毕，再热状态下罐底放料，得二氢槲皮素粗品8.7kg（水溶液）；
6）粗结晶:将盛有8.7kg二氢槲皮素水溶液的转移桶放入水浴箱内，温度4℃，静止46h，完成二氢槲皮素初结晶，弃除上部液体，得结晶物2.17kg，纯度81.26%（干燥）；
7）重结晶：将以上初结晶物加入10.85kg纯化水入搅拌罐内，加热搅拌2.5h，温度为95℃时，放入转移桶中置水浴箱内，温度4℃，静止96h，重结晶结束后，弃除上部液体，得结晶物1.99kg，纯度91.8%（干燥）； 
8）喷雾干燥：上述1.99kg结晶物加入7.96kg纯化水后，入搅拌罐，加热搅拌1.5h，温度升至95℃时，进入喷雾干燥塔，塔内风温142℃。
实施例3
1）原料处理：取人工种植长白落叶松根部，首先分解整理，清水清洗泥沙，风干，去除树皮和毛根，旋切成片，然后粉碎成木屑（0.4×0.4×8mm）；
2）提取:物料：半纤维素酶：纯化水（pH=5）：乙醇（95%）=400:0.2:960：1440，以上为重量比；具体流程如下：
a酶解：400kg物料投入3m3热回流提取罐中，将调配好的酶液加入纯化水中混合均匀投入提取罐中，加热至55-60℃保温1.5-2h；b）酶解过程完成后，将提取罐加入1440kg乙醇（95%），加热至80℃，保温1h，然后开启提取罐出口阀门，使800L提取液在真空（-0.08MPa）条件下，进入单效蒸发器进行浓缩，20min后，将蒸发器受液罐中的溶媒用泵打入提取罐，重复此过程10次后，将提取罐中的提取液全部吸入蒸发器，当浓缩液经过取样比重达到1:1.08时，停止浓缩，得浓缩液98.5kg；
3）水沉：将浓缩液在热的状态下倒入沉降罐，同时加入295.5kg纯化水，温度控制在60±1℃，静止30min，带松香沉淀后，取上清液共计373.6kg导入恒温罐中，此工艺旨在去除提取浓缩液中的松香；
4）萃取：将373.6kg水沉上清液在恒温罐中冷却至40-43℃，均匀导入3台萃取罐中（每台萃取罐均设有液位表），然后向萃取罐中加入40L甲基叔丁基醚，在屏蔽泵的作用下，使上清液和甲基叔丁基醚混合液在萃取罐中循环40min，结束后静止3h；
5）萃取液浓缩：将萃取罐中分层的上部分萃取液（有机相）放入夹层式蒸发罐中，加热至56℃，甲基叔丁基醚开始蒸发，2次醚蒸汽经冷凝，冷却入甲基叔丁基醚储罐，以备循环使用，当蒸发罐内温度显示为70℃时，说明甲基叔丁基醚已蒸发完毕，再热状态下罐底放料，得二氢槲皮素粗品7.75kg（水溶液）；
6）粗结晶:将盛有7.75kg二氢槲皮素水溶液的转移桶放入水浴箱内，温度4℃，静止46h，完成二氢槲皮素初结晶，弃除上部液体，得结晶物1.57kg，纯度81.8%（干燥）；
7）重结晶：将以上初结晶物加入7.85kg纯化水入搅拌罐内，加热搅拌2.5h，温度为95℃时，放入转移桶中置水浴箱内，温度4℃，静止96h，重结晶结束后，弃除上部液体，得结晶物1.66kg，纯度91.7%（干燥）； 
8）喷雾干燥：上述1.66kg结晶物加入6.64kg纯化水后，入搅拌罐，加热搅拌1.5h，温度升至95℃时，进入喷雾干燥塔，塔内风温142℃，
实施例4
1）原料处理：取人工种植长白落叶松根部，首先分解整理，清水清洗泥沙，风干，去除树皮和毛根，旋切成片，然后粉碎成木屑（0.4×0.4×8mm）；
2）提取:物料：半纤维素酶：纯化水（pH=5）：乙醇（95%）=400:0.2:960：1440，以上为重量比；具体流程如下：
a酶解：400kg物料投入3m3热回流提取罐中，将调配好的酶液加入纯化水中混合均匀投入提取罐中，加热至55-60℃保温1.5-2h；b）酶解过程完成后，将提取罐加入1440kg乙醇（95%），加热至90℃，保温1h，然后开启提取罐出口阀门，使800L提取液在真空（-0.08MPa）条件下，进入单效蒸发器进行浓缩，20min后，将蒸发器受液罐中的溶媒用泵打入提取罐，重复此过程10次后，将提取罐中的提取液全部吸入蒸发器，当浓缩液经过取样比重达到1:1.08时，停止浓缩，得浓缩液159.1kg；
3）水沉：将浓缩液再热的状态下倒入沉降罐，同时加入477.3kg纯化水，温度控制在60±1℃，静止30min，带松香沉淀后，取上清液共计577.4kg导入恒温罐中，此工艺旨在去除提取浓缩液中的松香；
4）萃取：将577.4kg水沉上清液在恒温罐中冷却至40-43℃，均匀导入3台萃取罐中（每台萃取罐均设有液位表），然后向萃取罐中加入40L甲基叔丁基醚，在屏蔽泵的作用下，使上清液和甲基叔丁基醚混合液在萃取罐中循环40min，结束后静止3h；
5）萃取液浓缩：将萃取罐中分层的上部分萃取液（有机相）放入夹层式蒸发罐中，加热至56℃，甲基叔丁基醚开始蒸发，2次醚蒸汽经冷凝，冷却入甲基叔丁基醚储罐，以备循环使用，当蒸发罐内温度显示为70℃时，说明甲基叔丁基醚已蒸发完毕，再热状态下罐底放料，得二氢槲皮素粗品7.1kg（水溶液）；
6）粗结晶:将盛有7.1kg二氢槲皮素水溶液的转移桶放入水浴箱内，温度4℃，静止46h，完成二氢槲皮素初结晶，弃除上部液体，得结晶物1.52kg，纯度83.13%（干燥）；
7）重结晶：将以上初结晶物加入7.6kg纯化水入搅拌罐内，加热搅拌2.5h，温度为95℃时，放入转移桶中置水浴箱内，温度4℃，静止96h，重结晶结束后，弃除上部液体，得结晶物1.22kg，纯度91.9%（干燥）； 
8）喷雾干燥：上述1.22kg结晶物加入10.68kg纯化水后，入搅拌罐，加热搅拌1.5h，温度升至95℃时，进入喷雾干燥塔，塔内风温142℃，
结论：根据以上四例二氢槲皮素制备结果，在酶解过程相同、溶媒量等其他条件恒定情况 下，PH值、提取温度改变时，得到二氢槲皮素的重量和纯度是不一样的，实施例1是最佳工艺路线。
实施例5：该提取物在化妆品中的应用
1、长白花旗松素（本发明提取物）霜剂的制备
成分w/%
A相
长白花旗松素（92.3%）0.01
水60.00
氯化钠(VEL)0.99
生物糖胶-38.00
B相
月桂醇PEG/PPG-18/十八甲基硅油2.00
环甲基硅油13.00
环甲基硅油(及)二甲基硅油多羟醇5.00
双-羟乙基丙基二甲基硅油4.00
环戊硅油(及)二甲基硅油交联共聚物(及)5.00
二甲基硅油/乙烯基二甲基硅油交联共聚物(及)
聚二甲基硅氧烷端醇C12～C15烷基安息香酸酯3.00
聚季戊四醇四乙基已酸酯2.00
甲基异丁烯酸酯交联共聚物2.00
苯氧乙醇(及)尼泊金甲酯(及)尼泊金乙酯(及)
尼泊金丁酯(及)尼泊金异丁酯(及)尼泊金丙酯适量
香精0.20
C相
聚丙烯/聚苯乙烯/乙烯/VA共聚物2.0
将A相加入到B相中，搅拌下加入C相,继续高速搅拌5min。
本品可恢复皮肤弹性，促进胶原蛋白产生，促进透明质酸生成，使皮肤光滑细腻
2、长白花旗松素化妆水的制备
丙二醇5
1，3-丁二醇5
柠檬酸0.1
柠檬酸钠0.1
鲜人参提取物0.01
长白花旗松素0.01
水89.5
复方抗菌剂香精适量
本品为人参滋养化妆水，将鲜人参提取物、长白花旗松素、香精溶解，其余组分溶于水中，然后将两者混合、搅拌均匀，静置，过滤即可。
3、长白花旗松素提取物洗面奶的制备
生产工艺为：将Carbopol941分散于水中，同时将油相加入水相，混合冷却,加入香精和三乙醇胺调节pH值到6，加入长白花旗松素0.01；鲜人参提取物5，均质乳化即得。
4、长白花旗松素香皂的制备
备好模型容器，将氢氧化钠以冷水150g溶解放置一旁，等待溶液冷却至50℃。将棕榈油250g，橄榄油100g，蓖麻油150g加热至50℃。将加热好油相和氢氧化钠70g溶液混合，加入聚乙二醇-90M3g、椰油醇甘油醚磺酸钠1g、硬脂酸钾0.1g、甘油10g、长白花旗松素0.01g、鲜人参提取物10g混合均匀调色调香味，加入搅拌至溶液呈现浓稠状，倒入模具中。将模具静置24小时，直到溶液完全凝固。将香皂脱模、切块，修饰，放置在阴凉通风处40天，包装即可使用。
或者在无水钠皂中加入鲜人参提取物以及各种添加剂,按香皂生产工艺加工而成。皂料→添加剂拌和→研磨/精制→压条→切割→打印→检验→包装→入库。
实验报告
通过以下实验证明长白落叶松二氢槲皮素提取物的化学组成及功效：
实验例一：液相-质谱法分析长白落叶松提取物中黄酮类物质
1、仪器及方法：
HPLC-UV-MS/MS，Thermo Accela高效液相系统（美国Thermo Fisher Scientific公司）；Thermo Electron LTQ-Qrbitrap XL组合式质谱仪，配备电喷雾接口（美国Thermo Fisher Scientific公司）。
色谱柱：Phenomenex Lunar(4.6mm×15mm，5μm)
梯度洗脱条件流动相：
流速：0.35ml/min，柱温：30度，检测波长：290nm
2、结果与分析 
按照色谱峰保留时间的顺序，峰的确证如下：
Rt=12.80min(12.72-12.86)min:m/z305.0673[M+H]+,m/z322.0939[M+NH3+H]+,m/z327.0493[M+Na]+,是二氢槲皮素（C15H13O7,calcd.m/z305.0661[M+H]+;C15H16NO7,calcd.m/z322.0927[M+NH3+H]+,C15H12NaO7,calcd.m/z327.0481[M+Na]+）；Rt=14.12min(13.99min-14.18min):m/z289.0723[M+H]+,m/z311.0544[M+Na]+,根据上次HPLC-MS/MS香橙素的保留时间要比圣草酚短，确定其为香橙素(C15H13O6,calcd.m/z289.0712[M+H]+，m/z 311.0532[M+Na]+）；Rt=15.26min(15.13-15.38min)m/z289.0696[M+H]+峰很弱，确认为圣草酚；Rt=16.81(16.79-16.94min)；m/z303.0516[M+H]+(C15H11O7,calcd.m/z303.0505[M+H]+),m/z325.0336[M+Na]+(C15H11O7,calcd.m/z325.0324[M+Na]+),确认为槲皮素；Rt=18.37min(18.20-18.45min)m/z287.0566[M+H]+,m/z304.2499[M+NH3+H]+,确认为山奈酚(C15H11O6,calcd.m/z287.0550[M+H]+)。上述各化合物与标准品对照TLC的Rf值与HPLC的保留时间均一致。进一步证明长白落叶松提取物中存在上述五种物质。
长白落叶松提取物中，二氢槲皮素是主要的黄酮类物质，此外还含有香橙素、圣草酚、槲皮素、山奈酚等黄酮类物质。与俄罗斯兴安落叶松提取物33相比，长白落叶松提取物不含柚皮素和松属素这两种黄酮类物质。长白落叶松提取物中不仅含有花旗松素，还含有香橙素、圣草酚、槲皮素、和山奈酚这些黄酮类物质都有广泛的生物活性。
实验例二：高效液相色谱测定长白落叶松提取物中二氢槲皮素含量
1、实验材料长白山落叶松（L.olgensis）树根提取物，临江健维天然生物公司
2、实验仪器JHBE-50S闪式提取器，河南金鼎科技有限公司。
超声波清洗仪，昆山超声波仪器有限公司。
DK-98-1型电热恒温水浴锅，天津市泰斯特仪器有限公司。
ZF-1型三用紫外分析仪，上海顾村电光仪器厂。
岛津2010A高效液相色谱仪、LC solution工作站、SPD-20A紫外检测器，日本SHIMADZU公司。
BP211D电子天平，德国sartorius公司。
SZ-93自动双重水蒸馏器，上海亚荣生化仪器厂。
EYELA系列旋转蒸发仪，TOKYO RIKAKAKAI CO.,LTD。
3、实验试剂及药品
甲醇、乙醇，分析纯，北京化工厂。
甲醇，色谱纯，美国Tedia公司。
无水三氯化铝，北京化工厂。
纯水，杭州娃哈哈哈集团有限公司。
花旗松素对照品（纯度大于98%），上海晶纯实业有限公司
对照品及样品溶液配制：分别取花旗松素对照品和样品各10mg，以甲醇：水（2:3）为溶剂配制对照品及样品溶液，使用0.22μm微孔滤膜过滤，备用。
色谱条件：色谱柱：EC150/4.6NUCLEOSIL100-5C18色谱柱（150mm×4.6mm）。柱温30℃，检测波长288nm，流动相：甲醇-水（40:60）等梯度洗脱，流速1mL/min，进样量：20μL，
分析时间：15min。
4、结果：长白山落叶松（L.olgensis）树根提取物含量92.3%。见色谱附图1。
实验例三：长白落叶松花旗松素提取物清除DPPH自由基作用的研究
黄酮类化合物独特的化学结构和高度的化学反应性，使其具有了众多了生物学活性，如清除自由基、抗氧化、抗衰老、抑菌、抑制酶活性等等[52]。而花旗松素作为黄酮类中的翘楚，拥有五个酚羟基，使其展现出了更强的生物学活性。本章即研究了花旗松素在清除DPPH自由基、抑制酪氨酸酶活性、对四氯化碳诱导的肝损伤的肝保护活性和抑菌等四个方面的作用， 为进一步研究花旗松素的生物学活性，开发花旗松素的功能性产品做理论参考之用。清除多余的自由基（抗氧化）对人体有重要的作用，自由基和氧化剂能够能够将细胞和组织分解，影响代谢功能，影响人体的健康，诸如白内障、心脑血管疾病、糖尿病、关节炎等疾病都与自由基相关。此外，过剩的自由基和活性氧与机体的衰老过程也是直接相关的，自由基会破坏蛋白质等生物大分子的结构，引起人体衰老，因此，清除自由基是抗氧化同时也是抗衰老研究重要的一部分。许多黄酮类化合物都具有DPPH自由基清除的作用[52]，通过测定自由基清除作用可以评价花旗松素的抗氧化和抗衰老作用。
1、材料、试剂和仪器
长白落叶松花旗松素提取物（纯度92.3%）自制；DPPH，Sigma Chemical Co.(St.Louis,MO,USA)；维生素C，纯度99%，上海同田生物技术有限公司；磷磷酸氢二钠、磷酸二氢钠，乙醇等均为分析纯，北京化工厂。
超声波提取器，昆山市超声仪器有限公司；连续光谱扫描式酶标仪SpectraMax Plus384美国分子生物仪器公司；EYELA系列旋转蒸发仪，TOKYO RIKAKIKAI CO.,LTD；BP211D电子天平，德国Sartorius公司；恒温水浴锅，天津泰斯特仪器有限公司；移液器（1-100μL，100-1000μL）芬兰BioHit公司。
2、实验方法 
样品溶液的制备准确称取0.0128g DPPH用无水乙醇溶解，并定溶于50mL容量瓶中，然后取10mL定溶于50mL容量瓶中，最终浓度为1.3×10-4mol/L。
分别取花旗松素样品（纯度92.3%）和对照品维生素C使用20%乙醇和水配制成浓度为0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、1mg·mL-1的溶液。
DPPH自由基清除活性测定方法DPPH自由基清除测定方法参考文献[68]并加以改进。96孔板用来快速测定样品的吸光度值。分别取各浓度花旗松素和维生素C样品溶液80μL，加入到80μL的DPPH乙醇溶液中，37℃下黑暗静置30分钟之后，用95%的乙醇溶液做参比，在525nm处测定其吸光度记为B，每个样品浓度平行测定3次；测定80μL的DPPH乙醇溶液与80μL水混合后的吸光度记为A；80μL不同浓度花旗松素和维生素C样品溶液与80μL无水乙醇混合，37℃下黑暗静置30分钟之后，在525nm处测定吸光度测定其吸光度值记为C。
自由基清除活性通过公式2.1计算：
DPPH清除率%=[1-(B-C)/A]×100    （2.1）
3、数据统计处理样品EC50值按照参考文献[172]利用SPSS17.0软件计算。
4、结果与分析 
不同浓度的长白落叶松花旗松素提取物和维生素C样品溶液的DPPH自由基清除率如表2-1所示，其半最大效应浓度EC50值分别为0.0138和0.0156mg·mL-1。
表1长白落叶松花旗松素提取物对DPPH自由基的清除率（n=3）
Tab1DPPH radical scavenging effects of taxifolin 
由表1及EC50值可知，长白落叶松花旗松素提取物具有与优良抗氧化剂维生素C相媲美的清除DPPH自由基活性，而且其在浓度较低（0.001mg·mL-1）时便展现出了一定的抗氧化清除自由基的能力，这可能与其特殊的分子结构相关。
5讨论
黄酮类化合物抗氧化反应的机理在于其不仅能清除链引发阶段的自由基,而且可以直接捕获自由基反应链中的自由基,阻断自由基链反应,起到预防和断链的双层作用[53]。一个物质有没有抗氧化能力取决于它的结构[54]。目前的研究认为黄酮类抗氧化能力的大小取决于其分子结构中的酚羟基数目和位置，酚羟基的数目越多，抗氧化能力越强；分子中邻二酚羟基和对二酚羟基的抗氧化性要强于间二酚羟基；邻二酚羟基的黄酮可以形成的半醌式自由基,电子自旋密度分布比较均匀,而电子自旋密度分布的均匀性,是黄酮类抗氧化性较强的最重要原因；同时黄酮分子内B环上酚羟基的数量和位置又是黄酮类抗氧化活性的重要基础[55,56]。花旗松素分子中含有多达5个酚羟基，且B环上两个酚羟基呈邻位位置，B环上的邻二酚羟基易形成稳定的半醌结构，同时B环的两个酚羟基还可以影响A环的酚羟基抗氧化作用，这就使它较其他黄酮类有着更强大的抗氧化活性。
用天然抗氧化剂取代合成抗氧化剂是今后以食品工业、化妆品业等为代表的各个行业的的发展趋势,开发实用、高效,成本低廉的天然抗氧化剂仍燃是天然抗氧化剂研究的重点。花旗松素作为一种品质优良的天然抗氧化剂，有着无毒、安全、且抗氧化效果好的优点，相信随着对它认知的逐渐加深，它在抗氧化、抗衰老方面的应用将更加的广泛。
实验例四：长白落叶松花旗松素提取物抑制酪氨酸酶活性的研究
随着人们对美白化妆品的需求量增加，许多著名的化妆品公司开展了对天然美白活性物质的筛选研究。美白活性物质的人体皮肤实验法主要有以下两种：一是色度计测定色素沉着抑制效果，根据被测区域的皮肤色度程度来评价美白活性物质的功效；二是污斑改善效果的测定，测定紫外线照射后二次黑化的预防改善效果，采用图像解析法测定污斑的改善效果，但是污斑会受到紫外线的影响，难以在相同的条件下获取图像，使测定难以达到标准化。体外美白功效测定目前主要有以下三种：一是直接测定酪氨酸酶活性的抑制作用，该方法简单易行，无需细胞实验或动物实验；二是测定细胞中黑色素的含量；三是使用MTT法、LDH测定法和显微镜观察法考察具有美白活性的物质对黑色素细胞生长的影响[57]。
随着对黑色素合成机制的进一步认识，发现在黑色素的合成过程中，酪氨酸酶、二羟基吲哚羧酸氧化酶和多巴色素互变酶等酶类起着重要的调节作用。其中酪氨酸酶是一种广泛分布在植物、微生物和动物中的酶类，它的催化作用主要有L-酪氨酸的羟化和L-多巴的氧化这两类 [58]。目前酪氨酸酶抑制剂的研究已成为美白化妆品研究开发的重点，众多的天然酪氨酸酶抑制剂被应用于美白化妆品中[59]。
酪氨酸酶可以将酪氨酸酪氨酸氧化为多巴并继而氧化为多巴醌,最终形成黑色素[60]。因此，可以通过考察酪氨酸酶与多巴的氧化反应是否被抑制来判断酪氨酸酶的活性是否被抑制，本节即是以L-多巴为底物，以熊果苷和维生素C为阳性对照研究长白落叶松提取物花旗松素对酪氨酸酶活性的抑制作用，考察其潜在的美白作用。
1材料、仪器与试剂
长白落叶松花旗松素提取物（纯度92.3%）自制。连续光谱扫描式酶标仪SpectraMax Plus384美国分子生物仪器公司；EYELA系列旋转蒸发仪，TOKYO RIKAKIKAI CO.,LTD；BP211D电子天平，德国Sartorius公司；自动双重纯水蒸馏器SZ-93，上海亚荣生化仪器厂；移液器（1-100μL，100-1000μL）芬兰BioHit公司。
L-多巴（DOPA），广州齐云生物技术有限公司；熊果苷，常州龙腾生物科技有限公司；酪氨酸 酶（25KU），上海宝曼生物科技有限公司；维生素C，纯度99%，上海同田生物技术有限公司；磷磷酸氢二钠、磷酸二氢钠，北京化工厂；纯水，实验室自制。其他试剂均为分析纯，北京化工厂。
2实验方法
样品及对照品溶液的制备长白落叶松花旗松素提取物（纯度92.3%）以10%乙醇配置成不同浓度的供试品溶液备用。将阳性对照品熊果苷和维生素C使用10%乙醇溶液配置成不同浓度的对照品溶液备用。
试剂溶液的制备磷酸缓冲溶液（pH6.8）的配制：分别配制甲、乙两种溶液，甲液是含磷酸氢二钠11.864g/L的水溶液，乙液是含磷酸二氢钠9.2g/L的水溶液。取50mL的甲液和50mL的乙液，两者混合均匀即得pH6.8磷酸缓冲液。
酪氨酸酶溶液的配制：精密称取25KU的酪氨酸酶0.0123g，用pH6.8的磷酸缓冲液定容到25mL容量瓶中，溶解摇匀即得46U/mL的酪氨酸酶溶液。
抑制酪氨酸酶活性测定抑制酪氨酸酶活性的测定方法参考Toshiya Masuda的文献[181]并稍加修改。使用96孔板，可以一次性方便快捷的测定多个样品，总共8孔设计，其中A（三孔），B（1孔），C（三孔）D（1孔）分别含有以下反应混合物：如表2-2所示。其中，样品溶液为不同浓度的长白落叶松花旗松素提取物（纯度92.3%）溶液、熊果苷和维生素C作为阳性对照品。在加入以上物质之前，各个测试孔中分别加入40μL的2.5mmol/L的L-DOPA磷酸缓冲溶液。待各物质加入后轻轻震荡使溶液混合均匀，然后在23℃下，静置10分钟，在475nm处测定其吸光度。酪氨酸酶抑制率用公式2.2计算，其中A、B、C、D分别为各孔的吸光度值。
酪氨酸酶的抑制率（%）=[（A-B）-（C-D）]/（A-B）×100%    （2.2）
表1反应液组成
Tab.1Composition of tyrosinase reaction solution 
数据统计处理样品EC50值使用SPSS17.0软件计算。
3结果与分析 
实验结果如图2所示，熊果苷、维生素C和长白落叶松花旗松素提取物（纯度92.3%）自制均表现出了一定的酪氨酸酶活性抑制作用，熊果苷的酪氨酸酶抑制作用EC50是0.001mg/mL，是三者中抑制作用最强的，花旗松素次之，EC50为1.391mg/mL，维生素C对酪氨酸酶的抑制率较低，EC50仅为10.735mg/mL。
4讨论
熊果苷和维生素C因为对酪氨酸酶活性有抑制作用，常常作为美白添加剂添加到化妆品中，熊果苷美白的机制在于其与酪氨酸竞争性结合酪氨酸酶，与多巴非竞争性抑制酪氨酸酶，但是其对黑色素细胞具有明显的细胞毒性，大量使用会使正常皮肤褪色；维生素C的作用机制在于其能够将深色氧化型色素还原成浅色还原型色素,使多巴醌还原成多巴,从而抑制其氧化过程的继续进行,使黑色素的形成减少，但因经还原的黑素仍可能再次氧化，因此必须 长期保持足够的浓度才有效，而且维生素C是水溶性的，不易渗透到皮肤角质层，使其应用受到限制[61-63]。
黄酮类抑制酪氨酸酶活性的机制在于其与底物酪氨酸和多巴竞争酪氨酸酶酶活位点，把酪氨酸酶从黑色素合成的催化环中带走[64]。其抑制酪氨酸酶活性的能力主要依靠其特殊的化学结构，它们是以螯合酶活性中心的金属离子来抑制酶活力；B环有羟基取代的比没有的抑制作用强；含有酚基结构，尤其是间苯二酚结构的化合物都具有抑制酪氨酸酶活性的能力。此外，还有研究表明黄酮类化合物通过抗氧化清除自由基来抑制酪氨酸酶活性。
花旗松素出众的抗氧化能力，B环上的羟基取代，与金属离子的螯合反应，多酚基结构，尤其是A环上5位和7位的间苯二酚使其具有了较为出色的抑制酪氨酸酶活性的作用。相对于具有细胞毒性的熊果苷和效果一般且需要长期大剂量使用的维生素C，花旗松素无毒、安全的特点使其具有更广阔的应用空间，相信会有越来越多的美白化妆品将目标投向花旗松素。
实验例五：长白落叶松花旗松素提取物对四氯化碳诱导的肝损伤的肝保护作用研究
肝是人体五脏之一，是人体代谢系统重要的器官；中医认为肝与胆相为表里，开窍于目，肝主藏血，主疏泄，有贮藏和调节血液的功能；《素问·五脏生成》上说“肝之合筋也，其荣爪也”，可见肝脏对人体的重要性。肝细胞损伤是各型病毒性肝炎,某些化学品和药物如乙醇、四氯化碳、半乳糖胺、扑热息痛、抗结核药等所造成的肝脏病理过程中的一部分,是肝纤维化和肝硬化的起始动因，防止肝细胞损伤,是预防和治疗慢性肝病的重要内容[65]。
四氯化碳（CCl4）是一种与肝脏亲和力较强的毒物，可导致肝细胞的脂肪变性、坏死、纤维化，被广泛用于制作体内外肝损伤的实验模型[66]。本节既是采用CCl4诱导小鼠肝损伤，并观察花旗松素的保肝作用。
1材料、试剂和仪器
长白落叶松花旗松素提取物（纯度92.3%）自制。
昆明小鼠，体重20±2g，购自于吉林大学实验动物中心。
连续光谱扫描式酶标仪SpectraMax Plus384美国分子生物仪器公司；EYELA系列旋转蒸发仪，TOKYO RIKAKIKAI CO.,LTD；BP211D电子天平，德国Sartorius公司；自动双重纯水蒸馏器SZ-93，上海亚荣生化仪器厂；移液器（1-100μL，100-1000μL）芬兰BioHit公司；HC-2517高速离心机，安徽中科中佳公司；FS-2可调高速分散器，江苏国胜仪器厂。
生理盐水，长春豪邦药业；联苯双酯，浙江万邦药业有限公司；大豆油，购自于长春佳得乐超市；四氯化碳，天津市津东天正精细化学试剂厂；丙氨酸氨基转移酶(ALT)测定试剂盒、天冬氨酸氨基转移酶(AST)测定试剂盒、丙二醛(MDA)测定试剂盒、考马斯亮兰蛋白测定试剂盒、总超氧化物歧化酶(T-SOD)测定试剂盒，南京建成科技有限公司；其他试剂均为分析纯。
2实验方法
2.1溶液的配制长白落叶松花旗松素提取物（纯度92.3%）自制，使用生理盐水配制成不同浓度溶液。阳性对照药联苯双酯使用生理盐水配制。CCl4以植大豆油配制成含10%CCl4大豆油溶液。
2.2小鼠的分组、给药及处理取健康昆明小鼠48只，随机分成六组(空白、模型、阳性对照、TF高剂量、TF中剂量、TF低剂量)。一周后，开始给药，空白组与模型组灌胃生理盐水，阳性对照组灌胃联苯双酯，其他三组按剂量灌胃长白落叶松花旗松素提取物（纯度92.3%），给药方式及剂量如表2-3所示。各组均充足供给水、鼠粮，垫料每天更换。给药饲养一周（7天）后，最后一次给药前十二个小时断粮、断水；最后一次给药一小时后向除空白组以外的其他五组按10ml/Kg剂量腹腔注射含10%四氯化碳的植物油，六小时后，对各组小鼠进行眼眶取血，处死并解剖小鼠，取肝脏组织。
表1各组给药方式及剂量
Tab.1Administration route&dose of every group 
2.3血清中转氨酶指标检测眼球取血于离心管中，离心两次，取上清液；按照ALT、AST试剂盒的操作步骤进行操作；使用酶标仪测定吸光度值（OD值）；代入ALT、AST标准曲线，求得酶活力。
2.4肝组织匀浆中生化指标检测取0.2g小鼠肝脏组织，添加9倍体积生理盐水，制成10%肝组织匀浆，离心，取上清液，待测；取少量离心后10%肝组织匀浆，稀释成1%肝组织匀浆，待测。
取1%肝组织匀浆分别按照考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒和SOD试剂盒的操作步骤进行操作，取10%肝组织匀浆按照MDA试剂盒的操作步骤进行操作；采用酶标仪测定各孔吸光度值；按照试剂盒提供的公式计算肝组织中SOD活力及MDA含量。
2.5数据统计处理所有的数据使用SPSS17.0软件进行均值和方差处理，数值用均值±标准差（mean±SD）表示。
3结果与分析 
3.1花旗松素对CCl4诱导的肝损伤小鼠血清生化指标的影响结果如表2和图2所示。CCl4模型组小鼠血清中的ALT、AST较空白组极显著升高（p﹤0.01），表示本次造模成功。与模型组数值比较，阳性对照药联苯双酯能够有效的降低小鼠血清中ALT（p﹤0.01）和AST，但是在AST方面无显著性。TF三个剂量组都展现出了降低血清中ALT和AST的能力，数值均低于模型组，与模型组比较均具有显著性（p﹤0.05），其中TF高剂量和中剂量在ALT方面，TF中剂量在AST方面呈现极显著差异（p﹤0.01）。
表2长白落叶松花旗松素提取物对小鼠血清ALT和AST的影响
Tab.2The effect of toxifolin on activities of ALT and AST in serum 
注：##：与空白比较，极显著差异，p﹤0.01；*：与模型比较，显著差异，p﹤0.05；**：与模型比较，极显著差异，p﹤0.01。
3.2花旗松素对CCl4诱导的肝损伤小鼠肝组织生化指标的影响结果如表2-5和图2.4、2.5所示，CCl4模型组中小鼠肝组织中SOD活力较空白组明显下降（p﹤0.01），MDA含量较空白组显著上升（p﹤0.01）。阳性对照药联苯双酯展现出了较强的增强SOD活力（与模型比较p﹤0.01）和降低MDA含量（与模型比较p﹤0.01）的能力。TF与模型组比较，显著的提高了肝损伤细胞组织中SOD的活力，降低了小鼠肝损伤细胞组织中MDA的含量，其中除TF低剂量在SOD方面，TF中剂量在MDA方面呈现显著性差异外（p﹤0.05），其余各组均呈现极显著差异（p﹤0.01）。
表3花旗松素对小鼠肝损伤细胞组织SOD活力和MDA含量的影响
Tab.3The effect of toxifolin on activities of SOD and concent of MDA in mice liver 
注：##：与空白比较，极显著差异，p﹤0.01；*：与模型比较，显著差异，p﹤0.05；**：与模型比较，极显著差异，p﹤0.01。
4讨论
丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）是检测肝细胞损伤的常用指标，转氨酶的升高程度反映了肝细胞膜的损伤程度；超氧化物歧化酶（SOD）是生物体内存在的一种重要的抗氧化酶，能特异性的清除体内超氧阴离子自由基(O2 -)，其活力的大小表示机体清除氧自由基的能力；丙二醛（MDA）是脂质过氧化重要的产物之一，对细胞有损伤作用，其含量高低反映机体内脂质过氧化的程度，间接反映机体细胞受到自由基攻击的严重程度[66]。上述实验结果表明，花旗松素各剂量能够显著的抑制CCl4诱导的肝损伤小鼠血清中ALT、AST的变化；并且能够显著提高肝损伤小鼠肝组织中的SOD活力，降低肝组织中MDA的含量；说明花旗松素能够抑制或者减轻由CCl4诱导的肝损伤。
CCl4是种很强的亲肝性毒物，其肝毒性主要是由过氧化损伤引起的，它与酶反应生成自由基引发肝细胞脂质过氧化作用，从而引起肝细胞的损伤[66]。研究表明，黄酮类保肝的作用与抗氧化、调节酶活性、抑制肿瘤坏死因子释放以及抑制正常肝细胞凋亡等作用有关[67]。花旗松素具有较强的抗氧化作用，能够清除体内多余自由基，防止CCl4引起的肝细胞脂质过氧化，这可能是其能够对CCl4诱导的肝损伤具有保护作用的主要原因，而花旗松素具有的调节酶活性、抑制恶性肿瘤细胞生长等药理作用使其保肝作用得到进一步加强。本节实验中花旗松素对CCl4诱导的肝损伤的肝保护作用表现一般，但是表现出了相当大的保肝作用潜力，其可能的原因是给药剂量偏低，还需要做进一步研究。
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Claims (5)

1.一种长白落叶松提取物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)原材料选定：国家计划择伐及皆伐的人工林长白落叶松树根，原材料中花旗松素含量测定：2％--4.5％为可用标准；
2)原材料前处理：将侧根与主根分割归类，用清水洗净泥沙后风干；去除树皮及毛根，切成片后粉碎成木屑(0.4×0.4×8mm)；
3)酶解：按物料重量半纤维素酶用量为0.4‰—0.6‰，纯化水的加入量是物料重量的2.3—2.5倍，在提取罐中加热至55-60℃保温1.5-2h；
4)提取、浓缩：酶解过程完成后，将物料重量3.5—3.8倍乙醇(95％)加入提取罐，升温至80℃--90℃，恒温1小时，然后进行热回流提取、浓缩，时间为2.5—3.5小时。浓缩时真空度为0.08MPa，当浓缩液经过取样比重达到1:1.08时收膏；
5)水沉：在60±1℃条件下，稀释浓缩液，浓缩液与纯化水之比为1:2.8—3.2，静沉30min，去除松香结晶物；
6)萃取：将水沉上清液泵入萃取罐中，在40℃--43℃条件下加入甲基叔丁基醚，上清液与甲基叔丁基醚之比为1:0.18—0.25。混合液在罐中循环40min，静止3h；
7)初结晶：将萃取罐中有机相导入夹层式蒸发罐中，加热至56℃--58℃，蒸除甲基叔丁基醚，罐中液体入转移桶，桶入水浴箱，3℃-5℃条件下静止46h；
8)重结晶：将初结晶物与纯化水(结晶物与纯化水之比为1:4.5—5.5)混合倒入加热罐中搅拌2.5h，温度为95℃，罐中液体入转移桶，桶入水浴箱，3℃-5℃条件下静止96h；
9)喷雾干燥：将重结晶物与纯化水(结晶物与纯化水之比为1:3.5—4.5)混合倒入加热罐中搅拌,1.5h，温度为95℃时入喷雾干燥塔，塔内风温142℃，得到提取物，二氢槲皮素纯度90.3-93.5％(干燥)。
2.根据权利要求1所述的长白落叶松提取物的制备方法，其特征在于：该制备方法制备得到的提取物采用液质联用法确认其黄酮类化合物的主要成分是二氢槲皮素，其他包括：香橙素、圣草酚、槲皮素和山奈酚。
3.根据权利要求1所述长白落叶松提取物的制备方法制备得到的提取物在用于制备化妆品上的应用。
4.权利要求1所述长白落叶松提取物的制备方法制备得到的提取物在用于制备治疗抗氧化抗衰老药物上的应用。
5.权利要求1所述长白落叶松提取物的制备方法制备得到的提取物在用于制备治疗肝损伤药物上的应用。
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