KR101322719B1 - 프라티코사이드를 고순도로 함유한 길경 분획물을 유효성분으로 하는 고지혈증 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents
프라티코사이드를 고순도로 함유한 길경 분획물을 유효성분으로 하는 고지혈증 예방 및 치료용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 프라티코사이드를 고순도로 함유하는 길경 분획물을 유효성분으로 하는 고지혈증 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 길경 에탄올 조추출물을 에탄올에 용해시키고 아세톤을 첨가하여 형성되는 침전물을 제거하고 여액을 농축한 길경 에탄올-아세톤 분획을 에틸아세테이트에 녹인 후 물과 수포화부탄올을 순차적으로 사용하여 분배하여 얻은 길경 부탄올 분획을 에탄올 함유 수용액을 용출용매로 하는 역상(C18) 카트릿지 크로마토그래피에 의해 분리 정제한 프라티코사이드를 고순도로 함유하는 길경 분획물을 유효성분으로 함유하는 고지혈증 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 의하면, 기존과 다른 방법으로 프라티코사이드를 손실없이 고순도로 분리 정제함으로써 분획물 내 길경 프라티코사이드 및 프라티코딘 D가 고순도로 다량 함유되며, 길경 추출물 및 길경 분획물의 경구투여에 의하여 혈액, 세포와 조직에 축적되어지는 트리글리세라이드 및 지질의 분해와 소화를 방해하고, 콜레스테롤의 간조직으로의 콜레스테롤의 축적을 방지함으로써 항고지혈증 활성 및 항동맥경화 활성이 있는 잠재적인 소재로서의 활용을 기대할 수 있다.
본 발명에 의하면, 기존과 다른 방법으로 프라티코사이드를 손실없이 고순도로 분리 정제함으로써 분획물 내 길경 프라티코사이드 및 프라티코딘 D가 고순도로 다량 함유되며, 길경 추출물 및 길경 분획물의 경구투여에 의하여 혈액, 세포와 조직에 축적되어지는 트리글리세라이드 및 지질의 분해와 소화를 방해하고, 콜레스테롤의 간조직으로의 콜레스테롤의 축적을 방지함으로써 항고지혈증 활성 및 항동맥경화 활성이 있는 잠재적인 소재로서의 활용을 기대할 수 있다.
Description
본 발명은 길경에 함유된 사포닌인 프라티코사이드(platycosides)를 고순도로 함유하는 길경 분획물을 유효성분으로 하는 고지혈증 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.
고지혈증이란 중성 지방과 콜레스테롤 등의 지방대사가 제대로 이루어지지 않아 혈액 중에 지방질이 많이 포함된 상태를 말한다. 혈액 중의 지방이라고 하면 흔히 콜레스테롤만을 떠올리기 쉽지만 중성지방이 높을 때에도 고지혈증을 일으킬 수 있다. 고지혈증은 열량 섭취가 소모에 비해 과다할 때 발생하는 고중성 지방혈증과 콜레스테롤이 많이 함유된 동물성 지방의 과잉 섭취로 인해 발생하는 고콜레스테롤 두 가지로 분류된다. 고지혈증은 그 자체가 질병은 아니지만, 순환기질환의 중요한 위험 요인으로 작용한다. 즉, 고지혈증은 아무런 병적증상을 발생시키지 않지만 심각한 합병증을 유발한다. 대표적인 고지혈증의 합병증은 동맥경화증이다.
동맥경화증은 심장에 산소와 영양분을 공급해주는 관상동맥에 발생하는 질환으로, 협심증, 심근경색증 및 돌연사의 원인이 되기도 한다. 이외에도, 동맥경화증은 뇌혈관에 발생하여 뇌졸중을 유발하기도 하는데 뇌졸중은 주로 중성지방에 의한 것이다.
상기한 고지혈증에 따른 질환발생을 예방 또는 치료하기 위한 연구들이 진행되고 있다. 그러나 종래에는 직접적으로 총 콜레스테롤(total cholesterol), 트리글리세라이드(triglyceride) 및 β-리포프로테인(β-lipoprotein) 등을 저하시키기 위한 방법에 한정되어, 고지혈증의 발병 원인을 분석하고, 근본적인 치료 및 예방에 대한 연구는 미비한 실정이다.
한편, 고지혈증은 간장, 비장, 신장과 밀접한 관계가 있으며, 그 중에서도 비장과 신장에 밀접한 관계가 있다. 한의학적 측면에서 고지혈증은 혈액 중에 수습(水濕), 담탁(痰濁) 및 어혈(瘀血)과 같은 이물질이 섞여서 발생되며, 이는 간장, 비장 또는 신장이 허하고 손상되었기 때문에 발생하는 것으로 보고 있다. 우리 몸의 기운은 크게 음기와 양기의 두 가지로 나눌 수 있는데, 이러한 음기와 양기가 조화를 이루어야 하며, 어느 한 쪽이라도 허약할 경우 신체는 건강을 유지하지 못한다. 예를 들면, 총 콜레스테롤이 증가하는 것은 신장의 양기가 허한 것과 관련이 있으며, 트리글리세리드의 증가는 신장의 음기가 허한 것과 관련이 있다.
그러나, 아직 고지혈증에 근본적인 원인으로 작용하는 문제점을 치료하거나 예방함으로써 고지혈증을 해결할 수 있는 방안은 제시되지 못하고 있다.
이러한 고지혈증의 개선과 관련하여, 한국등록특허 제0795822호에는 자귀나무 추출물, 결명자 추출물, 오미자 추출물, 상지 추출물 및 감초 추출물을 포함하는 고지혈 및 뇌졸중 회복 및 예방에 효과가 있는 천연 식물 추출물이 개시되어 있고, 한국등록특허 제0882194호에는 항고지혈, 항산화 및 항바이러스 활성을 갖는 참취 추출물로부터 분리된 화합물이 개시되어 있으며, 한국공개특허 제10-2010-0031848호에는 야콘 건조분말 또는 그 추출물을 유효성분으로 함유하는 고지혈증 및 동맥경화성 혈관계 질환의 예방 및 치료용 조성물이 개시되어 있다.
한편, 도라지(길경, 桔梗)[Platycodon grandiflorum A. DC)는 초롱꽃과(Campanulaceae)에 속하는 다년생 초본류로서 주로 뿌리가 전통적인 생약재 및 식품으로 활용되고 있다. 이때, 생약재로 사용될 경우에는 길경이라 부르고, 식품으로 사용될 경우에는 흔히 도라지라고 부르기도 한다. 길경 추출물의 다양한 건강상의 장점이 보고되고 있고, 특히 4년근의 경우 기관지염, 천식, 폐결핵, 당뇨 등에 효능이 있는 것으로 알려져 있다.
최근 길경 추출물의 면역학적 효과가 연구되었으며, 트리테르펜(triterpene) 사포닌 등의 몇몇 활성물질들이 분리 동정되었다. 알려진 길경의 성분으로는 프라티코디제닌(platycodigenin)의 배당체로 프라티코딘(platycodin) A, C, D, D2와 2종의 모노아세테이트 프라티코딘 D3, 디피오(deepio)-프라티코딘 D3가 보고되었으며, 폴리갈락산(polygalacic acid)의 배당체로 폴리갈라신(polygalacin) D와 2종의 모노아세테이트, 폴리갈라신 D2와 모노아세테이트가 있고, 프라티코젠산(platycogenic acid) A의 배당체로 메틸 프라티코네이트 A, 메틸-2-메톡시 프라티코네이트 A 등 10 여종의 트리테르펜 사포닌이 보고되었다. 그 외 아글리콘으로 프라티코젠산 B 및 C의 존재가 보고되어 있다.
한편, 도라지 물 추출물의 고콜레스테롤 및 고지혈증, 그리고 CCl4에 의해 유도되는 간손상을 보호하는 효과가 보고되어진 바 있다. 그러나 이러한 도라지 추출물 및 분획물의 항산화 활성과 관련된 효과는 검토되지 않았다.
비만과 인슐린 비의존성 당뇨병, 이상지질혈증, 고혈압, 심혈관계질환의 발생빈도가 증가하고 있는 시점에서 사포닌을 포함한 천연물로부터 콜레스테롤과 같은 혈중 지질의 농도를 감소시킬 수 있는 활성소재를 찾고자 하는 연구가 진행 중이며 이러한 질환을 개선시키거나 예방 치료할 수 있는 신약과 기능성 식품이 개발되고 있다.
이와 관련하여, 한국특허공개 제10-2010-0120614호에는 길경 추출물로부터 분리되는 길경 사포닌 분획물 및 이 분획물로부터 효소에 의하여 생전환시킨 고함량의 플라티코딘 D를 유효성분으로 함유하는 지질대사 질환의 예방 및 치료용 조성물이 개시되어 있고, 한국등록특허 제0315000호에는 장생도라지(20년근 이상의 다년생 도라지)의 열수 추출물 또는 유기용매 추출물을 포함하는 고지혈증 치료용 한방 제제가 개시되어 있다.
도라지의 사포닌인 프라티코딘은 도라지의 기본적인 생리활성물질로서 항염증효과 및 항알러지활성, 암세포성장 억제효능, 면역능 증대활성, 피부세포의 세포사멸(apoptosis) 유발 효과 등을 포함하는 광범위한 효능을 포함하고 있고, 항비만, 지질개선의 효능 등이 동물실험을 통해 입증되어 있으나, 고지혈증에 대한 효능 및 혈액과 간에서의 지질대사, 지질개선에 대한 메카니즘 구명이 미흡한 실정이다.
본 발명은 길경 추출물 및 본 발명의 특징적인 방법으로 수득한 길경 분획물의 항산화 활성과 고콜레스테롤 식이를 급여한 쥐에 대한 혈액에서의 지질대사 지표(총 콜레스테롤, 총 트리글리세라이드, LDL, HDL 함량과 ALT 및 AST)를 검정하고, 간 조직에서의 총 콜레스테롤, 총 트리글리세라이드 함량 및 고지혈증 질환 효소 지표인 HMG-CoA 리덕타아제, 아실 트랜스퍼라제 활성을 검토한 결과, 길경 분획물 섭취가 혈액 및 간에서의 총 콜레스테롤, 총 트리글리세라이드 함량을 감소시키고, 혈액 내 LDL 함량을 감소시킬 뿐만 아니라, ALT 및 AST 활성을 감소시킴을 확인하였으며, 간 조직에서는 HMG-CoA 리덕타아제 활성을 증가시키며, 아실 트랜스퍼라제 활성을 감소시켜 혈액 및 간에서의 지질대사를 조절할 수 있다는 결과를 확인하고 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명은 부작용에 대한 우려가 없이 인체에 안전하며 혈액과 간에서의 총 콜레스테롤, 총 트리글리세라이드, LDL 함량 저하를 유도하고, 혈액 중 콜레스테롤 축적과 연관되는 효소활성을 조절할 수 있는 천연물로서 길경의 새로운 용도를 제공하는데 그 목적이 있다.
상기한 목적을 달성하기 위한 일례로서 본 발명은, 길경 에탄올 조추출물을 에탄올에 용해시키고 아세톤을 첨가하여 형성되는 침전물을 제거하고 여액을 농축한 길경 에탄올-아세톤 분획을 에틸아세테이트에 녹인 후 물과 수포화부탄올을 순차적으로 사용하여 분배하여 얻은 길경 부탄올 분획을 에탄올 함유 수용액을 용출용매로 하는 역상(C18) 카트릿지 크로마토그래피에 의해 분리 정제한 프라티코사이드를 고순도로 함유하는 길경 분획물을 유효성분으로 함유하는 고지혈증 예방 및 치료용 조성물을 특징으로 한다.
상기한 목적을 달성하기 위한 다른 일례로서 본 발명은, 상기한 고지혈증 예방 및 치료용 조성물이 포함된 식품 및 약제를 포함한다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명한다.
본 발명에서 길경 분획물을 수득하는 방법은 다음과 같다.
길경 에탄올 조추출물을 에탄올에 용해시키고 아세톤을 첨가하여 형성되는 침전물을 제거하고 여액을 농축하여 길경 에탄올-아세톤 분획을 수득한다.
길경 에탄올 조추출물은 길경 건조 분말을 에탄올 함유 수용액으로 추출하여 얻어진다. 상기 에탄올 함유 수용액은 에탄올 40 내지 90 부피% 수용액을 사용하는 것이 적당하다. 추출을 위해 널리 알려진 다양한 추출 방법을 채택할 수 있으며, 초음파 추출을 수행하는 경우 추출 효율을 높일 수 있다. 추출한 다음 충분히 방치한 후 고형물을 여과하며, 여과 잔류물에 다시 에탄올 함유 수용액을 첨가하여 추출, 방치 및 여과하는 과정을 수회 반복한다. 상기 반복은 3 회 이상, 추출 효율의 측면에서 3 내지 5회 반복하는 것이 바람직하다. 상기 추출액을 모아서 다시 여과하여 고형물을 제거한 여액을 50 내지 60 ℃ 조건에서 감압 농축하여 에탄올을 제거하도록 한다. 상기 감압 농축에 의해 에탄올을 다 날려 보낸 길경 에탄올 조추출물은 함유된 당성분에 의해 고형화가 되지 않기 때문에 물 상태까지 농축한 다음 -50℃ 이하의 저온에서 동결시키고 동결건조하여 분말로 가공한다. 상기 길경 에탄올 조추출물에 함유된 성분은 이를 메탄올에 녹여 수행한 HPLC 크로마토그램으로 확인할 수 있다[도 1].
상기 길경 에탄올 조추출물을 에탄올에 용해시키고 아세톤을 첨가하여 형성되는 침전물을 제거하고 여액을 농축하여 길경 에탄올-아세톤 분획을 수득한다.
구체적으로, 상기 길경 에탄올 조추출물을 용해시키기 위하여 길경 에탄올 조추출물 10 g에 대하여 에탄올 약 1 L 수준의 비율로 사용한다. 이때, 침전물이 발생하게 되는데, 길경 에탄올 조추출물이 용해된 에탄올 용액은 조심스럽게 다른 용기에 옮기고, 용해되지 않은 잔류물에 계속 일정량의 에탄올을 넣어 계속 용해시킨다. 길경 에탄올 조추출물이 완전 용해된 용액에는 에탄올 사용량의 3 배 수준의 아세톤을 첨가한다.
일반적으로 길경의 사포닌이나 프라티코딘 D 등은 이를 분리하기 위하여 극성이 높은 용매로 추출한 후 물에 녹여 헥산, 에틸아세테이트, 부탄올 및 물 등의 순으로 분획하며, 그 중 부탄올 분획을 농축하고 HP-20 등과 같은 칼럼에 통과시키는 통상의 분리방법을 사용한다. 이 경우 길경 추출물로부터 사포닌을 얻기 위해서는 최소 4 회 이상의 오픈 칼럼 크로마토그래피를 수행하여야 하고, 각 단계별로 TLC 등에 의해 분획된 물질을 확인하고, LC-MS 등을 사용하여 구조 동정 및 순도 측정 등의 단계를 거치는 등 분리에 소요되는 시간만 최소 7 내지 9 개월이 걸리는 등 비경제적이고 비생산적인 문제점이 많았다.
이에, 본 발명의 본 단계에서는 기존과는 달리 아세톤을 특징적으로 사용한다. 길경 에탄올 조추출물이 용해된 에탄올 용액에 아세톤을 첨가하면 흰색의 침전물이 발생되는데, 이는 일부 용해도가 떨어진 수용성 다당체 및 단백질에 해당되는 것으로 여과하여 제거하도록 한다. 이때, 아세톤의 사용량은 길경 에탄올 조추출물을 용해시키기 위하여 사용한 에탄올의 2 내지 5 배 부피, 바람직하기로는 3 내지 4 배 부피인 것이 수용성 다당체와 단백질의 제거 효율 측면에서 바람직하다.
상기 흰색의 침전물을 제거한 여액은 완전히 농축하여 길경 에탄올-아세톤 분획을 얻는다.
상기 길경 에탄올-아세톤 분획을 물에 용해시키고 에틸아세테이트로 분배하여 물층을 농축하여 물 분획을 수득한다.
상기 길경 에탄올-아세톤 분획을 증류수에 완전히 용해하고, 여기에 사용된 증류수와 동량의 에틸아세테이트(EtoAC)를 첨가하고 격렬하게 흔들어서 물과 EtoAC 가 혼합되게 한 후 정치하여 상층인 EtoAC 층을 회수한다. 하층인 물층에 다시 동량의 EtoAC를 첨가하고 흔들어서 층분리시키는 과정을 수회 반복하여 물층과 EtoAC 층을 분리한다. 상기 층분리는 3 회 이상, 바람직하기로는 3 내지 5 회 반복수행하는 것이 효과적이며, 이 과정을 통해 EtoAC 층에 포함된 일부 당 성분과 비사포닌 계열의 중간극성 물질을 제거할 수 있다. 상기 EtoAC 층을 농축한 다음 메탄올에 용해하여 HPLC를 수행한 결과를 도 2에 나타내었으며, 이를 통하여 EtoAC 층에 당성분과 중간 극성의 물질이 포함되어 있었음을 확인할 수 있다. 상기 하층인 물층은 40 내지 50℃ 조건에서 감압농축기를 사용하여 농축하여 물층에 함유된 EtoAC 를 모두 날려 제거한다.
상기 단계의 물층에 수포화 부탄올을 혼합하고 물층과 부탄올층으로 층분리한 후 부탄올층을 농축하여 부탄올 분획을 수득한다.
상기 단계에서 EtoAC 를 제거한 물층에 동량의 수포화 부탄올을 첨가하고 흔들어 혼합한 후 정치하여 물층과 부탄올층으로 층분리시킨다. 상기 분리된 물층에 다시 수포화 부탄올을 첨가하고 흔들어 혼합한 후 정치하여 물층과 부탄올층으로 재 분리하는 층분리를 수회, 바람직하기로는 3 내지 5 회 수행하는 것이 효율적이다. 상층으로 분리된 부탄올층을 모두 회수하고 50 내지 60℃ 조건으로 감압농축하여 부탄올 분획을 얻는다. 상기 부탄올 분획에는 다수의 사포닌 계열 성분들이 집적되어 있음을 HPLC 수행 결과를 나타낸 도 3의 HPLC 크로마토그램에 의하여 확인할 수 있다. 한편, 층 분리된 하층의 물층에는 상기 EtoAC 층 분리에 의하여 제거되지 않았던 고도의 극성화합물 및 당성분이 용해되어 있음을 도 4의 HPLC 크로마토그램을 통하여 확인할 수 있는 바, 본 단계의 수포화 부탄올을 사용한 분배에 의하여 이들이 제거되는 효과가 있다.
상기 수포화 부탄올은 부탄올과 초순수를 동량 혼합하고 격렬하게 흔들고 방치하여 완전히 층분리가 된 후 하층인 물층을 버리고, 상층을 회수하여 사용하는데, 사전에 미리 제조하여 준비하도록 한다.
상기 부탄올 분획을 증류수에 용해시키고 에탄올 함유 수용액을 용출용매로 하는 역상(C18) 카트릿지 크로마토그래피에 의해 길경 프라티코사이드를 함유하는 길경 분획물을 분리 정제한다.
도 3에 나타낸 상기 부탄올 분획의 HPLC 크로마토그램을 살펴보면 상대적으로 사포닌 성분과 비교하여 극성이 높은 성분이 부탄올 분획에 여전히 포함되어 있음을 확인할 수 있으며, 수차례에 걸친 EtoAC 와 수포화 부탄올을 사용한 용매분배에 의해서도 이들이 완전히 제거되지 않음을 확인할 수 있다.
따라서, 본 발명에서는 부탄올 분획을 역상(C18) 카트릿지 크로마토그래피에 의하여 분리 정제하였다. 이때, 역상(C18) 카트릿지는 SEP-PAK vac 6cc를 사용할 수 있고, 이동상으로는 에탄올 함유 수용액을 사용할 수 있다. 증류수에 완전히 용해시킨 부탄올 분획을 역상(C18) 카트릿지에 하적하고 이동상에 해당하는 에탄올 함유 수용액의 에탄올 농도를 20 내지 90 부피% 범위로 순차적으로 변화시키면서 부탄올 분획을 용출시키면 에탄올의 함량에 따라 역상(C18) 카트릿지에 흡착되었던 도라지의 지표성분인 길경 사포닌인 프라티코사이드 및 프라티코딘 D를 용출시킬 수 있다.
즉, 길경 에탄올 조추출물로부터 상기한 방법으로 수득한 길경 분획물에는 고순도의 프라티코딘 D 및 프라티코사이드가 다량으로 함유되어 있음을 확인할 수 있다[표 1 및 도 11].
본 발명에서는 길경 추출물 및 고순도의 프라티코딘 D 및 프라티코사이드가 다량 함유된 길경 분획물의 항산화 활성을 검정하기 위하여 지질 과산화 저해, DPPH 라디컬 소거활성, 펜톤 반응에 의한 히드록시 라디컬 소거활성, 수퍼옥사이드 음이온 라디컬 소거활성을 측정하였으며, 콜레스테롤 대사 및 고지혈증 질환 관련 효소 지표에 미치는 영향을 조사하기 위해, 동물실험을 수행하였으며 4주 동안의 고콜레스테롤 식이 및 길경 에탄올 추출물과 길경 분획물을 경구투여 함에 따라 혈중 트리글리세라이드, 총 콜레스테롤, HDL, LDL 함량, ALT 및 AST의 효소활성, 간조직에서의 지질, 트리글리세라이드, 총 콜레스테롤 함량 변화를 조사하였으며, 간조직에서의 HMG-CoA 리덕타제(reductase), ACAT의 효소적 활성변화를 검정하였다.
길경 추출물 및 길경 분획물은 높은 지질과산화 저해 활성을 나타내었으며, 자유 라디칼의 생성을 저해하고, 히드록시 라디칼 및 수퍼옥사이드 음이온 라디칼의 소거활성을 증가시켜 높은 항산화 활성을 나타냄을 확인할 수 있었다.
또한 길경 추출물 및 길경 분획물은 경구투여에 의하여 ALT와 AST 활성이 저하되어 간손상에 의한 스트레스를 감소시키고 지방간 형성을 저해하며, 간조직에서 ACAT 효소활성을 저해하여 동맥에서 콜레스테롤의 축적을 억제하고 간에서 지단백의 형성을 방해하여 간조직으로의 콜레스테롤의 축적을 방지할 수 있음을 예측할 수 있게 하고, 세포와 조직에 축적되어지는 트리글리세라이드의 분해 및 지질의 소화를 방해하여 콜레스테롤 및 트리글리세라이드가 체내에서 축적되는 것을 저해하며, 고콜레스테롤 식이와 함께 투여 시 혈장에서 HMG-CoA 리덕타아제 활성을 일반식이 수준으로 증가시켜 체내의 콜레스테롤 소모를 증가시키는 등의 효과를 나타냄을 확인하였다.
즉, 길경 분획물이 고지혈증을 유발하는 주요 인자로 알려진 콜레스테롤의 체내 흡수 및 이용을 저해하고, 동맥 및 간조직에서 콜레스테롤의 축적을 저해하는 고지혈증 예방 및 치료용 조성물의 유효성분으로 이용 가능함을 확인하였다.
한편, 상기 길경 분획물을 유효성분으로 포함하는 고지혈증 예방 및 치료용 조성물은 임상 투여 시에 경구 또는 비경구로 투여, 예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용할 수 있으며, 일반적인 건강식품의 형태로 사용될 수 있다.
상기 조성물은 경구 투여용 제형, 예를 들면, 정제, 트로키제(troches), 로진지(lozenge), 수용성 또는 유성현탁액, 조제분말 또는 과립, 에멀젼, 하드 또는 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭실제(elixirs)로 제제화된다. 정제 및 캡슐 등의 제형으로 제제화하기 위해 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제; 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제; 옥수수 전분 또는 고구마 전분과 같은 붕괴제; 스테아린산 마그네슘, 스테아린산 칼슘, 스테아릴푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌글리콜 왁스와 같은 윤활유가 함유된다. 캡슐제형의 경우는 상기에서 언급한 물질 이외에도 지방유와 같은 액체 담체를 함유한다.
또한, 본 발명의 조성물은 비경구로 투여할 수 있으며, 비경구 투여는 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사, 흉부내 주사 주입방식에 의한다. 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위해서는 상기 조성물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액으로 제조하고 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여형으로 제제화될 수 있다.
상기한 길경 분획물은 조성물 중 1 ㎍/mL 이상, 바람직하기로는 1 내지 100 ㎍/mL 범위, 더욱 바람직하기로는 1 내지 10 ㎍/mL 범위로 함유되는 것이 항고지혈증 활성의 발현 측면에 좋다.
상기한 본 발명의 조성물의 유효투입량은 환자의 나이, 신체적 조건, 몸무게 등 에 의해 다양화될 수 있지만, 일반적으로 성인 환자 체중 1 kg 당 1 내지 50 mg/일이고, 바람직하기로는 5 내지 20 mg/일이며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정 시간 간격으로 1 일 수회, 바람직하기로는 하루 2 회 내지 3 회 분할 투여될 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 식용되는 도라지로부터 유래된 바, 인체에 안전하여 식품에 첨가하여 사용하기에 적합하므로, 고지혈증의 예방 및 치료의 기능성을 나타내는 다양한 식품으로 개발될 수 있다.
본 발명의 고지혈증 예방 및 치료용 조성물을 식품 중에 포함시킬 경우 총 중량 중 0.01 내지 50 %(w/w), 바람직하기로는 1 내지 30 %(w/w) 범위로 사용할 수 있을 것이다.
즉, 통상적인 기호성 식품 즉, 라면, 생면 등의 면류, 두부, 시리얼, 빵류, 츄잉 껌, 사탕, 과자류 중에 첨가하여 통상적으로 알려진 방법에 의하여 각종 식품을 제조할 수 있고, 또한, 정제, 과립제, 환제, 경질캡슐제, 연질캡슐제 또는 액제 제형 등 일반적인 제형으로 제형화 될 수 있으며, 생즙, 파우치, 음료, 또는 다류로 제조될 수 있고, 상기한 성분 이외에 다른 성분은 제형에 따라 당업자가 적의 하게 선택하여 배합할 수 있다.
상기한 본 발명에 의하면, 길경 추출물 및 고순도의 길경 프라티코사이드를 다량 함유하는 길경 분획물은 지질 과산화를 저해하고, DPPH 라디칼 소거활성을 나타내며, 수퍼옥사이드 음이온 라디칼 소거활성을 나타내어 높은 항산화능을 발현하였으며, 이는 고지혈증으로 인해 유발되는 동맥경화의 원인 중 하나라고 지적되는 자유라디컬의 체내 생성을 억제하는 효과를 기대할 수 있다.
또한, 본 발명에 의하면 길경 분획물이 ALT 및 AST의 활성을 저해하여 간손상에 의한 스트레스를 저감시키고 지방간의 형성을 저해하여 혈중 콜레스테롤 함량의 증가를 억제하는 효과를 기대할 수 있다.
또한 본 발명에 의하면, 길경 분획물은 ACAT 효소 활성을 저해하여 동맥에서 콜레스테롤의 축적을 억제하며, 간에서 지단백 형성을 방해하여 혈중 콜레스테롤의 증가를 방지할 수 있음을 확인할 수 있다.
또한 본 발명에 의하면, 길경 분획물은 고콜레스테롤 식이에서도 간조직의 HMG-CoA 리덕타아제 활성을 일반식이 수준으로 증가시켜 콜레스테롤의 체내 소모를 증가시킬 수 있는 효과를 기대할 수 있다.
상기한 결과를 종합하여 볼 때, 길경 추출물 및 길경 분획물이 항고지혈증 활성 및 항동맥경화 활성이 있는 잠재적인 소재로서 활용될 수 있음을 예측할 수 있다.
도 1은 길경 에탄올 조추출물의 함유성분을 분석한 역상 HPLC 크로마토그램이다.
도 2는 EtoAC 층 분리에 의해 길경 에탄올 조추출물로부터 제거된 성분을 분석한 HPLC 크로마토그램이다.
도 3은 부탄올 분획으로 회수된 성분을 분석한 HPLC 크로마토그램이다.
도 4는 길경 에탄올 조추출물[Crude extract]과 부탄올 분획으로 제거된 성분[water fraction after BuOH partition]을 분석한 HPLC 크로마토그램이다.
도 5 는 수포화 부탄올 분배에 의하여 얻어진 부탄올 분획[BuOH fraction]과 이를 역상 카트릿지 크로마토그래피에 하적한 후 용출액에 의해 제거된 [Loading effluent of Sep-pak] 성분을 분석한 HPLC 크로마토그램이다.
도 6은 수포화 부탄올 분배에 의하여 얻어진 부탄올 분획[BuOH fraction]과 이를 역상 카트릿지 크로마토그래피에 하적한 후 20 % 에탄올 수용액으로 용출시 회수되는 성분[Sep-pak with 20 % EtOH]의 HPLC 크로마토그램을 비교한 것이다.
도 7은 수포화 부탄올 분배에 의하여 얻어진 부탄올 분획[BuOH fraction]과 이를 상기 역상 카트릿지 크로마토그래피에 연속으로 40 % 에탄올 수용액으로 용출시 회수되는 성분[Sep-pak with 40 % EtOH]의 HPLC 크로마토그램을 비교한 것이다.
도 8은 수포화 부탄올 분배에 의하여 얻어진 부탄올 분획[BuOH fraction]과 이를 상기 역상 카트릿지 크로마토그래피에 연속으로 60 % 에탄올 수용액으로 용출시 회수되는 성분[Sep-pak with 60 % EtOH]의 HPLC 크로마토그램을 비교한 것이다.
도 9는 수포화 부탄올 분배에 의하여 얻어진 부탄올 분획[BuOH fraction]과 이를 상기 역상 카트릿지 크로마토그래피에 연속으로 80 % 에탄올 수용액으로 용출시 회수되는 성분[Sep-pak with 80 % EtOH]의 HPLC 크로마토그램을 비교한 것이다.
도 10은 도 8에서 용출된 성분 중 머무름시간이 21.13인 성분에 대해 LC/MS 질량분석을 수행한 결과의 예를 나타낸 것이고, 도 11은 도 8에서 용출된 성분을 동정한 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 FTC 법에 의하여 측정한 길경 추출물과 길경 분획물의 시간 경과에 따른 흡광도의 차이를 BHA 및 α-토코페롤과 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 길경 추출물과 길경 분획물의 히드록시 라디칼 저해율을 토코페롤과 비교한 그래프이다.
도 14는 길경 추출물 및 길경 분획물의 환원력을 BHT와 비교하여 나타낸 것이다.
도 15는 고콜레스테롤 식이를 한 실험동물의 간에서 ACAT 활성 변화를 나타낸 것이다.
도 16은 고콜레스테롤 식이를 한 실험동물의 간에서 HMG-CoA 리덕타아제(reductase) 활성 변화를 나타낸 것이다.
도 2는 EtoAC 층 분리에 의해 길경 에탄올 조추출물로부터 제거된 성분을 분석한 HPLC 크로마토그램이다.
도 3은 부탄올 분획으로 회수된 성분을 분석한 HPLC 크로마토그램이다.
도 4는 길경 에탄올 조추출물[Crude extract]과 부탄올 분획으로 제거된 성분[water fraction after BuOH partition]을 분석한 HPLC 크로마토그램이다.
도 5 는 수포화 부탄올 분배에 의하여 얻어진 부탄올 분획[BuOH fraction]과 이를 역상 카트릿지 크로마토그래피에 하적한 후 용출액에 의해 제거된 [Loading effluent of Sep-pak] 성분을 분석한 HPLC 크로마토그램이다.
도 6은 수포화 부탄올 분배에 의하여 얻어진 부탄올 분획[BuOH fraction]과 이를 역상 카트릿지 크로마토그래피에 하적한 후 20 % 에탄올 수용액으로 용출시 회수되는 성분[Sep-pak with 20 % EtOH]의 HPLC 크로마토그램을 비교한 것이다.
도 7은 수포화 부탄올 분배에 의하여 얻어진 부탄올 분획[BuOH fraction]과 이를 상기 역상 카트릿지 크로마토그래피에 연속으로 40 % 에탄올 수용액으로 용출시 회수되는 성분[Sep-pak with 40 % EtOH]의 HPLC 크로마토그램을 비교한 것이다.
도 8은 수포화 부탄올 분배에 의하여 얻어진 부탄올 분획[BuOH fraction]과 이를 상기 역상 카트릿지 크로마토그래피에 연속으로 60 % 에탄올 수용액으로 용출시 회수되는 성분[Sep-pak with 60 % EtOH]의 HPLC 크로마토그램을 비교한 것이다.
도 9는 수포화 부탄올 분배에 의하여 얻어진 부탄올 분획[BuOH fraction]과 이를 상기 역상 카트릿지 크로마토그래피에 연속으로 80 % 에탄올 수용액으로 용출시 회수되는 성분[Sep-pak with 80 % EtOH]의 HPLC 크로마토그램을 비교한 것이다.
도 10은 도 8에서 용출된 성분 중 머무름시간이 21.13인 성분에 대해 LC/MS 질량분석을 수행한 결과의 예를 나타낸 것이고, 도 11은 도 8에서 용출된 성분을 동정한 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 FTC 법에 의하여 측정한 길경 추출물과 길경 분획물의 시간 경과에 따른 흡광도의 차이를 BHA 및 α-토코페롤과 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 길경 추출물과 길경 분획물의 히드록시 라디칼 저해율을 토코페롤과 비교한 그래프이다.
도 14는 길경 추출물 및 길경 분획물의 환원력을 BHT와 비교하여 나타낸 것이다.
도 15는 고콜레스테롤 식이를 한 실험동물의 간에서 ACAT 활성 변화를 나타낸 것이다.
도 16은 고콜레스테롤 식이를 한 실험동물의 간에서 HMG-CoA 리덕타아제(reductase) 활성 변화를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 실시예 등에 의거하여 구체적으로 설명하겠는 바, 본 발명이 다음 실시예 등에 의하여 한정되는 것은 아니다.
실시예
1.
1)
길경
에탄올
조추출물의
제조
강원도 삼척시의 독농가가 재배한 6년근 도라지[길경(桔梗)]를 세척 및 건조하여 분말상태로 제조한 후 여기에 에탄올 80 부피% 함유 수용액을 분말 중량대비 20 배량을 첨가하여 40℃ 조건에서 30분간 초음파 추출 후 상온에서 30분 동안 방치하고, 와트만 No. 2번의 여과지를 사용하여 여과하였다. 상기 여과 후 잔류물에 다시 에탄올 80 부피% 함유 수용액을 처음과 동량 첨가하여 초음파 추출, 방치 및 여과를 3 회 반복 수행하였다. 상기 과정에서 얻어진 추출여액을 모두 모아 와트만 No. 2번의 여과지를 사용하여 다시 여과하고, 50 내지 60 ℃ 조건에서 감압 농축기를 사용하여 에탄올을 다 날려 보낸 후 물 상태까지 농축시켰다. 상기 농축물을 -50 ℃ 이하의 저온에서 동결 및 동결건조시켜 분말 상태로 가공하였다[길경 에탄올 조추출물, 이하 “길경 추출물”도 동일한 의미임].
상기 길경 에탄올 조추출물 일부를 메탄올에 용해하여 함유성분의 조성을 확인하고자 역상조건의 HPLC로 분석하였으며, 그 결과는 도 1의 크로마토그램과 같다. 도 1에 의하면, 수십 종의 함유성분이 공존하고 있는 양상을 확인할 수 있다.
2)
길경
부탄올
분획의 제조
상기 길경 에탄올 조추출물 10g 을 에탄올 약 1L에 용해시키며, 이때 침전물이 발생되는데 에탄올 용액은 조심스럽게 비이커에 옮기고, 잔류물에 다시 일정량의 에탄올을 넣어 용해시키며, 연속하여 잔류된 침전물에 에탄올을 첨가하여 용해시켰다.
상기 길경 에탄올 조추출물을 용해한 에탄올 용액 200 mL를 1000 mL 비이커에 옮기고 아세톤 600 mL와 혼합하여 흰색의 침전물 형성을 유도하고, 이를 와트만 No. 2번의 여과지로 여과하여 일부 용해도가 떨어진 수용성 다당체 및 단백질을 제거하였다. 상기 흰색의 침전물이 여과된 에탄올과 아세톤 용액을 50 ℃ 조건에서 감압 농축기를 사용하여 완전히 농축하고 얻어진 농축물에 증류수 약 400 mL 를 첨가하여 용해시켰다. 여기에 농축물이 용해된 증류수와 동량의 EtoAC 를 첨가하여 층 분리를 연속하여 3회 실시하였다. 이 과정은 추출물에 포함되어 있는 일부 당 성분과 비사포닌 계열의 중간극성 물질을 제거하기 위함이다.
상기 층 분리 결과에 의해 얻어진 상층인 EtoAC 층을 모두 모아 농축 후 메탄올로 용해하고, EtoAC 층 분리에 의해 추출물로부터 제거된 성분을 HPLC 분석으로 확인하였으며, 그 결과는 도 2에 나타내었다. 도 2에 의하면 길경 에탄올 조추출물로부터 층 분리된 EtoAC 층에는 HPLC 분석 시 머무름 시간 8분 내지 17분 사이에 해당되는 성분들이 많이 존재하고 있음을 확인할 수 있었다. 상기한 결과는 길경 에탄올 조추출물로부터 EtoAC 층 분리를 유도할 경우 이 부분에 해당되는 극성을 가진 물질이 제거됨을 의미하는 것으로 볼 수 있다.
상기 층 분리된 하층인 물층은 40 ℃ 조건의 감압농축기에 일부 농축하여 EtoAC 를 완전히 날려서 제거하며, EtoAC 를 제거한 물층으로부터 사포닌 계열의 물질을 회수하고, EtoAC 분획에서 제거되지 않았던 고도의 극성화합물 및 극성 당 성분을 제거하기 위하여 다시 동량의 수포화 부탄올을 넣어 층 분리를 동일하게 4회 실시하고, 층 분리 후 상층의 부탄올층을 회수하였다.
상기 수포화 부탄올은 부탄올과 초순수를 동량 넣어 격렬하게 흔들고 방치하여 완전히 층 분리가 된 후 상층을 회수하여 사용하며, 사전에 미리 제조하여 준비하도록 한다.
상기 상층으로 분리된 모든 부탄올층을 모아 60 ℃ 조건의 감압농축기를 사용하여 감압농축하여 부탄올 분획을 제조하였으며, 부탄올 분획에 의해 회수된 길경 사포닌 계열의 물질과 하층인 물층으로 분획되어 제거된 성분을 확인하기 위해 부탄올 및 물 분획 각각을 HPLC로 분석으로 하였으며, 그 결과는 도 3 및 도 4에 나타내었다.
도 3에 의하면 부탄올 분획에는 길경 에탄올 조추출물로부터 EtoAC 분획에 의해 일부 성분이 제거되었지만 나머지 잔존하고 있던 성분들이 용출되어 나오는 양상을 확인할 수 있다. 특히 HPLC 분석 시 머무름 시간이 21 내지 25분 사이에 해당하며, 길경 사포닌 화합물로 추측되는 수종의 성분들이 다량 분리되어 나오는 경향을 확인할 수 있다. 도 4에서는 부탄올 분획 처리에 의해 길경 에탄올 조추출물로부터 제거된 물층에는 다량의 완전 극성화합물이 포함되어 있어 HPLC 분석 시 머무름 시간이 3분 내지 15분 사이에 해당하는 완전 극성화합물의 제거효과를 확인할 수 있다.
3)
길경
부탄올
분획의 분리 정제
상기 부탄올 층을 농축하여 얻은 부탄올 분획에는 길경의 지표성분에 해당하는 사포닌 성분으로 추측되는 프라티코딘 D 및 프라티코사이드가 다량 함유되어 있지만, 도 3의 결과에서 보는 바와 같이 EtoAC 및 부탄올 등 2차례의 용매분획에도 불구하고 아직 HPLC의 머무름 시간이 3분 내지 10분 사이에 해당하는 상대적으로 사포닌 성분에 비해 극성이 극히 높은 다수의 극성화합물이 포함되어 있음을 확인할 수 있다.
이들 성분은 더 이상 용매분획에 의해서는 제거될 수 없으므로 다른 방법의 분리 정제과정을 적용하였다.
즉, 상기 부탄올층을 농축하여 얻은 부탄올 분획물 2g을 증류수 100mL에 완전 용해시키고 역상(C18) 카트릿지 크로마토그래피(Sep-pak vac 6cc)에 하적한 후 에탄올 0 내지 80 부피% 함유 수용액을 20% 에탄올 농도 수준으로 달리하여 10mL 용량으로 순차 용출한 후 각 에탄올 농도별 용출성분을 HPLC로 확인하고, 각 용출 에탄올 농도별 극성화합물의 제거 양상 및 길경의 지표성분에 해당하는 사포닌 성분의 회수양상을 도 5 내지 9에서 확인하였다.
도 5는 길경 추출물의 용매침전 및 2차례의 용매분배에 의해 획득된 길경 사포닌이 다량 함유되어 있는 것으로 추측되는 부탄올 분획과 이를 역상 카트릿지 크로마토그라피에 하적한 후 역상 카트릿지를 통과해 버려지는 용출액을 HPLC로 분석한 크로마토그램인데 결과에 의하면 부탄올 분획에 함유되어 있는 성분 중 머무름시간이 3분경에 해당하는 완전 극성화합물이 역상 카트릿지에 흡착되지 않고, 상당량 제거되는 양상을 확인할 수 있다.
도 6은 상기 도 5의 역상 카트릿지에 20% 에탄올 용액 10 mL를 이용하여 흡착된 성분을 용출하여 분석한 결과인데, 20% 에탄올 용액의 처리에 의해 머무름 시간 3분 내지 6분 사이의 극성화합물의 추가적인 제거를 확인할 수 있으며, 머무름 시간 10 분 이후의 상대적 중간극성 화합물의 용출은 전혀 확인할 수 없었다.
도 7은 상기 도 6의 역상 카트릿지에 연속하여 40% 에탄올 용액 10 mL를 이용하여 흡착된 성분을 용출하여 분석한 결과인데, 20% 에탄올 용액의 처리에 의해 제거된 머무름 시간 3분 내지 6분 사이의 극성화합물 중 일부 잔존하는 성분의 추가적인 제거와 머무름 시간 10 내지 15분 사이의 상대적 중간극성 화합물의 다량 용출을 확인할 수 있으며, 머무름 시간 15분 이후의 길경의 주요 사포닌 성분으로 추정되는 성분들의 용출은 전혀 확인되지 않았다.
도 8은 상기 도 7의 역상 카트릿지에 연속하여 60% 에탄올 용액 10 mL를 이용하여 흡착된 성분을 용출하여 분석한 결과인데, 40% 까지의 에탄올 용액 처리에 의해 머무름 시간 10분미만의 극성화합물 대부분이 거의 전량 제거된 양상을 확인할 수 있었고, 상대적으로 중간극성을 나타내는 머무름 시간 13 내지 15분 및 17 내지 18분 사이, 길경 주요 사포닌 성분으로 추정되는 머무름 시간 21 내지 24분 사이의 성분의 다량 용출을 확인할 수 있다.
도 9는 상기 도 8의 역상 카트릿지에 연속하여 80% 에탄올 용액 10 mL를 이용하여 흡착된 성분을 용출하여 분석한 결과인데, 60% 까지의 에탄올 용액 처리에 의해 거의 대부분의 부탄올 분획에 의해 분리된 성분이 용출되고 잔존물이 존재하지 않는 양상을 확인할 수 있다.
4)
길경
부탄올
분획 중
역상
카트릿지
정제 성분의 동정
길경에 함유되어 있는 사포닌 성분은 현재 전 세계적으로 지표성분인 프라티코딘 D 및 다양한 프라티코사이드를 포함하여 약 10종 정도 문헌적으로 보고된 바 있다.
따라서, 본 실시예에 의해 순차적 과정에 의해 최종적으로 정제된 60% 에탄올을 이용한 역상 카트릿지의 용출성분을 대상으로 LC/MS를 이용한 분자량 측정방식에 의해 화학구조를 동정하였다.
도 10은 60% 에탄올을 이용한 역상 카트릿지 분리에 의해 용출된 성분 중 길경의 주요 사포닌 성분으로 추정되는 머무름 시간 13 내지 24분 사이의 주요 성분 중 하나인 머무름 시간 21.13분대의 성분을 대표로 LC/MS 질량분석 결과를 도시한 것으로, 분석결과 분자량 1223.4를 나타내며 길경 활성의 지표성분으로 알려진 프라티코딘 D로 동정하였다. 아울러 동일한 방법에 의해 도 11에 보여진 60% 에탄올을 이용한 역상 카트릿지 분리에 의해 용출된 주요 성분 중 프라티코딘 D 외에 추가로 8종에 해당되는 프라티코사이드를 동정하였으며[표 1], 본 실시예에 의한 방법으로 길경 에탄올 조추출물로부터 순차적 정제과정에 의해 현재까지 보고된 길경에 함유된 총 10종의 프라티코사이드 중 길경의 지표성분으로 알려진 프라티코딘 D를 포함한 총 9종의 프라티코사이드를 HPLC 분석에 의한 자외선 흡광성분의 총 면적 대비 상대순도 70% 수준 이상으로 고순도 정제가 가능하였다.
| Peak No. | Retention time (min.) |
Platycoside | Molecular formula | [M-H]- |
| 1 | 13.14 | Deapi-Platycoside E | C64H104O34 | 1415.4 |
| 2 | 13.68 | Platycoside E | C69H112O38 | 1547.2 |
| 3 | 17.06 | Platycodin D3 | C63H102O33 | 1385.4 |
| 4 | 20.65 | Deapi-Platycodin D | C52H84O24 | 1091.4 |
| 5 | 21.13 | Platycodin D | C57H92O28 | 1223.4 |
| 6 | 21.57 | Polygalacin D | C57H92O27 | 1207.4 |
| 7 | 22.02 | 3"-O-acetyl polygalacin D | C59H94O28 | 1249.4 |
| 8 | 22.67 | Platycodin A | C59H94O29 | 1265.4 |
| 9 | 23.20 | 2"-O-acetyl polygalacin D | C59H94O28 | 1249.4 |
실시예
2.
길경
에탄올
조추출물
및
길경
분획물의
항산화 활성 검정
1) 지질과산화 저해 활성을 통한 항산화 활성
상기 실시예 1에 따라 수득한 길경 추출물 및 길경 분획물의 항산화 활성은 페릭 티오시아네이트(ferric thiocyanate)를 사용하여 Osawa와 Namiki (1981)에 의한 방법을 사용하여 검정하였다. 길경 추출물 600 ㎍을 98% 에탄올에 녹인 시료 0.12 mL를 40mM 소듐 포스페이트 완충액(sodium phosphate buffer, pH 7.0) 9 mL에 혼합하고 다시 2.88mL의 2.51% 리놀레산 용액(linoleic acid solution, dissolve in EtOH)을 첨가하였다.
상기 혼합물을 스크류 캡 바이알(screw cap vial)에 넣고 40 ℃, 암상태에서 반응시켜 산화를 유도하였으며 24, 48, 72시간으로 나누어 반응시켰다. 상기 기술한 반응액 0.1 mL에 75% 에탄올 9.7 mL로 희석하고 30 % 암모늄 티오시아네이트(ammonium thiocyanate) 0.1 mL, 3.5% HCl이 포함된 20mM 페루스 클로라이드(ferrous chloride) 0.1 mL를 혼합한 후에 3분 동안 정치하여 두었다가 UV-1200 UV/VIS 스펙트로미터(Shimadzu, Kyoto, Japan)를 사용하여 과산화물 생성(적색)정도를 500nm에서 흡광도로 측정하였다. 대조구는 시료를 첨가하지 않고 리놀레산만을 첨가한 것을 사용하였다[도 12, mean ± S.D.; n = 3]
길경 추출물 및 분획물의 항산화 활성을 검정하기 위한 FTC 시험 결과에서는 지질과산화의 초기단계에서 생성되어지는 퍼옥사이드(peroxide)의 양을 검정하였으며 낮은 흡광도를 나타낼수록 높은 항산화 활성을 나타낸다.
도 12에 나타난 바와 같이 길경을 첨가하지 않은 대조구에서 반응 3일까지 급격한 흡광도의 증가를 나타내는 반면 길경 추출물의 첨가 시 흡광도의 증가 비율이 낮아지는 경향을 나타내었다. 그러나, 24시간의 경우 BHA를 제외하고는 대조구의 흡광도와 유사한 경향을 나타내었기 때문에 길경 추출물의 지질과산화 초기 단계에서는 지질과산화 저해 효과는 미약한 것으로 사료되어진다. 반면 길경 분획물의 지질과산화 저해활성은 초기 24시간에는 α-토코페롤 보다 높은 저해활성을 나타냄을 확인할 수 있다.
2)
DPPH
라디칼
소거 활성
길경 추출물 및 길경 분획물의 전자공여능을 DPPH 라디칼 소거 활성을 통해 검정하였다. 전자공여능은 지질과산화 반응을 연쇄적으로 일으키는 반응에 관여하는 산화성 자유 라디칼에 전자를 제공하여 산화의 진행과정을 정지시킨다. 산화성 자유 라디칼은 생체 내에 존재하는 단백질과 세포막의 지질 등을 산화시켜 막에 쌓인다거나 DNA 등에 손상을 일으켜 각종 질병을 일으키는 것으로 알려져 있다. 최근 다수의 연구자들은 식물에 존재하는 각종 항산화성 물질들이 자유 라디칼을 제거하는 능력이 있는 것으로 증명되면서 이러한 물질을 찾으려는 연구가 다각도에서 이루어지고 있다.
실험방법으로서 시험관에 시료를 농도별(25, 50, 100, 200 ppm)로 첨가한 다음 100mM Tris-HCl 완충액(pH7.4) 400㎕와 0.5mM의 DPPH 1,600㎕를 첨가한 후 20분간 암실에서 반응시킨 뒤 517㎚에서 흡광도를 측정하였다. 이때 기질과 DPPH가 없는 초기(Ai)와 blank(Ab)를 측정하였으며, 시료 첨가 후 흡광도(As)를 측정하였고, RC50(㎍/mL)은 화합물을 첨가하지 않은 대조군의 값을 50 % 감소시키는 화합물의 농도를 나타내며, 기존의 항산화제인 α-토코페롤 및 BHA와 상호 비교하였다. DPPH 라디컬 소거활성 결과는 다음 표 2에 나타내었다.
| 시료 | PDE | PDS | BHT | Ascorbic acid |
| RC50(㎍/mL) | 149.51 ± 18.94 | 62.57 ± 7.61 | 8.14 ± 0.13 | 7.72 ± 0.12 |
길경 추출물(PDE) 및 길경 분획물(PDS)의 DPPH 라디칼 소거 활성은 RC50 값이 각각 149.5 ㎍/mL, 62.57 ㎍/mL를 나타내어 양성대조군인 BHT (8.1㎍/mL)나 아스코르브산(ascorbic acid, 7.7 ㎍/mL) 보다 낮은 수준을 나타내었으며, 농도 의존적으로 활성이 증가하는 경향을 나타내었다. 길경 추출물 보다 길경 분획물의 DPPH 라디칼 소거 활성이 2.1배 높은 활성을 나타내었다.
3) 히드록시
라디칼
소거 활성 검정
길경 추출물과 길경 분획물의 히드록시 라디칼(hydroxy radical) 소거 활성검정은 펜톤(Fenton) 반응에 의한 2-데옥시리보스(2-Deoxyribose)가 히드록시 라디칼에 의해 산화되어 말론알데하이드(malonaldehyde)로 변환되어 크로마젠(chromagen)을 형성하는 정도를 측정하는 방법을 이용하였다. 1 mL의 0.1 M 소듐 포스페이트 완충액(pH 7.4), 0.2 mL의 10mM 2-데옥시리보스(2-deoxyribose), 0.2 mL의 10mM FeSO4EDTA, 0.2 mL의 10mM H2O2 그리고 0.075 mL의 길경 추출물 농도별 시료(1.316 ppm, 2.632 ppm, 5.263 ppm, 10.526 ppm)를 에펜도르프 튜브(Eppendorf tube)에 넣고 37 ℃, 암 상태로 4시간 동안 반응시킨 후 1 mL의 2.8% (w/v) 트리클로로아세트 산(trichloroacetic acid)을 가하여 반응을 중지시킨 후에 다시 1 mL의 1.0% (w/v) TBA를 첨가한 후 이 반응액을 끓는 물에 10분 동안 처리한 후 급속 냉각시키고 UV-1200 UV/VIS 스펙트로미터(Shimadzu, Kyoto, Japan)를 사용하여 532 nm에서 흡광도로 측정하여 검정하였다. 히드록시 라디칼 소거활성 검정은 길경 추출물 및 분획물의 첨가에 따라 히드록시 라디칼에 의해 2-데옥시리보스가 산화되는 것을 저해하는 비율로 계산하였고, 대조군으로는 기존의 항산화제인 α-토코페롤을 사용하였으며, 그 결과를 다음 도 13에 나타내었다.
히드록시 라디칼(OH)은 활성산소 중 반응성이 매우 강하여 생체 산화에 주된 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 특히 히드록시 라디칼은 DNA의 푸린(purine)과 피리미딘(pyrimidine) 염기를 무차별적으로 공격하여 다양하게 변형시킬 뿐만 아니라 데옥시리보스(deoxyribose)부분을 공격하여 DNA사슬의 절단(scission)을 일으킨다. 암, 동맥경화증, 자가면역질환, 관절염, 폐질환, 당뇨병, 심근경색증, 뇌 및 신경질환 등의 발생과 진행 경과에 자유 라디칼이 관여하고 있다는 증거들이 많이 보고되고 있다.
길경 추출물의 히드록시 라디칼 소거활성을 검토한 결과 대조구 활성물질인 α-토코페롤이 약 50㎍/mL의 농도에서 20 % 이상의 저해율을 나타내는 반면 길경 추출물은 50㎍/mL의 농도에서 약 2 %의 저해율을 나타내었고 길경 분획물은 약 4%의 저해율을 나타내어 낮은 활성을 나타내었다. 히드록시 라디칼(OH)의 소거활성은 길경 에탄올 추출물보다 길경 분획물이 약 2배 정도로 높은 양상을 나타내었으나, 길경 추출물 및 길경 분획물 모두에서 농도를 약 500㎍/mL 이상으로 높인 경우에서도 저해율의 변화는 관찰되지 않았다.
4)
수퍼옥사이드
음이온
라디칼
(
Superoxide
anion
radical
) 소거활성
수퍼옥사이드 라디칼 소거활성은 NBT(nitro-blue tetrazolium) 환원법을 사용하여 검정하였다(Nagai et al., 2005). 즉, 3 mM 잔틴(xanthine) 80 ㎕, 0.05 mM 소듐 카보네이트 완충액(sodium carbonate buffer, pH 10.5) 1.92 mL, 3 mM 에틸렌디아민테트라아세트산 디소듐 염(ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt, EDTA) 80 ㎕와 0.75 mM NBT 80 ㎕로 구성된 혼합액에 길경 추출물 및 분획물을 10, 25, 50, 100 ㎍/mL의 농도로 각각 처리하였으며, 이 혼합물을 25℃ 에서 10분간 인큐베이션(incubation) 하였으며, 다시 1.0 mL의 XOD(6mU/mL)를 첨가하여 반응을 시작한 후 25 ℃에서 20분간 반응하였다. 그 후 0.02 mL의 6mM CuCl를 첨가하여 반응을 종결시킨 후 560 nm에서 흡광도를 측정하였다. 농도별 시료 첨가 양에 따른 NBT 환원에 대한 저해능을 50 % 감소시키는 화합물의 농도(IC50, 50% inhibition concentration)를 나타냈으며, (+)-카테친(catechin), 아스코르브 산(ascorbic acid, VC)을 대조구로 사용하여 비교하였다[표 3].
| 시료 | PDE | PDS | (+)-catechin | Ascorbic acid | BHT |
| Superoxide anion radical scavenging activity (IC50 ㎍/mL) |
197.15± 7.1 | 115.46± 11.0 | 7.2± 0.5 | 2.83± 2.1 | 2.59± 0.6 |
| Mean± S.E obtained from three experiments | |||||
정상적인 산화적 인산화의 과정 동안 소모되는 전체 산소의 0.4 내지 4 % 정도는 자유 라디칼, 수퍼옥사이드(O2 -)로 전환되며 생성된 수퍼옥사이드는 다른 ROS로 전환되어 직접적 또는 간접적으로 세포손상을 유발하는 것으로 알려져 있다. 정상적으로는 수퍼옥사이드는 내인성 항산화 방어기전에서 수퍼옥사이드 디스무타제(superoxide dismutase, SOD)에 의해 빠르게 과산화수소(H2O2)로 전환된다. 그러나, 이 내인성 항산화 방어체계가 세포내 산화 환원 균형을 유지하는데 문제가 생길 경우 결과적으로 산화스트레스가 일어나게 되며, 이 산화스트레스는 직접적으로 세포 내 거대분자의 손상을 일으키거나 세포손상을 일으키는데 중요한 역할을 한다.
길경 추출물과 길경 분획물의 수퍼옥사이드 음이온 라디칼소거활성을 측정한 결과[표 3], 녹차의 주요성분인 카테친 화합물이나 아스코르브 산, BHT의 수퍼옥사이드 음이온 라디칼 소거활성 보다는 낮은 활성을 나타내었다. 길경 분획물의 수퍼옥사이드 음이온 라디칼 소거활성이 길경 추출물의 소거 활성보다 다소 높은 경향을 나타내었다.
5) 환원력(
Reducing
Power
)
길경 추출물 및 길경 분획물의 환원력은 Oyaizu(1986) 의 방법에 따라 측정하였다. 0.2 M 소듐 포스페이트 완충액(pH 6.6) 1 mL, 시료 1 mL, 1% 포타슘 페리시아나이드(potassium ferricyanide) 1 mL를 가하고 이 혼합물을 50℃에서 20분간 반응시킨 후 10 % TBA(triobarbituric acid) 1 mL를 넣었다. 반응이 끝난 혼합물을 1,000 rpm으로 10분간 원심분리하여 얻은 상징액 2 mL와 메탄올 2 mL를 넣고 0.1 % 염화철(iron chloride) 용액 0.1 mL를 넣고, UV/VIS 스펙트로포토미터를 이용하여 흡광도 700 nm에서 측정하였다. 반응액은 Fe3 +과 Fe2 +간의 형질전환(transformation)에 의하여 청록색을 나타내며 흡광도 값이 클수록 높은 환원력을 나타낸다. 비교항산화제로 BHT를 사용하였으며, 그 결과를 도 14에 나타내었다.
길경 추출물의 환원력은 도 14에 나타난 바와 같이 농도 의존적으로 증가했다(r>0.99). 길경 추출물을 약 312 ㎍/mL를 적용하는 경우 환원력 60 %를 나타내어 BHT 2.9 ㎍/mL를 처리한 결과와 유사한 환원력을 나타내었다. 반면 길경 분획물은 312 ㎍/mL에서 54.8 %의 저해율을 나타내어 길경 추출물보다 낮은 활성을 나타내었고, 길경 추출물 및 길경 분획물을 1,250 ㎍/mL를 처리하는 경우 길경 추출물은 87%, 길경 분획물은 84%의 환원력을 나타내었다. 전반적으로 길경 추출물 및 길경 분획물은 1 mg/mL 이상의 높은 농도에서 활성 대조구인 BHT와 유사한 환원력을 가지는 것으로 생각된다.
실시예
3. 고지방
식이를
섭취한
쥐에서
길경
추출물과
길경
분획물의
항고지혈증
효과
1) 실험동물 식이
수컷 ICR 마우스 5주령 (25± 3g, Central Lab Animal Inc.)을 구입하여 사용하였으며, 스테인레스스틸 케이지(stainless steel cage)의 환경 제어장치 하에서 (20 ~ 23℃, 12 h periods of light and dark) 독립적으로 사육하였다.
고콜레스테롤 식이는 Dyets#101556 [일반식이 기본사료에 40 %(중량% 비)의 우지(Beef Tallow), Central Lab Animal Inc.]를 사용하였으며, 일반식이의 구성은 kg 당 200 g 카제인, 3 g DL-메티오닌, 150 g 옥수수전분, 500 g 수크로스, 50 g 셀룰로스, 50 g 옥수수유, 35 g 염 믹스(Salt Mix)(#200000), 10 g 비타민 믹스(vitamine mixture)(#300050), 2 g 콜린 비타르트레이트(choline bitartrate)로 구성하였다.
고지방식이의 영양성분 조성은 단백질 17.7 %, 지방 40.0 %, 섬유소(fiber) 5.0 %, 회분(Ash) 4.0 %, 수분 3.3 %, 당질 31.4 %로 구성되었다.
실험 전까지 실험동물에게 공급되는 사료와 물을 제한하지 않았으며 고지방 식이를 시작한지 1주 후에 혈액을 채취하여 혈중 콜레스테롤 함량을 측정하고 혈중 콜레스테롤 함량이 200㎎/㎗ 이상이 되는 개체만을 선발하여 실험에 사용하였다. 선발된 24개체를 무작위로 4군으로 나누어 일반식이를 한 군을 대조군(C)으로, 고지방식이를 함유한 사료를 식이한 군을 음성대조군(HCC)으로 하고 고지방식이에 길경 추출물(PDE) 및 길경 분획물을 식이한 군(PDS)으로 나누어 실험하였다[n=6].
길경 추출물 및 길경 분획물의 적용은 길경 추출물 및 길경 분획물을 각각 15 ㎎/㎏의 수준으로 4주 동안 경구투여 하였으며 고지방식이를 함유한 사료만을 적용한 대조군에는 0.9 %의 생리식염수를 경구투여 하였다. 실험을 실시한지 4주 경과 후에 길경 추출물을 및 길경 분획물을 경구투여하고 14시간이 경과한 후에 실험동물의 안구에서 혈액을 채취하였으며, 채취한 혈액은 2시간동안 상온에서 보관하였다가 원심분리하여(3500× g, 10분) 혈장을 얻고 분석 전까지 -80℃에서 보관하였다. 채혈 후 실험동물을 경추탈골하여 치사시키고 간을 적출한 후에 간의 무게를 측정하고 분석 전까지 -80℃에서 보관하였다.
2) 혈장에서의 콜레스테롤 대사 분석
혈장에서의 ALT(alanine amino-transferase)와 AST(aspartate amino-transferase)의 효소활성과 트리글리세라이드 및 총 콜레스테롤 함량은 색도계 키트(colorimetric kit, Eiken Chemicals Co. Ltd., Tokyo, Japan)를 이용하여 측정하였으며, 최종산물의 흡광도를 마이크로플레이트 리더(microplate reader, Molecular Devices, Sunnyvale, CA)를 사용하여 490 ~ 520 nm에서 측정하였다.
혈장에서 HDL(high density lipoprotein-cholesterol)의 농도는 고밀도 지단백-콜레스테롤 진단 시약(Kyowamedex Co. Ltd, Japan)을 사용하여 자동 분석기(Hitachi-747 auto-analyzer, Hitachi Co., Tokyo, Japan)로 측정하였고, LDL(low density lipoprotein-cholesterol)은 로쉐 2세대 저밀도 지단백-콜레스테롤 플러스 시약(Roche 2nd generation low density lipoprotein-cholesterol plus reagent)을 사용하고 자동분석기(Hitachi-7170 auto-analyzer, Hitachi Co., Tokyo, Japan)를 이용하여 측정하였다. 또한 혈장의 트리글리세라이드 및 콜레스테롤의 함량은 색도계 킷트(colormetric kit, Eiken Chemicla C. Ltd., Tokyo)를 이용하여 측정하였고, 최종산물의 흡광도를 마이크로플레이트 리더(microplat reader, Molecurlar device, Sunnyvale, CA)를 사용하여 490 ~ 520 nm에서 측정하였다. 간조직에서의 트리글리세라이드 및 콜레스테롤의 함량은 혈장에서와 같은 방법으로 측정하였다.
| Group | C (HC-free) | HCC | PDEd | PDSd |
| TG (mg/100mL) | 112.6± 16.5 | 140.9± 17.6c | 118.8± 13.3b | 126.2± 12.1c |
| TC (mg/100mL) | 116.8± 12.6b | 152.3± 6.4c | 98.2± 17.1 | 112.1± 13.9b |
| HDL-C (mg/100mL) | 75.7± 23.9a | 69.2± 29.3a | 74.5± 22.9a | 71.5± 16.2b |
| LDL-C (mg/100mL) | 60.4± 24.2b | 71.2± 27.2b | 47.2± 13.3 | 48.1± 27.9a |
| HDL-C/LDL-Cd | 1.5± 0.2 | 1.0± 0.2c | 1.6± 0.6a | 1.4± 0.4c |
| ALT (KU/L)e | 20.8± 2.7 | 25.4± 3.8 | 22.3± 2.7 | 19.8± 4.3 |
| AST (KU/L)e | 53.4± 4.6 | 70.2± 3.7 | 42.2± 6.6 | 45.9± 2.8 |
| The data are mean± S.D. and significantly different at aP<0.05, bP<0.01 and cP<0.001 by the unpaired Student's t-test. dThe discrete parameters of each measurement were used in statistical analysis after being counted and averaged. eKU (Karmen unit). PDE, ethanol extract from root of Platycodon grandiflorum., PDS, saponin fraction from root of Platycodon grandiflorum, HCC, high cholesterol., TG, triglyceride., TC, total cholesterol, HDL-C, high density lipoprotein cholesterol, LDL-C, low density lipoprotein cholesterol. |
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상기 표 4에 나타난 바와 같이, 실험동물에 대한 고콜레스테롤 식이와 길경 추출물과 길경 분획물을 경구투여한지 4주 후에 혈액 내 총콜레스테롤, 총 트리글리세라이드, LDL(low demsity lipoprotein), HDL(high density lipoprotein), ALT, AST의 효소활성을 검정한 결과, 고콜레스테롤을 단독으로 식이한 경우 혈액 내 총콜레스테롤, 총 트리글리세라이드, LDL은 증가하였고, HDL의 함량은 감소하였다. 이는 콜레스테롤이 첨가된 사료의 식이를 통해 ICR 마우스로부터 고콜레스테롤 혈증을 유발하기 적합하다는 것을 증명한다.
길경 추출물과 길경 분획물을 경구투여한 군에서는 고콜레스테롤 단독식이군 대비 트리글리세라이드 함량이 84.3% (PDE), 89.6% (PDS) 수준으로 감소하였으며, 총 콜레스테롤 함량이 콜레스테롤을 단독으로 식이한 군에 비하여 각각 64.5% (PDE), 73.6% (PDS)의 수준으로 나타났고, LDL 함량의 경우도 길경 추출물과 길경 분획물을 경구투여한 군이 콜레스테롤을 단독으로 식이한 군에 대하여 66.3% (PDE), 67.66% (PDS)의 수준으로 감소하는 경향을 나타내었다. 반면 HDL의 경우에서는 콜레스테롤을 단독으로 식이한 군, 일반식이군, 길경 추출물과 길경 분획물을 경구투여한 군 모두에서 변화를 나타내지 않았다. 길경 분획물의 경구투여에 따라 다른 콜레스테롤의 타입보다 LDL의 급격한 감소를 나타내고 HDL에 대한 변화가 크지 않은 결과는 티퀴사이드(tiqueside)나 파나퀴사이드(parnaqueside) 등과 같은 몇몇의 합성 사포닌이 혈장에서 콜레스테롤의 흡수를 방해하여 콜레스테롤의 함량을 낮추는 효과를 나타내나 HDL의 경우에는 영향을 미치는 않는다는 보고와 유사하였다. 길경 분획물에 존재하는 다양한 프라티코사이드 사포닌에 의해 콜레스테롤의 대사가 조절되는 것으로 생각된다.
상기 표 4에 나타난 바와 같이, 혈장에서의 ALT와 AST의 효소 활성에 있어서 콜레스테롤을 단독으로 식이한 군에서 일반식이군에 비교하여 AST 활성이 약간 증가하였으나 통계적으로 유의할 만큼의 변화는 관찰되지 않았으며, 길경 추출물과 길경 분획물을 경구투여한 군에서도 각 효소의 활성 정도는 감소하는 경향을 나타내었다.
3) 간에서의 콜레스테롤 대사 분석
간 조직에서 지질의 추출은 Folch 등 (1951)에 의한 방법으로 수행하였으며, 간 조직에서의 지질 추출 결과는 다음 표 5에 나타내었다.
각 실험군의 간 조직시료는 클로로포름과 메탄올(2:1)이 혼합된 용매를 조직시료 1㎎ 당 1 mL로 첨가하여 5분 동안 초음파처리(sonication) 한 후 원심분리(3000× g, 10분)를 수행하여 비용해성 물질을 제거하고 상층액에 물을 첨가하고 혼합한 후 다시 원심분리하여(3000× g, 10분) 아래에 있는 층을 모아 질소충전 하에 건조시켰으며, 건조된 추출물을 100 ㎕의 클로로포름에 재현탁하고 아미노프로필-고정 고형 추출 컬럼(aminoprophyl-bonded solid phase extraction column, 500 ㎎, Alltech, Deerfield, IL)을 이용하여 분리하였다. 아미노프로필-고정 컬럼을 4 mL의 헥산으로 2회 세척하였으며 재현탁된 지질 추출물을 통과시키고 다시 6 mL의 클로로포름과 2-프로판올(15:1, v/v)을 이용하여 지질을 용출시켰으며 건조한 후 무게를 정량하였다. 간조직에서의 트리글리세라이드 및 콜레스테롤의 함량은 혈장에서와 같은 방법으로 측정하였다.
| Group | C (HC-free) | HCC | PDEd | PDSd |
| Liver mass (g) | 1.83± 0.14 | 1.92± 0.13 | 1.54± 0.21 | 1.67± 0.14 |
| Total lipid extract | 24.5± 3.2a | 64.8± 2.3c | 38.6± 2.5b | 42.6± 3.3a |
| TG (mg/g liver mass) | 15.2± 1.8b | 19.9± 1.6 | 12.8± 0.8a | 14.2± 0.7a |
| TC (mg/g liver mass) | 16.5± 1.8b | 34.3± 2.2c | 20.2± 1.1b | 20.1± 3.9b |
| The data are mean± S.D. and significantly different at aP<0.05, bP<0.01 and cP<0.001 by the unpaired Student's t-test. dThe discrete parameters of each measurement were used in statistical analysis after being counted and averaged. | ||||
상기 표 5에 나타난 바와 같이, 실험동물에 대한 고콜레스테롤 식이와 길경 추출물과 길경 분획물을 경구투여한지 4주 후에 적출된 간에서의 간무게, 지방 함량, 총콜레스테롤, 총 트리글리세라이드의 함량을 검정하였다.
길경 추출물과 길경 분획물을 경구투여한 군이 콜레스테롤을 단독으로 식이한 군의 지방 함량 대비 59.6 ~ 65.7% 수준으로 감소하였으며, 트리글리세라이드 함량은 64.3 ~ 71.3% 수준으로 감소하였고, 특히 총 콜레스테롤 함량은 58.6% 수준으로 감소하였는데 간에서의 콜레스테롤 함량이 주로 에스터 폼 (cholesterol ester)으로 존재하는 것을 고려하여 볼 때 길경 추출물 및 길경 분획물이 ACAT 효소의 활성에 영향을 미쳐 동맥에서의 콜레스테롤 에스터 축적을 막고 간에서의 지단백질 형성을 방해하여 혈관 벽 내의 폼 셀의 증식을 막음으로써 강력한 항동맥경화 제제로서 활용할 수 있을 것으로 생각된다.
간의 무게는 콜레스테롤을 단독으로 식이한 군에서 1.92± 0.13 g을 나타내었으나 길경 추출물과 길경 분획물을 경구투여한 군에서 각각 1.54± 0.21 g, 1.67± 0.14 g 으로 약간 감소하는 경향을 나타내었다. 표 4 및 표 5의 결과를 종합적으로 볼 때 혈장에서 ALT, AST의 감소를 통하여 길경 추출물 및 길경 분획물이 고콜레스테롤과 연관된 간손상 스트레스에 대한 저해효과와 지방간 형성에 저해효과가 있음을 알 수 있었다.
사포닌이 콜레스테롤과 물리적인 결합에 의해 비수용성의 복합체를 형성하여 조직으로의 콜레스테롤의 흡수를 막는다는 여러 연구 결과를 고려하여 볼 때 길경프라티코사이드 사포닌은 이러한 콜레스테롤과의 경쟁적 결합을 통해 조직 내에서의 콜레스테롤 축적을 막을 수 있을 것으로 생각된다. 반면 사포닌과 콜레스테롤의 결합이 낮은 극성을 가지는 사포닌일수록 더 높은 비율과 강한 결합력으로 콜레스테롤과 결합할 수 있다는 결과로 볼 때 길경에 포함된 다양한 프라티코사이드의 극성과 콜레스테롤의 함량변화 및 축적에 대한 연구가 진행되어져야 할 것으로 생각된다.
4) 간에서의
아실트랜스퍼라제와
HMG
-
CoA
리덕타아제
활성에 대한 효능 측정
ACAT(Acyl-CoA : cholesterol acyltransferase)는 콜레스테롤의 에스터화를 통한 동맥에서의 콜레스테롤 에스터(cholesterol ester) 축적과 장으로부터 콜레스테롤 흡수 및 간에서의 지단백질 형성에 중요한 역할을 하는 효소이다. ACAT 활성에 의해 폼 셀(form cell)이 콜레스테롤로부터 유도된 다량의 콜레스테릴 에스터(cholesteryl ester)를 포함하기 때문에, 실험적, 임상적인 측면에서 대식세포와 평활근세포(smooth muscle cell)로부터 유도된 폼 셀의 형성은 매우 중요하기 때문에 동맥경화의 치료 혹은 예방 목적으로 혈관 벽 내의 폼 셀의 증식은 ACAT 활성증가와 직접적으로 연관되어 있기 때문에, 강력한 항동맥경화제로써 ACAT 저해제의 개발은 바람직하다.
ACAT에 대한 저해활성과 HMG-CoA 리덕타아제 효소활성은 간조직으로부터 마이크로좀을 Hulcher와 Oleson (1974)에 의한 방법으로 분리하여 측정하였다. 즉, 간 2 g을 0.1 M 트리에탄올아민(Triethanolamine), 0.02 M EDTA (pH 7.4), 2 mM DTT 가 포함된 완충용액으로 균질화(homogenization) 한 후, 10,000 × g 와 12,000 × g에서 차례로 원심분리한 상층액을 100,000 × g에서 초원심분리하여 상층액을 버리고 현탁하여 세척한 다음, 다시 100,000× g에서 초원심분리 하였다. 분리된 마이크로좀을 1 mL 완충용액에 현탁시켜 액체질소에 보관하였다가 필요시마다 사용하였으며 Bradford 방법으로 단백질을 정량하였다. ACAT에 대한 저해활성은 Gillies 등 (1986)에 의한 방법을 사용하였으며, Triton WR-1339에 녹인 콜레스테롤 6 ㎍ (20 ㎕), 1M 인산 칼륨 완충액(potassium phosphate buffer, pH 7.4), 0.6 mM BSA 5㎕와 분리한 50 ~ 100 ㎍의 마이크로좀을 잘 섞은 후 물로 180 ㎕까지 채우고, 37 ℃에서 30분간 전반응 시켰다. 올레일-CoA([14C]-Oleoyl-CoA, specific activity; 15,000 pm/nmole) 5.62 nmole을 섞어 전체 용량이 200 ㎕가 되게 한 후 37 ℃ 에서 30분간 반응시키고 500 ㎕의 이소프로판올:헵탄(4:1)용액, 300 ㎕의 헵탄, 그리고 200 ㎕의 0.1M 인산 칼륨 완충액(pH 7.4)을 넣고 잘 섞은 다음 실온에서 2분간 방치하고 상등액 200 ㎕에 칵테일(Lipoluma, Lumac Co.) 4 mL를 첨가한 액체 섬광 계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사능(radioactivity)을 측정하였다. 1 mg의 마이크로좀 단백질이 1분간 생성하는 콜레스테릴 올레오에이트(cholesteryl oleoate)의 pmole수 (pmoles Cholesteryl Oleoate (CE) formed/min/mg·microsomal protein)로 나타내었다.
HMG-CoA 리덕타아제(reductase) 효소활성 검정은 Shapiro 등 (1974)이 실시한 방법을 변형하여 실시하였다. 마이크로좀 100 ㎍ ~ 300 ㎍을 NADPH 500 nmole과 [14C]-HMG-CoA 50 nmole (1,200 cpm/nmole specific activity)에 혼합하여 37 ℃ 항온수조에서 15분간 반응시킨 후, 1/5 volume, 15 ㎕ 6N HCl을 혼합하여 다시 15분간 37 ℃ 항온수조에서 반응시켰다.
상기한 방법으로 메발로네이트(mevalonate)를 락톤 폼(lactone form)으로 만든 후 실리카 겔 60 F254 TLC 플레이트에 점적하여 전개시키고 메발로네이트 표준품(lactone form)과 비교하여 Rf 값이 0.2 부근의 밴드를 잘라 섬광 계수(scintilation counting) 하였다. 활성도는 1분 반응 당 마이크로좀 단백질 1 mg이 생성하는 메발로네이트 양을 pmole로 나타내었다.
고콜레스테롤 식이를 한 실험동물의 간에서 ACAT 활성 변화는 도 15에 나타내었다. ACAT는 체내 콜레스테롤 저장에 관여하는 효소로서 유리 콜레스테롤(free cholesterol)에 아실 CoA(acyl-CoA)를 연결하여 콜레스테롤 에스터(cholesterol ester)를 형성하고, 조직에 콜레스테롤 에스터를 축적시키는 것으로 알려져 있다. 일반적으로 고콜레스테롤 식이를 섭취하면 ACAT 활성이 증가되는 경향을 나타내기 때문에 길경 추출물과 길경 분획물을 경구투여함에 따라 간조직의 ACAT 활성을 감소시키는 활성을 검정하여 혈중 콜레스테롤 농도저하 효과가 있는 지의 여부를 검정하였다. 각 처리군의 ACAT 효소 활성도를 검정한 결과 일반식이 섭취군(C, HC-free)은 186.9± 21.5 pmol/mg protein/min의 효소활성도를 나타낸 반면 고콜레스테롤 섭취군(HCC)은 291.6± 16.6 nmol/mg protein/min를 나타내 64.1%의 ACAT 효소활성 증가를 나타낸 반면 고콜레스테롤 식이를 섭취하고 길경 추출물을 경구투여한 군에서의 ACAT 효소활성도는 215.6± 11.8 nmol/mg protein/min을 나타내어 고콜레스테롤 식이만을 섭취한 군의 73%의 수준으로 감소하였으며, 길경 분획물을 경구투여하는 경우 ACAT 효소활성도는 158.6± 17.2 nmol/mg protein/min을 나타내어 고콜레스테롤 식이만을 섭취한 군의 54.4%의 수준을 감소하였다. 따라서 길경에 포함된 프라티코사이드 사포닌이 ACAT 효소활성을 저해하여 간에서의 콜레스테롤 에스터의 생성을 감소시킬 수 있으며 ICR 마우스의 간조직에서 콜레스테롤 함량이 감소된 결과를 나타내었다고 판단되어진다. 이러한 결과는 길경 추출물 및 길경 분획물이 관상동맥질환의 위험을 줄일 수 있는 소재로서 활용되어질 수 있음을 나타낸다고 할 수 있다.
콜레스테롤 식이를 한 실험동물의 간에서 HMG-CoA 리덕타아제(reductase) 활성 변화는 도 16에 나타내었다. HMG-CoA 리덕타아제는 간의 세포막에 존재하고 비교적 높은 활성을 가지며 콜레스테롤 합성에 비율억제 효소(rate limiting enzyme)로 작용하는 효소로서 혈장 콜레스테롤 농도를 일정하게 유지시켜 주며 간으로 유입되는 콜레스테롤 양에 의해 조절되어진다. 고콜레스테롤 식이와, 길경 추출물과 길경 분획물을 경구투여한 군에서의 내인성 콜레스테롤의 합성 조절효소인 HMG-CoA 리덕타아제의 활성도를 검정한 결과 일반식이 섭취군(C, HC-free)은 2.9± 0.5 nmol/mg protein/min의 효소활성도를 나타낸 반면 고콜레스테롤 섭취군(HCC)은 1.2± 0.1 nmol/mg protein/min를 나타내 고콜레스테롤 식이에 따라 HMG-CoA 리덕타아제의 활성이 일반식이에 대해 41% 수준으로 급격히 감소하였다. 반면 고콜레스테롤 식이에 길경 추출물을 경구투여한 군에서의 HMG-CoA 리덕타아제는 일반식이에 대해 82%의 효소활성도를 나타내었으며, 길경 분획물을 경구투여한 군에서는 일반식이군과 유사한 수준으로 증가하였다. 길경 추출물과 길경 분획물을 경구투여한 군에서의 간 HMG-CoA 리덕타아제의 효소활성 증가는 간에서의 답즙합성 촉진과 콜레스테롤의 소장 내 흡수지연 및 분변 중 중성스테롤과 담즙산의 배설증가로 체내 콜레스테롤의 소모가 증가하여 HMG-CoA 리덕타아제 활성이 증가되는 생체의 항상성 기작으로 사료되어진다.
상기한 결과를 종합하여 보면 길경 추출물 및 길경 분획물에 포함된 프라티코사이드 사포닌은 경구투여에 의하여 혈액 및 세포와 조직에 축적되어지는 트리글리세라이드 분해 및 지질의 대사를 방해하여 콜레스테롤 및 트리글리세라이드가 혈액 및 간에 축적되어지는 것을 방지할 수 있는 전임상적 효과를 나타내며 혈장에서 HMG-CoA 리덕타아제 활성을 증가시켜 콜레스테롤의 소모 및 배설을 촉진시킬 수 있고 ACAT 효소활성을 저해하여 간조직으로의 콜레스테롤의 축적을 방지함으로써 항고지혈증 활성 및 항동맥경화 활성이 있는 잠재적인 소재로서 활용되어질 수 있다고 생각된다.
제제예
.
1) 시럽제의 제조
본 발명에 따른 프라티코사이드 고순도로 포함하는 길경 분획물 또는 길경 분획물을 포함하는 길경 추출물을 유효성분으로 함유하는 시럽은 다음과 같은 방법으로 제조하였다.
상기 길경 분획물(200 ㎍), 사카린, 당을 온수 80g에 녹인 후 냉각시키고, 여기에 글리세린, 감미제, 향미제, 에탄올, 소르브산 및 증류수로 이루어진 용액을 제조하여 혼합하였으며, 여기에 물을 첨가하여 100mL가 되게 하였다.
2) 정제의 제조
본 발명에 따른 길경 분획물을 유효성분으로 함유하는 정제는 다음과 같은 방법으로 제조하였다[길경 분획 10㎍/mg].
상기 길경 분획물 250g을 락토오스 175.9g, 감자전분 180g 및 콜로이드성 규산 32g과 혼합하고, 여기에 10% 젤라틴 용액을 첨가한 후 분쇄해서 14 메쉬 체를 통과시켰다. 이것을 건조시키고 여기에 감자전분 160g, 활석 50g 및 스테아린산 마그네슘 5g을 첨가해서 얻은 혼합물로 정제를 제조하였다.
3) 음료의 제조
상기 길경 분획물 500 ㎍ 을 적당량의 물에 녹인 후 비타민 C, 구연산, 구연산나트륨, 올리고당을 적당량 가하고, 보존제로서 적당량의 나트륨 벤조에이트를 가한 후에 물을 가하여 전량을 100 mL로 만들어 음료용 조성물을 제조하였다.
4) 건강식품의 제조
본 발명에 따른 길경 분획물을 유효성분으로 함유하는 건강식품은 다음과 같은 방법으로 제조하였다.
길경 분획물 100 ㎍, 비타민 혼합물 적량, 비타민 A 아세테이트 70 ㎍, 비타민 E 1.0㎎, 비타민 B1 0.13㎎, 비타민 B2 0.15㎎, 비타민 B6 0.5㎎, 비타민 B12 0.2㎍, 비타민 C 10㎎, 비오틴 10㎍, 니코틴산아미드 1.7㎎, 엽산 50㎍, 판토텐산 칼슘 0.5㎎, 무기질 혼합물 적량, 황산 제1철 1.75㎎, 산화아연 0.82㎎, 탄산마그네슘 25.3㎎, 제1인산칼륨 15㎎, 제2인산칼슘 55㎎, 구연산칼륨 90㎎, 탄산칼슘 100㎎, 염화마그네슘 24.8㎎을 통상의 건강식품 제조방법에 따라 혼합하여 제조하였다.
이상에서 설명한 본 발명은 전술한 실시예 및 첨부된 도면에 의해 한정되는 것이 아니고, 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 여러 가지 치환, 변형 및 변경이 가능함은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명백할 것이다.
도 11에서 1 은 대피-프라티코사이드 E(Deapi-Platycoside E)이고, 2는 프라티고사이드 E(Platycoside E)이며, 3은 프라티코딘 D3(Platycodin D3)이고, 4는 대피-프라티코딘 D(Deapi-Platycodin D) 이며, 5는 프라티코딘 D(Platycodin D) 이고, 6은 폴리갈락신 D(Polygalacin D) 이며, 7 은 3“-O-아세틸 폴리갈락신 D(3"-O-acetyl polygalacin D) 이고, 8은 프라티코딘 A(Platycodin A) 이며, 9는 2"-O-아세틸 폴리갈락신 D(2"-O-acetyl polygalacin D) 이다.
Claims (6)
- 길경 에탄올 조추출물을 에탄올에 용해시키고 아세톤을 첨가하여 형성되는 침전물을 제거하고 여액을 농축한 길경 에탄올-아세톤 분획을 에틸아세테이트에 녹인 후 물과 수포화부탄올을 순차적으로 사용하여 분배하여 얻은 길경 부탄올 분획을 에탄올 함유 수용액을 용출용매로 하는 역상(C18) 카트릿지 크로마토그래피에 의해 분리 정제한 자외선 흡광성분의 총면적 대비 상대순도가 70% 이상인 고순도의 프라티코사이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 항고지혈증 활성을 가지는 길경 분획물의 분리 정제 방법.
- 삭제
- 청구항 1에 있어서,
상기 분리 정제 방법은,
1) 길경 에탄올 조추출물을 에탄올에 용해시키고 아세톤을 첨가하여 형성되는 침전물을 제거하고 여액을 농축하여 길경 에탄올-아세톤 분획을 수득하는 단계;
2) 상기 길경 에탄올-아세톤 분획을 물에 용해시키고 에틸아세테이트로 분배하여 물층을 농축하여 물 분획을 수득하는 단계;
3) 상기 2) 단계의 물층에 수포화 부탄올을 혼합하고 물층과 부탄올층으로 층분리한 후 부탄올층을 농축하여 부탄올 분획을 수득하는 단계; 및,
4) 상기 부탄올 분획을 증류수에 용해시키고 에탄올 함유 수용액을 용출용매로 하는 역상(C18) 카트릿지 크로마토그래피에 의해 길경 프라티코사이드를 자외선 흡광성분의 총면적 대비 상대순도가 70% 이상인 고순도로 함유하는 길경 분획물을 분리 정제하는 단계;
를 포함하는 것을 특징으로 하는 항고지혈증 활성을 가지는 길경 분획물의 분리 정제 방법.
- 청구항 3에 있어서,
상기 1) 단계에서 에탄올과 아세톤은 1 : 3 내지 5 부피비로 이루어지는 것을 특징으로 하는 항고지혈증 활성을 가지는 길경 분획물의 분리 정제 방법.
- 삭제
- 삭제
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020110034799A KR101322719B1 (ko) | 2011-04-14 | 2011-04-14 | 프라티코사이드를 고순도로 함유한 길경 분획물을 유효성분으로 하는 고지혈증 예방 및 치료용 조성물 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020110034799A KR101322719B1 (ko) | 2011-04-14 | 2011-04-14 | 프라티코사이드를 고순도로 함유한 길경 분획물을 유효성분으로 하는 고지혈증 예방 및 치료용 조성물 |
Publications (2)
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| KR20120117196A KR20120117196A (ko) | 2012-10-24 |
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| KR1020110034799A KR101322719B1 (ko) | 2011-04-14 | 2011-04-14 | 프라티코사이드를 고순도로 함유한 길경 분획물을 유효성분으로 하는 고지혈증 예방 및 치료용 조성물 |
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| KR102276332B1 (ko) * | 2019-02-01 | 2021-07-12 | 경희대학교 산학협력단 | 길경 추출물 또는 이로부터 유래된 플라티코딘 D (Platycodin D) 를 유효 성분으로 포함하는 고콜레스테롤 혈증 예방 또는 치료용 병용투여 조성물 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20100120614A (ko) * | 2009-05-06 | 2010-11-16 | 서울대학교산학협력단 | 길경 추출물로부터 분리한 길경 사포닌 분획물 및 이 분획물로부터 효소에 의하여 생전환 시킨 고함량의 플라티코딘 ｄ를 유효성분으로 함유하는 지질대사 질환의 예방 및 치료용 조성물 |
-
2011
- 2011-04-14 KR KR1020110034799A patent/KR101322719B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (1)
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| KR20100120614A (ko) * | 2009-05-06 | 2010-11-16 | 서울대학교산학협력단 | 길경 추출물로부터 분리한 길경 사포닌 분획물 및 이 분획물로부터 효소에 의하여 생전환 시킨 고함량의 플라티코딘 ｄ를 유효성분으로 함유하는 지질대사 질환의 예방 및 치료용 조성물 |
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