KR101322720B1

KR101322720B1 - 프라티코사이드를 고순도로 함유한 길경 분획물을 유효성분으로 하는 면역활성 및 항암활성 증진용 조성물

Info

Publication number: KR101322720B1
Application number: KR1020110034800A
Authority: KR
Inventors: 정명근; 손은화; 황영선; 김흥재; 이상균; 김창기
Original assignee: 강원대학교산학협력단; 삼척시
Priority date: 2011-04-14
Filing date: 2011-04-14
Publication date: 2013-10-28
Also published as: KR20120117197A

Abstract

본 발명은 프라티코사이드를 고순도로 함유하는 길경 분획물을 유효성분으로 하는 면역활성 및 항암활성 증진용 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 길경 에탄올 조추출물을 에탄올에 용해시키고 아세톤을 첨가하여 형성되는 침전물을 제거하고 여액을 농축한 길경 에탄올-아세톤 분획을 에틸아세테이트에 녹인 후 물과 수포화부탄올을 순차적으로 사용하여 분배하여 얻은 길경 부탄올 분획을 에탄올 함유 수용액을 용출용매로 하는 역상(C18) 카트릿지 크로마토그래피에 의해 분리 정제한 프라티코사이드를 고순도로 함유하는 길경 분획물을 유효성분으로 함유하는 면역활성 및 항암활성 증진용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 의하면, 기존과 다른 방법으로 프라티코사이드를 손실없이 고순도로 분리 정제함으로써 분획물 내 길경 프라티코사이드 및 프라티코딘 D가 고순도로 다량 함유되며, 길경 분획물이 농도 의존적으로 산화질소의 발현과 생성을 억제하고, 면역활성의 증진과 항암 및 항종양 활성을 나타내어 관련된 질환의 개선에 보다 효과적인 결과를 기대할 수 있다.

Description

프라티코사이드를 고순도로 함유한 길경 분획물을 유효성분으로 하는 면역활성 및 항암활성 증진용 조성물{Immune and anticancer activities enhanced composition containing the Platycodon grandiflorum fraction from the Platycodon grandiflorum roots with high purity platycosides}

본 발명은 길경에 함유된 사포닌인 프라티코사이드(platycosides)를 고순도로 함유하는 길경 분획물을 유효성분으로 하며 면역활성을 증강시키고, 항암활성을 나타내는 조성물에 관한 것이다.

지난 수 십 년간 암이나 각종 질환 등을 치료하는데 주로 합성 의약품들이 이용되었으나, 합성 의약품 사용으로 인한 부작용이 심각히 나타남으로써 최근의 연구 방향은 안전성이 보장된 식물, 미생물 유래 등 천연자원을 이용한 기능성 식품 개발 및 의약품 연구에 관심이 집중되고 있다. 실제로 신약개발 기초자원으로 천연물은 주요 비중을 차지하고 있으며, 아스피린(aspirin)이 버드나무 추출물에서 유래한 것과 같이 오늘날 사용 약물의 60% 정도가 천연물로 부터 유래하고 있다.

특히 천연 추출물에 대한 인체 면역계 조절작용에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있는데 이는 면역계의 이상 현상이 건강을 깨뜨리고 다양한 질환을 일으키기 때문이다. 따라서 부작용을 최소화시킬 수 있는 안전한 천연물에 대한 면역조절제의 개발은 식품, 화장품 및 의약품 개발에 매우 중요한 소재가 될 수 있다. 실례로 상백피(뽕나무 껍질), 인삼의 사포닌, 표고버섯 등이 면역증강제로, 별불가사리, 영지·상황버섯, 인삼유래 진세노사이드가 항암보조제로 연구가 이루어지고 있고, 감초, 감초성분 글리시진(glycyrrhizin), 해삼, 웅담 성분 UDCA 등이 세포분화물질로 연구가 진행되고 있다. 이러한 천연물 소재를 이용한 면역조절제의 개발은 부작용 없이 암이나 만성적인 염증 질환 등을 안전하게 치료할 수 있기 때문에 많은 사람들의 관심과 흥미를 불러일으키고 있다.

도라지(길경, 桔梗)[Platycodon grandiflorum A. DC)는 초롱꽃과(Campanulaceae)에 속하는 다년생 초본류로서 주로 뿌리가 전통적인 생약재 및 식품으로 활용되고 있다. 이때, 생약재로 사용될 경우에는 길경이라 부르고, 식품으로 사용될 경우에는 흔히 도라지라고 부르기도 한다. 길경 추출물의 다양한 건강상의 장점이 보고되고 있고, 특히 4년근의 경우 기관지염, 천식, 폐결핵, 당뇨 등에 효능이 있는 것으로 알려져 있다.

최근 길경 추출물의 면역학적 효과가 연구되었으며, 트리테르펜(triterpene) 사포닌 등의 몇몇 활성물질들이 분리 동정되었다. 알려진 길경의 성분으로는 프라티코디제닌(platycodigenin)의 배당체로 프라티코딘(platycodin) A, C, D, D2와 2종의 모노아세테이트 프라티코딘 D3, 디피오(deepio)-프라티코딘 D3가 보고되었으며, 폴리갈락산(polygalacic acid)의 배당체로 폴리갈라신(polygalacin) D와 2종의 모노아세테이트, 폴리갈라신 D2와 모노아세테이트가 있고, 프라티코젠산(platycogenic acid) A의 배당체로 메틸 플라티코네이트 A, 메틸-2-메톡시 플라티코네이트 A 등 10 여종의 트리테르펜 사포닌이 보고되었다. 그 외 아글리콘으로 프라티코젠산 B 및 C의 존재가 보고되어 있다.

최근에는 도라지의 재배기간을 22년 동안 연장하여 생육시킨 일명 장생 도라지와 관련하여 몇몇의 특허가 개시되었는데, 한국특허공개 제2009-0132824호에는 장생도라지 열수추출물을 이용하여 건강기능식품을 제조하는 방법이 개시되어 있고, 한국특허등록 제0761329호에는 피부노화방지 및 주름 생성 억제 효과를 나타내는 장생도라지 추출물 및 이로부터 분리된 정제 분획물들을 함유하는 피부외용 조성물이 개시되어 있으며, 한국특허공개 제2009-0011694호에는 장생도라지 정제 분획물을 유효성분으로 함유하는 카드뮴 중독관련 질환의 예방 및 치료용 조성물이 개시되어 있고, 한국특허등록 제0314999호에는 장생도라지 추출물을 포함하는 항균성 및 염증성질환치료용 한방제제가 개시되어 있으며, 한국특허등록 제0643878호에는 장생도라지 추출물을 유효성분으로 함유하는 기관지질환의 억제 및 치료용 약학적 조성물이 개시되어 있고, 한국특허등록 제0643877호에는 장생도라지 추출물을 유효성분으로 함유하는 알코올성간질환의 억제, 치료용 약학적 조성물 및 알코올대사촉진용 조성물이 개시되어 있으며, 한국특허등록 제0550465호에는 혈관신생 억제 효과를 갖는 장생도라지 추출물이 개시되어 있고, 한국특허등록 제0943754호에는 장생도라지 조추출물 또는 이로부터 분리된 정제 분획물을 유효성분으로 함유하는 알러지 질환의 예방 및 치료용조성물이 개시되어 있으며, 한국특허등록 제0315002호에는 장생도라지 추출물을 포함하는 암치료용 한방제제가 개시되어 있고, 한국특허등록 제0315001호에는 장생도라지추출물을 포함하는 당뇨병 치료용 한방제제가 개시되어 있으며, 한국특허등록 제0315000호에는 장생도라지추출물을 포함하는 고지혈증 치료용 한방제제가 개시되어 있고, 한국공개특허 제2005-0021026호에는 장생도라지 열수추출물을 포함하는 대식세포 활성화 면역활성 증강용 조성물이 개시되어 있으며, 한국등록특허 제0640145호에는 장생도라지 열수추출물을 유효성분으로 함유하는 담배로 인한 폐암 억제 및 치료용 조성물이 개시되어 있고, 한국등록특허 제0541248호에는 암전이 억제효과를 갖는 장생도라지 추출물이 개시되어 있다.

또한, 한국등록특허 제0830236호에는 도라지 추출물을 함유하는 전립선암 예방 및 치료용 조성물이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2003-0002213호에는 항암 및 암 전이 억제 효과를 갖는 조성물이 개시되어 있다.

즉, 장생도라지와 관련하여 다양한 기술이 공지되어 있으며, 도라지를 일부 성분으로 포함하는 의약 조성물이 공지되어 있다.

그러나, 상기 공지된 기술의 경우 도라지 추출물 또는 분획의 경우 통상의 천연물로부터 유효성분을 추출하기 위하여 순차적으로 극성이 다른 용매를 추출용매로 사용하고 있는 등 큰 차이가 없다.

한편, 대식세포는 외부 물질이 침입했을 때 가장 먼저 반응하며, 활성화되면 체내에 침입한 병원 미생물이나 암세포에 대하여 탐식능(phagocytosis)을 나타내거나 직접적인 살상기능 즉, 항미생물 활성(antimicrobial activity) 및 항종양 활성(antitumor activity)을 갖는 면역세포이다.

이러한 과정에서 대식세포는 NO를 분비하고, 또한 대표적인 염증성 사이토카인(cytokine)으로 알려진 IL-1β, IL-6, TNF-α 등을 분비한다. 이들은 모두 매우 다양한 기능들을 갖고 있는데, 특히 NO는 TNF-α, IL-1β 등의 염증매개인자의 생성을 촉진시키는 사이토카인의 조절작용을 통해 T 임파구 및 NK 세포 등 면역세포의 기능을 조절하기도 하며, 과도하게 분비되어 염증반응을 유도하기도 한다. 또한, NO 및 TNF-α는 암세포 독성물질로도 알려져 있어 대식세포의 항암작용 기전의 일부로 보고되고 있으며, TNF-α는 암세포의 사멸 및 암 전이의 억제작용이 있다는 것이 밝혀졌다.

따라서 대식세포의 면역조절 기능과 NO를 비롯해 대식세포에서 분비되는 다양한 사이토카인들의 조절에 대한 연구는 인체 유용물질을 찾아내고 기능성 식품, 화장품, 의약품 소재를 개발하는데 매우 유용한 연구 방법으로 활용되고 있다.

본 발명은 본 발명의 특징적인 방법으로 수득한 프라티코사이드를 고순도로 함유한 길경 분획물의 다양한 암세포와 정상세포 및 면역계에 미치는 영향을 검토하고, 면역계의 1차적 방어체계에 관여하는 대식세포를 이용하여 면역활성 조절효과 여부 및 항암활성에 관하여 확인한 결과, 프라티코사이드를 고순도로 함유한 길경 분획물이 대식세포의 탐식능과 종양 및 암세포에 영향을 미침을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명은 부작용에 대한 우려가 없이 인체에 안전하여 정상세포에는 영향을 미치지 않으면서도 암세포 및 종양에 특이적으로 사멸작용을 유도하는 천연물로서 길경의 새로운 용도를 제공하는데 그 목적이 있다.

상기한 목적을 달성하기 위한 일례로서 본 발명은, 길경 에탄올 조추출물을 에탄올에 용해시키고 아세톤을 첨가하여 형성되는 침전물을 제거하고 여액을 농축한 길경 에탄올-아세톤 분획을 에틸아세테이트에 녹인 후 물과 수포화부탄올을 순차적으로 사용하여 분배하여 얻은 길경 부탄올 분획을 에탄올 함유 수용액을 용출용매로 하는 역상(C18) 카트릿지 크로마토그래피에 의해 분리 정제한 길경 분획물을 유효성분으로 함유하는 면역활성 및 항암활성 증진용 조성물을 특징으로 한다.

상기한 목적을 달성하기 위한 다른 일례로서 본 발명은, 상기한 면역활성 및 항암활성 증진용 조성물이 포함된 식품 및 약제를 포함한다.

이하, 본 발명을 구체적으로 설명한다.

본 발명에서 길경 분획물을 수득하는 방법은 다음과 같다.

길경 에탄올 조추출물을 에탄올에 용해시키고 아세톤을 첨가하여 형성되는 침전물을 제거하고 여액을 농축하여 길경 에탄올-아세톤 분획을 수득한다.

길경 에탄올 조추출물은 길경 건조 분말을 에탄올 함유 수용액으로 추출하여 얻어진다. 상기 에탄올 함유 수용액은 에탄올 40 내지 90 부피% 수용액을 사용하는 것이 적당하다. 추출을 위해 널리 알려진 다양한 추출 방법을 채택할 수 있으며, 초음파 추출을 수행하는 경우 추출 효율을 높일 수 있다. 추출한 다음 충분히 방치한 후 고형물을 여과하며, 여과 잔류물에 다시 에탄올 함유 수용액을 첨가하여 추출, 방치 및 여과하는 과정을 수회 반복한다. 상기 반복은 3 회 이상, 추출 효율의 측면에서 3 내지 5회 반복하는 것이 바람직하다. 상기 추출액을 모아서 다시 여과하여 고형물을 제거한 여액을 50 내지 60 ℃ 조건에서 감압 농축하여 에탄올을 제거하도록 한다. 상기 감압 농축에 의해 에탄올을 다 날려 보낸 길경 에탄올 조추출물은 함유된 당성분에 의해 고형화가 되지 않기 때문에 물 상태까지 농축한 다음 -50℃ 이하의 저온에서 동결시키고 동결건조하여 분말로 가공한다. 상기 길경 에탄올 조추출물에 함유된 성분은 이를 메탄올에 녹여 수행한 HPLC 크로마토그램으로 확인할 수 있다[도 1].

상기 길경 에탄올 조추출물을 에탄올에 용해시키고 아세톤을 첨가하여 형성되는 침전물을 제거하고 여액을 농축하여 길경 에탄올-아세톤 분획을 수득한다.

구체적으로, 상기 길경 에탄올 조추출물을 용해시키기 위하여 길경 에탄올 조추출물 10 g에 대하여 에탄올 약 1 L 수준의 비율로 사용한다. 이때, 침전물이 발생하게 되는데, 길경 에탄올 조추출물이 용해된 에탄올 용액은 조심스럽게 다른 용기에 옮기고, 용해되지 않은 잔류물에 계속 일정량의 에탄올을 넣어 계속 용해시킨다. 길경 에탄올 조추출물이 완전 용해된 용액에는 에탄올 사용량의 3 배 수준의 아세톤을 첨가한다.

일반적으로 길경의 사포닌이나 프라티코딘 D 등은 이를 분리하기 위하여 극성이 높은 용매로 추출한 후 물에 녹여 헥산, 에틸아세테이트, 부탄올 및 물 등의 순으로 분획하며, 그 중 부탄올 분획을 농축하고 HP-20 등과 같은 칼럼에 통과시키는 통상의 분리방법을 사용한다. 이 경우 길경 추출물로부터 사포닌을 얻기 위해서는 최소 4 회 이상의 오픈 칼럼 크로마토그래피를 수행하여야 하고, 각 단계별로 TLC 등에 의해 분획된 물질을 확인하고 LC-MS 등을 사용하여 구조 동정 및 순도 측정 등의 단계를 거치는 등 분리에 소요되는 시간만 최소 7 내지 9 개월이 걸리는 등 비경제적이고 비생산적인 문제점이 많았다.

이에, 본 발명의 본 단계에서는 기존과는 달리 아세톤을 특징적으로 사용한다. 길경 에탄올 조추출물이 용해된 에탄올 용액에 아세톤을 첨가하면 흰색의 침전물이 발생되는데, 이는 일부 용해도가 떨어진 수용성 다당체 및 단백질에 해당되는 것으로 여과하여 제거하도록 한다. 이때, 아세톤의 사용량은 길경 에탄올 조추출물을 용해시키기 위하여 사용한 에탄올의 2 내지 5 배 부피, 바람직하기로는 3 내지 4 배 부피인 것이 수용성 다당체와 단백질의 제거 효율 측면에서 바람직하다.

상기 흰색의 침전물을 제거한 여액은 완전히 농축하여 길경 에탄올-아세톤 분획을 얻는다.

상기 길경 에탄올-아세톤 분획을 물에 용해시키고 에틸아세테이트로 분배하여 물층을 농축하여 물 분획을 수득한다.

상기 길경 에탄올-아세톤 분획을 증류수에 완전히 용해하고, 여기에 사용된 증류수와 동량의 에틸아세테이트(EtoAC)를 첨가하고 격렬하게 흔들어서 물과 EtoAC 가 혼합되게 한 후 정치하여 상층인 EtoAC 층을 회수한다. 하층인 물층에 다시 동량의 EtoAC를 첨가하고 흔들어서 층분리시키는 과정을 수회 반복하여 물층과 EtoAC 층을 분리한다. 상기 층분리는 3 회 이상, 바람직하기로는 3 내지 5 회 반복수행하는 것이 효과적이며, 이 과정을 통해 EtoAC 층에 포함된 일부 당 성분과 비사포닌 계열의 중간극성 물질을 제거할 수 있다. 상기 EtoAC 층을 농축한 다음 메탄올에 용해하여 HPLC를 수행한 결과를 도 2에 나타내었으며, 이를 통하여 EtoAC 층에 당성분과 중간 극성의 물질이 포함되어 있었음을 확인할 수 있다. 상기 하층인 물층은 40 내지 50℃ 조건에서 감압농축기를 사용하여 농축하여 물층에 함유된 EtoAC 를 모두 날려 제거한다.

상기 단계의 물층에 수포화 부탄올을 혼합하고 물층과 부탄올층으로 층분리한 후 부탄올층을 농축하여 부탄올 분획을 수득한다.

상기 단계에서 EtoAC 를 제거한 물층에 동량의 수포화 부탄올을 첨가하고 흔들어 혼합한 후 정치하여 물층과 부탄올층으로 층분리시킨다. 상기 분리된 물층에 다시 수포화 부탄올을 첨가하고 흔들어 혼합한 후 정치하여 물층과 부탄올층으로 재 분리하는 층분리를 수회, 바람직하기로는 3 내지 5 회 수행하는 것이 효율적이다. 상층으로 분리된 부탄올층을 모두 회수하고 50 내지 60℃ 조건으로 감압농축하여 부탄올 분획을 얻는다. 상기 부탄올 분획에는 다수의 사포닌 계열 성분들이 집적되어 있음을 HPLC 수행 결과를 나타낸 도 3의 HPLC 크로마토그램에 의하여 확인할 수 있다. 한편, 층 분리된 하층의 물층에는 상기 EtoAC 층 분리에 의하여 제거되지 않았던 고도의 극성화합물 및 당성분이 용해되어 있음을 도 4의 HPLC 크로마토그램을 통하여 확인할 수 있는 바, 본 단계의 수포화 부탄올을 사용한 분배에 의하여 이들이 제거되는 효과가 있다.

상기 수포화 부탄올은 부탄올과 초순수를 동량 혼합하고 격렬하게 흔들고 방치하여 완전히 층분리가 된 후 하층인 물층을 버리고, 상층을 회수하여 사용하는데, 사전에 미리 제조하여 준비하도록 한다.

상기 부탄올 분획을 증류수에 용해시키고 에탄올 함유 수용액을 용출용매로 하는 역상(C18) 카트릿지 크로마토그래피에 의해 길경 프라티코사이드를 고순도로 함유하는 길경 분획물을 분리 정제한다.

도 3에 나타낸 상기 부탄올 분획의 HPLC 크로마토그램을 살펴보면 상대적으로 사포닌 성분과 비교하여 극성이 높은 성분이 부탄올 분획에 여전히 포함되어 있음을 확인할 수 있으며, 수차례에 걸친 EtoAC 와 수포화 부탄올을 사용한 용매분배에 의해서도 이들이 완전히 제거되지 않음을 확인할 수 있다.

따라서, 본 발명에서는 부탄올 분획을 역상(C18) 카트릿지 크로마토그래피에 의하여 분리 정제하였다. 이때, 역상(C18) 카트릿지는 SEP-PAK vac 6cc를 사용할 수 있고, 이동상으로는 에탄올 함유 수용액을 사용할 수 있다. 증류수에 완전히 용해시킨 부탄올 분획을 역상(C18) 카트릿지에 하적하고 이동상에 해당하는 에탄올 함유 수용액의 에탄올 농도를 20 내지 90 부피% 범위로 순차적으로 변화시키면서 부탄올 분획을 용출시키면 에탄올의 함량에 따라 역상(C18) 카트릿지에 흡착되었던 도라지의 지표성분인 길경 사포닌인 프라티코사이드 및 프라티코딘 D를 용출시킬 수 있다.

즉, 길경 에탄올 조추출물로부터 상기한 방법으로 수득한 길경 분획물에는 고순도의 프라티코딘 D 및 프라티코사이드가 다량으로 함유되어 있음을 확인할 수 있다[표 1 및 도 11].

상기와 같이 본 발명의 특징적인 방법으로 분리 정제한 길경 분획물을 이용하여 대식세포의 대표적인 면역조절능력을 평가하였으며, 그 결과 탐식작용, 항암 및 항종양 활성에서 모두 유의적인 효과를 나타냄을 확인하였다.

즉, 길경 분획물에 의한 NO 생성을 측정한 결과, 길경 분획물의 농도 증가에 따라 NO 생성이 증가하였으며, 이러한 결과는 길경 분획물이 대식세포의 NO 생성을 증가시키고 대식세포의 기능을 활성화시킴으로써 항암작용에 기여할 수 있을 것으로 예측할 수 있게 한다.

본 발명의 길경 분획물이 대식세포의 활성화에 미치는 직접적인 영향은 길경 분획물에 의해 활성화된 대식세포가 다른 면역세포와의 상호작용을 유도하거나 다른 면역세포의 활성에도 영향을 미칠 수 있기 때문에 실험예에서 제시한 결과뿐만 아니라 생체내에서 나타날 수 있는 간접적인 면역조절효과도 예측할 수 있다. 따라서 길경 분획물의 면역증강 작용에 대한 연구는 대식세포 외의 다른 면역세포들에 대한 조절작용 및 생체내에서 복합적으로 일어날 수 있는 면역조절작용에 대한 연구가 이루어져야 하며, 임상으로 활용될 수 있도록 동물모델을 이용한 in vivo 실험 등의 지속적인 연구가 이루어져야 할 것으로 보인다.

한편, 길경 에탄올 조추출물과 이로부터 본 발명의 특징적인 방법으로 수득한 프라티코사이드를 고순도로 함유한 길경 분획물로 다양한 인체 암세포주 및 종양에 대하여 세포생육 억제효과를 검정한 결과, 항암 및 항종양 활성을 나타내는 것을 확인하였다. 길경 분획물의 정상세포에 대한 세포독성을 확인한 결과 생육 억제효과가 거의 없는 것으로 나타났다.

특히, 본 발명의 특징적인 방법으로 수득한 프라티코사이드를 고순도로 함유한 길경 분획물은, 예를 들어 간암 세포주 같은 특정 암세포주에 대하여 특이적인 세포독성을 나타내는 것으로 해석할 수 있는 실험결과를 얻었다

한편, 상기 길경 분획물에 의하여 유발되는 대식세포의 항암작용이 NO 분비 증가에 의해 나타나는 효과인지를 확인하기 위하여 길경 분획물과 NO 억제제 NIL을 함께 처리하였는데, 길경 분획물에 의한 항암효과는 NIL 처리에 의해 증가되지 않았다. 이는 길경 분획물에 의한 대식세포의 항암작용이 NO 분비 증가에 의한 기전임을 직접적으로 증명해 준 것이다.

상기한 본 발명에 의하면, 길경 분획물이 면역증강, 항종양 및 항암 활성을 가지며, 이를 포함하는 조성물이 면역활성, 항종양 및 항암활성 증진용 조성물로서 다양한 기능성 식품, 의약품 소재로서 개발될 가능성을 제시해 주었다.

한편, 상기 길경 분획물을 유효성분으로 포함하는 면역활성 및 항암활성 증진용 조성물은 임상 투여 시에 경구 또는 비경구로 투여, 예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용할 수 있으며, 일반적인 건강식품의 형태로 사용될 수 있다.

상기 조성물은 경구 투여용 제형, 예를 들면, 정제, 트로키제(troches), 로진지(lozenge), 수용성 또는 유성현탁액, 조제분말 또는 과립, 에멀젼, 하드 또는 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭실제(elixirs)로 제제화된다. 정제 및 캡슐 등의 제형으로 제제화하기 위해 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제; 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제; 옥수수 전분 또는 고구마 전분과 같은 붕괴제; 스테아린산 마그네슘, 스테아린산 칼슘, 스테아릴푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌글리콜 왁스와 같은 윤활유가 함유된다. 캡슐제형의 경우는 상기에서 언급한 물질 이외에도 지방유와 같은 액체 담체를 함유한다.

또한, 본 발명의 조성물은 비경구로 투여할 수 있으며, 비경구 투여는 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사, 흉부내 주사 주입방식에 의한다. 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위해서는 상기 조성물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액으로 제조하고 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여형으로 제제화될 수 있다.

상기한 길경 분획물은 조성물 중 0.1 ㎍/mL 이상, 바람직하기로는 0.1 내지 10 ㎍/mL 범위로 함유되는 것이 면역활성과 항암활성의 증진 측면에 좋다.

상기한 본 발명의 조성물의 유효투입량은 환자의 나이, 신체적 조건, 몸무게 등에 의해 다양화될 수 있지만, 일반적으로 성인 환자 체중 1 kg 당 1 내지 50 mg/일이고, 바람직하기로는 5 내지 20 mg/일이며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정 시간 간격으로 1 일 수회, 바람직하기로는 하루 2 회 내지 3 회 분할 투여될 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 식용되는 도라지로부터 유래된 바, 인체에 안전하여 식품에 첨가하여 사용하기에 적합하므로, 면역활성 및 항암활성 증진을 위한 기능성을 나타내는 다양한 식품으로 개발될 수 있다.

본 발명의 면역활성 및 항암활성 증진용 조성물을 식품 중에 포함시킬 경우 총 중량 중 0.01 내지 50 %(w/w), 바람직하기로는 1 내지 30 %(w/w) 범위로 사용할 수 있을 것이다.

즉, 통상적인 기호성 식품 즉, 라면, 생면 등의 면류, 두부, 시리얼, 빵류, 츄잉 껌, 사탕, 과자류 중에 첨가하여 통상적으로 알려진 방법에 의하여 각종 식품을 제조할 수 있고, 또한, 정제, 과립제, 환제, 경질캡슐제, 연질캡슐제 또는 액제 제형 등 일반적인 제형으로 제형화 될 수 있으며, 생즙, 파우치, 음료, 또는 다류로 제조될 수 있고, 상기한 성분 이외에 다른 성분은 제형에 따라 당업자가 적의 하게 선택하여 배합할 수 있다.

상기한 본 발명에 의하면, 길경을 이용하여 대식세포 탐식능을 향상시키고, 산화질소 발현 및 생성을 억제하며, 정상세포에는 영향을 미치지 않으면 종양 및 암세포에 대하여 특이적으로 세포독성 효과를 나타내는 면역활성 및 항암활성 증진용 조성물을 제공할 수 있다.

또한, 본 발명에 의하면, 면역활성 증강, 종양 및 암과 관련된 질환에 유용하게 활용할 수 있는 길경 분획물을 포함하는 약제 및 식품을 제공할 수 있다.

도 1은 길경 에탄올 조추출물의 함유성분을 분석한 역상 HPLC 크로마토그램이다.
도 2는 EtoAC 층 분리에 의해 길경 에탄올 조추출물로부터 제거된 성분을 분석한 HPLC 크로마토그램이다.
도 3은 부탄올 분획으로 회수된 성분을 분석한 HPLC 크로마토그램이다.
도 4는 길경 에탄올 조추출물[Crude extract]과 부탄올 분획으로 제거된 성분[water fraction after BuOH partition]을 분석한 HPLC 크로마토그램이다.
도 5 는 수포화 부탄올 분배에 의하여 얻어진 부탄올 분획[BuOH fraction]과 이를 역상 카트릿지 크로마토그래피에 하적한 후 용출액에 의해 제거된 [Loading effluent of Sep-pak] 성분을 분석한 HPLC 크로마토그램이다.
도 6은 수포화 부탄올 분배에 의하여 얻어진 부탄올 분획[BuOH fraction]과 이를 역상 카트릿지 크로마토그래피에 하적한 후 20 % 에탄올 수용액으로 용출시 회수되는 성분[Sep-pak with 20 % EtOH]의 HPLC 크로마토그램을 비교한 것이다.
도 7은 수포화 부탄올 분배에 의하여 얻어진 부탄올 분획[BuOH fraction]과 이를 상기 역상 카트릿지 크로마토그래피에 연속으로 40 % 에탄올 수용액으로 용출시 회수되는 성분[Sep-pak with 40 % EtOH]의 HPLC 크로마토그램을 비교한 것이다.
도 8은 수포화 부탄올 분배에 의하여 얻어진 부탄올 분획[BuOH fraction]과 이를 상기 역상 카트릿지 크로마토그래피에 연속으로 60 % 에탄올 수용액으로 용출시 회수되는 성분[Sep-pak with 60 % EtOH]의 HPLC 크로마토그램을 비교한 것이다.
도 9는 수포화 부탄올 분배에 의하여 얻어진 부탄올 분획[BuOH fraction]과 이를 상기 역상 카트릿지 크로마토그래피에 연속으로 80 % 에탄올 수용액으로 용출시 회수되는 성분[Sep-pak with 80 % EtOH]의 HPLC 크로마토그램을 비교한 것이다.
도 10은 도 8에서 용출된 성분 중 머무름시간이 21.13인 성분에 대해 LC/MS 질량분석을 수행한 결과의 예를 나타낸 것이고, 도 11은 도 8에서 용출된 성분을 동정한 결과를 나타낸 것이다.
도 12의 (A)는 길경 분획물 첨가 후 대식세포의 항암활성(macrophage의 tumoricidal activity)의 변화를 나타낸 것이고, (B)는 NO 생성억제에 의한 길경 분획물 첨가 후 대식세포의 항암 활성 변화를 나타낸 것이다.
도 13은 길경 분획물 첨가 후 대식세포의 탐식능 변화를 나타낸 것이다.
도 14는 길경 분획물 첨가 후 NO 생성량 변화를 나타낸 것이다.

이하 본 발명을 실시예 등에 의하여 구체적으로 설명하겠는 바, 본 발명이 다음 실시예 등에 의하여 한정되는 것은 아니다.

실시예 1.

1) 길경 에탄올 조추출물의 제조

강원도 삼척시의 독농가가 재배한 6년근 도라지[길경(桔梗)]를 세척 및 건조하여 분말상태로 제조한 후 여기에 에탄올 80 부피% 함유 수용액을 분말 중량대비 20 배량을 첨가하여 40℃ 조건에서 30분간 초음파 추출 후 상온에서 30분 동안 방치하고, 와트만 No. 2번의 여과지를 사용하여 여과하였다. 상기 여과 후 잔류물에 다시 에탄올 80 부피% 함유 수용액을 처음과 동량 첨가하여 초음파 추출, 방치 및 여과를 3 회 반복 수행하였다. 상기 과정에서 얻어진 추출여액을 모두 모아 와트만 No. 2번의 여과지를 사용하여 다시 여과하고, 50 내지 60 ℃ 조건에서 감압 농축기를 사용하여 에탄올을 다 날려 보낸 후 물 상태까지 농축시켰다. 상기 농축물을 -50 ℃ 이하의 저온에서 동결 및 동결건조시켜 분말 상태로 가공하였다[길경 에탄올 조추출물, 이하 “길경 추출물”도 동일한 의미임].

상기 길경 에탄올 조추출물 일부를 메탄올에 용해하여 함유성분의 조성을 확인하고자 역상조건의 HPLC로 분석하였으며, 그 결과는 도 1의 크로마토그램과 같다. 도 1에 의하면, 수십 종의 함유성분이 공존하고 있는 양상을 확인할 수 있다.

2) 길경 부탄올 분획의 제조

상기 길경 에탄올 조추출물 10g 을 에탄올 약 1L에 용해시키며, 이때 침전물이 발생되는데 에탄올 용액은 조심스럽게 비이커에 옮기고, 잔류물에 다시 일정량의 에탄올을 넣어 용해시키며, 연속하여 잔류된 침전물에 에탄올을 첨가하여 용해시켰다.

상기 길경 에탄올 조추출물을 용해한 에탄올 용액 200 mL를 1000 mL 비이커에 옮기고 아세톤 600mL와 혼합하여 흰색의 침전물 형성을 유도하고, 이를 와트만 No. 2번의 여과지로 여과하여 일부 용해도가 떨어진 수용성 다당체 및 단백질을 제거하였다. 상기 흰색의 침전물이 여과된 에탄올과 아세톤 용액을 50 ℃ 조건에서 감압 농축기를 사용하여 완전히 농축하고 얻어진 농축물에 증류수 약 400 mL 를 첨가하여 용해시켰다. 여기에 농축물이 용해된 증류수와 동량의 EtoAC 를 첨가하여 층 분리를 연속하여 3회 실시하였다. 이 과정은 추출물에 포함되어 있는 일부 당 성분과 비사포닌 계열의 중간극성 물질을 제거하기 위함이다.

상기 층 분리 결과에 의해 얻어진 상층인 EtoAC 층을 모두 모아 농축 후 메탄올로 용해하고, EtoAC 층 분리에 의해 추출물로부터 제거된 성분을 HPLC 분석으로 확인하였으며, 그 결과는 도 2에 나타내었다. 도 2에 의하면 길경 에탄올 조추출물로부터 층 분리된 EtoAC 층에는 HPLC 분석 시 머무름 시간 8분 내지 17분 사이에 해당되는 성분들이 많이 존재하고 있음을 확인할 수 있었다. 상기한 결과는 길경 에탄올 조추출물로부터 EtoAC 층 분리를 유도할 경우 이 부분에 해당되는 극성을 가진 물질이 제거됨을 의미하는 것으로 볼 수 있다.

상기 층 분리된 하층인 물층은 40 ℃ 조건의 감압농축기에 일부 농축하여 EtoAC 를 완전히 날려서 제거하며, EtoAC 를 제거한 물층으로부터 사포닌 계열의 물질을 회수하고, EtoAC 분획에서 제거되지 않았던 고도의 극성화합물 및 극성 당 성분을 제거하기 위하여 다시 동량의 수포화 부탄올을 넣어 층 분리를 동일하게 4회 실시하고, 층 분리 후 상층의 부탄올층을 회수하였다.

상기 수포화 부탄올은 부탄올과 초순수를 동량 넣어 격렬하게 흔들고 방치하여 완전히 층 분리가 된 후 상층을 회수하여 사용하며, 사전에 미리 제조하여 준비하도록 한다.

상기 상층으로 분리된 모든 부탄올층을 모아 60 ℃ 조건의 감압농축기를 사용하여 감압농축하여 부탄올 분획을 제조하였으며, 부탄올 분획에 의해 회수된 길경 사포닌 계열의 물질과 하층인 물층으로 분획되어 제거된 성분을 확인하기 위해 부탄올 및 물 분획 각각을 HPLC로 분석하였으며, 그 결과는 도 3 및 도 4에 나타내었다.

도 3에 의하면 부탄올 분획에는 길경 에탄올 조추출물로부터 EtoAC 분획에 의해 일부 성분이 제거되었지만 나머지 잔존하고 있던 성분들이 용출되어 나오는 양상을 확인할 수 있다. 특히 HPLC 분석 시 머무름 시간이 21 내지 25분 사이에 해당하며, 길경 사포닌 화합물로 추측되는 수종의 성분들이 다량 분리되어 나오는 경향을 확인할 수 있다. 도 4에서는 부탄올 분획 처리에 의해 길경 에탄올 조추출물로부터 제거된 물층에는 다량의 완전 극성화합물이 포함되어 있어 HPLC 분석 시 머무름 시간이 3분 내지 15분 사이에 해당하는 완전 극성화합물의 제거효과를 확인할 수 있다.

3) 길경 부탄올 분획의 분리 정제

상기 부탄올 층을 농축하여 얻은 부탄올 분획에는 길경의 지표성분에 해당하는 사포닌 성분으로 추측되는 프라티코딘 D 및 프라티코사이드가 다량 함유되어 있지만, 도 3의 결과에서 보는 바와 같이 EtoAC 및 부탄올 등 2차례의 용매분획에도 불구하고 아직 HPLC의 머무름 시간이 3분 내지 10분 사이에 해당하는 상대적으로 사포닌 성분에 비해 극성이 극히 높은 다수의 극성화합물이 포함되어 있음을 확인할 수 있다.

이들 성분은 더 이상 용매분획에 의해서는 제거될 수 없으므로 다른 방법의 분리 정제과정을 적용하였다.

즉, 상기 부탄올층을 농축하여 얻은 부탄올 분획물 2g을 증류수 100mL에 완전 용해시키고 역상(C18) 카트릿지 크로마토그래피(Sep-pak vac 6cc)에 하적한 후 에탄올 0 내지 80 부피% 함유 수용액을 20 % 에탄올 농도 수준으로 달리하여 10mL 용량으로 순차 용출한 후 각 에탄올 농도별 용출성분을 HPLC로 확인하고, 각 용출 에탄올 농도별 극성화합물의 제거 양상 및 길경의 지표성분에 해당하는 사포닌 성분의 회수양상을 도 5 내지 9에서 확인하였다.

도 5는 길경 추출물의 용매침전 및 2차례의 용매분배에 의해 획득된 길경 사포닌이 다량 함유되어 있는 것으로 추측되는 부탄올 분획과 이를 역상 카트릿지 크로마토그라피에 하적한 후 역상 카트릿지를 통과해 버려지는 용출액을 HPLC로 분석한 크로마토그램인데 결과에 의하면 부탄올 분획에 함유되어 있는 성분 중 머무름시간이 3분경에 해당하는 완전 극성화합물이 역상 카트릿지에 흡착되지 않고, 상당량 제거되는 양상을 확인할 수 있다.

도 6은 상기 도 5의 역상 카트릿지에 20% 에탄올 용액 10 mL를 이용하여 흡착된 성분을 용출하여 분석한 결과인데, 20% 에탄올 용액의 처리에 의해 머무름 시간 3분 내지 6분 사이의 극성화합물의 추가적인 제거를 확인할 수 있으며, 머무름 시간 10 분 이후의 상대적 중간극성 화합물의 용출은 전혀 확인할 수 없었다.

도 7은 상기 도 6의 역상 카트릿지에 연속하여 40% 에탄올 용액 10 mL를 이용하여 흡착된 성분을 용출하여 분석한 결과인데, 20% 에탄올 용액의 처리에 의해 제거된 머무름 시간 3분 내지 6분 사이의 극성화합물 중 일부 잔존하는 성분의 추가적인 제거와 머무름 시간 10 내지 15분 사이의 상대적 중간극성 화합물의 다량 용출을 확인할 수 있으며, 머무름 시간 15분 이후의 길경의 주요 사포닌 성분으로 추정되는 성분들의 용출은 전혀 확인되지 않았다.

도 8은 상기 도 7의 역상 카트릿지에 연속하여 60% 에탄올 용액 10 mL를 이용하여 흡착된 성분을 용출하여 분석한 결과인데, 40% 까지의 에탄올 용액 처리에 의해 머무름 시간 10분미만의 극성화합물 대부분이 거의 전량 제거된 양상을 확인할 수 있었고, 상대적으로 중간극성을 나타내는 머무름 시간 13 내지 15분 및 17 내지 18분 사이, 길경 주요 사포닌 성분으로 추정되는 머무름 시간 21 내지 24분 사이의 성분의 다량 용출을 확인할 수 있다.

도 9는 상기 도 8의 역상 카트릿지에 연속하여 80% 에탄올 용액 10 mL를 이용하여 흡착된 성분을 용출하여 분석한 결과인데, 60% 까지의 에탄올 용액 처리에 의해 거의 대부분의 부탄올 분획에 의해 분리된 성분이 용출되고 잔존물이 존재하지 않는 양상을 확인할 수 있다.

4) 길경 부탄올 분획 중 역상 카트릿지 정제 성분의 동정

길경에 함유되어 있는 사포닌 성분은 현재 전 세계적으로 지표성분인 프라티코딘 D 및 다양한 프라티코사이드를 포함하여 약 10종 정도 문헌적으로 보고된 바 있다.

따라서, 본 실시예에 의해 순차적 과정에 의해 최종적으로 정제된 60% 에탄올을 이용한 역상 카트릿지의 용출성분을 대상으로 LC/MS를 이용한 분자량 측정방식에 의해 화학구조를 동정하였다.

도 10은 60% 에탄올을 이용한 역상 카트릿지 분리에 의해 용출된 성분 중 길경의 주요 사포닌 성분으로 추정되는 머무름 시간 13 내지 24분 사이의 주요 성분 중 하나인 머무름 시간 21.13분대의 성분을 대표로 LC/MS 질량분석 결과를 도시한 것으로, 분석결과 분자량 1223.4를 나타내며 길경 활성의 지표성분으로 알려진 프라티코딘 D로 동정하였다. 아울러 동일한 방법에 의해 도 11에 보여진 60% 에탄올을 이용한 역상 카트릿지 분리에 의해 용출된 주요 성분 중 프라티코딘 D 외에 추가로 8종에 해당되는 프라티코사이드를 동정하였으며[표 1], 본 실시예에 의한 방법으로 길경 에탄올 조추출물로부터 순차적 정제과정에 의해 현재까지 보고된 길경에 함유된 총 10종의 프라티코사이드 중 길경의 지표성분으로 알려진 프라티코딘 D를 포함한 총 9종의 프라티코사이드를 HPLC 분석에 의한 자외선 흡광성분의 총 면적 대비 상대순도 70% 수준 이상으로 고순도 정제가 가능하였다.

Peak No.	Retention time (min.)	Platycoside	Molecular formula	[M-H]^-
1	13.14	Deapi-Platycoside E	C₆₄H₁₀₄O₃₄	1415.4
2	13.68	Platycoside E	C₆₉H₁₁₂O₃₈	1547.2
3	17.06	Platycodin D₃	C₆₃H₁₀₂O₃₃	1385.4
4	20.65	Deapi-Platycodin D	C₅₂H₈₄O₂₄	1091.4
5	21.13	Platycodin D	C₅₇H₉₂O₂₈	1223.4
6	21.57	Polygalacin D	C₅₇H₉₂O₂₇	1207.4
7	22.02	3"-O-acetyl polygalacin D	C₅₉H₉₄O₂₈	1249.4
8	22.67	Platycodin A	C₅₉H₉₄O₂₉	1265.4
9	23.20	2"-O-acetyl polygalacin D	C₅₉H₉₄O₂₈	1249.4

실시예 2. 길경 분획물의 암세포 및 종양에 대한 대식세포의 활성측정

1) 길경 분획물의 종양세포에 대한 세포독성 및 항암 활성

대식세포 RAW 264.7 에 실시예 1에 따라 수득한 다양한 농도의 프라티코사이드가 고순도로 함유된 길경 분획물을 처리하여 B16 암세포와 함께 37 ℃의 95% air/5% CO₂ 배양기에서 48 시간동안 배양한 후 25 ㎕의 MTT(2 mg/ml)를 가하고 다시 4시간동안 배양하였다. 플레이트를 200 x g에서 5분간 원심분리한 후 50 ㎕ 만을 남기고 상층액을 제거한 후 포마젠 결정을 용해하기 위해 150 ㎕ 의 DMSO 를 가하여 10분간 진탕한 후 마이크로플레이트 리더(microplate reader)를 이용하여 540 nm에서 흡광도(OD)를 측정하고 다음 식을 이용하여 세포독성(항암 활성)을 계산하였으며, 도 12의 (A) 에 그 결과를 나타내었다.

도 12의 (A)에 나타난 바와 같이 길경 분획물의 농도가 증가할수록 항암 활성이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 특히 경향 및 신뢰도도 매우 높아 상당히 가치 있는 자료로 판단된다. 또한, NO 생성을 억제하는 물질인 NIL을 함께 첨가하여 항암 활성을 측정한 결과는 도 12의 (B)에 나타내었다.

도 12의 (B)에 나타난 바와 같이, 길경 분획물을 첨가했을 경우 NO 생성이 줄어들면 항암 활성은 NO 에 의하여 활성화되었음을 의미한다. 이 실험에서 NIL 첨가 후 항암 활성이 감소한 것으로 보아 길경 분획물 첨가 후 NO의 생성 증가에 의하여 대식세포 면역작용이 활발히 진행된 것임을 확인할 수 있다.

2) 대식세포의 식세포 활성( phagocytotic activity ) 측정

길경 분획물 첨가에 의한 대식세포의 식세포 활성 증가가 항암 효과를 증대시켰는지를 알아보기 위하여 대식세포 RAW 264.7 에 길경 분획물 첨가 후 NBT 및 Zymosan을 이용하여 식세포의 활성 변화를 측정하였다.

즉, 대식세포 RAW 264.7 세포주(1x10⁶ cell/mL)를 10% FBS 및 p/s를 함유한 RPMI 1640에 부유한 후 세포 부유액을 96 웰 마이크로플레이트에 100 ㎕ 씩 부착시킨 후 길경 분획물을 농도별로 처리하였다. 20 시간 처리한 후, 탐식능(phagocytosis)을 유도하는 지모산(Zymosan)과 NBT 염색액을 동시에 처리하여 대식세포에 의한 염색액의 흡수(uptake) 정도에 따라 대식세포의 식세포 활성을 측정하였다.

길경 분획물에 의한 대식세포의 1차 인체방어능력으로 알려진 식세포 활성변화를 알아보기 위하여 대식세포주에 다양한 농도의 길경 분획물을 처리하여 식세포 활성 변화를 측정하였으며, 그 결과는 도 13 에 나타내었다.

도 13 에 나타난 바와 같이, 특히 저농도에서 길경 분획물이 대식세포의 식세포 활성을 증가시켰음을 확인할 수 있었다. 즉, 길경 분획물이 대식세포의 식세포 활성을 증가시켜 인체방어능력을 증가시킬 수 있는 면역증강작용을 나타내었다는 결과를 확인할 수 있었다.

즉, 길경 분획이 대식세포의 식세포 활성을 증가시켜 면역증강 작용을 나타내며, 항암작용을 유도하였다는 결과를 얻었다.

실시예 3. 길경 분획물의 NO 생성 측정

대식세포 RAW 264.7 세포주(1x10⁶ cell/ml)를 10% FBS 및 p/s를 함유한 RPMI 1640에 부유한 후 세포 부유액을 96 웰 마이크로플레이트에 100 ㎕ 씩 부착시킨 후 길경 분획물을 농도별로 처리하였다. 20 시간 후에 배양 상등액 100 ㎕를 취하여 96 마이크로플레이트로 옮긴 후 100 ㎕ 그리스 시약(1% sulfanilamide, 0.1% napthyl-ethylenediamine dihydrochloride/2.5% H₃PO₄)를 넣고 10분간 실온에서 방치한 후 ELISA 리더를 사용하여 540 nm에서 측정하였다. 아질산나트륨(Sodium nitrite) 검량선으로 부터 대식세포가 분비하는 산화질소(NO, nitric oxide)를 계산하였다.

대식세포가 분비하는 암세포 독성물질의 하나인 NO 생성에 대한 길경 분획물의 영향을 알아보기 위하여 대식세포에 다양한 농도의 길경 분획물을 처리하여 NO의 생성량을 확인하였으며, 그 결과는 도 14 에 나타내었다.

도 14 에 나타난 바와 같이, 길경 분획물의 농도 증가에 따라 NO 생성이 증가하였음을 볼 수 있다. 이것은 길경 분획물이 대식세포의 NO 생성을 증가시켜 대식세포의 기능을 활성화함으로써 항암작용을 하였음을 알 수 있다.

실시예 4. 길경 분획물의 인체 암세포주 및 정상세포에 대한 활성 검정

길경 에탄올 추출물 및 길경 분획물의 인체 암세포주에 대한 세포생육억제 효과를 SRB(Sulfo Rhodamine B)법으로 조사하였다. 암세포주는 전립선암 세포주인 LNCaP, 결장암 세포주인 HT-29, 신장암 세포주인 ACHN, 폐암 세포주인 A549, 간암세포주인 HepG2를 사용하였다.

정상세포에 대한 독성을 확인하기 위하여 간세포주인 293(human embryo liver)을 Korea Cell Line Bank(KCLB)로부터 구입하여 대조구로 사용하였다. 상기 암세포주는 10% 소 태아 혈청이 포함된 RPMI 1640배지를 사용하여 배양하였고, 배양된 세포는 일주일에 한 번 또는 두 번 정도 분주하여 유지하였다.

항암활성을 측정하는데 사용한 세포 농도는 3,000 ~ 6,000개/mL이었으며, 상기 방법에 사용한 모든 시약은 100% DMSO에 녹이고, 이를 단계적으로 희석하여 길경 분획물의 농도를 30, 10, 5, 2.5, 1, 0.1 ㎍/mL로 조제하였다. 세포의 수를 측정하여 일정한 농도로 96 웰 플레이트에 분주하고 하루가 경과한 다음 세포가 나타내는 기본적인 흡광도를 나타내는데 필요한 Tz 플레이트로서 시료를 처리할 플레이트와 동일한 세포농도를 가진 다른 플레이트를 50% TCA를 사용하여 고정하였다. 그리고 시료를 처리할 플레이트는 시료의 최종 농도를 0.1% DMSO로 맞추어 5개의 농도로 처리하였다. Tz 플레이트는 1시간이 경과하면 수돗물로 세척하고, 시료를 처리한 플레이트는 2일이 경과한 다음 50% TCA를 웰 당 50㎕씩 처리하여 고정하고 역시 1시간이 경과하면 수돗물로 세척하였다. 세척한 플레이트는 상온에서 건조시키고, 그 후 0.4% SRB 용액을 웰 당 100㎕씩 가한 다음 30분이 경과하면 1% 아세트산 용액으로 세척하였고, 이를 다시 상온에서 건조 시켰다. 다음 10mM Tris 염기(pH: 10.5)를 well 당 100㎕씩 가하여 다시 용해시키고, ELISA 해독기를 사용하여 540nm 에서 흡광도를 측정하였다. 이 때 암세포의 성장을 50% 억제하는 화합물의 농도를 GI50(㎍/mL)으로 나타내었고, 대조군으로 아드리아마이신(adriamycin)을 사용하였다.

길경 에탄올 추출물 및 길경 분획물에 대한 인체 암세포주에 대한 세포생육 억제효과를 SRB법으로 검정하여 본 결과는 다음 표 2에 나타내었다.

Sample	GI₅₀ (㎍/㎖)
Sample	LNCaP	HT-29	ACHN	A549	HepG2
에탄올 추출물	> 30	28.5	> 30	> 30	21.4
길경 분획물	> 30	27.5	> 30	> 30	6.5
Adriamycin	0.13	0.12	0.13	< 0.03	0.19

상기 표 2에 나타난 바와 같이, 암세포주(LNCaP 전립선암, HT-29 결장암, ACHN 신장암, A549 폐암, HepG2 간암 세포주)를 대상으로 세포독성을 실험한 결과, 길경 에탄올 추출물 및 길경 분획물 모두 전립선암 세포주, 신장암 세포주, 폐암 세포주에서는 500㎍/mL 이상에서 암세포 생장 저해 효과를 내어 활성을 나타내지 않은 반면, 길경 에탄올 추출물의 경우 간암 세포주인 HepG2, 결장암 세포주 인 HT-29에서 암세포의 생육을 50% 억제하는 농도가 각각 28.5 및 21.4 ㎍/mL으로 세포독성 효과를 나타내었다.

또한 길경 분획물은 결장암 세포주에서는 길경 에탄올 추출물과 큰 차이를 나타내지 않았으나, 간암 세포주인 HepG2의 경우에는 GI50(㎍/mL) 값이 약 6.5 ㎍/mL으로 나타나 길경의 사포닌 계열 화합물인 프라티코사이드를 고순도로 함유한 길경 분획물이 간암 세포주에 대하여 특이적인 세포독성을 나타낸다고 판단되어진다.

길경 분획물이 정상 간세포주인 293세포에 대한 독성여부를 확인한 결과 293세포에 대해서는 5% 이하의 생육 억제율을 나타내었다. 이는 길경 분획물이 몇몇의 암세포주에 대해서는 높은 생장 억제효과를 나타내는 반면 정상세포에 대해서는 생육 억제효과가 거의 없는 것을 나타낸다고 할 수 있다.

제제예 .

1) 시럽제의 제조

본 발명에 따른 프라티코사이드 고순도로 포함하는 길경 분획물 또는 길경 분획물을 포함하는 길경 추출물을 유효성분으로 함유하는 시럽은 다음과 같은 방법으로 제조하였다.

상기 길경 분획물(200 ㎍), 사카린, 당을 온수 80g에 녹인 후 냉각시키고, 여기에 글리세린, 감미제, 향미제, 에탄올, 소르브산 및 증류수로 이루어진 용액을 제조하여 혼합하였으며, 여기에 물을 첨가하여 100mL가 되게 하였다.

2) 정제의 제조

본 발명에 따른 길경 분획물을 유효성분으로 함유하는 정제는 다음과 같은 방법으로 제조하였다[길경 분획물 10㎍/mg].

상기 길경 분획물 250g을 락토오스 175.9g, 감자전분 180g 및 콜로이드성 규산 32g과 혼합하고, 여기에 10% 젤라틴 용액을 첨가한 후 분쇄해서 14 메쉬 체를 통과시켰다. 이것을 건조시키고 여기에 감자전분 160g, 활석 50g 및 스테아린산 마그네슘 5g을 첨가해서 얻은 혼합물로 정제를 제조하였다.

3) 음료의 제조

상기 길경 분획물 500 ㎍ 을 적당량의 물에 녹인 후 비타민 C, 구연산, 구연산나트륨, 올리고당을 적당량 가하고, 보존제로서 적당량의 나트륨 벤조에이트를 가한 후에 물을 가하여 전량을 100mL로 만들어 음료용 조성물을 제조하였다.

4) 건강식품의 제조

본 발명에 따른 길경 분획물을 유효성분으로 함유하는 건강식품은 다음과 같은 방법으로 제조하였다.

길경 분획물 100 ㎍, 비타민 혼합물 적량, 비타민 A 아세테이트 70 ㎍, 비타민 E 1.0㎎, 비타민 B1 0.13㎎, 비타민 B2 0.15㎎, 비타민 B6 0.5㎎, 비타민 B12 0.2㎍, 비타민 C 10㎎, 비오틴 10㎍, 니코틴산아미드 1.7㎎, 엽산 50㎍, 판토텐산 칼슘 0.5㎎, 무기질 혼합물 적량, 황산 제1철 1.75㎎, 산화아연 0.82㎎, 탄산마그네슘 25.3㎎, 제1인산칼륨 15㎎, 제2인산칼슘 55㎎, 구연산칼륨 90㎎, 탄산칼슘 100㎎, 염화마그네슘 24.8㎎을 통상의 건강식품 제조방법에 따라 혼합하여 제조하였다.

실험 결과 길경 분획물이 면역조절반응에 있어 항암 효과가 있다는 것을 확인하였다. 다음 단계로 NO 및 식세포 활성을 측정함으로써 어떠한 작용이 대식세포의 항암작용을 유발했는지를 검증하였다.

암세포 독성물질로 알려진 NO의 분비량의 증가를 측정함으로써 NO 에 의해 대식세포의 항암작용이 활발히 진행되었는지를 알 수 있었다. 이는 대식세포의 항암효과에서 NO 분비를 억제하였을 때 항암효과가 나타나지 않은 결과를 확인함으로써 재검증 되었으며, NO의 분비가 길경 분획물이 가지는 항암활성에 매우 중요하고 직접적인 역할을 나타내고 있음을 알 수 있었다.

이상에서 설명한 본 발명은 전술한 실시예 및 첨부된 도면에 의해 한정되는 것이 아니고, 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 여러 가지 치환, 변형 및 변경이 가능함은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명백할 것이다.

도 11에서 1 은 대피-프라티코사이드 E(Deapi-Platycoside E)이고, 2는 프라티고사이드 E(Platycoside E)이며, 3은 프라티코딘 D₃(Platycodin D₃)이고, 4는 대피-프라티코딘 D(Deapi-Platycodin D) 이며, 5는 프라티코딘 D(Platycodin D) 이고, 6은 폴리갈락신 D(Polygalacin D) 이며, 7 은 3“-O-아세틸 폴리갈락신 D(3"-O-acetyl polygalacin D) 이고, 8은 프라티코딘 A(Platycodin A) 이며, 9는 2"-O-아세틸 폴리갈락신 D(2"-O-acetyl polygalacin D) 이다.

Claims

길경 에탄올 조추출물을 에탄올에 용해시키고 아세톤을 첨가하여 형성되는 침전물을 제거하고 여액을 농축한 길경 에탄올-아세톤 분획을 에틸아세테이트에 녹인 후 물과 수포화부탄올을 순차적으로 사용하여 분배하여 얻은 길경 부탄올 분획을 에탄올 함유 수용액을 용출용매로 하는 역상(C18) 카트릿지 크로마토그래피에 의해 분리 정제한 자외선 흡광성분의 총면적 대비 상대순도가 70% 이상인 고순도의 프라티코사이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 면역활성 및 항암활성을 가지는 길경 분획물의 분리 정제 방법.
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청구항 1에 있어서,
상기 분리 정제 방법은,
1) 길경 에탄올 조추출물을 에탄올에 용해시키고 아세톤을 첨가하여 형성되는 침전물을 제거하고 여액을 농축하여 길경 에탄올-아세톤 분획을 수득하는 단계;
2) 상기 길경 에탄올-아세톤 분획을 물에 용해시키고 에틸아세테이트로 분배하여 물층을 농축하여 물 분획을 수득하는 단계;
3) 상기 2) 단계의 물층에 수포화 부탄올을 혼합하고 물층과 부탄올층으로 층분리한 후 부탄올층을 농축하여 부탄올 분획을 수득하는 단계; 및,
4) 상기 부탄올 분획을 증류수에 용해시키고 에탄올 함유 수용액을 용출용매로 하는 역상(C18) 카트릿지 크로마토그래피에 의해 길경 프라티코사이드를 자외선 흡광성분의 총면적 대비 상대순도가 70% 이상인 고순도로 함유하는 길경 분획물을 분리 정제하는 단계;
를 포함하는 것을 특징으로 하는 면역활성 및 항암활성을 가지는 길경 분획물의 분리 정제 방법.
청구항 3에 있어서,
상기 1) 단계에서 에탄올과 아세톤은 1 : 3 내지 5 부피비로 이루어지는 것을 특징으로 하는 면역활성 및 항암활성을 가지는 길경 분획물의 분리 정제 방법.
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