KR102573243B1

KR102573243B1 - 신경병증성 통증 치료 또는 예방용 enu 약학 조성물

Info

Publication number: KR102573243B1
Application number: KR1020230053043A
Authority: KR
Inventors: 윤유석; 최영진; 이상호
Original assignee: 윤유석; 최영진; 이상호
Priority date: 2023-04-23
Filing date: 2023-04-23
Publication date: 2023-08-30

Abstract

본 발명의 한 실시예에 따른 신경병증성 통증 치료 또는 예방용 약학 조성물은, 황정, 마가목, 현지초, 그리고 담두시를 포함한다.

Description

신경병증성 통증 치료 또는 예방용 ENU 약학 조성물{ENU PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR TREATING OR PREVENTING NEUROPATHIC PAIN}

신경병증성 통증 치료 또는 예방용 약학 조성물에 관한 것이다.

신경병증성 통증은 신경계의 손상이나 기능 이상으로 인해 발생하는 통증으로, 신경계에서의 통증 신호 전달이나 처리 과정의 이상으로 인해 발생한다. 신경병증성 통증은 신경의 압박이나 포착, 손상, 감염이나 당뇨병, 다발성 경화증 같은 질병, 특정 약물 등으로 인해 발생한다. 통증은 화끈거리거나 찌르는 느낌 등으로 표현되며, 영향을 받는 부위의 마비나 무감각 등이 동반된다.

Sciatic nerve ligation(SNL)은 좌골 신경의 결찰로 인해 신경 섬유의 압박과 손상 및 염증이 유발되는 것으로, SNL은 동물 모델에서 신경병증성 통증을 유발하는 데에 자주 사용되며, 이러한 통증은 화끈거리거나 찌르는 느낌 등 비정상적인 감각과 함께 정상적으로 아픔을 유발하지 않는 자극에 대한 과민반응(allodynia) 및 아픈 자극에 대한 과민반응(hyperalgesia)을 특징으로 한다. SNL은 신경 섬유에 손상을 유발하여, 뇌에서 통증으로 해석되는 Neural activity의 패턴의 변경한다. SNL에 의해 발생하는 통증은 신경병증성 통증의 모델로 사용되어, 이러한 통증의 발생 기전을 연구하고 새로운 치료 방법 및 치료제를 실험적으로 검증하는 데에 사용될 수 있다.

한편, 신경계에서 비신경 세포인 신경아교세포(glial cell)들은 신경병증성 통증의 발생 및 유지에 관여한다고 알려져 있다. 특히, 척수 내, microglia와 astrocytes는 신경병증성 통증의 병인에 중요한 역할을 한다. 신경 손상 후, microglia와 astrocytes는 활성화되어 염증 반응을 일으키는 pro-inflammatory cytokines과 chemokines을 분비한다. 이로 인해 신경 섬유의 염증과 손상이 더욱 심화된다. 또한, 신경아교세포는 척수 내 신경세포가 통증 신호에 대해 과민하게 반응하는 현상인 central sensitization 발생에도 기여한다. 따라서 척수 내 신경아교세포를 타겟으로 하는 치료법은 신경병증성 통증 치료의 잠재적인 대안으로 떠오르고 있다. SNL 동물 모델에서 신경아교세포 활성화를 억제할 수 있는 약물이 신경병증성 통증을 완화시키는 것으로 나타난 바 있으므로, 신경아교세포의 조절은 신경통 치료의 새로운 대상으로 떠오르고 있다.

Central sensitization은 척수신경계의 변화로 인해 통증이 지속되는 현상을 말한다. 이 과정에서 중요한 역할을 하는 c-fos는 척수 내에서 통증 자극에 반응하여 발현된다. 중추신경계에서 발생하는 통증 자극은 Spinal dorsal horn에서 1차적으로 처리되고, 이러한 처리과정에서 c-fos 발현이 증가한다. 이로 인해 중추신경계의 뉴런은 민감해지고, 동일한 자극에 대한 반응이 증가한다. 이러한 과정이 지속되면, 중추신경계는 일종의 "기억"을 형성하게 되어, 정상적으로 아픔을 유발하지 않는 자극에 대해서도 과민반응을 보일 수 있게 된다. 따라서, c-fos 단백질은 중추신경계에서 발생하는 통증에 대한 이해와 치료에 매우 중요한 역할을 한다. c-fos의 발현을 억제하는 약물이나 기술은 중추신경계에서의 통증 반응을 줄일 수 있는 효과가 있을 수 있다.

한국등록특허 제10-1249930호 한국공개특허 제10-1992-0011502호

1. Baron R, et al. (2017) Peripheral neuropathic pain: a mechanism-related organizing principle based on sensory profiles. 158(2):261-272. 2. Finnerup NB, et al. (2015) Pharmacotherapy for neuropathic pain in adults: a systematic review and meta-analysis. 14(2):162-173. 3. Gilron I, Baron R, & Jensen T (2015) Neuropathic pain: principles of diagnosis and treatment. Mayo Clinic Proceedings, (Elsevier), pp 532-545. 4. Jaggi AS, Jain V, Singh NJF, & pharmacology c (2011) Animal models of neuropathic pain. 25(1):1-28. 5. Decosterd I & Woolf CJJP (2000) Spared nerve injury: an animal model of persistent peripheral neuropathic pain. 87(2):149-158. 6. Kim SH & Chung JMJP (1992) An experimental model for peripheral neuropathy produced by segmental spinal nerve ligation in the rat. 50(3):355-363. 7. Devor MJTop (1999) Pathophysiology of damaged nerves in relation to chronic pain.129-164. 8. Ikeda H, Tsuda M, Inoue K, & Murase KJEJoN (2007) Long-term potentiation of neuronal excitation by neuron-glia interactions in the rat spinal dorsal horn. 25(5):1297-1306. 9. Milligan ED & Watkins LRJNrn (2009) Pathological and protective roles of glia in chronic pain. 10(1):23-36. 10. Ren K & Dubner RJNm (2010) Interactions between the immune and nervous systems in pain. 16(11):1267-1276. 11. Raghavendra V, Tanga F, DeLeo JAJJoP, & Therapeutics E (2003) Inhibition of microglial activation attenuates the development but not existing hypersensitivity in a rat model of neuropathy. 306(2):624-630. 12. Ji R-R, Nackley A, Huh Y, Terrando N, & Maixner WJA (2018) Neuroinflammation and central sensitization in chronic and widespread pain. 129(2):343-366. 13. Gao Y-J & Ji R-RJTopj (2009) c-Fos and pERK, which is a better marker for neuronal activation and central sensitization after noxious stimulation and tissue injury 2:11. 14. Peirs C, et al. (2021) Mechanical allodynia circuitry in the dorsal horn is defined by the nature of the injury. 109(1):73-90. e77. 15. Malmberg AB & Basbaum AIJP (1998) Partial sciatic nerve injury in the mouse as a model of neuropathic pain: behavioral and neuroanatomical correlates. 76(1-2):215-222. 16. Latremoliere A & Woolf CJJTjop (2009) Central sensitization: a generator of pain hypersensitivity by central neural plasticity. 10(9):895-926. 17. Neumann S, Braz JM, Skinner K, Llewellyn-Smith IJ, & Basbaum AIJJoN (2008) Innocuous, not noxious, input activates PKCγ interneurons of the spinal dorsal horn via myelinated afferent fibers. 28(32):7936-7944.

본 발명의 한 실시예는 신경병증성 통증을 예방, 개선 또는 치료하기 위한 약학 조성물 및 약침 조성물을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 한 실시예는 항염증 효과가 우수한 약학 조성물 및 약침 조성물을 제공하기 위한 것이다.

상기 과제 이외에도 구체적으로 언급되지 않은 다른 과제를 달성하는 데 본 발명에 따른 실시예가 사용될 수 있다.

혼합 한약재는 백모근을 더 포함할 수 있다.

약학 조성물은 경구 투여용 제제의 제형일 수 있다.

본 발명의 한 실시예에 따른 신경병증성 통증 치료 또는 예방용 약제는 상기 약학 조성물을 포함한다.

본 발명의 한 실시예에 따른 신경병증성 통증 치료 또는 예방용 약침 조성물은 상기 약학 조성물을 포함한다.

혼합 한약재가 황정, 마가목, 현지초, 그리고 담두시를 포함하는 경우, 약침 조성물의 농도는 0.015 g/ml 내지 0.03 g/ml 일 수 있다.

본 발명의 한 실시예에 따른 신경병증성 통증 치료 또는 예방용 약침 조성물의 제조방법은, 황정, 마가목, 현지초, 그리고 담두시를 포함하는 혼합 한약재와 초순수액과의 혼합물을 저온 숙성하는 단계, 저온 숙성된 혼합물을 가열하여 추출액을 수득하는 단계, 추출액을 증류하여 증류 추출액을 수득하는 단계, 그리고 증류 추출액을 초순수액에 혼합한 후 염도 및 산도(pH)를 조절하는 단계를 포함한다.

혼합 한약재는 백모근을 더 포함할 수 있다.

본 발명의 한 실시예에 따른 약학 조성물 및 약침 조성물은 신경병증성 통증에 대한 예방, 개선 또는 치료 효과가 우수할 수 있고, 항염증 효과가 우수할 수 있다.

도 1a는 실시예들에 따른 약학 조성물 및 약침 조성물의 효과에 대한 실험 순서 및 절차를 나타내는 도면이다.
도 1b는 통증 유발 후 14일 동안 기계적 이질통의 증가를 나타내는 그래프이다.
도 2a는 조성물 투여 후 48시간 동안의 급성 진통 실험 결과(Paw withdrawal frequency)를 나타내는 그래프이고, 도 2b는 0 h 일 때를 기준으로 상대적인 급성 진통 효과를 나타내는 그래프이다.
도 3a는 통증 유발 후 14 일부터 28 일까지 2 일마다 총 7 회의 기계적 이질통을 검사하여 진통 실험 결과를 나타내는 그래프이고, 도 3b는 0 day 일 때를 기준으로 상대적인 진통 효과를 나타내는 그래프이다.
도 4a는 실시예 1 내지 5, 그리고 비교예 1에 따른 조성물의 반복 투여에 의한 척수신경 내 C-FOS 단백질 발현 억제 효과를 나타내는 사진이고, 도 4b는 카운트된 C-FOS positive cells의 개수를 나타내는 그래프이다.
도 5a는 실시예 1 내지 5, 그리고 비교예 1에 따른 조성물의 반복 투여에 의한 척수신경 내 GFAP의 발현 억제 효과를 나타내는 사진이고, 도 5b는 GFAP positive cells의 강도(intensity)를 나타내는 그래프이며, 도 5c는 GFAP cells의 면적(area)을 나타내는 그래프이다.
도 6a는 실시예들 및 비교예에 따른 조성물의 투여에 의한 Gfap 의 mRNA level의 변화를 나타내는 그래프이고, 도 6b는 실시예들 및 비교예에 따른 조성물의 투여에 의한 Iba1 의 mRNA level의 변화를 나타내는 그래프이며, 도 6c는 실시예들 및 비교예에 따른 조성물의 투여에 의한 Il-1β 의 mRNA level의 변화를 나타내는 그래프이고, 도 6d는 실시예들 및 비교예에 따른 조성물의 투여에 의한 Tnf-α 의 mRNA level의 변화를 나타내는 그래프이다.

첨부한 도면을 참고로 하여 본 발명의 실시예에 대해 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다. 도면에서 본 발명을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 동일 또는 유사한 구성요소에 대해서는 동일한 도면부호가 사용되었다. 또한 널리 알려져 있는 공지기술의 경우 그 구체적인 설명은 생략한다.

명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

명세서 전체에서, "조성물"은 2가지 이상의 성분이 균일하게 혼합되어 있는 상태의 물질을 의미하며, 완제품뿐만 아니라 완제품 제조를 위한 중간 소재를 포함하는 개념이다.

본 발명은, 신경병증성 통증의 예방, 개선 및 치료에 효과가 탁월한 새로운 약학 조성물 및 약침 조성물(Entrapment Neuropathy Unties, ENU)에 관한 것이다.

또한, 실시예들에 따른 약학 조성물은 염증 예방, 개선 및 치료에 효과가 우수할 수 있고, 천연 약재를 기반으로 하여 인체에 무해하고 안전성이 우수할 수 있다.

실시예들에 따른 신경병증성 통증 치료 또는 예방용 약학 조성물은, 황정(黃精, Polygonati Rhizoma), 마가목(Sorbus Commixta Hedl.), 현지초(Geranium Nepalense), 그리고 담두시(淡豆, Glycine Semen Preparata)를 포함하는 혼합 한약재의 추출물을 유효성분으로 포함한다.

약학 조성물은 기계적 이질통을 완화시킬 수 있다.

한편, C-fos 단백질은 immediate earl gene으로 신경 활동성을 반영하고, 중추신경계에서 발생하는 통증 자극은 Sinal dorsal horn에서 C-fos 단백질의 발현을 증가시키므로, c-fos 단백질은 중추신경계에서 발생하는 통증의 완화 및 치료에 중요한 역할을 할 수 있다. 실시예에 따른 약학 조성물은 이러한 c-fos 단백질의 발현을 억제시킬 수 있다.

이에 더하여, 약학 조성물은 항염증 효과를 나타낼 수 있다.

이러한 효과들에 기인하여, 실시예들에 따른 약학 조성물은 척수 신경의 기능을 회복시킴으로써 통증에 대한 개선 및 치료 효과를 나타낼 수 있다.

종래 마가목의 열매와 황정은 신경통 억제 효과를 나타내는 것으로 알려져 있으나, 현지초 및 담두시의 경우, 신경병증성 통증 완화에 대해서는 개시되거나 교시된 바 없다.

황정, 마가목, 현지초 및 담두시를 포함하는 혼합 한약재 조성은, 종래 기술에 개시되지 않은 새로운 조합이고, 이러한 조성의 한약재 추출물을 포함하는 약학 조성물 또한, 종래 기술에 개시되지 않은 새로운 조성물에 해당한다.

혼합 한약재가 황정, 마가목, 현지초 및 담두시를 모두 포함하였을 때, 상승 효과로 인해 신경병증성 통증 예방, 개선 및 치료 효과가 더욱 우수하게 나타난다.

혼합 한약재의 전체 중량을 기준으로, 황정, 마가목, 현지초 및 담두시의 중량비는 약 1:1:1:1 일 수 있고, 이러한 중량비에서 신경병증성 통증 예방, 개선 및 치료 효과가 더 증대될 수 있다.

약학 조성물의 혼합 한약재는 백모근(白茅根, Imperata cylindrica)을 더 포함할 수 있다. 백모근은 신경병증성 통증 완화 효능이 전혀 알려져 있지 않은 재료에 해당한다.

실시예에 따른 약학 조성물의 경우, 백모근 추출물이 추가적인 상승 효과를 발생시킴으로써, 약학 조성물의 신경병증성 통증 완화 및 개선 효과를 더욱 향상시킬 수 있고, 항염증 효과를 더욱 향상시킬 수 있다.

또한, 황정, 마가목, 현지초, 담두시 및 백모근을 포함하는 혼합 한약재 조성은, 종래 기술과 상이한 새로운 조합에 해당하고, 이러한 조성의 한약재 추출물을 포함하는 약학 조성물 또한, 신규 조성물에 해당한다.

혼합 한약재가 황정, 마가목, 현지초, 담두시 및 백모근을 모두 포함하였을 때, 상승 효과로 인해 신경병증성 통증 예방, 개선 및 치료 효과가 더욱 우수하게 나타날 수 있다. 또한, 혼합 한약재가 황정, 마가목, 현지초, 담두시 및 백모근을 모두 포함하였을 때, 혼합 한약재가 황정, 마가목, 현지초 및 담두시를 포함하는 경우에 비해서도, 더욱 우수한 통증 개선 및 치료 효과를 나타낼 수 있다.

혼합 한약재의 전체 중량을 기준으로, 황정, 마가목, 현지초, 담두시 및 백모근의 중량비는 약 1:1:1:1:1 일 수 있고, 이러한 중량비에서 신경병증성 통증 예방, 개선 및 치료 효과가 더욱 향상될 수 있다.

약학 조성물은 독성이나 부작용을 거의 갖지 않는 혼합 한약재 추출물을 유효성분으로 함유하므로, 예방 목적으로 장기간 복용 시에도 안심하고 사용될 수 있다.

한편, 약학 조성물은 전술한 성분들 이외의 다른 약학적 활성 성분을 함께 포함하거나, 또는 다른 유효 성분을 포함하는 약학 조성물과 혼합되어 이용될 수 있다.

실시예에 따른 약학 조성물은 신경병증성 통증 치료 또는 예방용 약제로 사용될 수 있다.

약학 조성물은 경구 투여용 제제의 제형일 수 있다. 여기서, 경구투여를 위한 고형 제제는 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 연질캅셀제, 환제 등의 제형일 수 있다. 또한 경구를 위한 액상 제제는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 겔제, 에어로졸 등의 제형일 수 있다. 조성물의 바람직한 투여량은 체내에서 활성성분의 흡수도, 불활성화율 및 배설속도, 환자의 연령, 성별 및 상태, 치료할 질병의 중증 정도에 따라 다르지만, 통상의 기술자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

실시예에 따른 약학 조성물은 통상적으로 사용되는 부형제, 붕해제, 감미제, 활택제, 향미제 등을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 부형제로는 락토즈(lactose), 덱스트로즈(dextrose), 수크로스(sucrose), 솔비톨(solbitol), 만니톨(mannitol), 자일리톨(xylitol), 에리스리톨(erythritol), 말티톨(maltitol), 전분, 아카시아 고무, 알지네이트(alginate), 젤라틴(gelatin), 칼슘 포스페이트(calcium phosphate), 칼슘 실리케이트(calcium silicate), 셀룰로오스(cellulose), 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈(polyvinyl pyrrolidone)등의 물질이 사용될 수 있다. 붕해제로는, 예를 들어, 전분 글리콜산 나트륨(Sodium starch glycolate), 크로스포비돈(crospovidone), 알긴산(alginic acid), 카르복시메틸 셀룰로오스 칼슘(carboxymethyl cellulose calcium), 카르복시메틸 셀룰로오스 나트륨(carboxymethyl cellulose sodium)), 키토산(chitosan), 구아검(guar gum), 저치환된 히드록시프로필 셀룰로오스(hydroxypropyl cellulose), 마그네슘 알루미늄 실리케이트(magnesium aluminum silicate) 등이 이용될 수 있다.

약학 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 첨가제를 더 포함할 수 있다. 이때 약제학적으로 허용가능한 첨가제는, 예를 들어, 전분, 젤라틴화 전분, 미결정셀룰로오스, 유당, 포비돈(povidone), 콜로이달 이산화규소(colloidal silicon dioxide), 인산수소칼슘(calcium hydrogen phosphate), 락토스(lactose), 만니톨(mannitol), 아라비아검(Arabic gum), 히드록시프로필 셀룰로오스, 전분 글리콜 산나트륨, 카르나우바 납(carbauba wax), 스테아린산(stearic acid), 스테아린산 마그네슘(magnesium stearate), 스테아린산 알루미늄(aluminum stearate), 스테아린산 칼슘(calcium stearate), 백당, 엿, 덱스트로스(dextrose), 소르비톨(sorbitol), 탈크(talc) 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 약제학적으로 허용가능한 첨가제는 약학 조성물 전체를 기준으로 약 0.1 내지 약 90 중량부 포함될 수 있다.

약학 조성물은 투여를 위해서 추가로 약학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조될 수 있다. 여기서, 약학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로오스 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상이 혼합되어 사용될 수 있다.

실시예에 따른 신경병증성 통증 치료 또는 예방용 약침 조성물은, 황정, 마가목, 현지초 및 담두시를 포함하는 혼합 한약재의 추출물이 유효성분으로 포함된 약학 조성물을 포함할 수 있다.

약침 조성물은, 피부를 통해 직접 투여되어, 경구 투여용 제형에 비해 빠르고 효과적으로 신경병증성 통증을 완화 또는 치료할 수 있다.

여기서, 약침 조성물의 농도는 약 0.015 g/ml 내지 0.03 g/ml 일 수 있다. 이러한 농도 범위에서, 신경병증성 통증 완화 효과가 극대화될 수 있다.

실시예에 따른 신경병증성 통증 치료 또는 예방용 약침 조성물은, 황정, 마가목, 현지초, 담두시 및 백모근을 포함하는 혼합 한약재의 추출물이 유효성분으로 포함된 약학 조성물을 포함할 수 있다. 약침 조성물의 농도는 약 0.015 g/ml 내지 0.03 g/ml 일 수 있다. 이러한 농도 범위에서, 신경병증성 통증 완화 효과가 극대화될 수 있다.

약침 조성물은 하기의 단계들을 거쳐 제조될 수 있다.

우선, 혼합 한약재를 세척 및 건조 후 초순수액과 혼합하여 농축기에서 저온 숙성하는 단계가 수행된다.

여기서, 저온 숙성은 약 65 ℃ ~ 80 ℃에서 약 48 시간 ~ 60 시간 동안 수행될 수 있다. 이러한 온도 및 시간 범위에서 저온 숙성이 이루어지면, 한약재의 숙성으로 세포 간 결합이 끊어지며 저분자화 됨으로써, 추출시 유효성분 추출이 가능해질 수 있다. 또한, 저온 숙성으로 한약재의 전분이 효소 분해되어, 당은 높아지고 맛과 향이 개선되며, 체내 흡수율이 높아지고, 항산화 효소가 많이 발생되어 피부 개선, 노화 예방, 체내 노폐물 정화에 도움을 줄 수 있다. 80 ℃ 이상의 숙성이 이루어지면, 한약재의 유효성분이 파괴될 수 있다.

저온 숙성 공정 후, 가열 후 추출액을 수득하는 단계가 수행된다.

이때, 가열은 약 105 ℃ ~ 115 ℃에서 약 1 시간 ~ 3 시간 동안 수행되고, 이러한 온도 및 시간 범위에서, 유효 성분의 변성 내지 변질이 없는 추출액을 수득할 수 있고, 추출액의 농도가 높아질 수 있다.

다음으로, 증류 추출액을 수득하는 단계가 수행된다.

증류 추출액은 이전 단계에서 수득된 추출액을 증류기를 통해 약 105 ℃ ~ 120 ℃ 에서 증류하여 증류 추출액을 수득할 수 있고, 이러한 온도 범위에서 유효 성분의 변성 내지 변질이 없는 증류 추출액을 수득할 수 있다.

이어서, 증류 추출액을 초순수액에 혼합하여 약침 혼합물을 제조하는 단계, 그리고 약침 혼합물의 염도와 산도(pH)를 조절하는 단계가 수행된다.

염도는 약 0.75 % ~ 0.98 %로 조절되고, pH는 약 7.25 ~ 7.85 범위로 조절될 수 있다. 이러한 범위 내에서, 약침 혼합물이 체액의 염도와 비슷한 수준으로 조절될 수 있고, pH가 약산성으로 조절됨으로써 조직 내 흡수가 용이해질 수 있다.

다음으로, 2단계 여과 단계를 거쳐 약침 조성물을 수득하는 단계가 수행된다.

1차 여과 단계는 평균 기공(pore) 크기 약 0.4 ㎛ ~ 0.5 ㎛ 의 멤브레인 필터로 수행될 수 있고, 2차 여과 단계는 평균 기공 크기 약 0.05 ㎛ ~ 0.15 ㎛ 의 멤브레인 필터로 수행될 수 있다.

수득된 약침 조성물은 교반 후 안정화 단계를 거쳐 보관될 수 있다.

이하에서는, 실시예 및 실험예를 들어 본 발명에 대해서 더욱 상세하게 설명할 것이나, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 - 약침 조성물

황정 100 g, 마가목 100 g, 현지초 100 g, 담두시 100 g, 백모근 100 g 을 포함하는 혼합 한약재를 준비하고, 흐르는 물로 세척한다.

세척 후 물기를 제거하고 한약재 500 g 과 초순수액 5000 g을 대한메디안추출농축기(추출,농축,증류) 에 함께 넣고 72 ℃ 에서 54 시간 동안 저온 숙성한다.

이 후 110 ℃ 에서 2 시간 동안 가열하고, PRESSURE GAUGE 0.15MPa 시점에 압력밸브를 개방하여 가열로 인하여 발생한 한약향을 제거 후 추출액 4300 g을 추출한다.

이어서, 추출액 4300 g을 증류기(대안메디안추출기)를 이용하여 112 ℃에서 증류하여 4000 g 증류 추출액을 수득한다.

다음으로, 초순수액에 증류 추출액을 혼합하여 약침 혼합물을 조제하고, 염도 0.87%, pH 7.55 로 조절한다.

이어서, 염도 및 pH가 조절된 약침 혼합물을, 1차로 평균 기공 크기 0.45 ㎛의 멤브레인으로 여과하고, 2차로 평균 기공 크기 0.1 ㎛의 멤브레인으로 여과하여 약침 조성물을 수득한다.

이어서, 무균실에서 교반기를 활용하여 500 rpm에서, 1 시간 동안 여과된 조성물을 교반하고, 1 시간 동안 안정화 시키고, 멸균된 vial 병에 약침 조성물을 auto dispenser로 소분하여 멸균된 실리콘 마개와 알루미늄 캡으로 capping하여 127 ℃에서 약 27 분 동안 고압 멸균하여 보관한다.

하나의 vial 병에 포함되는 약침 조성물의 전체 부피는 10 cc (10 ml)이고, 각 vial 병에 포함된 증류 추출액의 중량은 0.075 g 이며, 이에 따라 약침 조성물의 농도는 0.0075 g/ml 이다.

실시예 2 - 약침 조성물

하나의 vial 병에 포함되는 약침 조성물의 전체 부피는 10 cc (10 ml)이고, 각 vial 병에 포함된 증류 추출액의 중량은 0.15 g 이며, 이에 따라 약침 조성물의 농도는 0.015 g/ml 이라는 점을 제외하고는, 실시예 1과 동일한 방법으로 약침 조성물을 제조한다.

실시예 3 - 약침 조성물

하나의 vial 병에 포함되는 약침 조성물의 전체 부피는 10 cc (10 ml)이고, 각 vial 병에 포함된 증류 추출액의 중량은 0.3 g 이며, 이에 따라 약침 조성물의 농도는 0.03 g/ml 이라는 점을 제외하고는, 실시예 1과 동일한 방법으로 약침 조성물을 제조한다.

실시예 4 - 경구 투여용 조성물

황정 4 g, 마가목 4 g, 현지초 4 g, 담두시 4 g, 백모근 4 g 을 포함하는 혼합 한약재를 준비하고, 흐르는 물로 세척한다.

세척 후 물기를 제거하고 한약재 20 g 과 초순수액 200 g(200 cc)을 혼합한 후 약 2 시간 동안 열수 추출하여 100 g 증류 추출액(경구 투여용 약학 조성물)을 수득한다.

실시예 5 - 약침 조성물

황정 100 g, 마가목 100 g, 현지초 100 g, 담두시 100 g 을 포함하는 혼합 한약재를 준비하고, 흐르는 물로 세척한다.

세척 후 물기를 제거하고 한약재 400 g 과 초순수액 4000 g을 대한메디안추출농축기(추출,농축,증류) 에 함께 넣고 72 ℃ 에서 54 시간 동안 저온 숙성한다.

이 후 110 ℃ 에서 2 시간 동안 가열하고, PRESSURE GAUGE 0.15MPa 시점에 압력밸브를 개방하여 가열로 인하여 발생한 한약향을 제거 후 추출액 3440 g을 추출한다.

이어서, 추출액 3440 g을 증류기(대안메디안추출기)를 이용하여 112 ℃에서 증류하여 3200 g 증류 추출액을 수득한다.

하나의 vial 병에 포함되는 약침 조성물의 전체 부피는 10 cc (10 ml)이고, 각 vial 병에 포함된 증류 추출액의 중량은 0.15 g 이며, 이에 따라 약침 조성물의 농도는 0.015 g/ml 이다.

비교예 1

황정 100 g, 마가목 100 g, 현지초 100 g 을 포함하는 혼합 한약재를 준비하고, 흐르는 물로 세척한다.

세척 후 물기를 제거하고 한약재 300 g 과 초순수액 3000 g을 대한메디안추출농축기(추출,농축,증류) 에 함께 넣고 72 ℃ 에서 54 시간 동안 저온 숙성한다.

이 후 110 ℃ 에서 2 시간 동안 가열하고, PRESSURE GAUGE 0.15MPa 시점에 압력밸브를 개방하여 가열로 인하여 발생한 한약향을 제거 후 추출액 2580 g을 추출한다.

이어서, 추출액 2580 g을 증류기(대안메디안추출기)를 이용하여 112 ℃에서 증류하여 2400 g 증류 추출액을 수득한다.

상기 실시예 1 내지 5, 그리고 비교예에 따른 조성물에 대한 실험들을 위해, 신경병증성 통증 동물 모델을 제작하고, 군을 분리시켰으며, 약침 시술 또는 조성물 경구 투여를 진행하였다.

하기 실험들에 사용된 한약재는, 남이제약(경상북도, 영천시)으로부터 표준 약재를 구입하여 사용하였다.

하기 실험들에 사용한 실험 동물은 6주령 ICR 수컷 마우스 (20~25 g)를 (주)DBL (음성군, 충청북도, 한국)으로부터 공급받아 1주일 동안 순화시킨 후 동물모델 제작에 사용하였다. 실험 기간 동안 일정량의 고형 사료와 정수된 물을 자유롭게 섭취할 수 있도록 하였으며, 낮/밤의 주기는 12시간(Day light 08:00~20:00) 주기로, 약 23±2 ℃의 실내 온도와 약 50±10 %의 습도를 유지하여 실험 종료까지 일정한 사육 조건을 유지시켰다.

하기 실험들에서 사용된 면역형광염색법(Immunofluorescence)을 구체적으로 설명하면, 쥐를 Avertin (50mg/kg, i.p.)로 마취시킨 후, phosphate buffered saline (PBS) 50ml에 이어 phosphate buffer로 준비한 4% formalin 용액 80ml로 심장을 통해 관류하였다. 고정이 끝난 쥐는 척수(Spinal cord)와 척수후근신경절(dorsal root ganglia, DRG)를 꺼내 같은 고정액으로 24시간 후고정 시키고, 30% sucrose가 함유된 PBS에 넣어 4 ℃에서 하루 동안 보관하였다. 다음날 조직을 급속 냉동한 후 8-10um의 크기로 잘랐다. 절편된 조직은 triton-X100이 0.3% 함유된 Tris 완충용액 (TBST)로 조직을 10분간 3차례 씻고, 5% bovine serum albumin (BSA)를 TBST에 희석한 용액에 1시간 반응하였다. C-FOS (1:2000, rabbit monoclonal, ImmunSmol), GFAP (1:1000, Guinea pig monoclonal, Abcam) 일차 항체는 5 % BSA 를 함유한 TBST에 희석하여 준비하였다. 조직은 일차항체에 4 ℃에서 24 시간 동안 반응시켰다. 그 후, 뇌 조직을 TBST로 씻은 다음, 실온에서 2시간 동안 2차 항체에서 반응시켰다. Alexa anti-rabbit 488 (1:2000, Invitrogen), Alexa anti-mouse 594 (1:2000, Invitrogen) 또는 Alexa anti-guinea pig 594 (1:2000, Invitrogen) 2차항체는 5% BSA를 함유한 TBST에 희석하여 준비하였다. TBST로 3번 헹군 후 polymount로 봉입하였다. 조직의 각 부위의 발현 정도는 공초점현미경(confocal microscope)으로 관찰하고 촬영하였다.

하기 mRNA Level 측정을 위한, 정량적 실시간 PCR (Quantitative real-time PCR, qPCR)은 제조업체의 권장 조건을 사용하여 ABI PRISM 7700 Sequence Detection System Instrument 및 소프트웨어(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)로 수행되었다. ICR 마우스의 발바닥 조직으로부터 총 RNA를 분리하고 (TRIzol 시약, Invitrogen, CA), 역전사(Superscript III, Invitrogen, CA)를 통해 cDNA를 합성하였다. SYBER 그린 마스터 믹스(Invitrogen, CA)를 사용하여 정량적 PCR 분석을 수행하였다. Comparative threshold cycle (Ct) 방법을 사용하여 증폭 계수를 계산하고, primer 서열을 확인하여 표적의 상대적 양을 GAPDH(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) 수준으로 정규화했다.

모든 실험결과는 최소 3회 반복실험에 대한 평균과 표준편차(mean±SE)로 나타내었으며, 통계학적 유의성은 GraphPad Prism 8.0 분석프로그램(GraphPad Software, CA, USA)을 이용하여 two-way ANOVA(Bonferroni post hoc multiple comparison test)와 one-way ANOVA(Tukey's test)를 이용하여 검정하였다.

신경병증성 통증 동물 모델 제작 - SNL model

생쥐를 isoflurane 2.0 %로 호흡 마취 후, 좌측 고관절 후측의 피부를 면도하고 절개한 후 biceps femoris muscle 사이의 sciatic nerve을 찾아 microforcep으로 주변조직 및 혈관으로부터 분리시켰다. 이후 4.0 silk thread로 2회 결찰하였다. 절개된 부위는 kanamycin을 점적하고 피부를 봉합하였다.

군 분리

모두 42마리의 흰쥐는 정상군(Normal, n=6), SNL 모델링 후 식염수를 환부에 투여한 대조군(Control(환부), n=6), SNL 모델링 후 식염수를 경구 투여한 대조군(Control(경구), n=6), SNL 모델링 후 비교예 1에 따른 약침 조성물을 환부에 투여한 치료군(비교예 1, n=6), SNL 모델링 후 실시예 1에 따른 약침 조성물을 환부에 투여한 치료군(실시예 1, n=6), SNL 모델링 후 실시예 2에 따른 약침 조성물을 환부에 투여한 치료군(실시예 2, n=6), SNL 모델링 후 실시예 3에 따른 약침 조성물을 환부에 투여한 치료군(실시예 3, n=6), SNL 모델링 후 실시예 5에 따른 약침 조성물을 환부에 투여한 치료군(실시예 5, n=6), SNL 모델링 후 실시예 4에 따른 경구 투여용 조성물을 경구 투여한 치료군(실시예 4, n=6)으로 나누었다.

약침 시술

실시예 1, 실시예 2, 실시예 3, 실시예 5, 그리고 비교예 1에 따른 약침 조성물의 약침 시술은 insulin syringe (31 GХ8 mm, BD, U.S.A)를 사용하여 신경병증성 통증 유발 14 일 후부터 28 일 째까지 2일에 1회씩 총 7 회를 결찰된 sciatic nerve 주변의 환부에 100 ul 투여하였고, 정상군과 대조군은 생리식염수를 같은 양 투여하였다.

경구 투여

실시예 4에 따른 경구 투여용 조성물의 경구 투여는 1 ml/회 의 용량으로 투여하였고, 대조군은 생리식염수를 같은 양 투여하였다.

실험예 1 - 기계적 이질통 측정

신경병증성 동물 모델을 유발하기 위해, 왼쪽 좌골신경을 결찰하여 신경병증성 통증을 유발한 후 14 일에 걸쳐, 1, 3, 7, 10, 14 일에 Von frey 검사를 실시하였다(도 1a 참조). 같은 기간(14일) 동안 기계적 이질통은 Normal 군에 비해 모든 군에서 통계적으로 유의미하게 증가하였다(도 1b 참조, p < 0.001).

실험 방법을 구체적으로 설명하면, Von frey filament(Touch test 3.61 (0.4 g), north coast medical Inc, 영국)를 이용하여 쥐의 발바닥에 물리적인 자극을 가한 뒤 발바닥에서 유발된 회피 반응의 빈도를 측정하였다. 발의 회피반응을 측정하기 위해서 흰 쥐를 격자가 2 mm 철망 위에 올려진 투명한 아크릴통(10Х10Х10 cm)에 넣고 환경에 적응할 수 있는 약 30분 정도의 시간을 준 후, 쥐의 순응 여부를 확인하고 철망 격자 사이로 정량화된 Von Frey filament로 발바닥을 자극하였다. Von Frey filaments가 약간 구부러질 정도로 각 뒷발바닥에 총 10 회 자극(10초에 1회의 빈도)에서 회피 반응이 나오는 경우 양성 반응으로 간주하였다.

실시예 1 내지 5, 그리고 비교예 1에 따른 조성물의 투여 후, 조성물의 단회 투여를 통한 급성 진통 효능과, 반복투여 기간 설정을 위해 단회 투여 후 1, 3, 7, 12, 24, 32, 48 시간 동안 기계적 이질통을 검사를 실시하였고(급성 진통 효과 실험), 단회 투여 효과를 바탕으로 신경병증성 통증 유발 14 일 후부터 28 일 째까지 2 일에 1회씩 총 7회 기계적 이질통을 검사하였다(진통 효과 실험).

급성 진통 효과와 관련하여, 도 2a는 조성물 투여 후 48시간 동안의 급성 진통 실험 결과(Paw withdrawal frequency)를 나타내는 그래프이고, 도 2b는 0 h 일 때를 기준으로 상대적인 급성 진통 효과를 나타내는 그래프이다.

결과는 평균치 ± 표준 편차(Mean ± SEM)의 형식으로 나타내었다. 그래프들에서, *는 통계적 유의성 p 가 0.05보다 작은 경우를 나타내고, **는 통계적 유의성 p 가 0.01보다 작은 경우를 나타내며, ***는 통계적 유의성 p 가 0.001보다 작은 경우를 나타낸다. 이하의 그래프들에 관한 설명에서, 결과 표시 형식과 통계적 유의성과 관련된 부분은 동일한 설명을 생략한다.

급성 진통 효과 확인을 위해, 기계적 이질통 감소 효과는 Von Frey 필라멘트를 이용하여 측정되었다.

도 2a 및 도 2b를 참조하면, 신경병증성 유발 마우스에 비교예 1 조성물의 투여는 7, 12, 24 시간에 Control(환부) 및 다른 군에 비해 통증의 감소를 보였다(p < 0.05, p < 0.01). 실시예 1 조성물의 투여는 통증 감소 경향을 보였고, 실시예 2 조성물 및 실시예 3 조성물은 7, 12, 24 시간에 Control(환부) 및 다른 군에 비해 더욱 현저한 진통 효과를 나타냈다(p < 0.05, p < 0.01, p < 0.001). 실시예 5 조성물의 투여는 12, 24, 32 시간에 Control(환부) 및 다른 군에 비해 우수한 통증의 감소를 보였다 (p < 0.05, p < 0.001).

진통 효과와 관련하여, 도 3a는 통증 유발 후 14 일부터 28 일까지 2 일마다 총 7 회의 기계적 이질통을 검사하여 진통 실험 결과를 나타내는 그래프이고, 도 3b는 0 day 일 때를 기준으로 상대적인 진통 효과를 나타내는 그래프이다.

진통 효과 확인을 위해, 기계적 이질통 감소 효과는 Von Frey 필라멘트를 이용하여 측정되었다.

도 3a 및 도 3b를 참조하면, 신경병증성 통증 유발 마우스에 비교예 1 조성물의 투여는 6, 8, 10, 14 일에 Control(환부)에 비해 통증의 감소를 보였다(p < 0.05). 실시예 1 조성물의 투여는 통증의 감소를 보였다. 실시예 2 조성물의 투여는 6, 8, 10, 14 일에 Control(환부) 및 다른 군에 비해 현저한 통증의 감소를 보였고, 마지막 14 일에는 가장 좋은 효과를 보였다(p < 0.05, p < 0.01, p < 0.001). 실시예 3 조성물의 투여는 4 일 째부터 진통 효과를 보였고(p < 0.05), 6, 8, 10, 14일에 생리식염수를 투여한 Control(환부) 및 다른 군에 비해 현저한 진통효과를 보였다(p < 0.05, p < 0.01, p < 0.001). 실시예 2 및 실시예 3 조성물의 경우 투여 전 대비 50% 이상의 진통 효과를 나타내는 것을 파악할 수 있다. 실시예 5 조성물의 투여는 4, 8, 10 일에 현저한 수준의 통증의 감소를 보였다(p < 0.05).

실험예 2 - C-FOS 발현 억제 효과 실험

SNL로 인한 척수신경 내 신경세포의 비정상적인 활성을 확인하기 위해 C-FOS의 발현은 손상된 Sciatic nerve의 동측(ipsilateral) spinal dorsal horn에서 면역조직 염색을 통해 확인하였다.

도 4a는 실시예 1 내지 5, 그리고 비교예 1에 따른 조성물의 반복 투여에 의한 척수신경 내 C-FOS 단백질 발현 억제 효과를 나타내는 사진이고, 도 4b는 카운트된 C-FOS positive cells의 개수를 나타내는 그래프이다.

도 4a 및 도 4b를 참조하면, SNL은 spinal dorsal horn에서 C-FOS의 발현을 정상군(Normal)에 비해서 유의미하게 증가시켰다(vs. control(환부) or control(경구), p < 0.001). 비교예 1 조성물의 투여는 Control(환부)에 비해 통계적으로 유의미한 C-FOS 발현의 감소를 보였다(p < 0.001). 실시예 1, 실시예 2 및 실시예 3 조성물의 투여는 Control(환부)에 비해 현저한 수준으로 C-FOS의 발현을 감소시켰고(p < 0.001), 농도 의존적으로 C-FOS의 발현을 감소 시키는 것이 확인되었다. 실시예 5 조성물의 투여는 Control(환부)에 비해 통계적으로 유의미하게 C-FOS의 발현을 감소시켰다(p < 0.01). 실시예 4에 따른 조성물의 투여 또한 C-FOS의 발현을 Control(경구)에 비해 크게 감소시켰다(p < 0.05).

실험예 3 - GFAP 발현 억제 효과 실험

SNL로 인한 척수신경 내 염증세포의 활성을 확인하기 위해 성상세포(Astrocytes)(염증세포) 마커 GFAP의 발현은 손상된 Sciatic nerve의 동측(ipsilateral) spinal dorsal horn 조직 절편에서 면역형광염색법을 통해 확인하였다.

도 5a는 실시예 1 내지 5, 그리고 비교예 1에 따른 조성물의 반복 투여에 의한 척수신경 내 GFAP의 발현 억제 효과를 나타내는 사진이고, 도 5b는 GFAP positive cells의 강도(intensity)를 나타내는 그래프이며, 도 5c는 GFAP cells의 면적(area)을 나타내는 그래프이다.

도 5a 내지 도 5c를 참조하면, SNL은 spinal dorsal horn에서 GFAP 단백질의 발현 Intensity와 Area를 정상군(Normal)에 비해서 유의미하게 증가시켰다(vs. control(환부) or control(경구), p < 0.001). 비교예 1 조성물의 투여는 Control(환부)에 비해 소폭 GFAP 발현의 감소와 성상세포 size의 감소를 보였다(p < 0.01, p < 0.01). 실시예 1, 실시예 2 및 실시예 3 조성물의 투여는 Control(환부)에 비해 현저한 수준으로 GFAP의 발현을 억제 시켰고(p < 0.001), 농도 의존적으로 GFAP의 발현을 감소시키는 것이 확인되었다. 성상세포(염증세포)의 Size 또한 SNL로 인해 증가되었지만, 실시예 1 내지 3 조성물의 투여로 현저하게 감소되었다(p < 0.05, p < 0.001). GFAP의 발현은 실시예 5 조성물의 투여로 인해 Control(환부)에 비해 통계적으로 유의미하게 감소되었다(p < 0.05). 실시예 4에 의한 경구 투여용 조성물의 투여 또한, GFAP의 발현을 통계적으로 의미 있게 감소시켰다(p < 0.05).

실험예 4 - 항염증 효과 실험

SNL로 인한 척수신경 내 염증세포의 활성과 염증성 사이토카인의 발현을 확인하기 위해, 손상된 Sciatic nerve의 동측(ipsilateral) spinal dorsal horn 조직에서 qPCR을 통해, 성상세포(Astrocytes) 마커 GFAP와 미세아교세포(Microglia) 마커 Iba1의 발현을 확인하였다.

염증세포 마커 GFAP와 Iba1은 정상군(Normal)에 비해 대조군(Control(환부))에서 통계적으로 유의미하게 증가되었다(p < 0.001). GFAP는 조성물을 투여한 모든 군에서 유의미한 감소를 보였다(도 6a 참조, p < 0.01, p < 0.001). Iba1의 경우, 실시예 2 및 실시예 3 조성물을 투여한 군에서 현저한 감소를 보였다(도 6b 참조, p < 0.05).

SNL로 인한 척수신경 내 염증성 사이토카인의 발현을 확인하기 위해, 손상된 Sciatic nerve의 동측(ipsilateral) spinal dorsal horn 조직에서 qPCR을 통해, 염증성 사이토카인 Tnf-α와 Il-1β 마커의 발현을 확인하였다. 염증성 사이토카인 마커 Il-1β 는 정상군(Normal)에 비해 Control(환부)에서 통계적으로 유의미하게 증가되었다(p < 0.001). 이러한 Il-1β는 조성물을 투여한 모든 군에서 유의미한 감소를 보였다(도 6c 참조, p < 0.01, p < 0.001). Tnf-α의 발현은 실시예 2, 실시예 3 및 실시예 5 조성물을 투여한 군에서 현저한 감소를 보였다(Fig 6B right, p<0.001)

실시예 4에 따른 경구 투여 약학 조성물의 효과를 정리하면, Control(경구)투여군과 상호 비교할 경우, 반복투여 10 일, 14 일에서 통계적으로 유의미한 차이를 나타냈다(p < 0.05, 도 3a 참조). 또한, 투여 전 통증정도를 100%로 Normalize 하여 비교했을 때, 10, 12, 14일에 통계적으로 유의미한 진통 효과를 나타냈다(p<0.05, p<0.01, p<0.001, 도 3b 참조). 또한, Control(경구)와 상호 비교할 경우, Spinal dorsal horn에서 C-FOS의 발현이 유의미하게 감소하였고(p < 0.01, 도 4a 및 4b 참조), GFAP의 발현이 Control(경구)에 비해 통계적으로 의미 있게 감소되었다(p < 0.05, 도 5a 내지 5c 참조).

이상에서 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본 발명의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본 발명의 권리범위에 속하는 것이다.

Claims

황정, 마가목, 현지초, 그리고 담두시를 포함하는 혼합 한약재의 추출물을 유효성분으로 포함하는
신경병증성 통증 치료 또는 예방용 약학 조성물.
제1항에 있어서,
상기 혼합 한약재는 백모근을 더 포함하는 신경병증성 통증 치료 또는 예방용 약학 조성물.
제1항 또는 제2항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 약학 조성물은 경구 투여용 제제의 제형인 신경병증성 통증 치료 또는 예방용 약학 조성물.
제1항 또는 제2항 중 어느 한 항의 약학 조성물을 포함하는 신경병증성 통증 치료 또는 예방용 약제.
제1항 또는 제2항 중 어느 한 항의 약학 조성물을 포함하는 신경병증성 통증 치료 또는 예방용 약침 조성물.
제1항의 약학 조성물을 포함하는 신경병증성 통증 치료 또는 예방용 약침 조성물에 관한 것으로,
상기 약침 조성물의 농도는 0.015 g/ml 내지 0.03 g/ml 인 신경병증성 통증 치료 또는 예방용 약침 조성물.
황정, 마가목, 현지초, 그리고 담두시를 포함하는 혼합 한약재와 초순수액과의 혼합물을 65 ~ 80 ℃에서 48 ~ 60 시간 동안 숙성시키는 단계,
상기 숙성된 혼합물을 가열하여 추출액을 수득하는 단계,
상기 추출액을 증류하여 증류 추출액을 수득하는 단계, 그리고
상기 증류 추출액을 초순수액에 혼합한 후 염도 및 산도(pH)를 조절하는 단계
를 포함하는
신경병증성 통증 치료 또는 예방용 약침 조성물의 제조방법.
제7항에 있어서,
상기 혼합 한약재는 백모근을 더 포함하는 신경병증성 통증 치료 또는 예방용 약침 조성물의 제조방법.