CN101278940A - 用于治疗糖尿病性心血管病变的药物组合物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种包含纯度为90％以上、按重量份计的50－99的牛蒡子苷或1－50的牛蒡子苷元的组合物及其制备方法，其作用是治疗和预防糖尿病性心血管病变。本发明通过提纯牛蒡子苷和牛蒡子苷元，经药理、毒理和临床试验结果表明，本发明涉及的牛蒡子苷或牛蒡子苷元的组合物对于糖尿病性视网膜病变具有治疗效果强，毒副作用小的特点。

Description

用于治疗糖尿病性心血管病变的药物组合物及其制备方法

技术领域

本发明涉及以植物材料提取物为活性成分的药物组合物，具体涉及一组用于治疗糖尿病性心血管病变的组合物及其制备方法。

发明背景

目前全世界糖尿病发病率约4.6％，累计达2亿人。其发病率逐年上升，预计至2025年，糖尿病发病率约5.4％，达3亿人。

糖尿病心血管并发症是糖尿病患者最常见和最严重的慢性并发症，如大、中动脉的粥样硬化和微血管病变(糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变及糖尿病脑血管功能障碍等)，是预后不良及致死的主要原因。糖尿病可引起内皮细胞损伤及功能不全，导致炎性细胞浸入、血管平滑肌细胞增殖，增加细胞死亡，引发血管增生，最终导致粥样硬化、斑块破裂及血管再狭窄。糖尿病血管并发症在很大程度上是由于血管内皮细胞损伤或功能障碍所致。

血管内皮功能改变是血管病变的病理基础，而内皮功能的异常也加速了糖尿病及其并发症的进程。血管内皮细胞也是胰岛素的靶器官之一，胰岛素与内皮细胞表面胰岛素受体结合后，促使其释放一氧化氮(NO)增加而实现其血管舒张的生理功能。包括内皮细胞在内的细胞膜损伤引起胰岛素受体分布和功能变化，从而产生胰岛素抵抗，又促使内皮细胞功能进行性损害，使血管功能障碍发生、发展。血管内皮功能异常在糖尿病前期就已存在，随着血糖升高，血管内皮功能受损会逐渐加重。

内皮释放的NO具有一种血管舒张效应并抑制血小板的聚集、白细胞到内皮的粘附和内膜平滑肌细胞的增殖，它在许多关健性的心血管机理中是至关重要的。心血管疾病的形成中的关健步骤由于内皮NO释放的降低，例如，低密度脂蛋白的氧化作用，血管内膜中的单核细胞的补充和沉积，内膜细胞的增殖加速。动脉粥样化形成的后果是在血管的内壁上形成斑块，其可以反过来通过剪应力的减少而导致内皮NO释放的进一步下降以及病状的进一步恶化。由于内皮NO也是一种血管扩张剂，它们的降低还经常导致高血压，后者作为独立的危险因素可导致进一步的器官损坏。

目前，糖尿病并发心血管疾病的药物防治的常用措施为：

1、采用降糖药物控制血糖。但仅仅控制血糖是不够的，必须兼顾控制心血管疾病的危险因素。

2、采用降压药物控制血压。大量临床资料表明，控制血压可以使糖尿病人群心血管病风险减少25％～50％。

3、采用降脂药物调理血脂。如用他丁类或贝特类调理血脂，可使各种心血管疾病的危险降低25％～55％。

4、采用抗血小板聚集药物改善高凝状态。抗血小板聚集药物，如阿斯匹林，有助于改善高凝状态，使糖尿病患者的心血管事件与心肌梗死的发生率分别下降15％和46％。(吴秋枫，糖尿病并发心血管疾病的防治，浙江中西医结合杂志，2007年第17卷第7期，第397～418页；陈立新、李珏，糖尿病患者心血管并发症的干预性治疗进展，右江民族医学院学报，第24卷第4期，第601～602页)。

这些治疗措施的缺陷显而易见，西药治疗糖尿病及其心血管并发症注重于控制血糖及并发症的症状，但不能阻止糖尿病心血管并发症的发生，对心血管并发症常没有治本仅有治标的作用且疗效较低，而且还有一定的毒副作用。而传统中药药方存在有效成分不明确、含量偏低或极低，不利于生产质量控制及疗效较西药偏低等缺陷，尽管毒副作用较西药很低或无。

牛蒡子(Fructus arctii)是牛蒡的干燥成熟果实，为历版《中国药典》收载，具有疏散风热、宣肺透疹、解毒利咽的功效。传统中医临床多用于风热感冒、咳嗽痰多、麻疹、风疹、咽喉肿痛、痄腮丹毒等。现代药理学研究证明牛蒡子有抗肿瘤、降血糖、抗HIV和抑制血小板聚集等作用。临床上用牛蒡子治疗糖尿病及其并发症糖尿病肾病效果显著。药理实验也证明牛蒡子具有降低血糖和尿中蛋白质的作用。但是目前国内外均采用牛蒡子有效部分进行降血糖实验，而且其活性成分并不明确。

近年来，国内研究表明牛蒡子水提物、醇提物能显著而持久地降低大鼠血糖，对碳水化合物耐量增高，毒性较小；牛蒡子提取物对糖尿病大鼠肾脏病变有一定的改善，其作用机制可能与减轻细胞内蛋白非酶糖基化有关。

牛蒡子提取物中的成分中含有牛蒡子苷及牛蒡子苷元，牛蒡子苷(arctiin)及牛蒡子苷元(arctigenin)如下结构式(I)、结构式(II)所示：

结构式(I)                        结构式(II)

专利ZL02133954.6公开了一种用于治疗糖尿病肾病或糖尿病的牛蒡子总木脂素苷类提取物。其技术方案为：用乙醇等有机溶媒提取，精制，干燥，获得含牛蒡子总木脂素苷类物质50～90％(用紫外分光光度法测定)，或含牛蒡子苷15～70％(高效液相法测定)的提取物为原料药配制用于治疗糖尿病肾病或糖尿病的药物制剂。

专利申请CN200610013120.0公开了一种以牛蒡子总木脂素苷类提取物为原料制成的具有降糖益肾作用的中药，其牛蒡子总木脂素的含量50～89％之间，牛蒡子苷的含量在30％以上。

专利申请CN200510025834.9公开了一种牛蒡子提取物及其制备方法及应用，该提取物中包含以牛蒡子苷元为主的总木质素类化合物和牛蒡子苷，总木质素类化合物和牛蒡子苷的重量含量占52％-80％，其他成分的重量含量占20％-49％。

以上发明的不足是：仅发现牛蒡子提取物的降糖效果；药用成分为混合物，不利于生产质量控制和药效的提高；牛蒡子苷纯度不高。

本发明人经过研究后发现，牛蒡子苷和牛蒡子苷元可以用于治疗糖尿病性心血管病发症，牛蒡子苷和牛蒡子苷元对心血管血管内皮具有保护作用。

发明内容

本发明的目的在于提出一种对糖尿病性心血管病变标本兼治，且疗效较高、毒副作用较低的药物。

为了实现发明目标，本发明人进行了牛蒡子苷和牛蒡子苷元对心血管内皮的保护作用的研究。结果发现，小剂量牛蒡子苷和苷元能显著增加内皮细胞内皮型一氧化氮合酶的表达。本发明人同时发现，牛蒡子苷和牛蒡子苷元在一定剂量下，能够显著对抗高糖对内皮细胞增殖的抑制作用，改善内皮细胞功能，给予牛蒡子苷干预后内皮细胞在高糖条件下分泌NO的能力显著提高，此剂量下的牛蒡子苷能够显著的保护内皮细胞免受高糖条件所致的损伤。

在此基础上，本发明人进行了更深入广泛的研究，实现了这一目标。为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种治疗和预防糖尿病性心血管病变的组合物，其特征在于：其特征在于述组合物包含：(a)牛蒡子苷、药用添加剂和/或药用载体；

或(b)牛蒡子苷元、药用添加剂和/或药用载体；

或(c)牛蒡子苷、牛蒡子苷元、药用添加剂和/或药用载体。

其中所述组合物(c)中牛蒡子苷的含量为50-99重量份，牛蒡子苷元的含量为1-50重量份；优选为牛蒡子苷75-95重量份，牛蒡子苷元5-25重量份。

所述组合物中牛蒡子苷纯度为90％(高效液相色谱法测定)以上，牛蒡子苷元的纯度为90％(高效液相色谱法测定)以上。

药用添加剂和/或药用载体的含量为100-20000重量份；

所述组合物中的药用添加剂和药用载体包括：填充剂、崩解剂、粘合剂、滑润剂、湿润剂、稳定剂、乳化剂、分散剂、防腐剂、甜味剂、着色剂、调味剂、芳香剂、增稠剂、稀释剂、缓冲物质、溶剂、增溶剂、旨在获得贮存效果的试剂、旨在改变渗透压的盐、涂布剂或抗氧化剂。

所述组合物可制备成片剂、丸剂、胶囊剂、注射剂、喷雾剂或栓剂；

本说明书中各组分的重量以重量份计，有特殊说明的除外；

其中片剂或丸剂的片芯中含有：组合物(a)中牛蒡子苷1-100，从乳糖、淀粉、糊精、羟丙基纤维素中选出的至少一种250-350，从滑石粉、硬脂酸镁中选出的至少一种5-10，包衣预混剂欧巴代OY-C-7000A 3-5；组合物(b)中牛蒡子苷元1-100，从乳糖、淀粉、糊精、羟丙基纤维素中选出的至少一种250-350，从滑石粉、硬脂酸镁中选出的至少一种5-10，包衣预混剂欧巴代OY-C-7000A3-5；组合物(c)中牛蒡子苷50-99，牛蒡子苷元1-50，从乳糖、淀粉、糊精、羟丙基纤维素中选出的至少一种250-350，从滑石粉、硬脂酸镁中选出的至少一种5-10，包衣预混剂欧巴代OY-C-7000A 3-5；

其中含速释层的双层缓释片剂或丸剂的片芯中含有：组合物(a)中牛蒡子苷1-100，从乳糖、淀粉、羟丙基纤维素，聚乙烯基吡咯烷酮中选出的至少一种80-150，从滑石粉、硬脂酸镁中选出的至少一种5-10；组合物(b)中牛蒡子苷元1-100，从乳糖、淀粉、羟丙基纤维素，聚乙烯基吡咯烷酮中选出的至少一种80-150，从滑石粉、硬脂酸镁中选出的至少一种5-10；组合物(c)中牛蒡子苷50-99，牛蒡子苷元1-50，从乳糖、淀粉、羟丙基纤维素，聚乙烯基吡咯烷酮中选出的至少一种80-150，从滑石粉、硬脂酸镁中选出的至少一种5-10；所述双层缓释片剂或丸剂的包衣液中含有：羟丙基纤维素70-100，聚乙二醇-400 1-5、聚山梨酯-80 1-5，从柠檬黄、钛白粉中选出的至少一种1-5；

其中胶囊剂中含有：组合物(a)中牛蒡子苷1-100，乳糖、淀粉、糊精、羟丙基纤维素中选出的至少一种200-300，从滑石粉、硬脂酸镁中选出的至少一种1-4；组合物(b)中牛蒡子苷元1-100，从乳糖、淀粉、糊精、羟丙基纤维素中选出的至少一种200-300，从滑石粉、硬脂酸镁中选出的至少一种1-4；组合物(c)中牛蒡子苷50-99，牛蒡子苷元1-50，从乳糖、淀粉、糊精、羟丙基纤维素中选出的至少一种200-300，从滑石粉、硬脂酸镁中选出的至少一种1-4；

其中注射剂中含有：组合物(a)中牛蒡子苷1-100，氯化钠18，注射用水定容至2000；组合物(b)中牛蒡子苷元1-100，氯化钠18，注射用水定容至2000；组合物(c)中牛蒡子苷50-99，牛蒡子苷元1-50，氯化钠18，注射用水定容至2000；

其中栓剂中含有：组合物(a)中牛蒡子苷1-100，半合成脂肪酸酯600-800；组合物(b)中牛蒡子苷元1-100，半合成脂肪酸酯600-800；组合物(c)中牛蒡子苷50-99，牛蒡子苷元1-50，半合成脂肪酸酯600-800；

其中喷雾剂中含有：组合物(a)中牛蒡子苷1-100，甜菊素50，山梨酸钾30，注射用水加至10000；组合物(b)中牛蒡子苷元1-100，甜菊素50，山梨酸钾30，注射用水加至10000；组合物(c)中牛蒡子苷50-99，牛蒡子苷元1-50，甜菊素50，山梨酸钾30，注射用水加至10000。

所述的重量份可以是克、市两、公斤、市斤、吨等。

本发明分别提纯了纯度大于90％(高效液相色谱测定)的牛蒡子苷和牛蒡子苷元，牛蒡子苷、牛蒡子苷元单独用药可以分别作用于心血管内皮细胞治疗和预防糖尿病性心血管并发症，将牛蒡子苷和牛蒡子苷元组合用药对于治疗糖尿病性心血管并发症变具有协同的治疗效果。

提纯后的牛蒡子和牛蒡子苷元中的杂质包括：牛蒡酚B(lappaol B)、牛蒡酚A(lappaol A)、牛蒡酚F(lappaol F)、罗汉松脂素(matairesinol)、8-羟基松脂素(8-hydroxypinoresinol)、(+)-秦皮树脂醇((+)-Fraxiresinol)、山萘酚(kaempferol)、无梗五加苷B(acanthoside B)、槲皮素(quercetin)和异槲皮素(isoquercitrin)等。本发明采取的用于治疗和预防糖尿病性心血管并发症的组合物的制备方法

1、牛蒡子苷、牛蒡子苷元的分离提纯方法：

(1)牛蒡子苷的制备

①牛蒡子苷的粗提：牛蒡子粉碎后，置索氏提取器中，经沸程60-90℃石油醚回流脱脂2-4次，脱脂后取出晾干，60％-80％8倍乙醇回流提取2-4次，每次0.5-2h，提取液60℃-80℃减压浓缩，得深褐色浸膏；

②大孔树脂精制：将深褐色浸膏加15-35％乙醇，超声处理15-35分钟，使其恰恰充分溶解，过滤调至成浓度约为5-7mg/mL的溶液，通过AB-8型大孔吸附树脂，大孔吸附树脂体积为药液体积的1-2倍，流速控制为1.5-2.5BV/h，柱径高比控制为1∶5，水洗3倍树脂体积，水洗速度0.5-3BV/h；再换以4-6 BV50％乙醇洗脱，醇洗速度1-3BV/h，收集洗液，浓缩干燥得牛蒡子苷粗品；

③牛蒡子苷的分离：牛蒡子粗品用60目粗硅胶拌样，粗硅胶体积为牛蒡子苷粗品的1-2倍，经200-300目硅胶柱层析，硅胶柱为牛蒡子苷粗品的10-50倍，氯仿-甲醇95∶1洗脱，薄层色谱跟踪流出液，收集牛蒡子苷单点的流份，合并浓缩，得牛蒡子苷；

(2)牛蒡子苷元制备

①牛蒡子苷元粗提：牛蒡子药材粉碎后，过80目筛，置索氏提取器中，经沸程60～90℃的油醚回流脱脂3次，晾干后用乙酸乙酯回流提取2-4次，每次1.5-2.5h，提取液70℃减压浓缩，得褐色浸膏；

②牛蒡子苷元的精制：将褐色浸膏用60目粗硅胶拌样，粗硅胶体积为牛蒡子苷元粗品的1-2倍，水浴烘干，干法上样，经200-300目硅胶柱层析，氯仿-甲醇98∶1洗脱，洗脱液浓缩合并得到牛蒡子苷元。

其中大孔树脂精制牛蒡子苷提取物时的优选方案为：取牛蒡子苷醇提物，加15-30％乙醇，充分搅拌，超声处理15-30分钟，使其恰恰充分溶解，过滤调至成上样药液浓度为3-6.5mg/mL的溶液，使用AB-8型大孔吸附树脂，大孔吸附树脂体积为药液体积的1-2倍，上样流速控制为2BV/h，柱径高比控制为1∶5。水洗2-3倍树脂体积，水洗速度1-2BV/h；再换以3.5-4.5 BV50％乙醇洗脱，醇洗速度1-2BV/h，收集醇洗液，浓缩干燥得牛蒡子粗品。

2、按牛蒡子苷、牛蒡子苷元、药用添加剂和/或药用载体的比例配置混合。

本发明涉及的组合物可通过任何适宜的途径给予，例如，通过口服、眼局部、静脉内、肌内、真皮内、表皮下、直肠、经皮、或经肺给药。

本发明涉及的组合物可通过任何符合上述组合物的口服的给药形式包括但不限于丸剂、普通片剂、双层片剂、多层片剂、缓释片剂、单室控释片剂、双室控释片剂、微孔型控释片剂、舌下含片、口腔速崩片、分散片、肠溶片、颗粒剂、延迟释放片、定时/位释放片、普通胶囊、肠溶胶囊、缓释胶囊、控释胶囊、含有微丸或小片的胶囊、含有微丸或小片的pH依赖型胶囊、颗粒剂、膜剂或贴剂、水溶液、酒精溶液或油溶液、乳剂或混悬剂；眼局部给药的形式包括但不限于滴眼液、眼用软膏剂、眼用贴剂；直肠给药的形式包括但不限于栓剂；注射给药的形式包括但不限于溶液、固体粉未或块状物、乳剂或混悬剂。其它适用的给药形式还包括不限于经皮肤或局部给药，例如以软膏剂、酊剂、喷雾或透皮治疗剂体系的形式，或以鼻喷入法或气雾剂混合物的形式的吸入给药，或采取微囊剂、植入剂或植入棒的形式给药。本优选的给药形式为口服和注射给药形式给药。

药物给药形式的制备方法通常依据其具体形式、组合物实际情况和添加剂的性质等来确定。用于制备本发明的药物给药形式的方法在本领域中是已知的，对于本领域的普通技术人员是显而易见的。在这一方面，将牛蒡子苷、牛蒡子苷元或牛蒡子苷及牛蒡子苷元与一种或多种固体或液体药物载体和/或药用添加剂并且与其他具有治疗或预防功能的具有药物活性的化合物结合在一起，制成适当的给药形式或配药形式。

本发明涉及的组合物的给药形式也可以包含添加剂，例如填充剂、崩解剂、粘合剂、滑润剂、湿润剂、稳定剂、乳化剂、分散剂、防腐剂、甜味剂、着色剂、调味剂、芳香剂、增稠剂、稀释剂、缓冲物质、溶剂、增溶剂、旨在获得贮存效果的试剂、旨在改变渗透压的盐、涂布剂或抗氧化剂。本发明涉及的药用载体或药用添加剂的选择及其用量的选择根据具体的应用形式、口腔组合物实际情况、制备方法和主观需求等来确定。

口服给药形式通常包含惰性稀释剂或可食用载体。它们可以包封在明胶胶囊中或压成片剂。为了口服给药治疗，可以将活性化合物或其前体药物衍生物与赋形剂混合并以片剂，锭剂或胶囊剂的形式使用。也可以包含在药学上可配伍的粘合剂和/或佐剂物质，作为组合物中的一部分。

片剂、丸剂、胶囊剂、锭剂等等可以包含任何下列组分或性质类似的化合物：粘合剂如微晶纤维素、羟丙基纤维素、甲基纤维素或明胶；赋形剂如淀粉、甘露醇或乳糖；增塑剂为甘油、丙二醇或聚乙二醇；分散剂如藻酸或玉米淀粉；遮光剂为二氧化钛；抗粘剂如硬脂酸镁或滑石粉；润滑剂如胶态二氧化硅；增甜剂如糖精、阿斯巴甜或甜菊素；矫味剂如薄荷，橙皮油。当剂量单位形式为胶囊剂时，除上述种类的物质外，它可以包含液体载体如脂油。另外，剂量单位形式可以包含各种其它能够改变剂量单位物理形态或性能的物质，例如包衣剂。软明胶胶囊和栓剂的载体是例如脂肪、蜡、半固体和液体多元醇、天然或硬化油等。适用于微囊剂、植入剂或植入棒的载体是例如羟基乙酸和乳酸的共聚物。

也可以将牛蒡子苷、牛蒡子苷元或牛蒡子苷及牛蒡子苷元的冻干物，例如将其用于制备用于注射和输注的制剂中。

用于非肠道，真皮内，皮下或局部给药的溶液或悬浮液可包含下列组分：灭菌的稀释剂如注射用水，盐水溶液，固定油，聚乙二醇，甘油，丙二醇或其它合成溶剂；抑菌剂如苯甲醇或对羟苯甲酸甲酯；抗氧化剂如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；鳌合剂如乙二胺四乙酸；缓冲剂如乙酸盐，枸椽酸盐或磷酸盐和调节张力的试剂如氯化钠。非肠道给药的制剂可包封在由玻璃或塑料制成的安瓿，可处理注射器或多剂量小瓶中。

如果通过静脉注射给药，优选的载体是生理盐水或磷酸盐缓冲的盐水。

本发明涉及的组合物在药物制剂中的量一般为每剂0.1～1000mg(以牛蒡子苷、牛蒡子苷元或牛蒡子苷及牛蒡子苷元计，下同)，优选0.5～500mg，特别是1～200mg。典型的局部给药剂量为0.01～3％wt/wt(在适宜的载体中)。

给予本发明涉及的组合物来获得活性化合物的血浆峰浓度，其值为0.00001～10mmol/L，优选为0.001～300μmol/L，进一步优选为0.01～30μmol/L。例如，这可以通过静脉注射活性组分的溶液或制剂，可有可无的盐水或水性溶媒，或者可以通过给予活性组分的药团来获得。组合物中的活性化合物(牛蒡子苷、牛蒡子苷元或牛蒡子苷及牛蒡子苷元)的血药浓度依赖于药物的吸收，分布，灭活和排泄速率以及本领域技术人员已知的其它因素。

在本发明涉及的组合物中，也可以将牛蒡子苷、牛蒡子苷元或牛蒡子苷及牛蒡子苷元与其它不削弱所需作用的活性物质，或与补充所需作用的物质，如其它相同活性的药物、降糖药、抗氧化剂、醛糖还原酶抑制剂、内皮生长因子抑制剂、抗血小板聚集药或它们的混合物。

本发明还涉及上述的组合物的用途。其可用于治疗和预防糖尿病性视网膜病变的药物、保健品或食品添加剂。

本发明还涉及一种治疗和预防糖尿病性心血管并发症的组合物，包括：

I.牛蒡子苷、牛蒡子苷元或牛蒡子苷及牛蒡子苷元

II.其它治疗药，所述的治疗药选自：其它与牛蒡子苷相同活性的药物、降糖药、抗氧化剂、醛糖还原酶抑制剂、内皮生长因子抑制剂、抗血小板聚集药或它们的混合物。

上述的方法中，施用牛蒡子苷、牛蒡子苷元或牛蒡子苷及牛蒡子苷元的给药的剂量取决于各个实例，并且依惯例根据每一情况进行调整从而达到最好的效果。

施用本发明涉及的组合物的给药的剂量值也随着疾病产重程度的减轻而改变。进一步应该知道，就任何特定的治疗对象而言，特定的剂量方案应该根据个休需要和具体的疗程或监督给予组合物的人的职业判断，随时间变化进行调节，并且本文所提出的浓度范围仅作为实例说明并不限定所公开组合物的范围或应用。由此，上述剂量取决于待处理的病症的性质和严重程度，也取决于患者的性别和体征，取决于牛蒡子苷、牛蒡子苷元或牛蒡子苷及牛蒡子苷元的作用时间，取决于治疗是急性的或长期的或预防性的，或者取决于除牛蒡子苷、牛蒡子苷元或牛蒡子苷及牛蒡子苷元外是否有其它活性化合物被给药。一般而言，为了取得所希望的效果，适宜的每日剂量是约0.01～500mg/kg，优选0.05～200mg/kg，特别是0.1～100mg/kg。每日剂量可以在一次给药中使用，或者被分成几次(例如两次或三次)给药。在有些情况下，取决于个体的反应，可能需要从给出的每日剂量向上或向下调整。

本发明相对已有技术的优势：

1、本发明发现了牛蒡子苷和牛蒡子苷元对于心血管内皮细胞的治疗作用，可以显著提高内皮细胞在高糖条件下分泌一氧化氮(nitrogen oxide，NO)的能力，显著保护内皮细胞免受高糖条件所致的损伤。

2、与以往治疗糖尿病性心血管并发症的化学药物相比，本发明涉及的组合物具有标本兼治的效果，即针对糖尿病具有很强的治疗效果，又改善视网膜内皮细胞。因而具有多重疗效，且毒性极低，副作用极小。

3、与以往治疗糖尿病性心血管并发症的传统药方、中成药相比，本发明涉及的药物或药物组合物具有有效成分明确，纯度高；有利于生产质量控制，有利于实施中药现代化；疗效较高，且毒副作用没有明显增加等优势。

附图说明

图1是牛蒡子苷、牛蒡子苷元、牛蒡子苷和牛蒡子苷元1∶1混合物对高糖条件下大鼠主动脉内皮细胞(rat aortic endothelial cells，RAECs)表达内皮型一氧化氮合酶(eNOS)表达的影响。

具体实施方式

由此已详细地描述了本发明，对本领域技术人员而言在本发明的范围内显然还可有各种改变，本发明并不受说明书所述的限制。

实施例1牛蒡子苷和牛蒡子苷元的制备方法

(1)牛蒡子苷的制备

①牛蒡子苷的粗提：牛蒡子粉碎后，置索氏提取器中，经沸程60-90℃石油醚回流脱脂2次，脱脂后取出晾干，60％8倍乙醇回流提取2次，每次0.8h，提取液60℃减压浓缩，得深褐色浸膏；

②大孔树脂精制：将深褐色浸膏加15％乙醇，超声处理15分钟，使其恰恰充分溶解，过滤调至成浓度约为5mg/mL的溶液，通过AB-8型大孔吸附树脂，大孔吸附树脂体积为药液1倍，流速控制为1.5BV/h，柱径高比控制为1∶5，水洗3倍树脂体积，水洗速度0.5BV/h；再换以4 BV50％乙醇洗脱，醇洗速度1BV/h，收集洗液，浓缩干燥得牛蒡子苷粗品；

③牛蒡子苷的分离：牛蒡子苷粗品用60目粗硅胶拌样，粗硅胶体积为牛蒡子苷粗品的1倍，经200-300目硅胶柱层析，硅胶柱为牛蒡子苷粗品的10倍，氯仿-甲醇95∶1洗脱，薄层色谱跟踪流出液，收集牛蒡子苷单点的流份，合并浓缩，得牛蒡子苷，高效液相色谱测定纯度为90.3％；

(2)牛蒡子苷元制备

①牛蒡子苷元粗提：牛蒡子药材粉碎后，过80目筛，置索氏提取器中，经沸程60～90℃的油醚回流脱脂3次，晾干后用乙酸乙酯回流提取2次，每次1.5h，提取液70℃减压浓缩，得褐色浸膏；

②牛蒡子苷元的精制：褐色将浸膏用60目粗硅胶拌样，粗硅胶体积为牛蒡子粗品的1倍，水浴烘干，干法上样，经200-300目硅胶柱层析，氯仿-甲醇98∶1洗脱，洗脱液浓缩合并得到牛蒡子苷元，高效液相色谱测定纯度为90.5％。

实施例2牛蒡子苷和牛蒡子苷元的制备方法

(1)牛蒡子苷的制备

①牛蒡子苷的粗提：牛蒡子粉碎后，置索氏提取器中，经沸程60-90℃石油醚回流脱脂4次，脱脂后取出晾干，80％8倍乙醇回流提取4次，每次2h，提取液80℃减压浓缩，得深褐色浸膏；

②大孔树脂精制：将深褐色浸膏加35％乙醇，超声处理35分钟，使其恰恰充分溶解，过滤调至成浓度约为7mg/mL的溶液，通过AB-8型大孔吸附树脂，大孔吸附树脂体积为药液的2倍，流速控制为2.5BV/h，柱径高比控制为1∶5，水洗3倍树脂体积，水洗速度3BV/h；再换以6 BV50％乙醇洗脱，醇洗速度3BV/h，收集洗液，浓缩干燥得牛蒡子苷粗品；

③牛蒡子苷的分离：牛蒡子苷粗品用60目粗硅胶拌样，粗硅胶体积为牛蒡子苷粗品的2倍，经200-300目硅胶柱层析，硅胶柱体积为牛蒡子苷粗品的50倍，氯仿-甲醇95∶1洗脱，薄层色谱跟踪流出液，收集牛蒡子苷单点的流份，合并浓缩，得牛蒡子苷，高效液相色谱测定纯度为90.7％；

(2)牛蒡子苷元制备

①牛蒡子苷元粗提：牛蒡子药材粉碎后，过80目筛，置索氏提取器中，经沸程60～90℃的油醚回流脱脂3次，晾干后用乙酸乙酯回流提取4次，每次2.5h，提取液70℃减压浓缩，得褐色浸膏；

②牛蒡子苷元的精制：将褐色浸膏用60目粗硅胶拌样，粗硅胶体积为牛蒡子苷元粗品的2倍，水浴烘干，干法上样，经200-300目硅胶柱层析，氯仿-甲醇98∶1洗脱，洗脱液浓缩合并得到牛蒡子苷元，高效液相色谱测定纯度为90.8％。

实施例3牛蒡子苷和牛蒡子苷元的制备方法

(1)牛蒡子苷的制备

①牛蒡子苷的粗提：牛蒡子粉碎后，置索氏提取器中，经沸程60-90℃石油醚回流脱脂3次，脱脂后取出晾干，70％8倍乙醇回流提取3次，每次1h，提取液70℃减压浓缩，得深褐色浸膏；

②大孔树脂精制：将深褐色浸膏加20％乙醇，超声处理20分钟，使其恰恰充分溶解，过滤调至成浓度约为6mg/mL的溶液，通过AB-8型大孔吸附树脂，大孔吸附树脂体积为药液体积的1.5倍，流速控制为2BV/h，柱径高比控制为1∶5，水洗3倍树脂体积，水洗速度2BV/h；再换以5BV 50％乙醇洗脱，醇洗速度2BV/h，收集洗液，浓缩干燥得牛蒡子苷粗品；

③牛蒡子苷的分离：牛蒡子苷粗品用60目粗硅胶拌样，粗硅胶体积为牛蒡子苷粗品的2倍，经200-300目硅胶柱层析，硅胶柱体积为牛蒡子苷粗品的25倍，氯仿-甲醇95∶1洗脱，薄层色谱跟踪流出液，收集牛蒡子苷单点的流份，合并浓缩，得牛蒡子苷，高效液相色谱测定纯度为91.3％；

(2)牛蒡子苷元制备

①牛蒡子苷元粗提：牛蒡子药材粉碎后，过80目筛，置索氏提取器中，经沸程60～90℃的油醚回流脱脂3次，晾干后用乙酸乙酯回流提取3次，每次2h，提取液70℃减压浓缩，得褐色浸膏；

②牛蒡子苷元的精制：将褐色浸膏用60目粗硅胶拌样，粗硅胶体积为牛蒡子苷元粗品的1.5倍，水浴烘干，干法上样，经200-300目硅胶柱层析，氯仿-甲醇98∶1洗脱，洗脱液浓缩合并得到牛蒡子苷元，高效液相色谱测定纯度为91.7％。

实施例4牛蒡子苷和牛蒡子苷元的制备方法

(1)牛蒡子苷的制备

①牛蒡子苷的粗提：牛蒡子粉碎后，置索氏提取器中，经沸程80℃石油醚回流脱脂3次，脱脂后取出晾干，75％8倍乙醇回流提取3次，每次1h，提取液70℃减压浓缩，得深褐色浸膏；

②大孔树脂精制：将深褐色浸膏加25％乙醇，充分搅拌，超声处理25分钟，使其恰恰充分溶解，过滤调至成上样药液浓度为5mg/mL的溶液，使用AB-8型大孔吸附树脂，大孔吸附树脂体积为药液体积的1.5倍，上样流速控制为2BV/h，柱径高比控制为1∶5，水洗3倍树脂体积，水洗速度1.5BV/h；再换以4BV50％乙醇洗脱，醇洗速度1.5BV/h，收集醇洗液，浓缩干燥得牛蒡子苷粗品；

③牛蒡子苷的分离：牛蒡子苷粗品用60目粗硅胶拌样，粗硅胶体积为牛蒡子苷粗品的2倍，经200-300目硅胶柱层析，硅胶柱体积为牛蒡子苷粗品的40倍，氯仿-甲醇95∶1洗脱，薄层色谱跟踪流出液，收集牛蒡子苷单点的流份，合并浓缩得牛蒡子苷，高效液相色谱测定纯度为90.8％；

(2)牛蒡子苷元制备

①牛蒡子苷元粗提：牛蒡子药材粉碎后，过80目筛，置索氏提取器中，经沸程60～90℃的油醚回流脱脂3次，晾干后用乙酸乙酯回流提取3次，每次2h，提取液70℃减压浓缩，得褐色浸膏；

②牛蒡子苷元的精制：将褐色浸膏用60目粗硅胶拌样，粗硅胶体积为牛蒡子苷元粗品的2倍，水浴烘干，干法上样，经200-300目硅胶柱析层，氯仿-甲醇98∶1洗脱，洗脱液浓缩合并得到牛蒡子苷元，高效液相色谱测定纯度为91.2％。

实施例5胶囊剂

胶囊剂配方：组合物(a)

牛蒡子苷(活性成分)      100g

乳糖(赋形剂)            130g

淀粉(赋形剂)            120g

硬脂酸镁(抗粘剂)        2.5g

                                

共制成                  1000粒

组合物(b)

牛蒡子苷元(活性成分)    100g

乳糖(赋形剂)            130g

淀粉(赋形剂)            120g

硬脂酸镁(抗粘剂)        2.5g

                               

共制成                  1000粒

组合物(c)

牛蒡子苷(活性成分)      50g

牛蒡子苷元(活性成分)    50g

乳糖(赋形剂)            130g

淀粉(赋形剂)            120g

硬脂酸镁(抗粘剂)        2.5g

                                

共制成                  1000粒

制法：将活性成份和药用辅料均过100目筛，按处方分别准确称量，在混合机中混合10-15min，加入硬脂酸镁2.5g，混合2min后，装入1000粒胶囊即得。

实施例6注射剂

注射剂配方：组合物(a)

牛蒡子苷(活性成分)          100g

氯化钠(调节渗透压的盐)      18g

注射用水(药用载体)    至    2000ml

                                   

共制成                      1000支

组合物(b)

牛蒡子苷元(活性成分)        100g

氯化钠  (调节渗透压的盐)    18g

注射用水(药用载体)    至    2000ml

                                        

共制成                      1000支

组合物(c)

牛蒡子苷(活性成分)          85g

牛蒡子苷元(活性成分)        15g

氯化钠  (调节渗透压的盐)    18g

注射用水(药用载体)    至    2000ml

                                      

共制成                      1000支

制法：称取处方量的活性成份，加全量90％的注射用水搅拌使溶解，按注射用水量的0.1％(W/V)比例加入活性炭，搅拌20分钟，布氏漏斗铺两层无菌滤纸抽滤后，再将粗滤液经已灭菌的0.2μm微孔滤膜精滤。补加注射用水至足量，使牛蒡子苷和牛蒡子苷元含量为标示量的95.0％～105.0％，灌装，即得。

实施例7片剂或丸剂

片芯配方：组合物(a)

牛蒡子苷(活性成分)                    100g

糊精(赋形剂)                          162.5g

乳糖(赋形剂)                          137.5g

低取代羟丙基纤维素(粘合剂)            18.75g

4％羟丙基纤维素的50％乙醇(粘合剂)     112.5ml

滑石粉(抗粘剂)                        3.75g

硬脂酸镁(抗粘剂)                      3.75g

                                                

共制成                                1250片

组合物(b)

牛蒡子苷元(活性成分)                  100g

糊精(赋形剂)                          162.5g

乳糖(赋形剂)                          137.5g

低取代羟丙基纤维素(粘合剂)            18.75g

4％羟丙基纤维素的50％乙醇(粘合剂)     112.5ml

滑石粉(抗粘剂)                        3.75g

硬脂酸镁(抗粘剂)                      3.75g

                                               

共制成                                1250片

组合物(c)

牛蒡子苷(活性成分)                    75g

牛蒡子苷元(活性成分)                  25g

糊精(赋形剂)                          162.5g

乳糖(赋形剂)                            137.5g

低取代羟丙基纤维素(粘合剂)              18.75g

4％羟丙基纤维素的50％乙醇(粘合剂)       112.5ml

滑石粉(抗粘剂)                          3.75g

硬脂酸镁(抗粘剂)                        3.75g

                                                   

共制成                                  1250片

包衣液配方：

包衣预混剂(欧巴代OY-C-7000A)            4.37g

纯水                                    30g

                                                  

制成                                    1250片

制备工艺：将活性成份和其他辅料均过100目筛，称取处方量的活性成份、糊精和占处方量一半的低取代羟丙基纤维素，按等量递加法混合均匀，以4％羟丙基纤维素的50％的乙醇为润湿剂制软材，18目筛制粒，湿颗粒于45～50℃干燥，20目筛整粒，加入剩余量的低取代羟丙基纤维素、处方量的微粉硅胶、硬脂酸镁混匀，测定主药含量后，确定片重，于10.0mm浅凹冲模压片。按常规方法包以白色薄膜衣，包衣增重1～2％。

包衣液的配制：在搅拌下把包衣预混剂(欧巴代OY-C-7000A)加入纯水中，5分钟内加完，继续搅拌45分钟即得。

实施例8  喷雾剂

喷雾剂配方：组合物(a)

牛蒡子苷(活性成分)    100.0g

甜菊素(增甜剂)        50.0g

山梨酸钾(防腐剂)      30.0g

注射用水(药用载体)    加至10000ml

                                     

共制成                500支

组合物(b)

牛蒡子苷元(活性成分)  100.0g

甜菊素(增甜剂)        50.0g

山梨酸钾(防腐剂)          30.0g

注射用水(药用载体)        加至10000ml

                                          

共制成                    500支

组合物(c)

牛蒡子苷(活性成分)        80.0g

牛蒡子苷元(活性成分)      20.0g

甜菊素(增甜剂)            50.0g

山梨酸钾(防腐剂)          30.0g

注射用水(药用载体)        加至10000ml

                                         

共制成                    500支

制备方法：称取处方量的活性成份，加入约30％的温度80℃左右热注射用水中，搅拌使其溶解，再将甜菊素、山梨酸钾逐步加入其中，搅拌使其溶解，加入0.05％针用活性炭，于温度70～80℃吸附15分钟，脱炭，补加注射用水至全量，搅匀，灌装即得。

实施例9栓剂

栓剂配方：组合物(a)

牛蒡子苷(活性成分)            80g

半合成脂肪酸酯(药用载体)      700g

                                      

制成                          400粒

组合物(b)

牛蒡子苷元(活性成分)          20g

半合成脂肪酸酯(药用载体)      700g

                                       

制成                          400粒

组合物(c)

牛蒡子苷(活性成分)            85g

牛蒡子苷元(活性成分)          15g

半合成脂肪酸酯(药用载体)      700g

                                     

制成                          400粒

制备方法：称取活性成分过100目筛，另取半合成脂肪酸酯1700g加热熔融，待温度降至60℃以下时，将牛蒡子苷药粉加入，搅拌均匀，浇模制成1000粒即得。

实施例10含速释层的双层缓释片剂

缓释片芯配方：组合物(a)

牛蒡子苷(活性成分)        100.0g

羟丙基纤维素(粘合剂)      28.7g

乳糖(赋形剂)              58.0g

聚乙烯基吡咯烷酮(崩解剂)  8.0g

硬脂酸(抗粘剂)            5.3g

                                   

制成                      667片

组合物(b)

牛蒡子苷(活性成分)        100.0g

羟丙基纤维素(粘合剂)      28.7g

乳糖(赋形剂)              58.0g

聚乙烯基吡咯烷酮(崩解剂)  8.0g

硬脂酸(抗粘剂)            5.3g

                                    

制成                      667片

组合物(c)

牛蒡子苷(活性成分)        85.0g

牛蒡子苷元(活性成分)      15.0g

羟丙基纤维素(粘合剂)      28.7g

乳糖(赋形剂)              58.0g

聚乙烯基吡咯烷酮(崩解剂)  8.0g

硬脂酸(抗粘剂)            5.3g

                                    

制成                      667片

包衣液处方：

羟丙基纤维素(粘合剂)      86g

聚乙二醇-400(增溶剂)      3ml

聚山梨酯80(乳化剂)        2ml

钛白粉(着色剂)            3g

柠檬黄(着色剂)            6mg

60％乙醇                  3200ml

                                    

制成                      3200ml

制备方法：

1、预处理：将活性成份过7号筛。辅料羟丙基纤维素、聚乙烯基吡咯烷酮、硬脂酸分别过7号筛。

2、烟酸片芯颗粒制备：称取处方量的活性成份、聚乙烯基吡咯烷酮和31％处方量的羟丙基纤维素，混合均匀，作为混合粉，用水制粒。湿粒置60℃通风干燥，干颗粒经2号筛整粒后，加入处方量的硬脂酸和剩余量的羟丙基纤维素，混匀。测颗粒含药量，计算标准片重。

3、压片：13mm浅凹冲压片，片剂硬度控制在5～6千克力(kgf)。

4、包衣液的配制：称取处方量的羟丙甲基纤维素、聚乙二醇-400和吐温-80，溶于处方量的60％乙醇中，并用此液研磨处方量的钛白粉，取上清液即得空白包衣液。

5、包衣：取片芯称重，放入包衣锅内，温度控制在40±2℃，进行预包几分钟，将已过7号筛的牛蒡子苷分散到包衣液中，连续喷入包衣液，至片剂增重15％。

实施例11  牛蒡子苷、牛蒡子苷元和牛蒡子苷及牛蒡子苷元混合物对糖尿病性心血管的作用

(一)实验方法

1.实验材料

实验动物：SPF级Wistar大鼠4只，体重150～180g；

试验药物：牛蒡子苷、牛蒡子苷元，纯度均要求大于90.0％，实测值：牛蒡子苷94.2％(HPLC法)，牛蒡子苷95.2％(HPLC法)，牛蒡子苷与牛蒡子苷元混合物(质量比1∶1)。

2.大鼠主动脉内皮细胞培养与鉴定

2.1大鼠主动脉内皮细胞的培养(rat aortic endothelial cells，RAECs)

处死大鼠，无菌条件下取其胸腹主动脉，清除血管外膜及脂肪组织，将血管纵向剖开，用0.01PBS漂洗干净，用眼科剪剪成约1.5mm×1.5mm大小的组织块，放入培养瓶中，放入37℃、5％CO₂的培养箱中贴壁4h后加入含20％FBS(小牛血清)、100ug/mlECGS(endothelial cell growth supplement，内皮细胞生长添加剂)、100ug/ml肝素及双抗(100U/ml青霉素和100U/ml链霉素)的DMEM/F12培养基继续培养。3天后去除组织块并换液后继续培养。以后每3天更换培养液1次。取2～5代用于试验。

差速消化法纯化内皮细胞及其传代培养：吸弃培养液，用PBS液冲洗3次，加入0.1％的胰蛋白酶1～2ml，置相差显微镜下观察，1～3min即可见大部分RAECs收缩变圆而杂细胞仍然贴壁，此刻立即加入小牛血清终止消化，用吸管轻轻吹散细胞，吸出离心后，置于培养瓶中培养。

2.2 RAECs的鉴定

(1)RAECs的生长特性观察：分别在培养1天、2天、3天及7天时用倒置相差显微镜观察细胞的形态学特征。

(2)细胞免疫荧光染色：细胞免疫荧光染色检查VIII因子相关抗原来鉴定大鼠主动脉内皮细胞。

3.采用四甲基偶氮唑蓝(methylthiazoletetrazoliumm，MTT)法检测牛蒡子苷、牛蒡子苷元和牛蒡子苷及牛蒡子苷元混合物对RAECs增殖能力的影响

取生长良好的细胞，加入适量的0.25％胰蛋白酶消化吹打分散细胞后，再加入10％的新生小牛血清的DMEM/F12培养液，制备成细胞悬液，并调整细胞浓度至1×10⁵个/ml。按200μl/孔接种于96孔细胞培养板，6h后各孔内加牛蒡子苷使其终浓度分别为10ng·ml^-1、100ng·ml^-1、1μg·ml^-1、10μg·ml^-1、100μg·ml^-1、1mg·ml^-1、5mg·ml^-1及10mg·ml^-1，同时设立空白对照组，每组设6复孔，继续培养48小时。在培养结束前4小时，每孔加入MTT(5mg·ml^-1)20μl，培养结束后倾去培养上清液，加入二甲基亚砜150μl，振荡至完全熔解后，将96孔板放入酶标仪，在490nm处测定光密度(optical density，OD)值。

牛蒡子苷元、牛蒡子苷与牛蒡子苷元混合物加药剂量和实验方法同牛蒡子苷。

4.牛蒡子苷、牛蒡子苷元和牛蒡子苷及牛蒡子苷元混合物对高糖条件下RAECs活性的影响

方法同前3。各孔内加葡萄糖使其终浓度30mmol·L^-1，同时加入牛蒡子苷，其终浓度同上，同时设立正常对照(不加葡萄糖及牛蒡子苷)及空白对照组(加葡萄糖，不加牛蒡子苷)，每组设6复孔。

牛蒡子苷元、牛蒡子苷与牛蒡子苷元混合物加药剂量和实验方法同牛蒡子苷。

5.牛蒡子苷、牛蒡子苷元和牛蒡子苷及牛蒡子苷元混合物对RAECs释放乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)、丙二醛(maleic dialdehyde，MDA)和一氧化氮(nitrogen oxide，NO)的影响

实验方法：选用三种药物浓度(1μg·ml^-1、10μg·ml^-1、100μg·ml^-1)进行实验。参照上述方法，按200μl/孔接种于96孔细胞培养板和1ml/孔接种于24孔细胞培养板中进行细胞培养。24h后各孔内加牛蒡子苷使其终浓度分别为1μg·ml^-1、10μg·ml^-1、100μg·ml^-1，同时设立空白对照组，每组设6复孔，分别收集24孔细胞培养板细胞培养液，按照试剂盒说明书测定培养液中LDH、MDA和NO含量。

牛蒡子苷元、牛蒡子苷与牛蒡子苷元混合物加药剂量和实验方法同牛蒡子苷。

6.牛蒡子苷、牛蒡子苷元和牛蒡子苷及牛蒡子苷元混合物对高糖条件下RAECs释放LDH、MDA和NO的影响

方法同5。培养24h后各孔内加葡萄糖使其终浓度30mmol·L^-1，同时加牛蒡子苷使(浓度同5)，同时设立正常对照组(不加葡萄糖及牛蒡子苷)高渗对照组(加甘露醇终浓度为30mmol·L^-1)及模型对照组(加葡萄糖，不加牛蒡子苷)，每组设6复孔。

牛蒡子苷元、牛蒡子苷与牛蒡子苷元混合物加药剂量和实验方法同牛蒡子苷。

7.牛蒡子苷、牛蒡子苷元和牛蒡子苷及牛蒡子苷元混合物对高糖条件下RAECs表达内皮型一氧化氮合酶(eNOS)表达的影响

将细胞接种至培养瓶中，培养24h后加葡萄糖使其终浓度30mmol·L^-1，同时加牛蒡子苷使其终浓度分别为1μg·ml^-1、10μg·ml^-1、100μg·ml^-1，同时设立正常对照组(不加葡萄糖及牛蒡子苷)高渗对照组(加甘露醇终浓度为30mmol·L^-1)及空白对照组(加葡萄糖，不加牛蒡子苷)，待细胞达90％融合后，用0.25％胰酶消化收集、裂解细胞，用免疫沉淀法分离eNOS蛋白，并运用蛋白考马斯亮蓝法定量；蛋白免疫印迹增强化学发光法检测eNOS表达水平。

牛蒡子苷元、牛蒡子苷与牛蒡子苷元混合物加药剂量和实验方法同牛蒡子苷。

8.统计方法

所有数据结果用均数±标准差(x±SD)表示，采用SPSS 10.0专用统计分析程序对各组数据进行t检验或单因素方差分析，以P＜0.05为具有统计学意义。

(二)实验结果

(1)对高糖条件下大鼠血管内皮细胞保护作用

1.大鼠主动脉内皮细胞(rat aortic endothelial cells，RAECs)的鉴定原代和传代培养的大鼠主动脉内皮细胞体外生长情况及形态：原代内皮细胞2～3天即可由组织块边缘爬出并逐渐向外延伸，呈扁平短梭形或多角形，约7-10天融合成层，呈鹅卵石样排列；传代细胞12h后，可见细胞生长增殖，呈小簇状生长，24h后，细胞生长形成细胞群。细胞团块中间较密，呈鱼贯状相连或旋窝状排列，周边细胞多为长梭形并游离向外生长。7天后各细胞群相互融合成层，细胞成鹅卵石样排列。

细胞免疫荧光染色结果：vwF抗原免疫荧光染色呈阳性，表明培养的细胞表达vwF抗原。

2.对内皮细胞增殖能力的影响

表1(a)不同浓度牛蒡子苷对内皮细胞增殖能力的影响(x±SD，n＝6)

注：与正常对照组比较：*p＜0.05，**p＜0.01

表1(b)不同浓度牛蒡子苷元对内皮细胞增殖能力的影响(x±SD，n＝6)

注：与正常对照组比较：*p＜0.05，**p＜0.01

表1(c)不同浓度的牛蒡子苷和牛蒡子苷元混合物对内皮细胞增殖能力的影响(x±SD，n＝6)

注：与正常对照组比较：*p＜0.05，**p＜0.01

结果表明：在10ng·ml^-1～100μg·ml^-1之间，各给药组呈剂量依赖性地增强内皮细胞增殖能力，空白对照组490nm吸光光度值为0.48±0.06，各给药组组有增强内皮细胞增殖能力的趋势，与对照组相比有显著性差异(n＝6，p＜0.05)，而1μg·ml^-1、10μg·ml^-1、100μg·ml^-1的各给药组能显著增强内皮细胞增殖，与对照组相比有极显著性差异(n＝6，p＜0.01)；1mg·ml^-1、5mg·ml^-1及10mg·ml^-1组，与对照组相比尽管仍能增强内皮细胞的增殖能力，但与100μg·ml^-1的浓度相比其作用有逐渐减弱的趋势。

3.对高糖条件下RAECs增殖能力的影响

表2(a)不同浓度牛蒡子苷对高糖条件下RAECs增殖能力的影响(x±SD，n＝6)

注：与正常对照组相比，*p＜0.05，**p＜0.01；与高糖对照组相比，^Δp＜0.05，^ΔΔp＜0.01；

表2(b)不同浓度牛蒡子苷元对高糖条件下RAECs增殖能力的影响(x±SD，n＝6)

注：与正常对照组相比，*p＜0.05，**p＜0.01；与高糖对照组相比，^Δp＜0.05，^ΔΔp＜0.01；

表2(c)不同浓度的牛蒡子苷和牛蒡子苷元混合物对高糖条件下RAECs增殖能力的影响(x±SD，n＝6)

注：与正常对照组相比，*p＜0.05，**p＜0.01；与高糖对照组相比，^Δp＜0.05，^ΔΔp＜0.01；

结果表明：与正常对照组相比，高糖能显著降低细胞增殖能力(n＝6，p＜0.01)，高渗甘露醇(30mmol·L^-1)溶液对细胞增殖能力无影响(n＝6，p＞0.05)。1μg·ml^-1、10μg·ml^-1、100μg·ml^-1的牛蒡子各组呈剂量依赖性地增强高糖条件下内皮细胞的增殖能力，与高糖对照组相比有显著性差异(p＜0.01)；10ng·ml^-1及100ng·ml^-1的牛蒡子各组对高糖条件下内皮细胞增殖能力无影响，与空白对照组相比无显著性差异(p＞0.05)；1mg·ml^-1、5mg·ml^-1及10mg·ml^-1的牛蒡子各组作用于内皮细胞时与空白对照组相比尽管仍能增强内皮细胞的增殖能力(p＜0.05)，但与100μg·ml^-1的浓度相比其作用呈逐渐减弱趋势。

4.对高糖条件下RAECs细胞释放乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)、丙二醛(maleic dialdehyde，MDA)、一氧化氮(nitrogen oxide，NO)和内皮素(endothelium，ET)的影响

表3(a)牛蒡子苷对高糖条件下RAECs细胞释放MDA、NO、LDH和ET的影响(x±SD，n＝6)

注：与正常对照组相比，*p＜0.05，**p＜0.01，#p＞0.05；与高糖对照组相比，^Δp＜0.05，^ΔΔp＜0.01

表3(b)牛蒡子苷元对高糖条件下RAECs细胞释放MDA、NO、LDH和ET的影响(x±SD，n＝6)

注：与正常对照组相比，*p＜0.05，**p＜0.01，#p＞0.05；与高糖对照组相比，^Δp＜0.05，^ΔΔp＜0.01

表3(c)牛蒡子苷和牛蒡子苷元混合物对高糖条件下RAECs细胞释放MDA、NO、LDH和ET的影响(x±SD，n＝6)

注：与正常对照组相比，*p＜0.05，**p＜0.01，#p＞0.05；与高糖对照组相比，^Δp＜0.05，^ΔΔp＜0.01

试验结果：与正常对照组相比，高糖对照组MDA的含量显著增加(p＜0.01)；高渗对照与正常对照组相比，MDA释放量无显著差异(p＞0.05)。与空白对照组相比，1μg·ml^-1、10μg·ml^-1及100μg·ml^-1的牛蒡子各组均能显著减少高糖诱导的MDA释放，呈剂量依赖性。

与正常对照组相比，高渗对照组NO的含量无显著性差异(p＜0.05)，而高糖对照组NO的含量显著降低(p＜0.05)。1μg·ml^-1、10μg·ml^-1及100μg·ml^-1浓度的牛蒡子各组能显著增加高糖条件下内皮细胞分泌NO的能力，与高糖对照组相比有显著性差异(p＜0.05)，呈剂量依赖性。

与正常对照组相比，高糖对照组LDH的含量显著增加(p＜0.05)；高渗对照与正常对照组相比，LDH释放量无显著差异(p＜0.05)。与高糖对照组相比，1μg·ml^-1、10μg·ml^-1及100μg·ml^-1的牛蒡子各组均能显著减少高糖诱导的LDH释放，呈剂量依赖性。

与正常对照组相比，高糖对照组ET的含量显著增加(p＜0.05)；高渗对照与正常对照组相比，ET释放量无显著差异(p＜0.05)。与空白对照组相比，1μg·ml^-1、10μg·ml^-1及100μg·ml^-1的牛蒡子各组均能显著减少高糖诱导的ET释放，呈剂量依赖性。

5.对高糖条件下RAECs表达内皮型一氧化氮合酶(eNOS)表达的影响

表4牛蒡子苷、牛蒡子苷元、牛蒡子苷和牛蒡子苷元混合物对高糖条件下RAECs表达内皮型一氧化氮合酶(eNOS)表达的影响

注：与正常对照组相比，*p＜0.05，**p＜0.01，#p＞0.05；与高糖对照组相比，^Δp＜0.05，^ΔΔp＜0.01电泳图见说明书附图图1，其中M为marker，1为正常对照组，2为高糖对照组，3为牛蒡子苷10μg·ml^-1，4为牛蒡子苷元组10μg·ml^-1，5为混和物组(牛蒡子苷元5μg·ml^-1+牛蒡子苷5μg·ml^-1)，6为高渗对照。

实验结果：与正常对照组相比，高渗对照组eNOS的表达无显著性差异(p＞0.05)，而高糖对照组eNOS的表达显著降低(p＜0.05)；牛蒡子苷组、牛蒡子苷元组1及其混和物组能增加高糖条件下内皮细胞eNOS的表达，与高糖对照组相比有显著性差异(p＜0.05)。

实施例13牛蒡子苷和牛蒡子苷元的急性毒性试验

将本发明所述的牛蒡子苷和牛蒡子苷元用于进行小鼠的急性毒性试验，，得牛蒡子苷的小鼠的口服半数致死量LD₅₀为139.8g/kg，得牛蒡子苷元的小鼠的口服半数致死量LD₅₀为64.6g/kg，远远高于前述试验有效剂量，表明该牛蒡子提取物毒副作用小，在开发制备临床用药方面前景广阔。

一、试验材料

实验动物：昆明种小鼠，SPF级，6-8周龄，18-22g。饲养于全封闭动物房内，温度20-22℃，相对湿度50-60％，光照12小时暗，12小时明，中央空调集中通风8-15次/小时。自由摄食和饮水，每日更换饮用水一次。适应性饲养观察2天后，禁食不禁水过夜，次日称重、编号。

二、实验方案

1.动物分组：将给药组分为5个剂量组，每组10只小鼠，雌雄各半。

2.给药剂量：以“不等浓度等容积”的原则给药，牛蒡苷和牛蒡苷元用0.5％羧甲基纤维素钠配成供灌胃用的混悬液，各组小鼠按等比级数1∶0.5分别灌胃给予受试药物。以后常规饲养，连续观察7天动物的毛色、自发活动、饮食、体重等，记录死亡症状和时间，7天后处死动物，解剖观察小鼠各组织、脏器有无异常变化。将本发明所述的牛蒡子提取物用于进行小鼠的急性毒性试验，得牛蒡子苷的小鼠的口服半数致死量LD₅₀为139.8g/kg，得牛蒡子苷元的小鼠的口服半数致死量LD₅₀为64.6g/kg，远远高于前述试验有效剂量，表明该牛蒡子提取物毒副作用小，在开发制备临床用药方面前景广阔。

表5牛蒡子苷的小鼠死亡率

注：表内为“死亡数/动物数”。

表6牛蒡子苷对雄性小鼠体重的影响(X±s，g)

剂量(g/kg)    第1天            第7天

401.44        18.2±0.74(5)

200.72        21.5±1.01(5)    33.2±1.27(2)

100.36        17.2±0.82(5)    32.7±1.08(4)

50.18         17.8±1.27(5)    31.9±0.85(4)

25.09         21.7±1.55(5)    30.9±1.27(5)

注：“()”内为动物数，下同。

表7牛蒡子苷对雌性小鼠体重的影响(X±s，g)

剂量(g/kg)    第1天            第7天

401.44        19.1±0.73(5)

200.72        18.8±0.29(5)    28.1±0.99(1)

100.36        20.3±1.26(5)    29,6±1.65(4)

50.1 8        19.9±0.84(5)    30.1±1.31(5)

25.09         20.7±1.04(5)    29.5±0.87(5)

表8牛蒡子苷元的小鼠死亡率

剂量(g/kg)    雄性    雌性   总死亡率

240.48        5/5     5/5    100％

120.24        3/5     4/5    70％

60.12         1/5     1/5    20％

30.06         1/5     0/5    10％

15.03         0/5     0/5    0％

表9牛蒡子苷元对雄性小鼠体重的影响(X±s，g)

剂量(g/kg)    第1天             第7天

240.48        17.5±0.74(5)

120.24        19.4±1.15(5)     32.6±1.32(2)

60.12         18.5±0.095(5)    31.8±1.24(4)

30.06         18.1±1.17(5)     31.7±0.98(4)

15.03         21.4±0.86(5)     30.7±1.32(5)

表10牛蒡子苷元对雌性小鼠体重的影响(X±s，g)

剂量(g/kg)    第1天            第7天

401.44        19.5±0.91(5)

200.72        18.4±0.59(5)    27.8±1.15(1)

100.36        19.8±1.16(5)    28.5±1.55(4)

50.18         20.2±0.78(5)    30.7±0.71(5)

25.09         20.6±1.14(5)    29.6±0.77(5)

结论：牛蒡子苷的小鼠口服LD₅₀为139.8g/kg，LD₅₀的95％可信限为99.8～195.9g/kg。牛蒡子苷元小鼠口服LD₅₀为64.6g/kg，LD₅₀的95％可信限44.6～93.7g/kg。牛蒡子苷和牛蒡子苷元的小鼠LD₅₀远远高于其有效剂量，表明其毒副作用小，在开发制备临床用药方面前景广阔。

实施例14临床试验

研究病例：将80例糖尿病并高血压患者随机分为治疗组(Aa组，Ab组，Ac组，各组n＝40)和对照组(B组，n＝40)。A组治疗前平均血压(162±12)/(102±13)mmHg，平均空腹血糖为105±2.7mmol/L。B组治疗前平均血压为(171±11)/(105±14)mmHg，平均空腹血糖9.7±2.8mmol/L。糖尿病的诊断采用国际糖尿病联盟西太区委员会(IDF～WPF)1999年公布的诊断标准；高血压的诊断标准采用世界卫生组织(WHO)1999年新标准，舒张压≥100mmHg(即2，3级高血压)者作为人选对象。

治疗方法：各组均予糖尿病饮食，各组均予基础治疗：试验期间受试者根据适合个体需要的最佳用药原则，各组均同时口服二甲双胍以控制血糖，使受试者血糖达到控制标准或保持稳定的水平。在此基础上，Aa组加服牛蒡子苷胶囊(100mg/粒，实施例5a样品)，Ab组加服牛蒡子苷元胶囊(100mg/粒实施例5b样品)，Ac组加服牛蒡子苷与牛蒡子苷元混合物胶囊(100mg/粒，实施例5c样品)，每次2粒(每粒0.1g)，1天3次。

(一)观察内容：

1、实验室检查

初查和3月疗程结束后都进行系统的三大常规、空腹血糖(FBS)、餐后血糖(PBS)、血脂、肝肾功能、血内皮生长因子(VEGF)检查、一氧化氮含量及血液流变学参数检测，服药1个月，和2个月则只查FBS。

2、测定血压

降压疗效评定标准：收缩压或舒张压下降≥10mmHg并降至正常或下降20mmHg以上为显效；下降虽未达到10mmHg，但降至正常或下降10～19mmHg为有效；未达到上述水平者为无效。

3、观察副作用

(二)临床试验结果：

1、各组治疗前后空腹血糖(FBG)、餐后血糖(PBG)、糖化血红蛋白(HbAlc)的结果见表11、12。

表11(a)试验组(Aa)治疗前后FBG、PBG、HbAlc比较(x±S)

注：*表示p＜0.05

表11(b)试验组(Ab)治疗前后FBG、PBG、HbAlc比较(x±S)

注：*表示p＜0.05

表11(c)试验组(Ac)治疗前后FBG、PBG、HbAlc比较(x±S)

注：*表示p＜0.05

表12对照组治疗前后FBG、PBG、HbAlc比较(x±S)

注：*表示p＜0.05，#表示p＞0.05

结果显示：各组均具有一定的降血糖作用。

2、各组治疗前后血清血管内皮生长因子(VEGF)的结果见表13。

表13(a)血管内皮生长因子(VEGF)水平变化比较

注：*表示p＜0.05，#表示p＞0.05

表13(b)血管内皮生长因子(VEGF)水平变化比较

注：*表示p＜0.05，#表示p＞0.05

表13(c)血管内皮生长因子(VEGF)水平变化比较

注：*表示p＜0.05，#表示p＞0.05

结果显示：各试验组治疗前后血管内皮生长因子水平显著下降。

3、降压疗效评定结果见表14。

表14(a)试验组与对照组降血压疗效情况

注：*表示p＜0.05

表14(b)试验组与对照组降血压疗效情况

注：*表示p＜0.05

表14(c)试验组与对照组降血压疗效情况

注：*表示p＜0.05

结果显示：各治疗组均有一定的降血压作用。

4、一氧化氮含量结果见表15

表15(a)治疗前后一氧化氮比较

注：组内治疗前后比较，^★★★P＜0.01，^★★P＜0.05；组间治疗后比较，^★★★P＜0.01，组间治疗前比较，^★P＞0.05。

表15(b)治疗前后一氧化氮比较

注：组内治疗前后比较，^★★★P＜0.01，^★★P＜0.05；组间治疗后比较，^★★★P＜0.01，组间治疗前比较，^★P＞0.05。

表15(c)治疗前后一氧化氮比较

注：组内治疗前后比较，^★★★P＜0.01，^★★P＜0.05；组间治疗后比较，^★★★P＜0.01，组间治疗前比较，^★P＞0.05。

结果显示：各治疗组均能有效抑制一氧化氮含量下降。

5、全血高切粘度(ηHb)、全血低切粘度(ηLb)、血浆粘度(ηP)、红细胞聚集指数(EAI)、纤维蛋白原(Fb)的结果见表16

表16(a)治疗前后血液流变学变化(x±S)

注：*表示p＜0.05

表16(b)治疗前后血液流变学变化(x±S)

注：*表示p＜0.05

表16(c)治疗前后血液流变学变化(x±S)

注：*表示p＜0.05

结果显示：各治疗组治疗后患者全血高切粘度(ηHb)、全血低切粘度(ηLb)、血浆粘度(ηP)、红细胞聚集指数(EAI)、纤维蛋白原(Fb)比治疗前有明显减低(P＜0.05)。

6、安全性比较

各试验组及对照组服药期间血尿常规、肝功能指标(丙氨酸转氨酶ALT、天冬氨酸转氨酶AST)和肾功能指标(血尿素氮BUN、肌酐Cr)均未显示异常。各试验组未见比对照组中有更重的副作用，也没有出现与对照组不一样副作用。

以上各结果表明，牛蒡子苷、牛蒡子苷元、牛蒡子苷与牛蒡子苷元混合物均能安全有效控制糖病性心血管病变。

Claims (9)

1. 一种治疗和预防糖尿病性心血管病变的组合物，其特征在于，所述组合物含纯度为90％以上、按重量份计的50-99的牛蒡子苷或1-50的牛蒡子苷元。

2. 根据权利要求1的所述组合物，其特征在于，所述组合物中含100-20000重量份的药用添加剂或药用载体。

3. 权利要求1所述的组合物，其特征在于将所述组合物制备成片剂、丸剂、胶囊剂、注射剂、栓剂或喷雾剂。

4. 一种如权利要求3的所述组合物，其特征在于所述组合物制得的片剂或丸剂含按重量份计的牛蒡子苷1-100或牛蒡子苷元1-100或牛蒡子苷50-99与牛蒡子苷元1-50的混合物；250-350重量份的从乳糖、淀粉、糊精和羟丙基纤维素中选出的至少一种，5-10重量份的从滑石粉和硬脂酸镁中选出的中的一种，3-5重量份的包衣预混剂欧巴代OY-C-7000A。

5. 一种如权利要求3所述的组合物，其特征在于所述组合物制得的含速释层的双层缓释片剂或丸剂含按重量份计的牛蒡子苷1-100或牛蒡子苷元1-100或牛蒡子苷50-99和牛蒡子苷元1-50二者的混合物；80-150重量份的从乳糖、淀粉、羟丙基纤维素和聚乙烯基吡咯烷酮中选出的至少一种；5-10重量份的从滑石粉和硬脂酸镁中选出的至少一种；70-100重量份的羟丙基纤维素，1-5重量份的聚乙二醇-400、1-5重量份的聚山梨酯-80，1-5重量份的从柠檬黄和钛白粉中选出的至少一种。

6. 一种如权利要求3所述的组合物，其特征在于所述组合物制得的胶囊剂含按重量份计的牛蒡子苷1-100或牛蒡子苷元1-100或牛蒡子苷50-99和牛蒡子苷元1-50二者的混合物，200-300重量份的从乳糖、淀粉、糊精和羟丙基纤维素中选出的至少一种，1-4重量份的从滑石粉和硬脂酸镁中选出的至少一种。

7. 一种制备上述任一权利要求的组合物的方法，所说方法包括：

(1)牛蒡子苷的制备

①粗提

牛蒡子粉碎后，置索氏提取器中，经沸程60-90℃石油醚回流脱脂2-4次，脱脂后取出晾干，用60％-80％的8倍量乙醇回流提取2-4次，每次0.5-2h，于60℃-80℃下减压浓缩，得深褐色浸膏；

②大孔树脂精制

将深褐色浸膏加15-35％乙醇，超声处理15-35分钟，溶解，过滤，调至成浓度为5-7mg/mL的溶液，通过AB-8型大孔吸附树脂，大孔吸附树脂体积为药液体积的1-2倍，流速控制为1.5-2.5BV/h，柱径高比控制为1∶5，水洗3倍树脂体积，水洗速度0.5-3BV/h；再换以4-6BV50％乙醇洗脱，醇洗速度1-3BV/h，收集洗液，浓缩干燥得牛蒡子苷粗品；

③分离

牛蒡子苷粗品用60目粗硅胶拌样，粗硅胶体积为牛蒡子苷粗品的1-2倍，经200-300目硅胶柱析层，硅胶柱体积为牛蒡子苷粗品的10-50倍，氯仿-甲醇95∶1洗脱，薄层色谱跟踪流出液，收集牛蒡子苷单点的流份，合并浓缩，得牛蒡子苷；

(2)牛蒡子苷元制备

①粗提

牛蒡子药材粉碎后，过80目筛，置索氏提取器中，经沸程60～90℃的油醚回流脱脂3次，晾干后用乙酸乙酯回流提取2-4次，每次1.5-2.5h，于70℃下减压浓缩，得褐色浸膏；

②精制

褐色将浸膏用60目粗硅胶拌样，粗硅胶体积为牛蒡子苷元粗品的1-2倍，水浴烘干，干法上样，经200-300目硅胶柱层析，氯仿-甲醇98∶1洗脱，洗脱液浓缩合并得到牛蒡子苷元；

(3)按牛蒡子苷、牛蒡子苷元、药用添加剂和/或药用载体的比例配置混合。

8. 一种如权利要求7的制备方法，其特征在于所说牛蒡子苷的精制为：取牛蒡子苷醇提物，加15-30％乙醇，充分搅拌，超声处理15-30分钟，使其恰恰充分溶解，过滤调至成上样药液浓度为3-6.5mg/mL的溶液，使用AB-8型大孔吸附树脂，大孔吸附树脂体积为药液体积的1-2倍，上样流速控制为2BV/h，柱径高比控制为1∶5。水洗2-3倍树脂体积，水洗速度1-2BV/h；再换以3.5-4.5BV50％乙醇洗脱，醇洗速度1-2BV/h，收集醇洗液，浓缩干燥得牛蒡子粗品。

9. 权利要求1-6的任一组合物所述的用于治疗和预防制备糖尿病性心血管病变的用途，其特征在于，将所述的组合物与其他其它治疗药混合施用，所述的治疗药选自：与牛蒡子苷相同活性的药物、降糖药、抗氧化剂、醛糖还原酶抑制剂、内皮生长因子抑制剂、抗血小板聚集药或它们的混合物。

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