CN116350674B - 一种预防Lewis肺癌早期肺转移的中药组合物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种预防Lewis肺癌早期肺转移的中药组合物及其应用。所述中药组合物包括下列重量份的原料药制备而成：三七3‑18份，西洋参1‑8份，桔梗6‑12份，甘草3‑9份，旋复花10‑20份。该中药组合物配方严谨，药味精简，无毒副作用，可长期服用调理，依从性好，具有调气活血化痰和整体调节肺转移前微环境等功效，可预防Lewis肺癌早期肺转移。

Description

一种预防Lewis肺癌早期肺转移的中药组合物及其应用

技术领域

本发明属于中医药技术领域，具体包含一种预防Lewis肺癌早期肺转移的中药组合物及其应用。

背景技术

研究如何实施早期有效控制肺癌肺转移的方法，已是基础研究人员与临床医生普遍关注的重大科学问题。

“治未病”(预防)是传统医学一直倡导的原则，是控制肿瘤最有效对策，也是最具有成本效益的措施。在治未病理念指导下，研发针对预防转移前微环境形成的药物，对于早期有效预防肿瘤转移、肿瘤治疗关口前移具有重要价值(目前预防转移药物研发领域尚属空白)，进而降低患者病死率、延长患者生存时间具有重要意义。

转移是恶性肿瘤最重要的生物学行为，也是导致肿瘤患者治疗失败的主要因素，但是目前关于肿瘤早期转移的分子机制依旧不明确。转移前微环境(pre-metastaticniche)理念的提出为阐释早期转移形成的分子机制提供了理论研究基础，其中髓系细胞是引起早期转移的关键细胞群。研究认为肿瘤微环境可以改变肿瘤转移的潜能，微观整体性调控肿瘤微环境防治肿瘤越来越受到重视，理论上整体性调节肿瘤微环境应具有广谱、双向、低毒、高效的特点，中药正是由于上述治疗特点常被长期单独应用或者联合应用于肿瘤预防与治疗中。

临床研究表明，中医药防治肿瘤的优势在于有效预防复发转移，并提出应按时间、阶段施治相应的治法治则，但依旧未有相关药物的研发。近年的研究发现，供肿瘤细胞种植的微环境(“土壤”)与肿瘤细胞(“种子”)在肿瘤发生转移过程中起到同等重要的作用。“转移前微环境”概念的建立为更好的研究“土壤”(转移前相对正常的器官组织中的局部环境)在肿瘤转移中的作用提供了理论基础。根据传统中医基础理论，中医的整体观念与微环境(包括转移前微环境)的概念具有宏观与微观方面的一致性。以微环境作为中医药研究重要的功能单位，将整体系统的揭示其作用分子机制，并可以从时间上进行严格限定，并依据进行相应的治则。长期的临床观察与实践发现，调气活血化痰法有良好的抗肿瘤转移效果，但既往的研究多集中在生活质量改善、肿瘤大小及对荷瘤机体免疫重塑方面，对于调控肺转移前微环境方面研究较少。因此，亟待提供一种通过调控肺转移前微环境来预防肺癌早期肺转移的中药组合物。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明的第一个目的在于提供一种预防Lewis肺癌早期肺转移的中药组合物。

本发明的第二个目的在于提供一种预防Lewis肺癌早期肺转移的药物。

本发明的第三个目的在于提供一种利用如上所述的中药组合物在制备预防Lewis肺癌早期肺转移药物中的应用。

为实现以上第一个目的，本发明所采用的技术方案包括：

本发明公开一种预防Lewis肺癌早期肺转移的中药组合物，所述中药组合物包括下列重量份的原料药制备而成：

三七3-18份，西洋参1-8份，桔梗6-12份，甘草3-9份，旋复花10-20份。

发明人根据肺的生理特性、肺转移前微环境的特征以及大量的临床实践相结合进行综合分析，提出可以通过调整调气活血化痰的中药组方来调控肺转移前微环境进而实现肺癌的早期控制，这对于癌症的治疗具有重要价值。其具体解释为：气血形成和运行均与肺有密切的关系，从肺的生理功能分析，肺司呼吸、主一身之气，朝百脉、主治节，若肺主一身之气与朝百脉的功能失常，必然导致气的生成和运行的异常，血脉运行不畅，甚则血脉瘀滞，痰浊内生，从而导致各种疾病的发生；长期的临床观察发现，气机失调，痰瘀互结证是癌症患者的主要证型，在肺癌患者出现比例高于其他肿瘤，并且随肿瘤进展，气虚痰瘀互结证所占比例明显增高，可以分析得出气机失调，痰瘀互结是肿瘤转移早期及发生进展过程中的一种重要病理状态；中医临床针对不同阶段的肿瘤特点提出了相应的治则治法，如扶正培本法，活血化瘀法，化痰解毒法等，并在此基础上对不同治则治法干预不同肿瘤微环境的作用机制进行了深入探讨。经过大量实验研究，发明人将调气与活血化痰两大法则有机结合，对于改善机体免疫功能、改善内分泌、改善血液流变及微循环等多方面具有综合作用，从而调控肺转移前微环境，改善气虚血瘀证的病理基础，这对于抑制肿瘤的发展、提高抗肿瘤疗效具有十分重要的意义。

上述中药处方中各药材的功能主治如下：

三七：为五加科植物三七的干燥根，性味甘、微苦，温，归肝、胃经，具有祛瘀通络，活血养血，止痛散结之功效，祛邪不伤正，被誉为“理血妙品”。主治出血证，跌打损伤，瘀血肿痛。

西洋参：是五加科、人参属多年生草本植物，性味甘、微苦，寒。归心、肺、肾经，具有滋阴补气、生津止渴、除烦躁、清虚火、扶正气、抗疲劳的功效。

桔梗：味苦、辛，性平。归肺经，具有宣肺祛痰，利咽，排脓，能浮而治上焦，升提肺气，为众药之舟楫也。

甘草：生甘草味甘，性平，归心、肺、脾、胃经。具有补脾益气，清热解毒，祛痰止咳的功效。

旋复花：性味甘，微温，冷利，入肺、肝、胃经，治疗胸中痰结，胁下胀满，咳喘，呃逆，唾如胶漆，心下痞鞕，噫气不除，大腹水肿。

本方的方解如下：

中医认为肺转移由肺主一身之气、朝百脉、主治节等调气、血津液功能失常及宣发肃降的生理特性失调引起肺转移前微环境失衡引起。肺气不足、肺失宣降则见气短、咳嗽、乏力；肺主治节，津液运行失调，凝聚成痰，则见咳痰；宣降失调，气机阻滞则见胸胁不舒或胀痛，肺朝百脉，调节全身血液运行，其失调导致血瘀，则见刺痛，甚者见唇紫，舌质暗；治疗以调气为本，活血化痰治标，标本兼顾。方中三七具有人参皂苷Rb1、Rh1、Rg3、Rh2、Rd1和三七皂苷R1等多种活性成分，具有高效性、低毒性、多靶点抗肿瘤的优势，能够直接抑制肿瘤细胞增殖，还可促进肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞转移、提高免疫等途径发挥抗肿瘤作用，为君药；西洋参可以补肺一身之气，调百脉瘀滞，与三七相合共凑益气活血之功效，同时西洋参与三七所含化学成分具有相似性，主要含有的活性成为皂苷类成分，具有抗肿瘤和调节免疫的作用，为臣药；桔梗皂苷具有良好的体外抗肿瘤活性。旋覆花性味苦辛咸微温，归肺胃经，有降气平喘、降逆，止呕的作用；旋覆花主降，桔梗主升，两药提、降并举，调上焦肺气之枢纽，二药相合共凑调气化痰，活血通络之功，为佐药。甘草调和诸药之功效，为使药。

诸药合用，补肺益气，调节百脉之血瘀，恢复肺宣发肃降的生理特性，共凑调气活血化痰之功效，整体调节肺转移前微环境，用于预防Lewis肺癌早期肺转移。

进一步，所述中药组合物包括下列重量份的原料药制备而成：

三七6-18份，西洋参3-8份，桔梗6-12份，甘草6-9份，旋复花10-20份。

进一步，所述中药组合物包括下列重量份的原料药制备而成：

三七6份、西洋参3份、桔梗12份、甘草6份、旋复花20份。

进一步，所述中药组合物包括下列重量份的原料药制备而成：三七3份、西洋参1份、桔梗9份、生甘草3份、旋复花10份。

进一步，所述中药组合物包括下列重量份的原料药制备而成：三七6份、西洋参2份、桔梗6份、生甘草6份、旋复花15份。

为实现以上第二个目的，本发明所采用的技术方案包括：

本发明公开一种预防Lewis肺癌早期肺转移的药物，所述药物以上所述的中药组合物为活性成分。

进一步，所述药物还包括药学上可接受的辅料。药学上可接受的辅料包括但不限于，填充剂、崩解剂、润滑剂、助悬剂、粘合剂、甜味剂、矫味剂、防腐剂等。

进一步，所述药物的剂型包括煎剂、散剂、颗粒剂、滴丸剂、片剂、胶囊剂、口服液、膏剂或汤剂。

为实现以上第三个目的，本发明所采用的技术方案包括：

本发明公开一种利用如上所述的中药组合物在制备预防Lewis肺癌早期肺转移药物中的应用。

进一步，所述中药组合物通过调气和活血化痰的方式来改善机体免疫功能、内分泌、血液流变以及肺转移前微环境，进而预防Lewis肺癌早期肺转移。

本发明有益效果：

本发明提供的中药组合物配方严谨，药味精简，无毒副作用，可长期服用调理，依从性好。

该中药组合物的功能主治为调气活血化痰，整体调节肺转移前微环境，可用于预防Lewis肺癌早期转移，肺癌术后患者，可治疗疾病引发的咳嗽、咳痰，气短，乏力，胸胁痞满不舒或胀痛、刺痛，唇紫，舌质暗，苔白腻或者薄白，脉涩、滑等症。

附图说明

图1示出动物实验中不同药物在预防Lewis肺癌肺转移的效果图。

图2示出动物实验中不用剂量下中药组合物对小鼠LLC肿瘤生长的影响。

图3示出动物实验中GFP⁺LLC细胞移植后肺转移前微环境形成和生物标志物表达的鉴定。

图4示出动物实验中模型组和中药组在延缓体内肺转移发生的对比图。

图5示出动物实验中对照组、模型组、中药组在降低体内肺转移前微环境标记物表达中的对比。

图6示出动物实验中单细胞测序中该中药组合物对细胞群组间差异分析。

图7示出动物实验中ELISA检测GFP⁺LLC细胞移植后第14天，正常组、中药组和对照组(n＝6)血液中因子GM-CSF、TGF-β、TNF-α、VEGF对比图。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。应当明确，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

所述中药组合物由下列重量份的原料药组成：三七6份、西洋参3份、桔梗12份、甘草6份、旋复花20份。

按照上述药物份数称取并煎煮成膏制粒，即可。

实施例2

所述中药组合物包括下列重量份的原料药制备而成：

三七3份、西洋参1份、桔梗9份、生甘草3份、旋复花10份。

按照上述药物份数称取并煎煮成膏制粒，即可。

实施例3

所述中药组合物包括下列重量份的原料药制备而成：

三七6份、西洋参2份、桔梗6份、生甘草6份、旋复花15份。

按照上述药物份数称取并煎煮成膏制粒，即可。

实施例4：动物实验

目前由于微小转移临床及动物实验难以监测，发明人通过建立Lewis肺癌小鼠模型转移前模型，用于评估中药早期预防肺癌肺转移的疗效。小鼠肺癌Lewis细胞系应用于转移瘤的研究，Lewis肺癌为一株恶性程度较高的自发性肺内未分化上皮样癌，受体鼠为C57BL/6。移植于皮下、肌肉或者足趾等特定部位，随后肿瘤细胞开始侵袭周围的正常组织和血管，继之癌细胞进入血液循环转运至靶器官，粘附于血管壁上并穿过血管，癌细胞增殖成集落，最后形成转移瘤。

1研究方法

1.1药物制备

按照实施例1的方案煎煮成膏制粒，按照人剂量6g/天进行换算，小鼠用药剂量为0.9g/Kg(20g小鼠每天服药18.02mg)，经前期实验观察：C57BL/6小鼠每天进食量为2-6g，按平均4g/天计算，将药物粉末与饲料混合制备不同剂量的小鼠含药饲料。

1.2建立绿色荧光蛋白(GFP)转染的Lewis肺癌细胞系

使用Invitrogen公司Lippo2000标准程序将p-GPU6-GFP-Neo siRNA vector转染进Lewis肺癌细胞系(由中国医学科学院基础医学研究所提供)，用1000ug/ml G418筛选2周后，改用500ug/ml浓度维持筛选压力，培养皿中细胞满90％时，用流式细胞仪筛选出GFP表达强阳性的10％细胞，如此筛选重复3次，建立100％GFP强阳性的稳定转染细胞系(LLC细胞)。

1.3Lewis肺癌肺转移造模

GFP⁺标记的Lewis肺癌动物模型：从液氮中复苏GFP⁺标记的Lewis肺癌，培养于含10％胎牛血清及青霉素100IU/ml，链霉素100IU/ml的高糖DMEM(GIBCO公司产品)完全培养液中。待细胞处于对数生长期时，取2*10⁶个GFP⁺标记的Lewis肺癌细胞在小鼠左侧背部肩胛骨部位进行皮下注射，建立GFP⁺标记的Lewis肺癌荷瘤小鼠模型。

1.4肺转移前微环境模型的评价及建立

根据文献报道，Lewis肺癌小鼠自接种肿瘤细胞后16-18天出现肺部转移，由于细胞状态、接种手法不同可能影响转移时间，前期课题研究表明：14天时在肺脏中未发现肺癌细胞，实验将该时间点定为小鼠肺转移前微环境。因而此实验干预时间为接种GFP⁺标记的Lewis肺癌细胞后的14天，便于观察干预肺转移前微环境对肺转移的影响。本实验采用GFP⁺标记的Lewis肺癌细胞接种建立荷瘤肺癌小鼠模型，进一步通过下列实验确定GFP⁺标记的Lewis肺癌细胞到达肺脏的时间。

1.5分组

6～8周龄的SPF级C57BL/6雄性小鼠，体重20±2g。所有动物适应性喂养1周之后，采用随机数字表分为3组(空白组，模型组，中药组)，每组10只动物。

1.6给药

药物给药时间：按前期实验证实的转移前微环境的时间点：即接种GFP⁺标记的Lewis肺癌细胞后的14天。1)空白组：正常饲料喂养。2)模型组：接种GFP⁺标记的Lewis肺癌细胞的小鼠模型后，即可给予正常饲料喂养。3)中药组：接种GFP⁺标记的Lewis肺癌细胞的小鼠模型后，即可给予含有实施例1配方的中药颗粒的饲料喂养。

2指标检测

①测定各组小鼠体重、瘤体大小、肺转移率；

②摄食量：各组小鼠每日饲料称重，测量每笼动物每日摄食量。

③瘤体大小(GFP⁺标记的Lewis肺癌细胞的整体光密度值)：活体生物体内成像技术(小动物体内可见光快速成像系统，IVIS LuminaⅡ，Caliper)检测荷瘤小鼠实体瘤大小。GFP⁺标记的Lewis肺癌小鼠接种24小时后于第7、10、14、17、20、21、24、28天进行通过荧光成像系统，动态观察各组荷瘤小鼠肿瘤大小，评价GFP⁺标记Lewis肺癌细胞的情况及不同药物干预的疗效，并在14d后观察GFP⁺标记的Lewis肺癌到达肺脏的时间及含量。

④荧光酶标仪高通量精准检测GFP⁺标记的Lewis肺癌到达肺脏的时间及含量：各组于第14、17、20、23、26、29、33、35天收集肺单细胞悬液、分别加入黑色96孔板中，每个样品设置5个复孔，每个样本加入100μL，再加入50mmol/L Tris-HCl(pH＝10)补平到总体积为200μL。采用ELX多功能酶标仪在激发光波长483nm、发射光波长535nm下使用读取样品的荧光强度，用i-Control软件优化增益值自动调节荧光强度的范围，计算GFP⁺标记的Lewis肺癌细胞含量

⑤单细胞测序检测肺转移前微环境中与转移相关髓系细胞的变化：干预14天结束后即收集肺单细胞悬液，单细胞检测其细胞比例。

⑥检测转移相关分泌的相关因子：干预14天结束后即收集肺组织，利用免疫组化检测各组肺转移前微环境中MMP9、Fibronectin、Lox、Versican的蛋白表达水平。

⑦检测各组肺转移前微环境相关的特异性TDSFs：干预14天结束后即眼球取血收集血液，ELISA法检测各组血液中的G-CSF、VEGF、TNF-α及TGF-β的表达水平。

3统计学分析

统计学分析用SPSS22.0统计软件进行单因素方差分析(One-Way ANOVA)，组间比较采用LSD-t检验，P<0.05表示有统计学差异。

4研究结果

4.1本研究的中药组合物与临床常用的抗肿瘤中成药在预防Lewis肺癌肺转移作用。

在肺癌肺转移模型上给予消癌平分散片0.81g/kg，自移植瘤建立后，给药持续14天。康莱特胶囊组：在肺癌肺转移模型上给予康莱特1.2g/kg，自移植瘤建立后，给药持续14天。威麦宁胶囊：在肺癌肺转移模型上给予康莱特1.05g/kg，自移植瘤建立后，给药持续14天。中药组合物：在肺癌肺转移模型上给予实施例1中药组合物0.9g/kg，自移植瘤建立后，给药持续14天。于21d后取肺行HE染色确定转移；从图1中可以看出，中药组合物可以预防转移，也可显著减轻转移相关的炎症，显示出优于消癌平、康莱特、威麦宁的预防肺转移的疗效，而消癌平不能预防肺癌肺转移；康莱特与威麦宁可以看到预防肺转移的效果，但在抑制转移相关炎症效果不明显。

4.2中药组合物对Lewis肺癌肺转移作用最佳剂量的研究

为了确定抑制转移而不直接抑制移植瘤生长的中药组合物剂量，选择了0.018g/d、0.18g/d和0.36g/d作为剂量范围，并通过体内生物发光成像监测肿瘤生长。图2中A为不同浓度中药组合物对肿瘤生物发光信号，图2中B为第10天、第14天、第17天肿瘤定量生物发光信号(光子/秒/cm²/sr)的幅度变化(****P<0.0001)，从图2中发现0.18g/d的剂量是有效的，0.36g/d组小鼠出现腹泻和食欲不振的症状，更重要的是，0.36g/d的剂量并没有表现出明显更强的抑制效果。

4.3预防肺癌肺转移模型的建立

首先，用苏木精和伊红染色确定了肿瘤细胞到达荷瘤小鼠肺部的时间点。图3中A为GFP⁺LLC细胞移植后第14天、17天和20天肺切片代表性苏木精和伊红(HE)染色和绿色荧光蛋白(GFP)荧光图像(200×magnification)，LLC细胞移植后第14天肺内未见转移灶，但在移植后第17天和第20天观察转移明显。因此，我们认为移植后第14天是PMN建立的时间点。图3中B为GFP⁺LLC细胞移植后14、17、20、23、26、29、33、35天收集的肺单细胞悬液数据图，按以下公式计算相对荧光强度:

相对荧光强度＝(模型组肺单细胞悬液荧光强度-对照组肺单细胞悬液荧光强度)/对照组肺单细胞悬液荧光强度。

图3中B显示GFP⁺标记的Lewis肺癌细胞含量不断增加，说明第14天是PMN建立的时间点，作为监测和用药的时间点，自移植瘤接种第17d开始，肺内开始出现GFP⁺标记的Lewis肺癌细胞，说明微转移的逐渐形成。

随后检测了PMN标记物纤维连接蛋白、MMP9、verican和LOX的表达来评估PMN的建立，见图3中C。与对照组相比，免疫组化显示移植后第14天阳性染色(棕色)细胞数量更多，表明PMN标记物水平更高。

4.4中药组合物预防肺转移的发生

使用荧光显微镜来确定该中药组合物是否可以延缓肺转移的发生，参见图4。GFP⁺LLC细胞分别在模型组和中药组移植后第17天和第20天首次在小鼠肺组织中发现。移植后第17天至第35天，中药组肺组织中GFP⁺LLC细胞明显少于对照组，第17、20、23、26、29、32、35天p值分别为0.0001、0.0792、0.0178、0.011、0.0465、0.0001、0.0002。此外，与对照组相比，中药组在移植后第35天显著减少了肺转移灶的数量(5.2±0.8vs.13.1±2.2,p<0.05)。

4.5中药组合物可以降低肺转移前微环境关键标记物

通过监测肺转移前微环境模型中PMN标记物的表达水平来评估中药组合物的疗效，参见图5，发现中药组MMP9和versican水平显著降低(P<0.05)，但纤维连接蛋白和LOX水平变化不显著。与正常组相比，对照组所有四个PMN标记物均升高(P<0.01)，说明中药组合物可降低体内肺转移前微环境标记物的表达。

4.6中药组合物可以降低肺转移前微环境中促进肺转移相关细胞

将制备完成的肺单细胞悬液进行单细胞测序，结果如下：

细胞组成成分分析：小鼠肺组织被分成11个主群，分别为B细胞、T细胞、NK细胞、巨噬细胞、中性粒细胞等进行组间差异分析，参见表1和图6，组间差异分析显示，在肺泡细胞、B细胞、T细胞、中性粒细胞等细胞群内，中药组对模型组具有显著差异。各组小鼠T细胞亚分群结果显示，中药组合物能够降低抑制性T细胞(分群6)，升高辅助性T细胞(分群4)。

表1

4.7中药组合物可以降低转移相关的肿瘤相关源性因子

通过ELISA分析了中药组合物对体内TNF-α、VEGF GM-CSF和TGF-β血药水平的影响。与对照组相比，模型组在LLC细胞移植后第14天血液中GM-CSF和TGF-β水平升高(p<0.05)。此外，与对照组相比，在LLC细胞移植后第14天，中药组小鼠血液中的GM-CSF和TGF-β水平显著降低(图7，p<0.01)。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims (7)

1.一种预防Lewis肺癌早期肺转移的中药组合物，其特征在于，所述中药组合物由下列重量份的原料药制备而成：

三七6-18份，西洋参3-8份，桔梗6-12份，甘草6-9份，旋复花10-20份。

2.根据权利要求1所述的中药组合物，其特征在于，所述中药组合物由下列重量份的原料药制备而成：

三七6份、西洋参3份、桔梗12份、生甘草6份、旋复花20份。

3.一种预防Lewis肺癌早期肺转移的药物，其特征在于，所述药物以权利要求1-2任一项所述的中药组合物为活性成分。

4.根据权利要求3所述的药物，其特征在于，所述药物还包括药学上可接受的辅料。

5.根据权利要求3所述的药物，其特征在于，所述药物的剂型包括散剂、颗粒剂、滴丸剂、片剂、胶囊剂、口服液、膏剂或汤剂。

6.一种如权利要求1-2任一项所述的中药组合物在制备预防Lewis肺癌早期肺转移药物中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述中药组合物通过调气和活血化痰的方式来改善机体免疫功能、内分泌、血液流变以及肺转移前微环境。