KR20120044451A

KR20120044451A - 권백 추출물을 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20120044451A
Application number: KR1020100105727A
Authority: KR
Inventors: 마진열; 심기석; 이윤희; 최성업; 김동선; 이재훈
Original assignee: 한국 한의학 연구원
Priority date: 2010-10-28
Filing date: 2010-10-28
Publication date: 2012-05-08
Also published as: KR101242635B1

Abstract

본 발명은 골다공증 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 권백 추출물을 유효성분으로 함유하는 골다공증 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강식품에 관한 것이다. 본 발명의 권백 추출물을 포함하는 조성물은 파골세포 분화 및 관련 유전자 발현의 억제 효과가 뛰어나므로, 골다공증의 예방 및/또는 치료용으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

권백 추출물을 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 조성물{Composition for Prevention or Treatment of Osteoporosis Comprising Extract of Selaginellae Herba}

본 발명은 골다공증 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 권백 추출물을 유효성분으로 함유하며, 골다공증 예방 및/또는 치료용으로 유용하게 사용될 수 있는 조성물에 관한 것이다.

생물의 뼈조직은 파골세포에 의한 뼈흡수와 조골세포에 의한 뼈형성이 계속적으로 반복되어 동적인 평형 상태를 유지하고 있으며, 두 작용의 상대적인 균형에 의해 뼈의 항상성이 유지된다. 하지만, 비정상정인 파골세포의 생성이나 활성의 증가는 뼈의 리모델링에 불균형을 초래하여 골다공증과 같은 여러 가지 뼈 관련 질환을 유발한다. 따라서, 파골세포의 분화와 활성을 조절하는 연구가 골다공증 치료제 개발을 위한 연구로 주목받고 있다(Rodan and Martin, 2000, Science, 289:1508-1514; Boyle et al., 2003, Nature, 423:337-342). 파골세포는 단핵백혈구/대식세포로 단핵구 전구 세포에서 파골세포로 분화되어 뼈를 흡수하는 기능을 한다. RANKL (Receptor activator for nuclear factor κB (NF-κB) ligand)은 TNF-수퍼패밀리의 일원으로서 파골세포 분화 과정의 조절과 분화된 파골세포의 성장에 중요한 인자이다. RANKL이 이것의 수용체인 RANK에 결합하면 TRAF 6 (tumor necrosis factor receptor-associated factor 6)을 활성화시키고, TRAF 6는 다시 MAP (mitogen-activated protein) 키나제, 전사 인자인 NF-kB, AP-1, 및 NFATc1의 활성을 연속적으로 유도한다. 이 전사인자들은 파골세포 분화 및 파골세포의 골흡수 기능과 연관된 유전자들의 조절에 필수적이며 중요한 역할을 한다(Takayanagi et al., 2002, Dev Cell, 3:889-901; Boyle et al., 2003, Nature, 423:337-342).

골다공증은 골 흡수가 골 형성보다 항진됨으로서 골리모델링의 평형이 무너져 유발되는 질병으로, 골 조직의 석회가 감소되어 뼈의 치밀질이 엷어지고 그로 인해 골수강(骨髓腔)이 넓어지게 되며, 증세가 진전됨에 따라 뼈가 약해지기 때문에 작은 충격에도 골절되기 쉽다. 골다공증의 원인으로는 노령, 운동 부족, 저체중, 흡연, 저칼슘 식이, 폐경, 난소 절제 등이 알려져 있는데, 특히 여성의 경우 30세 이후부터 골 감소가 지속적으로 진행되며, 폐경기에 이르면 호르몬의 변화에 의해 골 감소가 급격히 진행된다. 즉, 골다공증은 정도의 차이는 있으나 노년층, 특히 폐경기 이후의 여성에게 있어서는 피할 수 없이 나타나는 증상으로, 선진국에서는 인구가 노령화됨에 따라 골다공증 및 그 치료제에 대한 관심이 점차 증가되고 있다. 골다공증은 크게 3가지 유형으로 나눌 수 있는데, 첫째는 원인불명(idiopathic)의 골다공증, 둘째는 폐경기 이후 여성호르몬 부족에 의해 나타나는 타입 Ⅰ 골다공증, 셋째는 고령화된 노인층의 남녀에게 발견되는 타입 Ⅱ 골다공증이다.

현재 사용되고 있는 골다공증 치료제는 대부분 에스트로겐 계통의 물질로서, 이들은 장기 투여할 경우 암, 담석, 혈전증 등의 부작용이 나타나는 문제점이 있다. 골다공증은 약물의 단기 투여만으로는 치료할 수 없고 장기 투여가 필수적인 질환이므로, 약물을 장기 투여할 때에도 상기와 같은 부작용이 없고 에스트로겐을 대체할 수 있을 만큼 우수한 약효를 갖는 새로운 물질의 개발이 요구되고 있다. 따라서, 콩 및 콩 가공품 등 식품에 함유된 제니스테인(genistein)이나 다이드제인(daidzein) 등의 피토에스트로겐(phytoestrogen)을 응용하여 장기간 복용할 수 있고 상대적으로 부작용이 적은 골다공증 예방 및 치료제를 개발하고자 많은 연구가 진행 중이다.

식물성 호르몬인 피토에스토로겐은 생체이용률은 비교적 낮으나 에스트로겐 수용체-α (ER-α) 및 에스트로겐 수용체-β (ER-β)에 대한 친화력이 좋고 유방암 등의 부작용이 적어 골다공증 치료제인 Estradiol의 대체 의약품으로 각광받고 있다. 피토에스트로겐으로 알려진 물질로는 다이드제인, 제니스테인, 포르모노네틴(formononetin), 비오카닌 A (biochanin A) 등의 이소플라본(isoflavone)류 화합물, 쿠메스트롤(coumestrol) 등의 쿠메스탄(coumestan)류 화합물, 엔테로락톤(enterolactone) 등의 리그난(lignan)계 화합물 및 엔테로디올(enterodiol) 등의 페놀(phenol)계 화합물이 있다. 상기 화합물들 중 당 화합물은 장내 박테리아의 β-글루코시다제(glucosidase) 또는 위산에 의해 가수분해되어 결국 비배당체 형태인 유리(free) 이소플라본으로 흡수된다.

한편, 권백은 혈뇨 억제 및 치질을 치료하는 효능이 있는 것으로 알려진 전통 허브 약제이다(정보섭, 1990, 생약대사전, 영림사, 서울, pp.88-89). 현대에 밝혀진 다양한 권백의 약리 효능으로는 염증유발 사이토카인의 생성 억제에 의한 항염증 효능(Kuo et al., 1998, J. Lab. Clin. Med., 132(1):76-85), 종양 억제 인자인 p53의 유전자 발현 증가 유도에 의한 항위암 효능(Lee et al., 1999, Cancer Lett, 144(1):93-99), NO 생성 억제를 통한 비항균성 항여드름 효과(Joo et al., 2008, Phytother Res, 22:335-339) 등이 보고된 바 있다. 하지만, 아직까지 권백이 파골세포 분화를 억제하여 골다공증의 완화 또는 치료에 사용될 수 있음을 보여주는 종래문헌은 알려져 있지 않다.

본 발명은 권백 추출물을 함유하는 골다공증 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 권백 추출물을 유효성분으로 함유하는 골다공증 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 권백 추출물을 제조함에 있어서, 추출용매로는 물을 사용하는 것이 일반적이지만, 필요에 따라 물 이외에 다른 유기용매를 사용해도 무방하다. 사용될 수 있는 유기용매로는 C₁ 내지 C₄의 저급 알코올, 아세톤, 또는 이의 수용액 등을 들 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 권백 추출물을 제조하기 위해서는 권백에 2?20배량의 추출용매, 바람직하게는 물을 가한 후 70 내지 100℃에서 열수 추출한 수추출물을 제조한다. 이때, 상기 권백을 0.5 내지 5시간 동안 추출용매에 침적시킨 후 추출 과정을 수행하는 것이 바람직하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 권백 추출물은 임상 투여시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 즉, 본 발명의 권백 추출물은 실제 임상 투여시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 권백 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제, 연고, 크림제 및 경피제제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다. 또한, 골다공증 예방 또는 치료 효능 증진을 위해 칼슘이나 비타민 D₃를 추가로 첨가할 수 있다.

또한, 상기 권백 추출물은 여러 한의학 처방들, 예를 들면, 가감속명탕(加減續命湯), 갈근(葛根), 갈근귤피탕(葛根橘皮湯), 갈근맥문동산(葛根麥門冬散), 갈근죽여탕(葛根竹茹湯), 갈근탕(葛根湯), 갈근해기탕(葛根解肌湯), 갈출탕(葛朮湯), 갈황환(葛黃丸), 지각자산(枳殼煮散), 당귀백출탕(當歸白朮湯), 맥문동음자(麥門冬飮子), 발운탕(撥雲湯), 방풍탕(防風湯), 백출산(白朮散), 사물해기탕(四物解肌湯), 사위탕(瀉胃湯), 산종궤견탕(散腫潰堅湯), 삼두해정탕(三豆解湯), 삼양탕(三陽湯), 생갈근즙(生葛根汁), 소풍순기탕(疏風順氣湯), 승마갈근탕(升麻葛根湯), 승마부자탕 (升麻附子湯), 승마위풍탕(升麻胃風湯), 승양보위탕(升陽補胃湯), 시호승마탕(柴胡升麻湯), 시호조경탕(柴胡調經湯), 신달탕(腎疸湯), 신선불취단(神仙不醉丹), 신성산(神聖散), 신효명목탕(神效明目湯), 십신탕(十神湯), 여택통기탕(麗澤通氣湯), 연교승마탕(連翹升麻湯), 영선제통음(靈仙除痛飮), 옥설탕(沃雪湯), 온폐탕(溫肺湯), 익기총명탕(益氣聰明湯), 익지화중탕(益智和中湯), 인삼청기산(人蔘淸肌散), 인진사황탕(茵蔯瀉黃湯), 일보일발단(一補一發丹), 자음청위환(滋陰淸胃丸), 전생활혈탕(全生活血湯), 정력산(散), 조중탕(調中湯), 지갈탕(止渴湯), 지유산(地楡散), 진교승마탕(秦교升麻湯), 청양탕(淸陽湯), 청열해기탕(淸熱解肌湯), 충화순기탕(沖和順氣湯), 취향보설(醉鄕寶屑), 통치백물독일방(通治百物毒一方), 평위지유탕(平胃地楡湯), 평혈음(平血飮), 해백물독일방(解百物毒一方), 해소주독일방(解燒酒毒一方), 해약중독(解藥中毒), 해주화독산(解酒化毒散), 해채소독일방(解菜蔬毒一方), 해파두독방(解巴豆毒方), 홍설통중산(紅雪通中散) 등에도 첨가되어 사용될 수 있다.

투약 단위는, 예를 들면 개별 투약량의 1, 2, 3 또는 4배로, 또는 1/2, 1/3 또는 1/4배로 함유할 수 있다. 개별 투약량은 유효 약물이 1회에 투여되는 양을 함유하며, 이는 통상 1일 투여량의 전부, 1/2, 1/3 또는 1/4배에 해당한다.

본 발명의 권백 추출물의 인체 투여량은 체내에서의 활성성분의 흡수도, 불활성화율 및 배설속도, 환자의 연령, 성별, 상태, 질병의 정도 등에 따라 적절히 선택되며, 성인에게 (10?300 ㎎/㎏)이고, 바람직하기로는 (20?100 ㎎/㎏)이며, 하루 1 내지 6회 나누어 투여될 수 있다.

본 발명의 조성물을 마우스에 경구 투여시 및 복강내 투여시의 독성 실험을 수행한 결과, 경구 독성시험에 의한 50% 치사량(LD₅₀)은 적어도 (5 g/㎏) 이상인 안전한 물질로 판명되었다.

본 발명의 한 구현예에 따르면, 권백 추출물은 세포 독성을 나타내지 않을 뿐만 아니라(도 1 참조), 권백 추출물을 처리하면 파골세포 분화 관련 마커인 TRAP 활성과, 다핵성 파골세포의 형성이 유의성 있게 감소한다(도 2 참조).

또한, 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 권백 추출물 처리시 대표적인 파골세포 분화 관련 유전자들의 발현 및 이들의 발현을 조절하는 전사 인자의 발현도 유의성 있게 감소하는 효과를 얻을 수 있다(표 2 및 표 3 참조).

또한, 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 권백 추출물은 파골 세포 분화의 신호전달에 참여하는 것으로 알려져 있는 ERK, JNK, p38의 활성 증가를 억제시킨다(도 3 참조)(Lee and Kim, 2003, BBRC, 305:211-214).

또한, 본 발명은 권백 추출물을 유효성분으로 함유하는 골다공증 예방 또는 치료용 건강식품을 제공한다.

본 발명의 권백 추출물은 골다공증 개선을 목적으로 건강식품에 첨가될 수 있다. 상기 권백 추출물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 권백 추출물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에는 권백 추출물이 원료에 대하여 30 중량% 이하, 바람직하게는 10 중량% 이하의 양으로 첨가된다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

본 발명의 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물에는 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토오스, 수크로오스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올이 있다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 권백 추출물 100 ㎖당 일반적으로 약 0.01?0.04 g, 바람직하게는 약 0.02?0.03 g 이다.

상기 외에도 권백 추출물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 권백 추출물은 천연 과일주스, 과일주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 권백 추출물 100 중량부 당 0.01?0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 권백 추출물은 파골세포 분화 및 관련 유전자 발현의 억제 효과가 뛰어나므로 골다공증의 예방 및/또는 치료용으로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 권백 추출물(SH)의 세포 독성을 보여주는 그래프이다.
도 2는 권백 추출물(SH)이 각각 RAW264.7 세포에서 RANKL에 의해 유도된 TRAP 활성(A)과 TRAP-양성 다핵성 파골세포의 형성(B)에 미치는 효과를 보여주는 그래프 및 사진이다.
도 3은 권백 추출물(SH)이 RAW264.7 세포에서 RANKL에 의해 유도된 MAP 키나제의 활성에 미치는 영향을 보여주는 웨스턴 블롯 전기영동 사진이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 권백 추출물의 제조

권백 50.06 g을 생수 1 ℓ에 넣고 1시간 동안 침적한 후, 대웅약탕기(Daewoong Extractor DWP-5000M, Incheon, Korea)를 이용하여 4시간 동안 추출하였다. 이후, 상기 추출물을 표준 시험용 체(106 ㎛, Retsch, Haan, Germany)를 이용하여 여과한 후 최종 100 ㎖이 되도록 하였다. 이를 동결 건조하여 2.8154 g(수율: 5.62%)의 권백 추출물을 얻었고, 사용하기 전까지 4℃에 보관하였다.

실시예 2. 세포 독성 측정

실시예 1에서 제조한 권백 추출물의 세포 독성을 측정하기 위하여, 96-웰 플레이트에 1,000 세포/웰이 되도록 RAW264.7 세포(TB-71, ATCC, UT, USA)를 분주하여 24시간 동안 배양한 후, 권백 추출물을 농도별(50, 100, 200, 400 ㎍/㎖)로 처리하고 3일 동안 배양하였다. 권백 추출물의 세포 독성은 CCK-8 키트(Dojindo Molecular Technologies, Rockville, MD, USA)를 사용하여 측정하였다.

4가지 농도(50, 100, 200, 400 ㎍/㎖)의 권백 추출물을 RAW264.7 세포에 처리한 후 3일 동안 배양한 결과, 최고 농도(400 ㎍/㎖)까지 RAW264.7 세포 성장에 영향을 주지 않았다(도 1). 따라서, 상기 농도 범위 내에서 TRAP 활성과 파골세포 분화 관련 유전자의 발현 변화를 조사하였다.

실시예 3. 권백 추출물이 파골세포 분화에 미치는 영향

단핵구 세포인 RAW264.7 세포(TB-71, ATCC, UT, USA)는 RANKL(R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA) 처리시 파골세포 분화의 마커인 TRAP 활성의 증가를 보이며 파골세포로 분화한다(Minkin, 1982, Calcif Tissue Int.,34(3):285-90; Hsu et al., 1999, Proc.Nat.Acad.Sci. USA, 96:35403545). RAW264.7 세포의 성장 배지로 10% FBS가 포함된 DMEM(Invitrogen Inc., NY, USA) 배지를 사용하였으며, 2일 간격으로 새로운 배지로 교체하며 배양하였다. 파골 세포 분화를 유도하기 위하여 RAW264.7 세포가 70% 정도 자라면 스크랩퍼로 세포를 긁어 배양 플레이트에서 분리하고, 이를 96-웰 플레이트에 1,000 세포/웰이 되도록 분주하였다. 이 때 세포를 부유시키는 세포 분화 배지로 100 ng/㎖의 RANKL과 10% FBS가 포함된 α-MEM (Invitrogen Inc., NY, USA)을 사용하였으며, RANKL이 포함된 분화 배지에서 세포를 4일 동안 배양하였다

시험 물질 처리 4일째에 TRAP 활성을 측정하였고, TRAP 양성의 다핵성 파골세포 형성을 확인하는 TRAP 염색을 실시한 후, 현미경으로 다핵성 파골세포를 확인하였다. 이를 위하여, RANKL로 분화된 파골세포를 10% 포르말린에서 10분 동안 고정시킨 후, 95% 에탄올로 탈수시키고, 상온에서 건조시켰다. 이후, 염색 키트(Leukocyte Acid Phosphatase Kit 387-A, Sigma, MO, USA)를 사용하여 분화배지에서 배양한 RAW264.7 세포를 TRAP 염색하였다. 분화된 다핵성 파골세포는 eXcope(DIXI Optics, Seoul, Korea)가 장착된 현미경(Olympus Optical Co. Ltd., Tokyo, Japan)으로 관찰하였다. TRAP 활성 측정을 위하여, 상기에서 고정한 파골세포가 든 플레이트에 10 mM 나트륨 타르트레이트, 5 mM p-니트로페닐포스페이트(Sigma, MO)가 들어간 100 ㎕의 시트레이트 버퍼(50 mM, pH 4.6)를 첨가한 후 1시간 동안 37℃에서 배양하였다. 이후, 새로운 96-웰 플레이트에 90 ㎕의 효소 반응액을 옮기고, 이 효소 반응액을 동일량의 0.1 N NaOH와 혼합한 후, 410 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. TRAP 활성은 대조군 대비 %로 환산하여 나타내었다.

RAW264.7 세포에 권백 추출물을 농도별로 4일 동안 첨가하여 배양한 결과, 권백 추출물은 200 ㎍/㎖ 농도에서부터 RANKL에 의해 유도되는 TRAP 활성(도 2의 A) 및 다핵성 파골 세포의 형성(도 2의 B)을 유의성 있게 억제하였다. 파골세포의 분화를 억제한다고 알려진 phosphatidylinositol 3-kinase 억제제 LY294002(Lee et al., 2002, Bone, 30:717-717)를 양성대조물질로 사용하였고, LY294002를 RAW264.7 세포에 4일 동안 첨가하여 배양한 결과, RANKL에 의해 유도되는 TRAP 활성(도 2의 A)을 유의성 있게 억제하였다.

실시예 4. 권백 추출물이 전사 인자 및 파골세포 분화 관련 유전자에 미치는 영향

TRAP 염색과 활성을 억제하는 권백 추출물이 파골세포 분화 관련 유전자인 TRAP, c-Src, Cathepsin K, MMP-9 및 ATP6v0d2의 발현과 이들의 발현 조절에 관여하는 전사 인자인 c-fos, Fra-1, Fra-2 및 NFATc1의 발현에 미치는 효과를 확인하기 위하여 실시간 정량 PCR (real time quantitative PCR)을 수행하였다. 전사인자의 발현 확인을 위한 RNA는 권백 추출물을 2시간 동안 전처리하고 RANKL을 처리하고 24시간 후에 분리하였다. 파골세포 분화 관련 유전자 발현 확인을 위한 RNA는 RANKL을 처리하고 24시간 후에 권백 추출물을 3일 동안 처리하고 분리하였다. 총 RNA는 RNeasy 미니 키트(Qiagen, Valencia, CA, USA)를 사용하여 분리하였다. 파골세포 분화 관련 유전자 및 전사 인자에 특이적인 프라이머는 온라인 프라이머 디자인 프로그램을 사용하여 디자인하였으며(Rozen and Skaletsky, 2000, Methods Mol. Biol., 132:365-386), 각 유전자에 대한 프라이머로는 하기 표 1에 나타낸 전방(forward) 및 후방(reverse) 프라이머쌍을 사용하였다. cDNA의 합성은 2 ㎍의 총 RNA, 1 μM의 oligo-dT₁₈ primer 및 10 unit의 RNase inhibitor RNasin (Promega, WI, USA)과 4 Unit의 Omniscript Reverse Transcriptase (Qiagen, CA)를 이용하여 합성하였다. SYBR 그린계 정량 PCR 증폭은 50배 희석한 cDNA 와 20 p㏖의 프라이머를 SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)와 혼합한 후, Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR system을 이용하여 수행하였다. PCR 프로그램은 다음과 같다. 폴리머라제 활성을 위해 95℃에서 10분간 유지한 후, 94℃에서 40초(변성), 60℃에서 40초(어닐링) 및 72℃에서 1분(연장)을 40회 반복 수행하였다. 이후, 95℃에서 1분, 55℃에서 30초 및 95℃에서 30초간 유지하여 생성된 PCR 산물의 온도 해리 곡선(temperature dissociation curves, 'melting curves'라 하기도 함)을 작성하였다. 모든 실험은 3회 반복 실시하였으며, PCR 데이터는 2^-△△ ^CT 방법에 따라 분석하였다(Livak and Schmittgen, 2001, Methods 25:402-408). 이때, GAPDH를 PCR의 내부 대조군(internal control)으로 사용하였고, GAPDH-normalized 2^-△△ ^CT 데이터를 Student's t-test로 분석한 후, p < 0.05을 유의성 있는 차이로 판정하였다.

그 결과, RANKL 미처리한 세포와 비교하여, RANKL 처리한 세포에서 TRAP, c-Src, Cathepsin K, MMP-9, 및 ATP6v0d2 유전자의 mRNA 발현양이 유의성 있게 증가하였지만, 권백 추출물 처리군(400 ㎍/㎖)의 경우에는 TRAP, Cathepsin K 및 ATP6v0d2 유전자의 mRNA 발현이 모두 유의성 있게 감소되었다(표 2). 또한, 권백 추출물은 50 ㎍/㎖ 농도에서 RANKL로 유도되는 c-fos 및 NFATc1 유전자의 발현양을, 400 ㎍/㎖ 농도에서는 RANKL로 유도되는 c-fos, Fra-2 및 NFATc1 유전자의 발현양을 유의성 있게 감소시켰다(표 3).

유전자	전방 프라이머(5'->3')	서열 번호	후방 프라이머(5'->3')	서열 번호
c- fos	CCAGTCAAGAGCATCAGCAA	1	AAGTAGTGCAGCCCGGAGTA	2
Fra -1	CAGCCTCATTTCCTGGGACC	3	CCTTTCTTCGGTTTCTGCACT	4
Fra -2	ATCCACGCTCACATCCCTAC	5	GTTTCTCTCCCTCCGGATTC	6
NFATc1	GGGTCAGTGTGACCGAAGAT	7	GGAAGTCAGAAGTGGGTGGA	8
TRAP	ACACAGTGATGCTGTGTGGCAACTC	9	CCAGAGGCTTCCACATATATGATGG	10
c- Src	CCAGGCTGAGGAGTGGTACT	11	CAGCTTGCGGATCTTGTAGT	12
MMP -9	GCCCACCGTCCTTTCTTGTT	13	CGGTGAAGTGCCTGTCACAA	14
Cathepsin K	GGCCAACTCAAGAAGAAAAC	15	GTGCTTGCTTCCCTTCTGG	16
ATP6v0d2	AGACCACGGACTATGGCAAC	17	CAGTGGGTGACACTTGGCTA	18
GAPDH	AACTTTGGCATTGTGGAAGG	19	ACACATTGGGGGTAGGAACA	20

RAW264.7 세포에서 RANKL에 의해 유도된 파골세포 특이적 유전자의 mRNA 발현에 권백 추출물이 미치는 영향

	TRAP	c- Src	Cathepsin K	ATP6v0d2	MMP -9
RANKL 미처리	1.01±0.18	1.05±0.35	1.01±0.19	1.02±0.27	1.08±0.53
RANKL 처리	1249.28±127.76^*	41.37±11.81^*	2426.69±157.49^*	112.57±4.35^*	1520.06±337.93^*
RANKL+추출물 (50 ㎍/㎖)	1238.83±100.58^*	35.69±2.12^*	2461.01±103.42^*	87.55±13.79^*	1288.12±113.19^*
RANKL+추출물 (400 ㎍/㎖)	749.41±110.73^*#	39.66±4.42^*	1590.04±333.98^*#	85.97±10.15^*#	1306.62±217.23^*

^* p < 0.05, RANKL 미처리 군과 비교하여 현저하게 차이가 남.

^# p < 0.05, RANKL 처리 군과 비교하여 현저하게 차이가 남.

RAW264.7 세포에서 RANKL에 의해 유도된 전사 인자의 mRNA 발현에 권백 추출물이 미치는 영향

	c- fos	Fra -1	Fra -2	NFATc1
RANKL 미처리	1.00±0.07	1.01±0.15	1.00±0.08	1.01±0.10
RANKL 처리	1.83±0.30^*	2.06±0.61^*	7.42±1.64^*	9.78±1.55^*
RANKL+추출물 (50 ㎍/㎖)	0.80±0.02^*#	2.45±0.35^*	5.04±0.41^*	5.84±0.78^*#
RANKL+추출물 (400 ㎍/㎖)	1.09±0.17^#	2.54±0.29^*	4.10±0.58^*#	3.21±0.23^*#

^* p < 0.05, RANKL 미처리 군과 비교하여 현저하게 차이가 남.

^# p < 0.05, RANKL 처리 군과 비교하여 현저하게 차이가 남.

실시예 5. 웨스턴 블롯 분석

단백질 추출 버퍼(50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.1% SDS, 1 mM PMSF, and one protease inhibitor cocktail tablet (Roche, Germany))를 이용하여 세포 내 단백질을 추출한 후 원심 분리(10,000×g, 15분, 4℃)를 하여 단백질 추출물을 얻었다. 단백질 농도는 BCA 단백질 분석 키트(Pierce, IL)를 사용하여 정량하였다. 10 ㎍ 단백질 샘플을 SDS-PAGE용 샘플 버퍼(100 mM Tris-HCl, 2% SDS, 1% 2-mercaptoethanol, 2% glycerol, 0.01% bromophenol blue, pH 7.6)와 섞은 후 가열(100℃, 5분)하여 변성시켰고, 10% 폴리아크릴 아마이드 겔로 전기영동하였다. 전기영동에는 Mini protean 3 Cell (Bio-Rad, CA)을 사용하였다. 겔에 분리된 단백질은 나이트로 셀롤로오스 막(Whatman, Germany)에 전달하였고 Ponceau S 염색으로 단백질 전달과 점적된 단백질 양을 확인하였다. 이 후 나이트로 셀롤로오스 막을 블록킹 버퍼(10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.1% Tween 20, 3% nonfat dry milk)로 블록킹하고 2시간 동안 1차 항체(희석 배수, 1:1000; Cell Signaling Technology, Inc., MA)와 배양시켰다. 이때, 상기 1차 항체는 RANKL에 의해 활성이 증가되며 파골 세포 분화의 시그널에 참여하는 것으로 알려져 있는 ERK, JNK 및 p38에 특이적으로 결합하는 항체(Cell Signaling Technology, Inc., MA)를 사용하였다(Lee and Kim, 2003, BBRC, 305:211-214). 1차 항체와 반응시킨 막을 블록킹 버퍼로 10분간 3회 세척한 후 2차 항체(1:2000)와 1시간 동안 배양시켰다. 이 후, 블록킹 버퍼로 10분간 3회 세척한 후 SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate (Pierce, IL)로 현상하였다. 형광 시그널은 LAS-3000 발광 이미지 분석기(Fuji Photo Film Co., Japan)를 사용하여 검출하였고, 밴드 밀도는 Multi Gauge software version 3.0 (Fuji Photo Film Co.)을 사용하여 측정하였다.

그 결과, RANKL 처리 후 15분부터 ERK, JNK 및 p38의 활성이 증가하였다. 그러나, 권백 추출물을 처리할 경우에는 15분부터 나타나는 ERK, JNK 및 p38의 활성 증가가 현저하게 감소하였다(도 3).

제조예 1: 권백 추출물을 포함하는 약학적 조성물의 제조

<1-1> 시럽제의 제조

권백 추출물을 유효성분 2%(중량/부피)로 함유하는 시럽은 다음과 같은 방법으로 제조하였다. 먼저, 실시예 1에서 제조한 권백 추출물 분말, 사카린, 당을 온수 80 g에 용해시켰다. 상기 용액을 냉각시킨 후, 여기에 글리세린, 사카린, 향미료, 에탄올, 소르브산 및 증류수로 이루어진 용액을 제조하여 혼합하였다. 이 혼합물에 물을 첨가하여 100 ㎖가 되게 하였다.

상기 시럽제의 구성 성분은 다음과 같다.

권백 추출물????????????????????????? 2 g

사카린 ?????????????????????????? 0.8 g

당???????????????????????????? 25.4 g

글리세린 ????????????????????????? 8.0 g

향미료?????????????????????????? 0.04 g

에탄올 ?????????????????????????? 4.0 g

소르브산 ????????????????????????? 0.4 g

증류수??????????????????????????? 정량

<1-2> 정제의 제조

유효성분 15 ㎎이 함유된 정제를 다음과 같은 방법으로 제조하였다.

권백 추출물 250 g을 락토오스 175.9 g, 감자전분 180 g 및 콜로이드성 규산 32 g과 혼합하였다. 상기 혼합물에 10% 젤라틴 용액을 첨가시킨 후, 분쇄해서 14 메쉬체를 통과시켰다. 이것을 건조시키고 여기에 감자전분 160 g, 활석 50 g 및 스테아린산 마그네슘 5 g을 첨가해서 얻은 혼합물을 정제로 만들었다.

권백 추출물???????????????????????? 250 g

락토오스 ???????????????????????? 175.9 g

감자전분 ????????????????????????? 180 g

콜로이드성 규산 ?????????????????????? 32 g

10% 젤라틴 용액

감자전분 ????????????????????????? 160 g

활석???????????????????????????? 50 g

스테아르산 마그네슘????????????????????? 5 g

제조예 2: 권백 추출물을 함유하는 건강식품의 제조

<2-1> 식품의 제조

권백 추출물을 포함하는 식품들을 다음과 같이 제조하였다.

1. 조리용 양념의 제조

권백 추출물 20?95 중량%로 건강 증진용 조리용 양념을 제조하였다.

2. 토마토 케찹 및 소스의 제조

권백 추출물 0.2?1.0 중량%를 토마토 케찹 또는 소스에 첨가하여 건강 증진용 토마토 케찹 또는 소스를 제조하였다.

3. 밀가루 식품의 제조

권백 추출물 0.5?5.0 중량%를 밀가루에 첨가하고, 이 혼합물을 이용하여 빵, 케이크, 쿠키, 크래커 및 면류를 제조하여 건강 증진용 식품을 제조하였다.

4. 스프 및 육즙(gravies)의 제조

권백 추출물 0.1?5.0 중량%를 스프 및 육즙에 첨가하여 건강 증진용 육가공 제품, 면류의 수프 및 육즙을 제조하였다.

5. 그라운드 비프(ground beef)의 제조

권백 추출물 10 중량%를 그라운드 비프에 첨가하여 건강 증진용 그라운드 비프를 제조하였다.

6. 유제품(dairy products)의 제조

권백 추출물 5?10 중량%를 우유에 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.

7. 선식의 제조

현미, 보리, 찹쌀, 율무를 공지의 방법으로 알파화시켜 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60메쉬의 분말로 제조하였다. 검정콩, 검정깨, 들깨도 공지의 방법으로 쪄서 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60메쉬의 분말로 제조하였다. 권백 추출물을 진공 농축기에서 감압?농축하고, 분무, 열풍건조기로 건조하여 얻은 건조물을 분쇄기로 입도 60메쉬로 분쇄하여 건조분말을 얻었다. 상기에서 제조한 곡물류, 종실류 및 권백 추출물의 건조분말을 다음의 비율로 배합하여 제조하였다.

곡물류(현미 30 중량%, 율무 15 중량%, 보리 20 중량%),

종실류(들깨 7 중량%, 검정콩 8 중량%, 검정깨 7 중량%),

권백 추출물의 건조분말(3 중량%),

영지(0.5 중량%),

지황(0.5 중량%)

<2-2> 음료의 제조

1. 탄산음료의 제조

설탕 5?10%, 구연산 0.05?0.3%, 카라멜 0.005?0.02%, 비타민 C 0.1?1%의 첨가물을 혼합하고, 여기에 79?94%의 정제수를 섞어서 시럽을 만들고, 상기 시럽을 85?98℃에서 20?180초간 살균하여 냉각수와 1:4의 비율로 혼합한 다음 탄산가스를 0.5?0.82%를 주입하여 권백 추출물을 함유하는 탄산음료를 제조하였다.

2. 건강음료의 제조

액상과당(0.5%), 올리고당(2%), 설탕(2%), 식염(0.5%), 물(75%)과 같은 부재료와 권백 추출물을 균질하게 배합하여 순간 살균을 한 후 이를 유리병, 페트병 등 소포장 용기에 포장하여 건강음료를 제조하였다.

3. 야채주스의 제조

권백 추출물 5 g을 토마토 또는 당근주스 1,000 ㎖에 가하여 건강 증진용 야채주스를 제조하였다.

4. 과일주스의 제조

권백 추출물 1 g을 사과 또는 포도주스 1,000 ㎖에 가하여 건강 증진용 과일주스를 제조하였다.

<110> Korea Institute of Oriental Medicine <120> Composition for Prevention or Treatment of Osteoporosis Comprising Extract of Selaginellae Herba <130> 2010-dpa-0122 <160> 20 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for c-fos <400> 1 ccagtcaaga gcatcagcaa 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for c-fos <400> 2 aagtagtgca gcccggagta 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for Fra-1 <400> 3 cagcctcatt tcctgggacc 20 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for Fra-1 <400> 4 cctttcttcg gtttctgcac t 21 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for Fra-2 <400> 5 atccacgctc acatccctac 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for Fra-2 <400> 6 gtttctctcc ctccggattc 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for NFATc1 <400> 7 gggtcagtgt gaccgaagat 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for NFATc1 <400> 8 ggaagtcaga agtgggtgga 20 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for TRAP <400> 9 acacagtgat gctgtgtggc aactc 25 <210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for TRAP <400> 10 ccagaggctt ccacatatat gatgg 25 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for c-Src <400> 11 ccaggctgag gagtggtact 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for c-Src <400> 12 cagcttgcgg atcttgtagt 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for MMP-9 <400> 13 gcccaccgtc ctttcttgtt 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for MMP-9 <400> 14 cggtgaagtg cctgtcacaa 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for Cathepsin K <400> 15 ggccaactca agaagaaaac 20 <210> 16 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for Cathepsin K <400> 16 gtgcttgctt cccttctgg 19 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for ATP6v0d2 <400> 17 agaccacgga ctatggcaac 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for ATP6v0d2 <400> 18 cagtgggtga cacttggcta 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for GAPDH <400> 19 aactttggca ttgtggaagg 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for GAPDH <400> 20 acacattggg ggtaggaaca 20

Claims

권백에 물 또는 유기용매를 가하여 추출한 권백 추출물을 유효성분으로 함유하는 골다공증 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 권백 추출물은 권백에 (2?15배량)의 물을 가한 후 (70 내지 100℃)에서 열수 추출하여 제조되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 유기용매는 C₁ 내지 C₄의 알코올, 아세톤 및 이의 수용액으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
권백에 물 또는 유기용매를 가하여 추출한 권백 추출물을 유효성분으로 함유하는 골다공증 예방 또는 개선용 건강식품.
청구항 4에 있어서,
상기 권백 추출물은 권백에 (2?15배량)의 물을 가한 후 (70 내지 100℃)에서 열수 추출하에 제조되는 것을 특징으로 하는 건강식품.
청구항 4에 있어서,
상기 유기용매는 C₁ 내지 C₄의 알코올, 아세톤 및 이의 수용액으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 건강식품.