KR101569256B1

KR101569256B1 - 메이신을 포함하는 전립선암 예방 및 치료용 약학적 조성물

Info

Publication number: KR101569256B1
Application number: KR1020130144128A
Authority: KR
Inventors: 박용일; 이지선; 이슬
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2013-11-25
Filing date: 2013-11-25
Publication date: 2015-11-16
Also published as: KR20150061116A

Abstract

본 발명은 메이신을 포함하는 전립선암 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 pro-caspase-3 단백질 감소 및 이를 통한 활성화 및/또는 Bcl-2의 단백질 발현을 감소시켜 전립선암세포 사멸을 촉진하여 세포증식을 억제하는 활성을 갖는 메이신을 포함하는 전립선암 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

Description

메이신을 포함하는 전립선암 예방 및 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition comprising maysin for the prevention and treatment of prostate cancer}

암의 발생률과 암으로 인한 사망률은 의학의 혁신적인 발전에도 불구하고 계속 증가추세에 있다. 세계보건기구는 암 발생을 높이는 서구식 식습관의 확산과 현재의 흡연추세로 볼 때 2020년에는 암 진단자가 1천 500만 명으로 50 %이상 증가할 것으로 예상하였다. 또한 우리나라 보건복지부와 국립암센터에 따르면 2001년에 발생, 등록된 암은 9만1천9백44건으로 전년에 비해 9.7% 증가했으며, 여자는 유방암, 남자는 전립선암이 크게 늘어나는 등 우리나라 암 발생이 선진국과 비슷한 양상을 보이는 것으로 조사되었다.

암화(carcinogenesis)는 (a) 발암물질에 의해 DNA에 돌연변이가 유도되는 개시단계, (b) 양성 종양(benign tumor)이 나타나는 촉진단계, (c) 양성종양이 악성종양(malignant tumor)으로 변환되는 진행단계 및 (d) 악성 정도의 증가 및 전이로의 진행단계와 같이 다단계로 진행된다. 각 단계로의 진전속도나 다음 단계로의 진행은 여러 물질에 의해 증가되거나 억제될 수 있다.

현재 신규 항암제와 암 치료법이 지속적으로 개발되면서 암에 대한 치료나 수명 연장이 기대되고 있는 실정이다. 특히, 백혈병, 악성 임파종, 전립선암 등의 혈액암에 대하여는 높은 치료효과를 얻고 있다. 하지만, 암 치료 중에 항암제에 저항성을 나타내는 내성암이 나타나기도 하고, 항암제에 거의 반응하지 않는 소화기암을 대표하는 고형암(solid tumor)이 존재하고 있어, 여전히 암은 현대 선진국에서 제1위의 사망원인을 차지하고 있다. 상기 문제를 해결하기 위해, 염산이리노데칸(CPT-Ⅱ)이나 파크리탁셀(택솔) 등의 새로운 항암제는 상술한 종래 항암제와는 달리 혈액암뿐만 아니라 일부의 고형암에 대하여도 어느 정도 항암 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다. 하지만, 종래 항암제는 약제 저항성과 정상세포와의 선택성에 대하여 아직도 많은 해결되지 못하고 있는데 특히 그 가운데서도 임상에 사용되고 있는 항암제들의 가장 큰 문제점은 암세포와 정상세포를 선택적으로 구분할 수 없는 것이 가장 큰 문제점이라 할 수 있다. 이와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 최근에는 세포의 암화, 약제 내성이나 전이 등 분자수준에서의 암의 특성에 대한 집중적인 연구가 진행되어 왔으며, 이중 암 분자 표적 약제로서 성공한 예로 Bcr-Abl(일종의 타이로신 키나제)의 저해제인 글리벡(Gleevec)과 EGF 수용체 타이로신 키나제(epidermal growth factor receptor tyrosine kinase) 저해제인 이레사(Iressa) 등을 개발 사례로 들 수가 있다.

한편, 전립선암은 미국이나 유럽에서 남성 암사망자의 약 20%를 차지하는 빈도 높은 암으로써, 우리나라도 식생활의 서구화 및 고령화 사회로의 이행에 따라 전립선암과 유방암의 발생이 급격히 증가하는 추세이다. 전립선암 치료법으로 안드로겐-결핍(androgen-deprivation) 요법을 사용하나, 내분비요법은 병의 진행을 완화시키기는 하나 골다공증, 지방대사의 이상, 빈혈, 무력, 성욕감소, 피로 등의 부작용을 유발할 뿐만 아니라, 그 효과가 오래 지속되지 않아 결국 모든 전립선암 환자들이 이 요법에 반응을 보이지 않는 안드로겐 비의존성 상태로 발전하여 치료가 거의 불가능하게 된다. 따라서 현재의 전립선암에 대한 치료는 조기 발견하여 암이 전립선에 국한되어 있을 때 전립선을 제거하는 수술 방법이 제일 성공적인 처치 방법이다. 그러나 발견 당시 암이 전립선에 국한되지 않고 원격전이가 되어 수술적 처치가 적용되지 않는 경우가 빈번한 실정이다. 이에 특히, 호르몬 비의존성 전립선암에 효과적인 약제의 필요성이 절실한 상태이다.

나아가, 현대 의학의 대표적 암 치료법에는 외과적 수술요법, 생물요법, 방사선요법, 항암물질 투여에 의한 화학요법 등이 있다. 화학요법은 항암제를 경구나 주사로 투여하여 암세포의 증식을 억제하는 방법으로서, 화학요법이 가지는 장점은 몸의 어떤 부위에 생긴 암이라도 약물이 도달할 수 있고, 전이된 암을 치료할 수 있다는 것으로, 현재 화학요법은 전이성 암 치료에 표준요법으로 사용되고 있다. 물론 화학요법으로 전이된 암을 완치시킬 수 있는 것은 아니지만 증상을 완화시켜 수명을 연장시켜주는 중요한 역할을 한다.

현재 사용중인 대부분의 항암제들은 심각한 독성 및 부작용으로 인해 사용이 제한적이고, 항암제 다제내성뿐만 아니라 치료효과의 증강을 위해 투여용량을 증가시키고 있어 인체에 치명적으로 작용한다. 특히, 항암제 사이클로포스파미드(cyclophosphamide; CY)는 알킬레이트화제로서 DNA 복제 및 RNA 전사를 억제하여 항암작용을 나타내며 급/만성 백혈병 및 기타 고형암에 널리 사용되는 항암제이지만 심각한 면역억제(면역독성) 작용을 나타낸다. 또한 5-플루오로우라실(5-fluorouracil; 5-Fu)은 피리미딘 유도체로서 헥산대사를 억제하여 주로 유방암, 대장암, 위암, 췌장암 등에 항암효과를 나타내지만 골수억제, 구강, 소화기 궤양, 간 및 신장손상 등의 부작용 때문에 제약을 받고 있다.

이에 대한 대안으로 천연물 유래의 항암 물질을 개발하기 위한 연구가 계속되었다. 현재까지 천연물 유래의 항암제 중 가장 널리 사용되고 있는 항암제는 택솔(taxol)로서 유방암, 난소암의 치료에 사용되고 있다. 상기 천연물 유래 항암 활성 물질 중 공개특허 10-2013-0026622(공개일자: 2013.03.14)에는 콩으로부터 분리된 클로로필류를 유효성분으로 포함하고, 항암 활성을 가지는 약학적 조성물을 제공한다.

그러나 이러한 종래 화학요법의 부작용, 항암제 내성 등의 문제점에 관해 지금까지 암에 대한 많은 연구가 계속되고 있음에도 불구하고 암 자체의 다양성 및 발병기전의 다양화로 인해 부작용이 적고 내성을 극복할 수 있는 항암제는 개발되지 않았다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로, 본 발명은 pro-caspase-3 단백질 감소 및 이를 통한 활성화 및/또는 Bcl-2의 단백질 발현을 감소시켜 전립선암세포 사멸을 촉진하여 세포증식을 억제하는 활성을 갖는 메이신을 포함하는 전립선암 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하고자 한다.

또한, Akt의 인산화의 억제 및 미토콘드리아의 막전위를 감소시켜 전립선암에 대해 항암 활성이 뛰어난 전립선암 예방 및 치료용 항암제 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명은 메이신을 유효성분으로 포함하는 전립선암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명은 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 약학적 조성물은 전립선암세포 사멸(apoptosis)을 촉진하여 세포증식을 억제하는 것일 수 있다.

본 발명은 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 메이신은 옥수수수염으로부터 유래한 것일 수 있다.

본 발명은 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 약학적 조성물은 pro-caspase-3 단백질 감소 및 이를 통한 활성화 또는 Bcl-2의 단백질 발현을 감소시키는 것일 수 있다.

본 발명은 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 약학적 조성물은 Akt의 인산화의 억제 및 미토콘드리아의 막전위를 감소시키는 것일 수 있다.

본 발명은 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 약학적 조성물은 메이신 25 ~ 200 ㎍/㎖의 농도로 포함할 수 있다.

본 발명은 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 약학적 조성물 중 메이신의 농도가 100 ㎍/㎖ 이상으로 포함하여 p-Akt 인산화를 억제하는 것일 수 있다.

본 발명은 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 약학적 조성물은 150 ㎍/㎖ 농도 이상의 메이신을 포함하여 전립선암 세포의 40% 이상을 사멸할 수 있다.

또한, 본 발명은 상술한 바와 같은 전립선암 예방 또는 치료용 약학적 조성물; 및 항암제; 를 포함하는 전립선암용 항암제 조성물을 제공한다.

본 발명은 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 항암제는 5-플루오로라실(5-FU;5-fluorouracil), 에토포시스(etoposide), 시스플라틴(cisplatin), 캠토테신(camptothecin), 독소루비신 (doxorubicin), 빈블라스틴 (vinblastine) 및 파크리탁셀 (paclitaxel)로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함할 수 있다.

나아가, 본 발명은 메이신을 포함하는 전립선암 예방 또는 개선용 건강기능성 식품을 제공한다.

본 발명은 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 메이신은 옥수수수염으로부터 유래한 것일 수 있다.

본 발명은 전립선암세포 사멸을 촉진하여 세포증식을 억제하는 활성을 가지는 전립선암 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 효과가 있다.

또한, 본 발명은 종래 합성 약학적 조성물보다 인체에 무해하며, 정상세포에 부작용을 유발하지 않아 장기간 사용하는데 인체에 무리가 없는 약학적 조성물을 제공하는 효과가 있다.

도 1은 실시예 1에서 측정한 흡광도 결과이다.
도 2는 실시예 2에서 관찰한 세포 형태 변화 결과이다.
도 3은 실시예 3-1에서 유세포기분석기를 이용하여 세포사멸을 분석한 결과이다.
도 4는 도 3을 수치화한 결과이다.
도 5는 실시예 3-2에서 웨스턴 블럿 방법을 이용하여 분석한 pro-caspase-3의 단백질 및 Bcl-2 단백질 발현량 측정결과이다.
도 6은 실시예 4에서 측정한 전립선암세포의 미토콘드리아에서의 막전위 변화를 측정한 형광광도이다.
도 7은 실시예 4에서 측정한 전립선암세포의 미토콘드리아에서의 막전위 변화를 수치화한 그래프이다.
도 8은 실시예 5에서 조사한 메이신의 농도에 따른 전립선암세포의 DNA 단편화 변화 결과이다.
도 9는 실시예 6에서 조사한 메이신의 전립선암세포에 대한 암세포 사멸기전 결과이다.
도 10은 실시예 7에서 MTT assay에 따라 조사한 암세포 성장 억제 결과이다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

상술한 바와 같이, 종래 화학요법의 부작용, 항암제 내성 등의 문제점에 관해 지금까지 암에 대한 많은 연구가 계속되고 있음에도 불구하고 암 자체의 다양성 및 발병기전의 다양화로 인해 부작용이 적고 내성을 극복할 수 있는 항암제는 개발되지 않아 이에 대한 항암제 개발이 시급한 실정이다.

본 발명은 메이신을 유효성분으로 포함하는 전립선암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공함으로써 상술한 문제의 해결을 모색하였다. 이를 통해 전립선암세포 사멸을 촉진하여 세포증식을 억제하는 활성을 가지는 전립선암 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하며, 종래 합성 약학적 조성물보다 인체에 무해하며, 정상세포에 부작용을 유발하지 않아 장기간 사용하는데 인체에 무리가 없는 약학적 조성물을 제공하는 효과가 있다.

상기 메이신(maysin)은 옥수수, 테오신테(teosinte) 및 센티페드그라스에서 발견되는 황색의 식물 색소 플라보노이드 (flavonoid) 계열의 물질로서 항산화작용이 있다고 알려져 있다. 그런데 본 발명에서는 옥수수수염 유래의 메이신이 전립선암에 대한 예방 및 치료 효과를 확인하였다.

본 발명의 메이신은 통상적으로 제조 및/또는 구매할 수 있는 것이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 옥수수수염으로부터 유래한 것일 수 있다.

상기 옥수수수염에서 유래된 메이신의 신규한 생리활성인 전립선암 예방 및/또는 예방을 발견하였다. 그 결과, 상기 메이신은 pro-caspase-3 단백질 감소 및 이를 통한 활성화 또는 Bcl-2의 단백질 발현의 감소에 의한 전립선암세포의 사멸을 촉진 활성을 확인하였다.

또한, 본 발명의 유효성분인 메이신은 Akt의 인산화를 감소시켜 전립선암세포의 사멸(apoptosis)을 촉진할 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 실시예 6에 나타난 바와 같이, 전립선암세포의 세포사멸이 메이신을 처리함으로써 촉진됨을 확인할 수 있었다. 이를 통해 메이신이 전립선암의 치료제로서 사용될 수 있음을 알 수 있다(실시예 6 및 도면 9 참조).

한편, 본 발명의 용어 "세포사멸(apoptosis)"은 일정 시간 및 장소에서의 프로그램화된 세포자살 과정으로서, 조직 항상성(tissue homeostasis) 및 배아 발달(embryonic development)과 같은 생리적 과정뿐만 아니라 많은 인간 질환에 관련된다.

나아가, 본 발명의 유효성분인 메이신은 미토콘드리아의 막전위를 감소시켜 전립선암세포의 사멸을 촉진할 수 있다. 구체적으로 본 발명의 실시예 4에 나타난 바와 같이, 전립선암세포에 메이신을 처리함으로써 전립선암세포 사멸이 촉진됨을 확인할 수 있었다. 이를 통해 이를 통해 메이신이 전립선암의 치료제로서 사용될 수 있음을 알 수 있다(실시예 4 및 도면 6 내지 7 참조).

더불어, 상기 전립선암 예방 및 치료용 약학적 조성물은 메이신을 포함하는 것이라면 그 함량을 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 25 ~ 200 ㎍/㎖의 농도로 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 50 ~ 200 ㎍/㎖의 농도로 포함할 수 있다.

만약, 25 ㎍/㎖의 농도 이하의 메이신을 포함할 경우, 전립선 암에 대한 항암효과가 낮아져 전립선암 예방 및 치료용으로 사용하기 힘든 문제가 발생할 수 있으며, 200 ㎍/㎖의 농도를 초과하는 양의 메이신을 포함할 경우, 정상세포에도 영향을 줄 수 있는 문제가 발생할 수 있다.

게다가, 본 발명은 상술한 바와 같은 전립선암 예방 또는 치료용 약학적 조성물; 및 항암제;를 포함하는 전립선암용 항암제 조성물을 제공한다.

상기 전립선암용 항암제 조성물은 종래 항암제와 본 발명의 전립선암 예방 또는 치료용 약학적 조성물과 병용하여 종래 항암제 단독 사용보다 현저하게 뛰어난 항암 활성을 보였다. 구체적으로, 실시예 8에는 통상적으로 전립선암에 사용되는 항암제와 본 발명의 전립선암 예방 또는 치료용 약학적 조성물과 병용하여 처리한 결과, 종래 항암제 단독 사용보다 전립선암세포의 생존율을 20 ~ 30% 더 감소시키는 것을 확인할 수 있었다(도면 10 참조).

본 발명의 전립선암 예방 또는 치료용 약학적 조성물과 병용하여 사용할 수 있는 항암제는 통상적으로 전립선암에 항암제로 사용되는 것이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 5-플루오로라실(5-FU;5-fluorouracil), 에토포시스(etoposide), 시스플라틴(cisplatin), 캠토테신(camptothecin), 독소루비신 (doxorubicin), 빈블라스틴 (vinblastine) 및 파크리탁셀 (paclitaxel)로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 메이신을 포함하는 전립선암 예방 및 치료용 약학적 조성물 및/또는 전립선암 항암제 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

상세하게는, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.

경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 메이신에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose), 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다.

경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween)61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 메이신을 포함하는 전립선암 예방 및 치료용 약학적 조성물 및/또는 전립선암용 항암제 조성물은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으나, 일반적으로 0.01 내지 50 ㎎/㎏의 양, 바람직하게는 0.1 내지 10 ㎎/㎏의 양을 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다. 또한 메이신을 포함하는 조성물의 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 메이신을 포함하는 전립선암 예방 또는 개선용 건강기능성 식품을 제공한다.

상기 건강 기능성 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 메이신을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 환제, 분말, 과립, 침제, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있고 통상적인 의미에서의 건강 기능성 식품을 모두 포함한다.

이때, 식품 또는 음료 중 메이신의 첨가량은, 일반적으로 본 발명의 건강 기능성 식품 조성물의 경우 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물의 경우 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 500 ㎍, 바람직하게는 1 내지 200 ㎍의 비율로 첨가할 수 있다.

본 발명의 건강 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 메이신을 함유하는 외에는 액체성분에는 특별한 제한은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예로는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린; 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제 (타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.

상기 외에 본 발명의 건강 기능성 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.

그밖에 본 발명의 건강 기능성 식품들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.

상기 메이신은 통상적으로 구매 및/또는 제조할 수 있는 것이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 옥수수수염 유래인 것일 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 ]

실시예 1. 암세포 성장억제 효과

메이신의 암세포 성장 억제 효과는 MTT 어세이(assay)에 따라 시험하였다. 전립선암세포(PC-3)를 5×10⁴ cells/㎖의 밀도로 96-웰 배양 플레이트에 24시간 동안 37℃, 5% CO₂조건으로 배양하였다. 상기 배양된 전립선암세포는 혈청이 없는 RPMI1640 배양액으로 2시간 동안 처리하였다.

상기 배양된 전립선암세포에 메이신(농촌진흥청 식량과학원의 김선림박사님께서 분리 및 정제하신 메이신을 분양받아 사용함)을 첨가하여 25 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖, 150 ㎍/㎖ 또는 200 ㎍/㎖의 농도가 되게 하고 이후 48시간 배양한 후, 5 ㎎/㎖ 농도의 MTT(3-[4,5-dimethyl-thiazol]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide) 시약을 20 ㎕씩 첨가하여 4시간 동안 반응시켰다.

상기 반응 후 200 ㎕의 디메틸 설폭사이드(DMSO; Dimethyl sulfoxide)를 첨가하여 형성된 포마젠을 모두 녹인 뒤 마이크로플레이트 리더기(microplate reader)를 이용하여 570 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 측정한 흡광도 결과는 도면 1에 나타냈다.

도 1에서 확인되는 바와 같이, 메이신을 0 ㎍/㎖, 25 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖, 150 ㎍/㎖, 200 ㎍/㎖ 의 농도로 처리하였을 때, 농도 의존적으로 세포 생존율이 감소하는 것을 확인하였으며, 100 ㎍/㎖에서 메이신은 50% 이상의 세포성장 억제 효과를 보였다.

실시예 2: 세포형태 변화

메이신의 암세포 형태변화를 확인하기 위해 광학현미경으로 관찰하였다. 전립선암세포(PC-3)를 6-웰 배양 플레이트에서 37℃에서 24시간 동안 배양하였다.

상기 배양한 전립선암세포에 실시예 1에서 사용한 메이신과 동일한 메이신을 첨가하여 25 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖, 150 ㎍/㎖ 또는 200 ㎍/㎖의 농도가 되게하여 48시간 동안 처리한 후, 광학현미경(×200)으로 세포의 형태를 관찰하였다. 관찰 결과는 도면 2에 나타냈다.

도 2에서 확인되는 바와 같이, 메이신을 처리 한 후 처리하지 않은 대조군과 비교했을 때 세포체 응축, 신경돌기 소실, 분절, 세포막수포현상 등의 세포사멸 형태가 증가한 것을 확인할 수 있었다.

실시예 3: 세포사멸 분석

3-1: 유세포분석기(Flow cytometry)를 이용한 세포사멸 분석

세포사멸은 아넥신 V-FITC 아폽토시스 검출 키트(Bio Vision, USA)를 사용하여 측정하였다.

전립선암세포(PC-3)를 6-웰 배양 플레이트에서 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 상기 배양한 전립선암세포에 메이신을 첨가하여 25 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖, 150 ㎍/㎖ 또는 200 ㎍/㎖의 농도가 되게 하고, 48시간 동안 처리하였다. 48시간 처리 후 인산완충식염수(PBS; phosphate buffered saline)로 세척하고 1400 rpm으로 5분 동안 원심분리하여 세포를 수득하였다.

수득한 세포는 500 ㎕의 바인딩 버퍼로 부유시킨 후, 5 ㎕의 아넥신 V-FITC 및 5 ㎕의 프로피디움 요오드화물(propidium iodide)를 첨가하여 실온에서 15분 동안 반응시켰다. 상기 반응 이후 유세포분석기(Flow cytometry)를 이용하여 분석하였다. 분석 결과는 도면 3에 기재하였으며, 도면 3의 결과를 수치화한 결과는 도면 4에 나타냈다.

도 3에서 확인되는 바와 같이, 메이신을 처리하지 않은 대조군과 비교해서 메이신을 처리한 군에서 농도가 증가함에 따라 유의적으로 아폽토틱(apoptotic) 세포가 증가하였으며, 150 ㎍/㎖에서 43.29%, 200 ㎍/㎖에서 60.25%의 수치를 나타내었다.

또한, 도 4에서 확인되는 바와 같이, 메이신의 농도가 25 ~ 200 ㎍/㎖일 때, 효과상의 현저한 차이가 있음을 확인할 수 있었다.

3-2: 웨스턴 블럿 방법( Western blotting )을 이용한 세포사멸 분석

메이신의 암세포 사멸 기전을 조사하기 위해 전립선 암세포에 대해 Bcl-2 패밀리, pro-caspase-3의 단백질 발현양을 웨스턴 블럿 방법으로 조사하였다.

전립선암세포(PC-3)를 6-웰 플레이트에서 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 상기 배양한 세포에 메이신을 첨가하여 25 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖, 150 ㎍/㎖ 또는 200 ㎍/㎖의 농도가 되게 하였으며, 이후 48시간 동안 처리하였다. 48시간 처리 후 PBS 세척하고 1400 rpm에서 5분 동안 원심분리 하여 세포를 수득하였다.

수득한 세포는 50 ㎕의 용해 버퍼를 첨가한 후에 30분 동안 얼음 상에서 반응시키고 12,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 단백질을 수확하였다. 수확한 단백질은 브래드포드 분석법을 이용하여 단백질을 정량하고 샘플 로딩 버퍼를 넣고 95℃에서 5분 동안 변성시킨 뒤에 SDS-PAGE(Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis)겔을 이용하여 전기영동하였다.

상기 전기영동 이후 단백질은 니트로셀룰로즈 (Nitrocellulose; NC) 막에 전송한 뒤 5% 탈지분유로 실온에서 1시간 동안 블로킹(blocking)하고, 이후 1차 항-Bcl-2 항체(1:1000)(v/v), 항-pro-caspase-3 항체(1:1000)(v/v), 항-베타 액틴 항체 (1:1000)(v/v)를 5% 탈지분유에 각각의 비율로 희석한 후 4℃에서 24 시간 동안 반응시켰다.

상기 반응시킨 단백질은 TBST (TBS, 0.1% Tween 20)로 10분마다 3번 세척하고 HRP(horeseradish peroxidase)-컨쥬게이티드 2차 항체를 5% 탈지분유에 1:2000(v/v)으로 희석한 후 실온에서 1시간 동안 반응시켰다.

상기 반응 이후 상술한 바와 같은 방법으로 TBST로 3차례 세척한 후 ECL (Enchanced Chemiluminescence) 기질 용액을 막에 1분 동안 반응시킨 후에 X-ray 필름에 현상하였다. 현상한 X-ray 필름은 도 5에 나타냈다.

도 5에서 확인되는 바와 같이, 세포 사멸(Apoptosis)의 특징적인 지표인 caspase-3의 전구체인 pro-caspase-3의 단백질 발현량은 메이신 농도가 증가할수록 감소함을 확인할 수 있었다. 이를 통해, 메이신의 농도가 증가함에 따라 전립선암세포 사멸관련 효소인 caspase-3가 분활되면서 활성화됨을 알 수 있었다.

또한, Bcl-2 패밀리에 속하는 몇 가지 인자들은 세포소멸 유발 조절에 가장 대표적인 유전자로 알려져 있는데, 그 중 Bcl-2는 항-아폽토틱 분자로서 세포소멸의 유발을 억제하는 기능을 가지는 분자로 세포소멸의 유발과 관계가 있다. 아무것도 처리하지 않은 것을 대조군으로 하고, 메이신을 처리한 군을 실험군으로 하여 Bcl-2 발현량을 측정한 결과, 처리한 메이신의 농도가 증가함에 따라 농도의존적으로 단백질 발현량이 감소하는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 4: 미토콘드리아 기능장애 조사

미토콘드리아의 기능장애는 미토콘드리아 막의 전위차가 상실함으로써 발생하는데 이는 시토크롬 C(cytochrom C)를 세포질로부터 방출하여 Apaf1, Caspase9 과 아팝토좀(apoptosome)을 형성하여 세포 사멸(apoptosis)를 유발하는 것으로 알려져 있다.

메이신에 의해서 전립선암 세포(PC-3)의 미토콘드리아 막전위가 상실하였는지를 측정하기 위하여, JC-1(5,5',6,6'-tetrachloroc-1,1',3,3'tetraethylbenz imidazolylcarbocyanine iodide) 미토콘드리아 막 전위 측정 키트를 이용하였다. 전립선암 세포 (PC-3)를 1×10⁵ cells/㎖의 밀도로 6-웰 플레이트(well plate)와 96-웰 플레이트(well plate)에 24시간 동안 37℃, 5% CO₂조건으로 배양하였다. 배양 이후 혈청이 없는 RPMI1640 배양액으로 2시간 동안 처리하고, 메이신을 25 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖, 150 ㎍/㎖ 또는 200 ㎍/㎖의 농도로 세포에 처리 후 48시간 배양하였다. 배양 후 JC-1을 6-웰 플레이트에 500 ㎕씩, 96-웰 플레이트 100 ㎕씩 각 웰(well)에 처리한 다음 30분 동안 37 ℃에서 배양한 뒤에 형광현미경과 현광광도계를 이용하여 빨강 형광은 엑시테이션(excitation) 550 ㎚, 이미션(emission) 600 ㎚에서 형광광도를 측정하였고 초록 형광은 형광 엑시테이션(excitation) 485 ㎚, 이미션(emission) 535 ㎚에서 형광광도를 측정하였다. 형광현미경으로 관찰한 결과는 도면 6에 나타냈으며, 형광광도계로 측정한 형광광도는 빨강 형광과 초록 형광의 비율로 나타내어 미토콘드리아의 막 전위 붕괴 정도를 측정한 그래프는 도면 7에 나타냈다.

빨강 형광은 살아있는 모든 세포에서 측정되고, 초록 형광은 세포사멸(apoptosis)로 죽은 세포에서 측정된다. 캠토테신(CPT; Camptothecin)는 종래에 알려진 항암제로써 본 실험에서 세포사멸에 대한 양성 대조군으로 사용하였다. 또한, FCCP(Carbonyl cyanide-4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone)는 종래에 알려진 산화적인 산화 반응해제제(uncoupling agent)로써 본 실험에서 미토콘드리아 막전위 변화에 대한 양성 대조군으로 사용하였다.

도 6에서 확인되는 바와 같이, 메이신을 100 ㎍/㎖ 처리하였을 때 살아있는 세포에 존재하는 빨강 형광은 아무것도 처리하지 않은 대조군에 비해 감소하는 것을 확인할 수 있었고, 미토콘드리아 막전위가 붕괴함으로써 손상을 입은 세포에 존재하는 초록 형광은 급격히 증가함을 확인할 수 있었다. 이는 메이신에 의해 전립선암세포의 미토콘드리아 막전위가 붕괴함을 시사하는 것이다.

또한, 도 7에서 확인되는 바와 같이, 대조군에 비해 메이신을 25 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖, 150 ㎍/㎖ 또는 200 ㎍/㎖ 처리하였을 때, 미토콘드리아 막전위가 메이신의 농도 의존적으로 각각 0.4배, 0.17배, 0.06배, 0.04배 또는 0.039배로 줄어든 것을 확인할 수 있다.

실시예 5: 전립선암 세포의 DNA 단편화 변화 확인

DNA 단편화(fragmentation)는 세포에 세포사멸이 일어날 때, 핵으로부터 분리된 DNA가 조금씩 절편되는 것을 확인할 수 있다. 즉, 세포가 축소되고 세포 사이 틈새가 생기며 세포 내에서 DNA가 규칙적으로 절단돼 절편화되는 정도를 확인하는 것이다. 상술한 바와 같은 DNA 절편화가 지속될 경우, 세포 전체가 단편화돼 인접한 세포에 잡아먹혀 일생을 마치게 된다. 그러므로 DNA 단편화는 세포사멸의 정도를 측정하는 대표적인 지표로 사용되고 있다.

본 실험에서 메이신에 의해 유발된 전립선암세포(PC-3)의 DNA 단편화를 확인하기 위해, TUNEL(terminal transferase mediated dUTP-fluorescein nick end labeling) assay를 수행하였다. TUNEL assay는 TUNEL(초록색)과 PI의 형광(빨간색)을 같이 사용하여 살아있는 세포와 죽어가는 혹은 이미 죽은 세포(apoptotic cell)를 구분하는 방법이다.

구체적으로, TUNEL은 TdT(thermal deoxynucleotidyl transferase)라는 효소를 이용해 dUTP(deoxyuridine triphosphate)를 핵 내의 DNA 조각(DNA fragment) 말단에 붙여 그 DNA가 여러 조각 절편으로 분해되고 있는지 즉, DNA 단편화가 일어났는지 여부를 파악하는 실험으로 이를 통해 세포사멸(apoptosis)이 일어났는지 여부를 파악할 수 있는 실험이다.

DNA 단편화가 일어나면 DNA의 이중나선 구조에 분열이 생기고 N 터미날(terminal)이 노출되게 되어 N terminal 말단에 TUNEL이 결합하는 원리를 이용한 방법이다. 본 연구에서는 도 8에서 보는 바와 같이 dUTP에 FITC 형광(초록 형광)을 붙인 FITC-dUTP를 사용하여 형광현미경으로 형광을 측정하였다.

전립선암세포(PC-3)를 커버 슬립(cover slip)에서 24시간 동안 배양하고 메이신을 150 ㎍/㎖ 또는 200 ㎍/㎖의 농도가 되게 첨가하고, 이후 48시간 동안 처리하였다. 이후, TUNEL assay kit인 ApoDIRECT In Situ DNA fagmentation assay kit (Biovision Research Products, Mountain View, CA, USA)을 이용하여 형광 염색한 후, 형광현미경(×100)으로 핵 내의 DNA 형태변화를 관찰하였다. 관찰 결과는 도면 8에 나타냈다.

도 8에서 확인되는 바와 같이, 아무것도 처리하지 않은 대조군(Con, control)에서는 PI가 핵과 결합하여 빨간색으로 나타남을 보이지만, TUNEL(FITC-dUTP 처리)에서는 아무런 색이 보이지 않으므로 DNA 단편화가 일어나지 않았음을 보이고, 따라서 이들 두 사진을 겹쳐서(Merge) 관찰한 결과 그대로 빨간색만 나타내고 있다. 이는 대조군 (control)세포에는 전립선암세포의 사멸(apoptosis)이 일어나지 않고 모두 정상적으로 살아있는 세포들임을 보여준다.

이에 반해, 메이신을 150 ㎍/㎖ 또는 200 ㎍/㎖의 농도로 처리한 세포에서는 TUNEL(FITC-dUTP 처리)에서 핵 내의 절편화된 DNA에 염색된 초록색이 대조군에 비해 메이신의 농도 의존적으로 증가함을 확인할 수 있었다. 특히, 200 ㎍/㎖의 농도로 처리한 세포에서는 핵 내의 절편화된 DNA에 염색된 초록색이 강하고 광범위하게 나타나 DNA 단편화가 현저히 많이 발생했음을 확인할 수 있었다. 상기 대조군과 동일하게 이들 두 사진(PI 및 TUNEL)을 겹쳐서(Merge) 관찰한 결과, 그대로 PI 핵염색에 의한 빨간색과 TUNEL(FITC-dUTP처리)에 의한 초록색이 대부분 겹쳐져 연노랑색으로 관찰되었다.

이는 메이신 처리에 의해 세포의 핵부위에 DNA 단편화가 놀랍게 많이 일어나 세포가 사멸되고 있음을 보여준다. 또한, 메이신의 농도가 증가할수록 DNA 단편화도 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 나아가, 메이신이 전립선암세포의 사멸을 유도함으로써 메이신은 전립선암에 대해 항암효과가 있음을 확인할 수 있었다.

실시예 6: 세포 사멸 기전 조사

메이신의 전립선암 세포에 대한 암세포 사멸 기전을 조사하기 위해, 세포 생존과 사멸에 관여하는 대표적인 신호전달 경로인 PI3K(Phosphoinositide 3-kinase)/Akt(Protein Kinase B) 신호전달을 통한 세포 사멸 기전을 웨스턴 블렛(western blot) 방법으로 조사하였다. 조사 결과는 도면 9에 나타냈다.

구체적으로, PI3K/Akt 신호경로는 세포의 증식이나 분화에 관여하는 것으로 알려져 있으며, 여러 암종에서 Akt가 과활성화 되는 것으로 밝혀져 있다.

도 9에서 확인되는 바와 같이, 메이신을 이용하여 항-아폽토틱 단백질인 Akt의 인산화를 측정한 결과, 아무것도 처리하지 않은 대조군에서는 Akt의 과인산화가 관찰된 반면, 처리한 메이신의 농도가 증가함에 따라 농도 의존적으로 Akt의 인산화가 감소함을 확인할 수 있었다.

이는 메이신이 전립선암세포에서 나타내는 세포사멸이 세포생존에 관여하는 PI3K/Akt 신호전달경로를 차단함으로써 일어난다는 것을 의미한다고 할 수 있다.

실시예 7: 항암제와의 동반상승효과( synergy effect ) 조사

암 치료에 있어서 아직도 해결되지 못하고 있는 문제 중의 하나인 항암제에 대한 약제 저항성에 대해 메이신을 함께 처리하였을 때 약제의 동반상승효과 (synergy effect)를 알아보기 위해 종래의 항암제인 5-플루오로라실(5-FU; 5-fluorouracil), 에토포시스(etoposide), 시스플라틴(cisplatin) 또는 캠토테신(camptothecin)과 메이신 50 ㎍/㎖을 함께 처리한 후, 암세포 성장 억제 효과는 MTT assay에 따라 조사하였다. 조사 결과는 도면 10에 나타냈다.

도 10에서 확인되는 바와 같이, 메이신을 50 ㎍/㎖을 처리한 군과 종래의 항암제인 5-FU, etoposide, cisplatin 또는 camptothecin만을 처리한 군은 아무것도 처리하지 않은 군과 비교하여 전립선암 세포의 생존율이 약 30 ~ 40 %가 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 메이신과 종래의 항암제를 함께 처리한 군들은 항암제만을 단독으로 처리한 군과 비교하여 전립선암 생존율이 약 20 ~ 30 % 더 감소한 것을 확인할 수 있었다.

이로 인해, 메이신은 종래의 항암제들과 함께 사용할 때 동반상승효과를 나타냄을 알 수 있었다.

상기 실시예를 통해 확인할 수 있듯이, 본 발명의 메이신은 pro-caspase-3 단백질 감소 및 이를 통한 활성화 및 Bcl-2의 단백질 발현을 감소시켜 전립선암세포의 사멸을 촉진하며, Akt 및 ERK의 인산화를 억제하여 PI3K/Akt 신호전달경로를 차단함으로써 전립선암세포의 사멸을 유도하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 본 발명의 메이신은 미토콘드리아의 막전위를 감소시켜 전립선암세포의 사멸을 유발하며, 전립선암세포의 DNA 단편화를 증가시켜 전립선암에 대한 탁월한 항암효과를 확인할 수 있었다. 상술한 바와 같은 결과를 종합해 봤을 때, 본 발명의 메이신은 전립선암세포의 예방 및 치료용 조성물에 유효성분으로 적합한 것을 알 수 있었다.

Claims

옥수수수염으로부터 유래한 메이신을 유효성분으로 포함하고,
pro-caspase-3 단백질 발현 감소;
Bcl-2의 단백질 발현 감소;
Akt의 인산화 억제; 및
미토콘드리아 막전위 감소;로 구성되는 군에서 선택된는 1종 이상의 효능을 통해 전립선암세포 사멸(apoptosis)을 촉진하는 것을 특징으로 하는 전립선암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
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제1항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 메이신 25 ~ 200 ㎍/㎖의 농도로 포함하는 것을 특징으로 하는 전립선암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제7항에 있어서, 상기 약학적 조성물을 처리하지 않은 대조군에 비해 전립선암 세포가 20% ~ 90% 정도 사멸하는 것을 특징으로 하는 전립선암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
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옥수수수염으로부터 유래한 메이신을 유효성분으로 포함하고,
pro-caspase-3 단백질 발현 감소;
Bcl-2의 단백질 발현 감소;
Akt 인산화 억제; 및
미토콘드리아 막전위 감소;로 구성되는 군에서 선택되는 1종 이상의 효능을 통해 전립선암세포 사멸(apoptosis)을 촉진하는 것을 특징으로 하는 전립선암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 포함하는 전립선암 예방 또는 개선용 건강기능성 식품.
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