KR20230150914A - 연자방 추출물을 포함하는 폐암의 예방, 개선, 또는 치료용 조성물 - Google Patents

연자방 추출물을 포함하는 폐암의 예방, 개선, 또는 치료용 조성물 Download PDF

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KR20230150914A
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Abstract

본 발명은 연자방 추출물을 포함하는 조성물에 관한 것으로, 폐암 세포의 증식을 억제하고 세포 사멸을 유도하므로 폐암 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 개선용 식품으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

연자방 추출물을 포함하는 폐암의 예방, 개선, 또는 치료용 조성물 {Composition for Preventing, Ameliorating, or Treating Lung Cancer Comprising Lotus Seedpod Extract}
본 발명은 연자방 추출물을 포함하는 폐암의 예방, 개선, 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
연(Nelumbo nucifera, Lotus)은 쌍떡잎 식물 미나리아재비목 수련과의 여러해살이 수생식물로, 진흙 속을 가로 기는 땅속줄기는 마디가 있고 희고 가늘며, 가을에 비대해져서 연근이 된다. 이 연근에서 잎이 되는 줄기와 꽃이 피는 줄기가 생기며, 꽃은 여름에 피고 열매는 가을에 맺는다. 열매는 벌집모양으로 생긴 연자방이라고 불리는 씨방 속에 생기며, 씨앗은 연자라 불린다. 연의 줄기인 연근, 씨앗인 연자육(연자, 연밥), 씨앗 내 배아인 연자심, 씨방인 연자방(연방), 연잎, 연꽃, 땅 속 줄기의 마디인 우절 등은 약용 또는 식용을 사용되고 있다.
폐암은 남녀 모두의 성별에서 두 번째로 흔히 발생하는 암으로, 모든 암에서 15%를 차지한다. 2011년 미국 암 학회(America cancer society)의 보고에 따르면 한 해 22만 환자 이상이 폐암으로 진단을 받으며 이중 약 70%가 사망에 이르는데, 이는 전체 암 사망 환자의 27%를 차지한다. 또한, 통계청에 따르면 2019년 한국인 사망자 수는 29만 5100명이며, 사망 원인 1위 악성신생물(암)이 27.5%를 차지하였다. 그 중 폐암으로 인한 사망자는 10만명 당 사망자 36.2 명으로 가장 높은 사망률을 보이고 있다.
이러한 폐암 중에서도 비소세포성 폐암(non-small lung cancer)은 상피성 암(carcinoma)의 일종으로 소세포성 폐암(small lung cancer)이 아닌 모든 상피성 폐암(epithelial lung cancer)을 일컬으며, 폐암 전체의 약 85% 내지 90%를 차지한다. 비소세포성 폐암의 증상은 지속적인 기침, 흉부 통증, 체중감소, 손톱 손상, 관절 통증, 호흡의 단기화(shortness of breath) 등이 있으나, 비소세포성 폐암은 일반적으로 초기에는 그 증상을 거의 나타내지 않아 조기 발견 및 치료가 어렵고, 어느 정도 진행된 후 에야 발견될 가능성이 높다.
따라서 폐암의 진행을 억제하면서 암세포의 사멸을 유도할 수 있는 물질이 있다면, 폐암을 진단 받은 환자들에게 유용하게 사용될 수 있을 것이다.
대한민국 등록공보 제10-1865148호(2018.05.31)
일 양상은 연자방 추출물을 포함하는 폐암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
다른 양상은 연자방 추출물을 포함하는 폐암 예방 또는 개선용 식품조성물을 제공하는 것이다.
일 양상은 연자방 추출물을 포함하는 폐암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
상기 연자방은 연꽃의 씨앗이 있는 곳으로, 벌집모양으로 생긴 씨방일 수 있다. 또한 상기 연자방은 연꽃의 씨앗을 분리해 씨방만 포함한 것일 수 있고, 씨앗과 씨방을 모두 포함하고 있는 것일 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 추출물은 물, C1 내지 C4 의 알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출되는 것일 수 있으며, 저급 알코올로는 에탄올을 이용하는 것이 바람직하다. 구체적으로는 물, 에탄올 또는 이들의 혼합용매를 이용하는 것일 수 있으며, 더 구체적으로는 70% 에탄올을 이용하는 것일 수 있다.
상기 추출은 열 추출, 환류 냉각 추출, 초음파 추출, 여과 추출, 침지 추출 등의 추출 방법을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 여과 추출 방법일 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 추출물은 Axl의 발현을 억제하는 것일 수 있다.
상기 Axl은 세포 생존, 증식, 세포 사멸 및 전이와 관련된 다양한 세포의 신경 전달 경로를 조절하는 유전자일 수 있다.
본 발명의 실시예에서, 연자방 추출물을 처리하였을 때 폐암 세포의 생존율이 감소되는 것, 세포사멸을 유도하는 H2AX가 인산화되는 것을 확인하였으며, Axl mRNA 및 단백질의 발현이 억제되는 것을 확인하였다. 또한, Axl을 과발현 시켰을 때 연자방 추출물의 세포 증식 억제 효과 및 군집 형성 효과가 감소되는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명은 연자방 추출물은 Axl 발현이 억제되므로 항암 효과를 나타내는 것일 수 있다.
상기 폐암은 소세포성 폐암 또는 비소세포성 폐암일 수 있으며, 일 구체예에 따르면 상기 폐암은 비소세포성 폐암일 수 있다.
본 발명의 용어 '예방'은 상기 조성물을 통해 폐암이 발생하는 것을 지연시키거나 억제하는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 용어 '치료'는 상기 조성물을 통해 폐암의 암세포를 사멸하거나 증식하는 것을 억제하는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구 투여(예를 들어, 도포 또는 정맥 내, 피하, 복강 내 주사)할 수 있으나 경구 투여가 바람직하다. 비경구 투여를 위한 제제로는 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 멸균된 수용액, 액제, 비수성용제, 현탁제, 에멀젼, 시럽, 좌제, 에어로졸 등의 외용제 및 멸균 주사제제의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 바람직하게는 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제의 피부 외용 약학적 조성물을 제조하여 사용할 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다. 국소투여의 조성물은 임상적 처방에 따라 무수형 또는 수성형일 수 있다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
경구 투여를 위한 고형제제에는 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 연질캅셀제, 환 등이 포함된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 에어로졸 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
상기 조성물은 투여를 위해서 연자방 추출물 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형 등으로 제제화할 수 있다.
본 발명에 따른 약제학적으로 허용가능한 첨가제는 상기 조성물에 대해 0.1~90 중량부 포함되는 것이 바람직하다.
본 발명의 조성물의 바람직한 투여량은 체내에서 활성성분의 흡수도, 환자의 연령, 성별 및 비만의 정도에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 경구 투여제의 경우 일반적으로 성인에게 1일에 체중 1㎏당 본 발명의 조성물을 1일 0.0001 내지 100 ㎎/㎏으로, 바람직하게는 0.001 내지 100 ㎎/㎏으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수 회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
다른 양상은 연자방 추출물을 포함하는 폐암 예방 또는 개선용 식품조성물을 제공하는 것이다.
상기 연자방, 추출물, 폐암, 예방에 관한 설명은 상기에 기재된 바와 같다.
본 발명의 용어 '개선'은 폐암의 진행을 완화 또는 억제하는 모든 행위를 의미한다.
상기 식품조성물은 건강식품 조성물일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 연자방 추출물을 식품 또는 음료 첨가물로 사용할 경우, 상기 연자방 추출물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용되고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 상기 연자방 추출물의 혼합양은 그의 사용목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 초콜릿류, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있다.
음료수로 제형화할 경우에 연자방 추출물 이외에 첨가되는 액체 성분으로는 이제 한정되지는 않으나, 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드(예, 포도당, 과당 등), 디사카라이드(예, 말토오스, 수크로오스 등) 및 폴리사카라이드(예, 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당), 및 자일리톨, 소르비톨, 에리스리톨 등의 당 알코올이다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖ 당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제[타우마린, 스테비아 추출물(예, 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)] 및 합성 향미제(예, 사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 증진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.
또한 본 발명의 식품 조성물은 과일 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 단독으로 또는 조합으로 사용될 수 있으며, 이러한 첨가제의 비율은 조성물 전체 중량당 0.001 내지 50 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
본 발명의 연자방 추출물은 폐암 세포의 증식을 억제하고 세포 사멸을 유도하므로 폐암 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 개선용 식품으로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1의 A는 A549 세포에, B는 H460 세포에 연자방 추출물(이하 'LSPE')를 24 시간 또는 48 시간 동안 처리하였을 때 세포의 생존율을 확인한 것이다.
도 2의 A는 A549 세포 또는 H460 세포에 LSPE를 농도 별로 처리하였을 때 세포 군집 형성 정도를 이미지로 확인한 데이터이고, B는 군집 형성 정도를 OD570nm에서 확인하여 나타낸 그래프이다.
도 3의 A는 A549 세포에서, B는 H460 세포에서 LSPE 처리 농도에 따라 PARP, 절단된 PAR 및 γ-H2AX의 단백질 발현 정도를 확인한 데이터이다.
도 4는 A549 세포 및 H460 세포의 Axl 단백질 발현 정도를 확인한 데이터이다.
도 5는 A549 세포 및 H460 세포의 Axl mRNA 발현 정도를 확인한 데이터이다.
도 6은 LSPE 농도 및 처리 시간에 따른 Axl 프로모터 활성을 측정한 데이터이다.
도 7은 기본 벡터(이하 'pcDNA3' 벡터)를 포함하는 H460 세포와 Axl 프로모터가 있는 벡터(이하 'pcDNA3-Axl' 벡터)를 포함하는 H460세포에서 Axl 단백질 발현을 비교한 데이터이다.
도 8은 pcDNA3 벡터를 포함하는 세포(이하 'pcDNA3 세포')와 pcDNA3-Axl 벡터를 포함하는 세포(이하 'pcDNA3-Axl 세포')에 LSPE 처리하고 24 시간 또는 48 시간 후 세포 생존율을 확인한 데이터이다.
도 9의 A는 LSPE의 처리에 따른 pcDNA3 세포와 pcDNA3-Axl 세포 군집 형성 정도를 이미지로 확인한 데이터이고, B는 A의 군집 형성 정도를 그래프로 나타낸 데이터이다.
도 10은 LSPE의 처리에 따른 pcDNA3 세포와 pcDNA3-Axl 세포의 PARP, 절단된 PARP, γ-H2AX의 단백질 발현 정도를 확인한 데이터이다.
도 11은 LSPE 처리하였을 때 Axl에 특이적인 siRNA에 형질 감염된 H460 세포(이하 'H460/siAxl 세포')와 대조군 siRNA로 형질 감염된 대조군 H460 세포(이하 'H460/siCtrl 세포')에서 Axl 단백질 발현 정도를 확인한 데이터이다.
도 12의 A는 LSPE 처리하였을 때, H460/siAxl 세포와 H460/siCtrl 세포의 세포 생존율 변화를 확인한 데이터이고, B는 LSPE 처리하였을 때 H460/siAxl 세포와 H460/siCtrl 세포의 세포 군집 형성 정도를 확인한 데이터이다.
도 13은 LSPE 처리하였을 때 H460/siAxl 세포와 H460/siCtrl 세포의 PARP, 절단된 PARP 및 γ-H2AX의 단백질 발현하는 정도를 확인한 데이터이다.
이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통해 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실험예 1. 시료 준비
건조된 연자방(500g, 참누리, 서울)을 분쇄한 다음 70% 에탄올(6L)로 밤새 여과하여 추출하였다. 추출한 추출물을 혼합한 후, 회전 증발기(ETELA Co., Tokyo, Japan)를 사용하여 40℃ 미만의 온도에서 진공농축 하였다. 진공 농축하여 얻어낸 에탄올 추출물 3.8 g을 실험에 사용하였다. 비소세포성 폐암의 세포인 A549 및 H460 세포는 American Type Culture Collection(Manassaas, VA, USA)에서 구입하였다. Axl용 프라이머와 글리세르 알데히드 3-인산탈수소 효소(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase; GAPDH)는 국내 회사 인바이오니어(대전)에서 합성했다. TRI 시약은 (주)솔젠트(대전)에서 구입하였다. AmpliTaq DNA 중합효소는 Toche Diagnostics Corp(Indianapolis, IN, USA)에서 구입하였다. 리포펙타민 2000 및 포유류 발현 벡터인 pcDNA3은 Invitrogen(Carlsbad, CA, USA)에서 입수하였다. 플라스미드, pGL3 기본 벡터 및 Dual-Glo 루시퍼라제 분석 키트는 Promega Corp(Madison, WI, USA)에서 구입하였다. Axl-targeting siRNA 및 control siRNA는 Bioneer Corp에서 구입하였다. 웨스턴 블롯 분석을 위한 β-actin, Axl, phosphor-H2X, PARP, 및 GAPDH의 항체와 2차 항체는 Santa Cruz Biotechnology(Dallas, TX, USA)에서 구입하였다.
실험예 2. 세포 배양
A549 및 H460 세포는 10% 소태아혈청(FBS), 2 mM L-글루타민, 10 U/ml 페니실린 및 10 g/ml 스트렙토마이신을 함유하는 Roswell Park Memorial Institute(RPMI) 1640 배지(Gibco BRL)에서 수포화된 5% CO2 대기, 37℃ 에서 배양하였다.
실험예 3. 프로모터 활성 측정
전사 시작 지점의 -556 내지 +7 bp 영역을 포함하여, Axl 프로모터 부위를 포함하는 pGL3-Axl 프로모터 리포터 플라스미드를 제작하였다. PCR은 2 ul 게놈 DNA와 서열번호 1 및 2로 이루어진 프라이머를 각 1 ul로 수행되었으며, 94℃에서 3분동안 1싸이클, 34℃에서 30초동안 30싸이클, 65℃에서 30초, 72℃에서 5분동안 1싸이클을 조건으로 하였다. PCR로 증폭된 DNA 단편은 프로모터 없는 루시퍼라제 플라스미드인 pGL3-기본 벡터에 서브 클론닝하였다. 구축된 프로모터-리포터 플라스미드를 레닐라 루시퍼라제 벡터(renilla luciferase vectors)인 pRL-SV40를 대조군으로 사용하여, 세포(60mm dish에 3 X 105 cells)로 공동 형질 감염을 시켰다. 루시퍼라제 활성은 Dual-Glo luciferase 분석 시스템을 사용하여 측정하였다. 제조업체의 지침(Promega Corp, Madison, WI)에 따라 루시퍼라제 분석을 수행하였다. 간단히 설명하면, Passive Lysis Buffer를 사용하여 4시간 또는 8시간동안 연자방 추출물이 0, 20, 40 및 80 ug/ml로 처리된 세포뿐만 아니라 대조군 세포까지 세포 용해물(cell lysate)로 만들었다. 세포 용해물(cell lysates) 20ul는 파이어플라이 루시퍼라제 시약(firefly luciferase assay reagent Ⅱ) 100ul와 혼합한 후 파이어플라이 루시퍼라제 활성을 측정하여 Axl 프로모터의 활성을 측정하였다. 그 후, Stop & GloTM 시약 100ul를 반응 혼합물에 첨가한 후 레닐라 루시퍼라제(Renilla luciferase) 활성도 측정하였다. 그 후, 레닐라 루시퍼라제(Renilla luciferase) 활성에 대한 파이어플라이의 비율을 계산하였다.
서열번호 종류 염기서열 (5'> 3')
서열번호 1 Axl promoterSnese primer GAAGGTACCAATGAAGGGCCAAGGAGGC
서열번호 2 Axl promoterAnti-sense primer TTGGATCCGCACCGCCACGCCATGGGTG
실험예 4. 웨스턴 블롯 분석
전체 세포 용해물은 연자방 추출물(lotus seedpod extract:LSPE)을 제시된 농도 0, 20, 40, 80 ug/ml에 맞게 처리한 세포에 lysis buffer[1% Triton X-100, 50 mM Tris(pH 8.0), 150 mM NaCl, 1 mM phenylmethylsulfontl fluoride(PMSF), 1 mM Na-3VO4, protease inhibitor cocktail]를 사용하여 제조하였다. 연자방 추출물을 처리하지 않은 세포는 대조군으로 사용하였다. 단백질의 농도는 Bio-Rad protein assays를 사용하여 결정하였다. 세포 용해물 20~40 ug으로부터 12% SDS(Sodium dodecyl sulfate)-PAGE(Poylacrylamide gel electrophoresis)로 분리하고, 니트로셀룰로오스 멤브레인(nitrocellulose membrane)으로 전기이동을 시켜 단백질을 분리하였다. 멤브레인은 5% 탈지분유를 포함하는 0.05% Tween-20(TTBS)와 Tris-buffered saline으로 30분간 실온에서 블록킹하고, 1차 항체를 포함한 TTBS를 4시간동안 실온에서 인큐베이션하였다. 그 후 TTBS로 10분간 세척하는 것을 3번 반복하였으며, 멤브레인은 peroxidase conjugated 2차 항체로 1시간동안 인큐베이션하였다. 10분간 TTBS로 3번 반복하여 세척하고, 단백질 밴드를 화학발광 감지 시스템(AmershamTM ECLTM Prime Western Blotting Detection Reagent; GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA)을 사용하여 확인하였다. 각 단백질의 농도는 LAS-3000 Fujifilm Image Reader과 Multi-Guage 3.0 software을 사용하여 측정하였고, Axl 단백질 수준은 GAPDH 수준으로 표준화하였다.
실험예 5. 역전사 PCR 분석
2x105 세포를 6 웰 세포 배양 접시에 분주하여 하룻동안 배양하고, 연자방 추출물 0, 20, 40, 80 ul/ml를 처리하여 8시간 배양하였다. TRI reagent를 사용하여 추출한 총 RNA를 이용하여 cDNA 합성 후 PCR하였다. PCR에 사용된 Axl 프라이머와 GAPDH 프라이머는 하기 표 2의 프라이머를 사용하였다.
서열번호 이름 염기서열
서열번호 3 Axl sense primer AACCTTCAACTCC TGCCTTCTCG
서열번호 4 Axl anti-sense primer CAGCTTCTCCTTCAGC TCTTCAC
서열번호 5 GAPDH sense primer GGAGCCAAAAGGGTCAT CAT
서열번호 6 GAPDH anti-sense primer GTGATGGCATGGACTGTGGT
실험예 6. 세포 생존율 측정
세포의 생존율은 Cell counting kit-8 assay kit(Dofindo Laboratories, Kumamoto, Japan)를 사용하여 측정하였다. 96 웰 플레이트에 세포 1x103 세포를 분주하여 하룻동안 배양한 후, 연자방 추출물을 0, 20, 40, 80 ug/ml를 24 또는 48시간 동안 처리하였다. 처리가 끝난 후, 10 ul의 CCK-8 솔루션을 첨가하고 4시간 동안 더 배양하였다. 570nm에서 microplate reader(Model 680 microplate reader, Bio-Rad LAboratories)로 흡광도를 측정하였다. 데이터 값은 추출물을 처리하지 않은 대조군 세포 값을 정규화하여 생존율 %를 결정하고, 대조군 세포에 대한 생존 세포의 백분율로 표현하였다.
실험예 7. 군집 형성 분석(Colony formation assay)
세포는 24웰 플레이트에 1x103 또는 2x103으로 분주하고, 연자방 추출물을 각 농도에 맞게 0, 20, 40, 80 ug/ml로 24시간동안 처리하였다. 그 후, PBS로 세척하여 연자방 추출물을 제거하였다. 그 후, 세포를 7~10일간 배양하여 군집을 형성하게 하였다. 크리스탈 바이올렛(in 60% methanol; Junsei Chemical CO., Ltd., Tokyo, Japan)으로 군집을 염색하였고, RAS-3000 Image Analysis System(FujiFilm, Tokyo, Japan)을 사용하여 이미지를 획득하였다. 군집의 수를 정량화하기 위하여, 10% 아세트산을 사용하여 군집에서 크리스탈 바이올렛 염료를 추출하고 분해된 크리스탈 바이올렛 염료의 광학 밀도를 570 nm 에서 흡광도를 측정하였다.
실험예 8. Axl 과발현 측정
이소성적인 Axl 발현을 위하여, pcDNA3-Axl은 pcDNA3 벡터의 EcoRI와 BamHI 사이로 Axl cDNA를 복제함으로써 구축하였다. 그 후, 정제된 플라스미드 pcDNA3-Axl 2 ug을 Lipofectamine 2000(Invitrogen)을 사용하여 H460 세포가 3x105 있는 100 mm dish에서 세포에 형질 도입하였다. Axl을 발현하는 안정적인 세포주를 구축하기 위해, 형질 도입한 세포는 G418 400ug/ml의 존재하에 배양하였다. G418을 포함하는 RPMI 1640 배지는 3일마다 교체해주었다. 3~4주 후, Axl을 발현하는 세포는 농축되었고, 이 세포에서 Axl 발현은 웨스턴 블롯을 통해서 분석하였다.
실험예 9. 작은 간섭 RNA 형질 도입
유전자 억제(Gene silencing)를 매개하는 RNA 간섭은 Axl 단백질 정도를 줄이기 위해 수행하였다. 60 mm 배양접시에 H460 5 x 105 세포를 분주하고, 하룻동안 배양한 후, Axl을 타켓팅하는 100 nM siRNA 또는 대조군 siRNA로 형질 전환하였다. 세포는 형질전환 후 24 또는 36시간이 되었을 때 수확하였고, 단백질 발현과 세포 증식을 평가하였다.
실험예 10. 통계적 분석
각 실험은 3번 반복적으로 수행되었고, 결과 값은 평균±표준 편차(SD)로 표시하였다. 통계처리는 스튜던트 t-테스트로 하였으며, p값이 0.05 이하인 경우를 유의한 차이로 간주하였다.
실시예 1. 연자방 추출물의 비소세포성 폐암 세포 증식 억제 및 세포사멸 유도 여부 확인
비소세포성 폐암의 세포인 A459와 H460세포에서 연자방 추출물의 독성 평가를 하였다. 각 세포에 연자방 추출물 10, 20, 40, 80 ug/ml을 24시간, 48시간 동안 처리하고, 세포 생존율을 측정하였다.
도 1에서 보이는 바와 같이, A459 세포와 H460 세포 모두 연자방 추출물의 농도 의존적으로 세포생존율이 감소하였다. 특히 48시간 처리시, 연자방 추출물의 IC50 값은 A549 세포에서 53.37 ug/ml, H460 세포에서 36.85 ug/ml 였다. 비소세포성 폐암의 증식에 대한 연자방 추출물의 효과는 군집 형성 분석을 통하여 확인하였다.
도 2에서 보이는 바와 같이, A549와 H460 세포의 군집성은 연자방 추출물의 용량에 의존적으로 억제되는 것을 확인하였다. 따라서 세포 생존율과 군집 형성 분석을 통해 연자방 추출물의 비소세포성 폐암 세포의 억제 효과를 확인하였다.
연자방 추출물의 세포사멸 유도성을 확인하기 위하여, 연자방 추출물을 10, 20, 40, 80 ug/ml 농도로 24시간동안 처리하였을 때 암세포의 DNA 복구를 방지하고 세포 사멸을 유도하는 폴리(ADP-ribose)-중합효소(PARP)의 절단 및 DNA 손상을 의미하는 H2AX 인산화 여부를 확인하였다.
도 3에서 보이는 바와 같이, PARP의 감소와 PARP의 절편 증가를 웨스턴 블롯을 통해서 확인하였다. 또한, A549 세포에서 인산화된 H2AX인 γ-H2AX의 유도는 연자방 추출물의 용량 의존적이었으나 H460 세포에서는 γ-H2AX가 연자방 추출물 40 및 80 ug/ml 처리에 의해 급격히 증가하는 것을 확인하였다.
이러한 결과는 연자방 추출물의 세포사멸 촉진 효과를 나타내며, 항증식 효과를 나타낸다는 것을 확인하였다.
실시예 2. 연자방 추출물 처리에 따른 전사 단계의 Axl 발현 감소 여부 확인
Axl은 수용체티록신인산화효소(receptor tyrosine kinase: RTK)이며, 세포 생존과 증식에 중요한 신호를 전송한다. Axl 억제는 종양 성장을 억제하고 세포 사멸을 촉진하므로, Axl의 단백질 발현 수준을 확인하였다.
도 4에서 보이는 바와 같이, 연자방 추출물이 처리된 세포에서 웨스턴 블롯 분석은 연자방 추출물에 노출된 A549 세포 및 H460 세포에서 Axl 단백질 수준이 연자방 추출물의 용량 의존적으로 감소했음을 확인하였다. 특히, 연자방 추출물이 80 ug/ml로 처리된 H460 세포에서는 Axl이 거의 검출되지 않았다.
그 후, RT-PCR을 통해 Axl mRNA 발현에 대한 연자방 추출물의 억제 효과를 확인하였다.
도 5에서 보이는 바와 같이, 연자방 추출물의 처리에 따라 A549 및 H460 세포의 Axl mRNA 발현량이 유의하게 감소한 것을 확인하였다.
Axl 발현에 대한 연자방 추출물의 효과를 추가로 확인하기 위하여, 연자방 추출물 처리 후 Axl 프로모터의 활성을 측정하였다. Axl 프로모터-리포터 구축물(Axl promoter-reporter)을 포함하는 H460 세포를 연자방 추출물과 함께 2, 4, 및 8시간 동안 배양하였다.
도 6에서 보이는 바와 같이, 리포터 유전자 산물인 루시퍼라제(luciferase)의 활성은 용량의존적으로 감소하는 것을 확인하였고, 이것은 연자방 추출물이 비소세포성 폐암 세포에서 Axl 발현을 전사적으로 하향 조절함을 확인한 것이다.
실시예 3. Axl 과발현에 따른 연자방 추출물의 세포 항증식 및 전 세포사멸 효과 확인
연자방 추출물의 Axl 발현 억제 효과와 항증식 효과 사이의 관련성을 확인해보았다. Axl 유전자 및 대조군 세포를 이소성으로 발현하여 Axl이 과발현되는 H460/pcDNA3-Axl 세포, 대조군으로 빈 벡터를 보유한 H460/pcDNA3 세포를 0, 20, 40, 80 ug/ml 농도의 연자방 추출물로 24시간동안 처리하였다.
도 7에서 보이는 바와 같이, 연자방 추출물 처리 후에도 H460/pcDNA3-Axl 세포에서 Axl 단백질 수준은 H460/pcDNA3 세포에서보다 상당히 높았으며, 연자방 추출물 처리에 의한 Axl 단백질의 용량 의존적 감소는 Axl 과발현 세포와 대조군 세포 모두에서 확인되었다. 또한, 도 8에서 보이는 바와 같이, 연자방 추출물의 항증식 효과는 대조군 세포에 비해 Axl 과발현 세포에서 감소되는 것을 확인하였다.
도 9에서 보이는 바와 같이, 군집 형성 분석을 통하여 연자방 추출물 40 ug/ml에 의한 세포 증식 억제가 대조군 세포에서보다 Axl 과발현 세포에서 더 적은 것을 추가로 확인하였다. 또한, 도 10에서 보이는 바와 같이, 웨스턴 블롯 결과를 통해 PARP의 절단과 연자방 추출물의 γ-H2AX의 유도가 Axl 과발현 세포에서도 약화되어 연자방 추출물의 전 세포사멸 효과가 Axl 단백질 수준과 반비례한다는 것을 확인하였다.
실시예 4. Axl 발현의 RNA 간섭에 따른 연자방 추출물의 항암 활성 증가 여부
연자방 추출물의 Axl 발현 하향 조절이 항암 활성과 관련이 있는지 확인하기 위하여, Axl 특이적 siRNA인 siAxl로 형질 감염된 H460 세포에서 연자방 추출물이 세포 증식 및 세포 사멸유도에 미치는 영향을 관찰하였다.
도 11에서 보이는 바와 같이, 웨스턴 블롯 결과는 연자방 추출물 40 ug/ml로 처리한 H460/siAxl 세포의 Axl 단백질 수준이 대조군 siRNA로 형질 감염된 대조군 세포인 H460/siCtrl 세포의 Axl 단백질 수준보다 더 감소했음을 확인하였다.
도 12에서 보이는 바와 같이, Axl 과발현 세포와는 대조적으로, 세포 증식 및 군집 형성에 대한 연자방 추출물의 억제 효과는 대조군 세포인 H460/siCtrl 세포 대비 H460/siAxl세포에서 증가하였다. 도 13에서 보이는 바와 같이, 40 ug/ml 연자방 추출물의 처리시 PARP의 절단 및 γ-H2AX의 유도는 H460/siCtrl 세포 대비 H460/siAxl 세포에서 더 많이 증가하는 것을 확인하였다. 이를 통해 Axl 발현에 대한 RNA의 간섭이 연자방 추출물의 항증식 효과와 전 사멸유도 효과를 강화하는 것을 확인하였다.
<110> Dongguk University Gyeongju Campus Industry-Academy Cooperation Foundation <120> Composition for Preventing, Ameliorating, or Treating Lung Cancer Comprising Lotus Seedpod Extract <130> PN200404 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Axl promoter sense primer <400> 1 gaaggtacca atgaagggcc aaggaggc 28 <210> 2 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Axl promoter Anti-sense primer <400> 2 ttggatccgc accgccacgc catgggtg 28 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Axl sense primer <400> 3 aaccttcaac tcctgccttc tcg 23 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Axl promoter Anti-sense primer <400> 4 cagcttctcc ttcagctctt cac 23 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH sense primer <400> 5 ggagccaaaa gggtcatcat 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH Anti-sense primer <400> 6 gtgatggcat ggactgtggt 20

Claims (4)

  1. 연자방 추출물을 포함하는 폐암 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서,
    상기 추출물은 물, C1 내지 C4의 알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출되고,
    상기 추출물은 Axl의 발현을 억제하는 것인,
    비소세포성 폐암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 연자방 추출물을 포함하는 비소세포성 폐암 예방 또는 개선용 식품조성물.
  3. 연자방 추출물을 포함하는 시험관 내(in vitro) Axl 발현 저해용 조성물.
  4. 시험관 내(in vitro) 조건에서, 연자방 추출물 또는 후보 물질을 각각 비소세포성 폐암 세포에 별도로 처리하는 단계; 및
    상기 연자방 추출물이 처리된 비소세포성 폐암 세포의 Axl 발현량 대비, 상기 후보물질이 처리된 비소세포성 폐암 세포의 Axl 발현량이 동등하거나 그보다 낮을 경우, 상기 후보 물질을 비소세포성 폐암의 예방 또는 치료용 물질로 선택하는 단계를 포함하는,
    비소세포성 폐암의 예방 또는 치료용 물질 스크리닝 방법.

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