KR102174166B1

KR102174166B1 - 호모해링토닌을 유효성분으로 함유하는 세포노화 관련 질환 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR102174166B1
Application number: KR1020180161042A
Authority: KR
Inventors: 김재룡; 김억천; 정경진; 빈범호; 손유림
Original assignee: 영남대학교 산학협력단
Priority date: 2018-12-13
Filing date: 2018-12-13
Publication date: 2020-11-04
Also published as: KR20200072924A; WO2020122391A1; US20220023309A1; US11992492B2

Abstract

본 발명은 호모해링토닌을 유효성분으로 함유하는 세포노화 관련 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 상기 호모해링토닌을 유효성분으로 함유하는 조성물은 노화가 유도된 섬유아세포 및 신장세뇨관 세포를 선택적으로 사멸시키는 세노리틱스 효과를 나타낸 반면, 노화가 유도된 혈관내피세포, 상피 멜라닌세포 및 망막색소상피세포에서는 세포의 기능 및 형태를 복원시키는 세노모르픽스 효과를 나타내는 것으로 확인됨에 따라, 상기 호모해링토닌은 세포의 종류에 따라 다르게 작용하여 세포 노화에 의해 발병되는 노인성 안구질환, 조직 섬유화 질환, 죽상경화증, 골관절염, 퇴행성 뇌질환, 만성 피부손상, 비만 및 당뇨를 효과적으로 예방하거나 치료할 수 있으며, 피부 미백 및 수명연장용 조성물로 제공될 수 있다.

Description

호모해링토닌을 유효성분으로 함유하는 세포노화 관련 질환 예방 또는 치료용 조성물{Composition for preventing or treating cell senescence associated diseases comprising homoharringtonine}

본 발명은 노화세포의 종류에 따라 다르게 작용하는 호모해링토닌을 유효성분으로 함유하는 세포노화 관련 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

노화세포는 노화에 따라 개체의 조직 및 기관에 축적되며, 노화세포의 축적은 노화로 인한 조직과 기관의 기능 및 구조 변화를 유도할 뿐만 아니라, 암, 당뇨와 비만, 조직 섬유화증, 노인성 안질환, 심뇌혈관질환, 퇴행성뇌질환, 골관절염, 피부노화 및 만성 피부상처 등과 같은 다양한 노화관련 질환의 병인에 중요한 작용을 한다. 따라서 노화를 지연시키거나 극복하는 것이 암, 당뇨, 심혈관질환과 같은 노화관련 질환의 예방과 치료에 가장 효과적인 방법임이 제안되었다.

라파마이신, SIRT1 활성제, 칼로리제한 모방약, AMPK 활성제, 텔로머라제 활성제 등이 노화 제어 약물로 가능성이 제시되고 있으며, 이와 더불어 최근 노화세포를 표적으로 하는 세노세라퓨틱스(senotherapeutics)가 개발되어 세포 수준과 동물모델에서 그 효능이 보고되고 있다. 세노세라퓨틱스는 노화세포만 선택적으로 죽이는 세노리틱스 (senolytics)와 노화세포의 기능이나 형태를 젊은 세포처럼 복원하는 세노모르픽스 (senomorphics)로 구분된다.

세노리틱스로는 퀘르세틴(quercetin)과 Bcr-Abl protein kinase 저해제인 다사티닙(dasatinib), Bcl-2 kinase 저해제인 ABT263과 ABT737, BCL-XL 저해제인 A1331852과 A1155463, MDM2/p53 저해제인 UBX0101, p53 저해제인 FOXO4-DRI, HSP90 저해제인 17-DMAG가 최근 보고되었다. 세노모르픽스로는 mTOR 저해제인 라파마이신, IKK/NFkB 저해제, 자유 라디칼 제거제 및 JAK 저해제 등이 보고되었다.

이에 따라 노화 및 노화세포를 표적으로 하는 세노세라퓨틱스 개발을 통하여 노화관련 질환을 예방하거나 치료하기 위한 연구 개발이 활발히 진행되고 있다.

호모해링토닌(homoharringtonine, omacetaxine mepesuccinate)은 개비자나무(Cephalotaxus harringtonii)에서 추출한 천연물 단일성분으로 만성골수성백혈병(chronic myeloid leukemia) 치료제로 상용되고 있다. 그 작용 기전은 리보솜과 결합하여 단백질 번역을 저해하는 작용을 하는 것으로 알려져 있으나, 아직까지 세노세라퓨틱스 작용에 대해서는 보고된 바 없다.

대한민국 공개특허 제10-2018-0085124호 (2018.07.26. 공개)

본 발명은 호모해링토닌을 유효성분으로 함유하는 조성물을 제공하여 노화세포를 선택적으로 사멸시키거나 노화세포의 기능 및 형태를 복원시켜 세포 노화에 따른 질환을 개선하거나 치료하기 위한 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명은 호모해링토닌을 유효성분으로 함유하는 세노리틱스 조성물을 제공한다.

본 발명은 호모해링토닌을 유효성분으로 함유하는 세노모르픽스 조성물을 제공한다.

본 발명은 호모해링토닌을 유효성분으로 함유하는 세포노화 관련 질환 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.

본 발명은 호모해링토닌을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 호모해링토닌을 유효성분으로 함유하는 노화개선 또는 수명연장용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따르면, 호모해링토닌을 유효성분으로 함유하는 조성물은 노화가 유도된 섬유아세포 및 신장세뇨관 세포를 선택적으로 사멸시키는 세노리틱스 효과를 나타낸 반면, 노화가 유도된 혈관내피세포, 상피 멜라닌세포 및 망막색소상피세포에서는 세포의 기능 및 형태를 복원시키는 세노모르픽스 효과를 나타내는 것으로 확인됨에 따라, 상기 호모해링토닌은 세포의 종류에 따라 다르게 작용하여 세포 노화에 의해 발병되는 비만, 당뇨병, 퇴행성신경질환, 골관졀염, 죽상경화증, 만성 피부손상, 노인성 안구질환 및 조직 섬유화 질환을 효과적으로 예방하거나 치료할 수 있으며, 피부 미백 및 수명연장용 조성물로 제공될 수 있다.

도 1은 독소루비신에 의해 조기 노화된 사람 섬유아세포에서 호모해링토닌의 세노리틱스 작용을 확인한 결과로, 도 1A는 젊은 섬유아세포(HDF)와 독소루비신에 의해 조기 노화된 섬유아세포에 100 nM 라파마이신, 100 nM ABT263 및 100 nM 호모해링토닌을 처리하고, 4일 후, SAβG 활성 염색을 수행한 결과이며, 도 1B는 SAβG 활성 수준을 나타낸 결과이며, 도 1C는 세포생존도를 확인한 결과이다. HDF=human dermal fibroblasts, Young=젊은 세포, Dox=doxorubicin, NT=0.01% DMSO, Rap=100 nM rapamycin, ABT=100 nM ABT263, HHT=100 nM homoharringtonine. (** p<0.01, * p<0.05)
도 2는 복제노화된 사람 섬유아세포에서 호모해링토닌의 세노리틱스 작용을 확인한 결과로, 도 2A는 젊은 섬유아세포(HDF)와 복제노화 섬유아세포에 100 nM ABT263과 100 nM 호모해링토닌을 처리하고, 4일 후, SAβG 활성 염색을 수행한 결과이며, 도 2B는 호모해링토닌의 농도에 따른 세포생존도를 확인한 결과이며, 도 2C는 LDH 활성분석을 통한 세포독성효과를 확인한 결과이며, 도 2D는 세포사멸관련 단백질인 PARP 및 caspase-3의 발현수준을 확인한 웨스턴 블롯 분석결과이다. HDF=human dermal fibroblasts, Young=젊은 세포, Senescent=복제노화세포, NT=0.01% DMSO, ABT=100 nM ABT263, HHT=100 nM homoharringtonine. (*, p<0.05; **, p<0.01 vs NT; **, p<0.01 vs Young)
도 3은 독소루비신에 의해 조기 노화된 신장세뇨관세포(HK2)에서 호모해링토닌의 세노리틱스 작용을 확인한 결과로, 도 3A는 독소루비신에 의해 조기 노화된 사람 신장세뇨관세포(HK2)에 100 nM ABT263, 100 nM 라파마이신, 100 nM 호모해링토닌을 처리하고, 4일 후, 세포생존 수준을 확인한 세포사진이며, 도 3B는 CCK-8 분석 결과이다. HK2=human tubular epithelial cells, Dox=doxorubicin, NT=0.01% DMSO, Rap=100 nM rapamycin, ABT=100 nM ABT263, HHT=100 nM homoharringtonine. (**, p<0.01)
도 4는 독소루비신에 의해 조기 노화된 혈관내피세포에서 호모해링토닌의 세노모르픽스 작용을 확인한 결과로, 도 4A는 젊은 혈관내피세포(HUVEC)와 독소루비신에 의해 조기 노화된 혈관내피세포에 100 nM 라파마이신, 100 nM ABT263 및 100 nM 호모해링토닌을 처리하고 4일 후, SAβG 활성을 확인한 염색사진이며, 도 4B는 SAβG 활성 염색 수준을 나타낸 결과이며, 도 4C는 세포생존도를 확인한 결과이다. HUVEC=human umbilical vascular endothelial cells, Young=젊은 세포, Dox=doxorubicin, NT=0.01% DMSO, Rap=100 nM rapamycin, ABT263=100 nM ABT263, HHT=100 nM homoharringtonine. (*, p<0.05; **, p<0.001)
도 5는 복제노화된 혈관내피세포에서 호모해링토닌의 세노모르픽스 작용을 확인한 결과로, 도 5A는 젊은 혈관내피세포(HUVEC)와 복제노화 혈관내피세포에 100 nM 라파마이신 및 100 nM 호모해링토닌을 처리하고, 4일 후, SAβG 활성을 확인한 염색 사진이며, 도 5B는 SAβG 활성 염색 수준을 나타낸 결과이며, 도 5C는 p53과 p16 단백질의 발현 수준을 확인한 웨스턴 블롯 분석 결과이며, 도 5D는 호모해링토닌의 농도에 따른 세포증식율을 확인한 결과이며, 도 5E는 LDH 활성 분석을 통한 세포독성효과를 확인한 결과이다. HUVEC=human umbilical vascular endothelial cells, Young=젊은 세포, Senescent=복제노화세포, NT=0.01% DMSO, Rap=100 nM rapamycin, ABT=100 nM ABT263, HHT=100 nM homoharringtonine. (*, p<0.05; **, p<0.01)
도 6은 독소루비신에 의해 조기 노화된 망막색소상피세포(ARPE)에서 호모해링토닌의 세노모르픽스 작용을 확인한 결과로, 도 6A는 젊은 망막색소상피세포(ARPE)와 독소루비신에 의해 조기 노화된 망막색소상피세포에 100 nM 라파마이신 및 100 nM 호모해링토닌을 처리하고, 4일 후, SAβG 활성을 확인한 염색사진이며, 도 6B는 SAβG 활성 염색 수준을 나타낸 결과이며, 도 6C는 p53과 p16 단백질 발현 수준을 확인한 웨스턴 블롯 분석 결과이며, 도 6D는 호모해링토닌의 농도의존적으로 세포 증식수준을 확인한 결과이며, 도 6E는 LDH 활성 분석을 통한 세포독성효과 를 확인한 결과이다. ARPE=adult retinal pigmented epithelial cells, Young=젊은 세포, Dox=doxorubicin, NT=0.01% DMSO, ABT=100 nM ABT263, HHT=100 nM homoharringtonine. (**, p<0.01)
도 7은 복제노화된 멜라닌세포(HEM)에서 호모해링토닌의 세노모르픽스 작용을 확인한 결과로, 도 7A는 젊은 멜라닌세포(HEM)와 복제노화 멜라닌세포에 100 nM 라파마이신 및 100 nM 호모해링토닌을 처리하고, 4일 후, SAβG 활성을 확인한 염색사진이며, 도 7B는 복제노화세포의 생존수준을 확인한 결과이며, 도 7C는 복제노화세포의 SAβG 활성 염색 수준을 나타낸 결과이며, 도 7D는 세포돌기와 세포크기 (>30 μm)에 따른 노화세포의 수를 확인한 결과이며, 도 7E는 젊은 세포의 세포 증식에 미치는 호모해링토닌의 효과를 확인한 결과이다. HEM=human epidermis melanocytes, Young=젊은 세포, Senescent=복제노화 세포, NT=0.01% DMSO, Rap=100 nM rapamycin, HHT=100 nM homoharringtonine, BT=before HHT treatment. (**, p<0.01 vs NT)
도 8은 생쥐에서 신장 허혈-재관류 손상으로 유도된 신장 섬유화에 대한 호모해링토닌의 효능을 확인한 결과로, 도 8a의 8A는 실험과정을 나타낸 모식도이며, 8B는 실험 전과 신장 절제 후 체중변화를 확인한 결과이며, 8C는 혈장 크레아티닌 농도를 나타낸 결과이며, 8D는 혈장 BUN 농도를 나타낸 결과이며, 도 8b의 8E는 조직 표본의 헤마톡실린-에오신 염색, 트리크롬 염색 및 PAS 염색 결과이며, 8F는 조직 표본에서 트리크롬 염색 후, 섬유화 정도를 확인한 결과이며, 도 8c의 8G는 조직에서 세포노화 정도를 확인한 Sudan Black B 염색결과이며, 도 8d의 8H는 조직 내 지질 과산화물 수준을 확인한 결과이며, 8I는 조직에서 MDA 분석을 수행한 결과이며, 8J는 조직 내 초과산화물 (superoxides) 수준을 확인한 결과이며, 8K는 조직 내 4-HNE 및 p16 단백질의 발현 수준을 확인한 웨스턴 블롯 분석결과이며, 도 8e의 8L은 조직 단백질들에 대한 웨스턴 블롯 분석결과이며, 8M은 웨스턴 블롯 결과에 대한 densitometry 분석 결과이다. Sham=허혈-재관류 손상 없음, PBS=허헐-재관류 손상, HHT=허혈-재관류 손상 후 호모해링토닌 복강 주사, UIRI=왼쪽 신장 허혈-재관류 손상, UNx=오른쪽 신장 절제, PAS=periodic acid-Schiff, MDA=malondialdehyde, 4-HNE=4-hydroxynonenal, pRb=phosphorylated Rb, COL1=collagen type I, α-SMA=alpha-smooth muscle actin, SOD2=superoxide dismutase 2. (**, p<0.01, *, p<0.05).
도 9는 생쥐에서 CHG에 의한 복막 섬유화에 대한 호모해링토닌의 효능을 확인한 결과로, 도 9A는 실험과정을 나타낸 모식도이며, 도 9B는 실험 과정에서 체중변화를 확인한 결과이며, 도 9C는 복벽 조직 표본에서 헤마톡실린-에오신, 트리크롬 염색을 수행한 결과이며, 도 9D는 조직 표본에서 복막 중피세포증의 두께를 확인한 결과이다. CHG=chlorhexidine gluconate, D=호모해링토닌 또는 DMSO 복강 주사, NT=not treated, DMSO=DMSO 복강 주사, HHT=호모해링토닌 복강 주사 (**, p<0.01).

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

동물모델에서 조직에 존재하는 노화세포를 제거할 경우, 노화로 인한 조직 및 기관의 구조와 기능이 개선되어 노화 관련 질환이 치료되고, 건강수명이 증가하는 것으로 보고됨에 따라, 본 발명의 발명자들은 노화 및 노화세포를 표적으로 하는 세노세라퓨틱 연구를 진행하던 중 호모해링토닌이 노화 세포의 종류에 따라 다르게 작용하여 세포 노화에 따른 질환을 개선하고 세포의 수명을 연장시키는 효과를 나타내는 것을 확인함에 따라 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 호모해링토닌을 유효성분으로 함유하는 세노리틱스 조성물을 제공할 수 있다.

상기 세노리틱스는 노화세포를 선택적으로 사멸시키는 것일 수 있다.

상기 노화세포는 약물처리 또는 계대배양으로 노화가 유도된 섬유아세포 및 신세뇨관상피세포로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

본 발명은 호모해링토닌을 유효성분으로 함유하며, 상기 호모해링토닌은 생체 외(in vitro)에서 노화된 세포를 사멸시키는 것을 특징으로 하는 세노리틱스용 시약조성물을 제공할 수 있다.

또한, 본 발명은 생체 외에서 사람을 제외한 포유류로부터 분리된 섬유아세포 또는 신세뇨관상피세포에 호모해링토닌을 처리하는 단계를 포함하는 노화세포 사멸 방법을 제공할 수 있다.

본 발명은 호모해링토닌을 유효성분으로 함유하는 세노모르픽스 조성물을 제공할 수 있다.

상기 세노모르픽스는 노화세포의 기능을 정상세포로 회복시키는 것일 수 있다.

상기 노화세포는 약물처리 또는 계대배양으로 노화가 유도된 혈관내피세포, 망막색소상피세포 및 멜라닌 세포로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.

본 발명은 호모해링토닌을 유효성분으로 함유하며, 상기 호모해링토닌은 생체 외(in vitro)에서 노화된 세포의 기능 또는 형태를 정상세포로 회복시키는 것을 특징으로 하는 세노모르픽스용 시약조성물을 제공할 수 있다.

또한, 본 발명은 생체 외에서 사람을 제외한 포유류로부터 분리된 혈관내피세포, 망막색소상피세포 또는 멜라닌 세포에 호모해링토닌을 처리하는 단계를 포함하는 노화세포의 기능 또는 형태를 정상세포로 회복시키는 방법을 제공할 수 있다.

본 발명은 호모해링토닌을 유효성분으로 함유하는 세포노화 관련 질환 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공할 수 있다.

상기 호모해링토닌은 노화세포를 선택적으로 사멸시키거나 노화세포의 기능 또는 형태를 정상세포로 회복시켜 세포노화에 의해 유도되는 질환을 예방하거나 치료하는 것일 수 있다.

상기 세포노화 관련 질환은 조직 섬유증, 노인성 안구질환, 죽상경화증, 골관절염, 퇴행성 뇌질환, 비만, 당뇨 및 만성 피부손상으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

보다 상세하게는 상기 조직 섬유증은 신장 섬유증 및 복막 섬유증으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

상기 노인성 안질환은 백내장, 녹내장 및 황반변성으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

상기 퇴행성 뇌질환은 파킨슨병, 알츠하이머병 및 뇌졸증으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명은 호모해링토닌을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 조성물을 제공할 수 있다.

상기 호모해링토닌은 노화가 유도된 멜라닌세포의 증식을 억제하는 것일 수 있다.

상기 피부 미백용 조성물은 약학조성물, 건강식품 또는 화장료 조성물로 제공될 수 있다.

본 발명의 한 구체예에서, 상기 호모해링토닌을 유효성분으로 함유하는 약학조성물은 통상적인 방법에 따라 주사제, 과립제, 산제, 정제, 환제, 캡슐제, 좌제, 겔, 현탁제, 유제, 점적제 또는 액제로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 제형을 사용할 수 있다.

본 발명의 다른 구체예에서, 호모해링토닌을 유효성분으로 함유하는 약학조성물은 약학조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제, 붕해제, 감미제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제, 향미제, 항산화제, 완충액, 정균제, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.

구체적으로 담체, 부형제 및 희석제는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 사용할 수 있으며, 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 있으며 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기재로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면 상기 약학 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 대상체로 투여할 수 있다.

상기 호모해링토닌의 바람직한 투여량은 대상체의 상태 및 체중, 질환의 종류 및 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 달라질 수 있으며 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면 이에 제한되는 것은 아니지만 1일 투여량이 0.01 내지 200 mg/kg, 구체적으로는 0.1 내지 200 mg/kg, 보다 구체적으로는 0.1 내지 100 mg/kg 일 수 있다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고 수회로 나누어 투여할 수도 있으며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 '대상체'는 인간을 포함하는 포유동물일 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 구체예에서, 건강식품은 상기 호모해링토닌 이외에 다른 식품 또는 식품 첨가물과 함께 사용되고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다.유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적 예를들어 예방, 건강 또는 치료적 처치에 따라 적합하게 결정될 수 있다.

상기 건강식품에 함유된 화합물의 유효용량은 상기 치료제의 유효용량에 준해서 사용할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있음은 확실하다.

상기 건강식품의 종류에는 특별한 제한이 없고, 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제등을 들 수 있다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 화장료조성물은 유효성분인 호모해링토닌 외에 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함할 수 있다.

상기 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 썬 크림, 유연 화장수, 수렴 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

상기 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜,실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

상기 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

상기 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해 화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

상기 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

또한, 본 발명은 호모해링토닌을 유효성분으로 함유하는 노화개선 또는 수명연장용 조성물을 제공할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

하기의 실험예들은 본 발명에 따른 각각의 실시예에 공통적으로 적용되는 실험예를 제공하기 위한 것이다.

< 실험예 1> 세포배양

사람 섬유아세포 (human dermal fibroblast, HDF)와 사람 제대혈관내피세포 (human umbilical vascular endothelial cell, HUVEC)는 LONZA Inc. (Walkersville, MD)에서, 사람 상피 멜라닌세포(human epidermis melanocyte, HEM)는 Cascade Biologics (Portland, OR, USA)에서, 사람 망막색소상피세포 (human retinal pigmented epithelial cells, ARPE-19)와 HK2 세포 (human tubular epithelial cell)는 ATCC (Manassas, VA)에서 각각 구입하여 사용하였다.

사람 섬유아세포는 10% 태아소혈청(FBS)을 포함한 DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle Medium) 배양액, 사람 제대혈관내피세포는 EGM-2 배양액, 사람 상피 멜라닌세포는 멜라닌세포 성장인자 (HMGS)를 포함한 M254 배양액, 사람 망막색소상피세포는 10% FBS를 포함한 DMEM:F12 배양액, HK-2 세포는 10% FBS가 포함된 RPMI1640 배양액으로 각각 배양하였다.

세포(2×10⁵)를 100 mm 배양 접시에 분주하여 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 계대 배양하였다. 배양 접시에 80-90% 정도로 세포가 자라면 트립신-EDTA 용액을 처리하여 배양 접시로부터 세포를 분리하고 세포 수를 측정하였다.

세포 성장 정도는 하기식과 같이 세포집단 배가시간 (population doubling time; PDT)으로 확인하였다.

PDT=((T-T₀)log2)/(logN-logN₀)

(N = 배양 접시에서 자란 세포 수, N₀ = 처음 분주한 세포 수, T-T₀ = 세포배양 시간)

< 실험예 2> 독소루비신 ( doxorubicin ) 처리에 의한 조기 노화세포 제조

각 세포를 독소루비신(0.5 μM)이 포함된 무혈청 배양액에서 4시간 처리하였다. 세포를 무혈청 배양액으로 세척한 후, 10% FBS가 포함한 배양액에서 4일 동안 배양한 후 세포노화는 노화연관 베타 갈락토시다제 염색으로 노화 수준을 확인하였다.

< 실험예 3> 복제노화세포 제조

100 mm 배양 접시에 2×10⁵세포를 분주한 후, 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다. 배양접시에 80~90% 정도로 세포가 성장하면 트립신-EDTA를 처리하여 세포를 떼어낸 후 세포 수를 측정하고, 세포집단 배가시간 (PDT)을 측정하였다.

상기와 같은 과정으로 연속적으로 세포를 계대 배양하면서, 복제노화를 유도하였다. 젊은 섬유아세포의 PDT는 36시간, 복제노화 섬유아세포의 PDT는 12일, 젊은 혈관내피세포의 PDT는 24시간, 복제노화 혈관내피세포의 PDT는 7일이었으며, 젊은 사람 멜라닌세포의 PDT는 2일, 복제노화 사람 멜라닌세포의 PDT는 20일이었다.

세포노화 수준은 노화연관 베타 갈락토시다제 염색, p53과 p16 단백질 발현 분석 등으로 확인하였다.

< 실험예 4> 임상시험 화합물로부터 세노리틱스 및 세노모르픽스 효능 물질 확인

한국화합물 은행으로부터 임상시험 화합물 2,150종을 분양받았다.

독소루비신을 처리하여 조기 노화가 유도된 사람 섬유아세포와 사람 혈관내피세포를 96 웰 플레이트에 분주한 후, 2,150종의 화합물을 100 nM 농도로 각각 4일 동안 처리하였다. 노화세포의 생존 정도를 CCK-8 분석으로, 세포의 노화 정도를 노화연관 베타 갈락토시다제 염색으로 조사하였다.

< 실험예 5> 약물처리

호모해링토닌은 TOCRIS Bioscience (Minneapolis, MN, USA)에서, 라파마이신은 EMD Millipore (Burlington, MA, USA)에서, ABT263은 Selleckchem (Houston, TX, USA)에서 구입하였다.

각 시료를 DMSO에 녹인 후, 호모해링토닌은 100 nM, 라파마이신은 100 nM, ABT263은 100 nM 농도로 젊은 세포, 복제노화세포, 독소루비신 처리에 의해 조기 노화가 유도된 노화세포에 처리하였다. 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 4일 동안 배양한 후, 세포생존 정도는 CCK-8 분석, 세포노화 정도는 노화연관 베타갈락토시다제 (SAβG) 염색, p53 및 p16 단백질 발현 분석, 세포사멸은 PARP, caspase-3 단백질 발현 분석으로 확인하였다.

< 실험예 6> 노화연관 베타 갈락토시다아제 염색 분석 (Senescence-associated β- galactosidase , SAβG )

세포를 1×인산완충용액로 세척하고, 3.7%(v/v) 파라포름알데하이드가 포함된 인산완충용액으로 고정하였다. 1 mg/ml 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside, 40 mM citric acid-sodium phosphate (pH 6.0), 5 mM potassium ferricyanide, 5 mM potassium ferrocyanide, 150 mM NaCl, 2 mM MgCl₂ 용액을 첨가한 후, 37℃에서 18시간 동안 반응시켰다. 대조 염색으로 에오신으로 염색하였다. 광학현미경을 사용하여 세포질에 파란색으로 염색된 세포를 확인하였다.

< 실험예 7> 세포생존도 분석 (cell counting kit-8 assay; CCK -8)

젊은 세포 (1×10³ cells/well) 또는 노화세포 (2×10³ cells/well)를 96 웰 플레이트에 분주한 후, 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 하룻밤 동안 배양하였다.

호모해링토닌, ABT263 및 라파마이신을 각 농도로 처리한 후, 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 4일 동안 배양하였다. 각 웰에 CCK-8 시약 (Dojindo Molecular Technologies Inc., Kumamoto, Japan)을 10 μl를 첨가하고, 배양기에서 2시간 배양하였다. 이후 Microplate reader를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포생존 정도는 DMSO만 처리한 대조군의 흡광도를 100%로 하고 이에 대한 상대적인 값으로 나타내었다.

< 실험예 8> 젖산 탈수소화효소 분석 (lactate dehydrogenase assay; LDH )

젊은 세포와 노화세포에 대한 세포독성은 젖산탈수소화효소 (LDH) 활성 키트 (Dojindo Molecular Technologies Inc.)로 조사하였다. 젊은 세포 (1×10³ cells/100 μl/well) 또는 노화세포 (2×10³ cells/100 μl/well)를 96 웰 플레이트에 분주한 후, 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 하룻밤 동안 배양하였다.

호모해링토닌, ABT263 및 라파마이신을 각 농도로 처리한 후, 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 4일 동안 배양하였다. 세포배양액을 1.5 ml 튜브로 옮긴 후, 4℃, 12,000 rpm에서 원심분리하였다. 상청액을 96 웰 플레이트에 100 μl씩 분주하고, 각 웰에 LDH 측정 용액을 100 μl로 넣은 후, CO₂ 배양기에서 30분 반응시켰다. LDH 반응 정지 용액을 50 μl 넣고, microplate reader를 이용하여, 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. LDH 활성 정도는 DMSO만 처리한 대조군의 흡광도를 기준으로 하고 이에 대한 상대적인 값으로 나타내었다.

< 실험예 9> 허혈- 재관류 손상 유도 실험동물 준비

동물실험은 영남대학교 의과대학 동물실험윤리위원회의 승인을 받아 수행하였다 (YUMC-AEC2018-024). C57BL/6J 8주령 수컷 생쥐를 2.5% Avertin (0.025 ml/g 체중)을 복강 주사하여 마취시켰다. 생쥐를 37℃ 열판에 올려놓은 후 왼쪽 옆구리를 절개하여, 왼쪽 신장을 노출하였다. 신장 동정맥 혈관을 microanuerism clamp (Roboz)로 결찰하고, 혈관이 막혔는지 신장의 색깔 변화로 확인하였다. 허혈을 유도하는 동안 생쥐의 체온을 36.5-37.5℃로 유지시켰다. 35분 후, clamp를 제거하고, 재관류가 이루어지는지 확인하였다.

대조군으로 신장 동정맥혈관을 결찰하지 않고, 나머지는 동일하게 시술하였다. 허혈-재관류 손상 4일 후부터 2일 간격으로 2.5 μl 10 mM 호모헤링토닌을 100 μl 인산완충용액에 희석하여 복강으로 3회 주사하였다(HHT 군). 대조군은 허혈-재관류 손상을 유도하지 않은 군 (Sham 군) 및 허혈-재관류 손상 군 (PBS)으로 하였다. 각 군별로 3마리의 생쥐를 사용하였다.

허혈-재관류 손상 10일째 오른쪽 신장을 제거하고, 11일째 희생시켰다 (도 8A). 허혈-재관류 손상을 유도한 왼쪽 신장을 반으로 절제하여 10% 포르말린 용액에 고정하거나, 액체 질소에 냉동 보관하였다.

< 실험예 10> 신장기능 평가

허혈-재관류 손상에 의한 신장 기능을 평가하기 위하여, 혈장과 소변에서 크레아티닌 (creatinine)과 혈중 요소질소 (blood urea nitrogen, BUN) 농도를 측정하였다.

헤파린 모세관을 이용하여 생쥐의 눈 뒤쪽 (retro-orbital) 혈관총으로부터 혈액을 채취하고, 혈장을 분리하였다. 혈장 크레아티닌은 QuantiChromTM creatinine assay kit (DICT-500; BioAssay Systems, Hayward, CA, USA)를 이용하였으며, BUN은 BUN colorimetric detection kit (Arbor Assays, Ann Arbor, Michigan, USA)를 이용하여, 각각 490 nm와 450 nm에서 흡광도를 spectrophotometer로 측정하였다.

< 실험예 11> 말론디알데하이드 ( malondialdehyde ; MDA ), 지질 과산화물 (hydroperoxides) 및 초과산화물 (superoxides, O ₂ ^- ) 확인

조직에서 지질 과산화 정도를 확인하기 위해, TBARS 법으로 말론디알데하이드 (malondialdehyde; MDA)를 확인하였다(Garcia YJ, et al., Journal of neuroscience methods. 2005).

간략하게 조직 분쇄액 (0.3 mg protein /0.1 ml)에 TBARS 용액 [0.375% thiobarbituric acid (TBA), 15% trichloroacetic acid (TCA), 0.25 N HCl] 1.4 ml을 넣고, 95-100℃에서 15분간 중탕한 후, 4℃, 12,000 rpm에서 10분 원심분리하여 540 nm에서 상청액의 흡광도를 확인하였다.

지질 하이드로퍼옥사이드(hydroperoxides)는 ferrous ion oxidation xylenol orange (FOX) 법으로 확인하였다(Jiang ZY, et al., Lipids. 1991).

조직의 조직 분쇄액 (0.3 mg protein/0.1 ml)에 0.9 ml의 FOX 시약 [100 μM 자일레놀 오렌지(xylenol orange), 25 mM H₂SO₄, 0.1 M 소르비톨(sorbitol), 2.5 mM 황산암모늄철(ferrous ammonium sulfate)]을 30분 동안 실온에서 반응시킨 후 원심분리하여 570 nm에서 상청액의 흡광도를 측정하였다.

조직의 초과산화물은 디하이드로에티듐(dihydroethidium, DHE; Sigma, St. Louis, MO)을 사용하여 측정하였다(Peshavariya HM, et al., Free radical research. 2007). 조직 분쇄액 0.2 ml에 10 μM DHE 0.2 ml를 넣고 실온에서 10분 동안 반응시켰다. 37℃에서 여기(excitation) 544 nm, 방출(emission) 612 nm에서 Emax Precision Microplate Reader (Molecular Devices Corporation, Menlo Park, CA, USA)로 형광을 측정하였다.

< 실험예 12> 단백질 추출 및 웨스턴 블롯 분석

세포를 60 mm 배양접시에 분주한 후, 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 하룻밤 배양하였다. 호모해링토닌, ABT263 및 라파마인신을 처리한 후, 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 3일 동안 배양하였다. 세포를 1×인산완충용액으로 세척한 후, RIPA 완충액 (12 mM EDTA, 137 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM Na3VO4 (Sigma-Aldrich, USA) 10 mM NaF (Sigma), 1 mM PMSF (Sigma), 1% Triton X-100, 10% 글리세롤, 프로테아제 억제 칵테일 (Roche, Germany))를 첨가하여 용해(lysis)하였다.

용해된 세포를 1.5 ml 튜브에 옮기고, 3-4회 피펫팅한 다음, 얼음 위에서 20분간 방치하였다. 12,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 상청액을 회수한 후 상청액의 단백질 농도를 BCA 분석으로 정량하였다.

조직에 RIPA 완충액을 넣고 WiseTis homogenizer HG-15D (DAIHAN Scientific, Seoul, South Korea)로 분쇄하였다. 4℃에서 12,000 rpm으로 20분간 원침하고, 상청액을 새 튜브로 옮겼다. 상청액의 단백질 농도를 BCA법으로 정량하였다.

단백질 30 μg을 전기영동 (SDS-PAGE)한 후, 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 전기영동 후, 단백질을 겔에서 폴리비닐리덴 플루오라이드 멤브레인 (Polyvinylidene fluoride membrane, Pall Corporation)으로 옮겼다. 멤브레인을 상온에서 2시간 동안 5% DifcoTM skim milk 용액 (Becton, Dickinson and Company, USA)로 처리하고, 1차 항체를 첨가한 한 후, 2시간 동안 상온에서 반응시켰다.

1차 항체로 항-p53 항체, 항-p16 항체, 항-caspase 3 항체, 항-PARP 항체, 항-actin 항체, 항-GAPDH 항체는 Santa Cruz Biotechnology, Inc. 에서, 항-인산화-Rb 항체는 New England Biolabs (Ipswich, MA, USA)에서, 항-SOD2 항체와 항-catalase 항체는 Bioworld Technology Inc. (Louis Park, MN, USA)에서, 항-4-HNE 항체, 항-α-smooth muscle actin 항체, 항-type I collagen 항체는 Abcam (Cambridge, UK)에서 구입하였다. 1차 항체가 처리된 멤브레인을 TBST (20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 137 mM NaCl, 0.1% Tween 20)로 15분씩 3회 세척하고 2차 항체를 처리하여 60분간 반응시켰다. TBST로 60분 이상 세척한 후 ECL 검출 키트 (Elpis Biotech, Daejeon, South Korea)을 사용하여 단백질 발현을 확인하였다.

< 실험예 13> 복막 섬유화 실험동물 준비

복막 섬유화 실험동물 제작을 위해, 클로르헥시딘 글루코네이트 (chlorhexidine gluconate, CHG)에 의한 복막 섬유화 모델을 이용하였다 (Choi SY, et al., Journal of dermatological science. 2018).

도 9A를 참고하면, C57BL/6J 8주령 수컷 생쥐에게 0.1% CHG 용액 (15% 에탄올 인산완충용액에 CHG를 0.1%로 녹임)을 10 ml/kg로 2일 간격으로 20일 동안 복강 주사하였다. 9일째부터 100 μl 인산완충용액에 10 mM 호모해링토닌 2.5 μl (HHT 군) 또는 DMSO 2.5 μl (DMSO 군)를 각각 희석하여 복강으로 2일 간격으로 주사하였다.

음성 대조군 (NT 군)으로 0.1% CHG 용액 대신 15% 에탄올 인산완충용액을 100 μl를 복강으로 주사하였다. 20일째, 생쥐를 희생시키고, 복막 조직을 절제한 후 조직을 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde) 용액에 고정시켰다.

< 실험예 14> 조직 표본 제작 및 염색

10% 포르말린 용액에 고정한 조직을 파라핀으로 포매하고 4 μm로 절단하여 조직 표본을 제작하였다. 조직 표본에서 파라핀을 제거한 후, 헤마톡실린-에오신 염색, 트리크롬 (Trichrome) 염색 및 PAS 염색을 수행하였다.

신장의 섬유화 정도는 트리크롬 염색 후, i-SolutionTM software program (IMT Inc., Canada)을 이용하여 콜라겐 염색 정도를 분석하여 측정하였으며, 조직 표본에서 세포노화 정도는 리포푸신 (lipofuscin)을 Sudan black B로 염색하여 조사하였다 (Viegas MS, et al., European journal of histochemistry : EJH. 2007). 복막 섬유화 정도는 복막 중피세포층의 두께 (submesothelial thickness)를 NIH Image J 프로그램으로 측정하였다.

< 실험예 15> 통계분석

값은 평균과 표준에러 (standard error)로 표시하였다. 본 연구의 통계처리는 one-way ANOVA 분석하고 Turkey post hoc 검증하여 통계적인 유의성을 검토하였다.

< 실시예 1> 호모해링토닌의 세노리틱스 작용 확인

1. 사람 섬유아세포에 대한 호모해링토닌의 세노리틱스 작용 확인

사람 섬유아세포에 독소루비신 처리하여 조기 세포노화를 유도하였다. 조기 노화가 유도된 세포에 0.01% DMSO (NT), 100 nM 호모해링토닌 (HHT), 100 nM 라파마이신 (Rap) 및 100 nM ABT263 (ABT)을 처리하고 4일 후, SAβG 활성염색을 수행하여 세포의 노화 정도를 확인하였으며, CCK-8 분석을 수행하여 세포생존도를 확인하였다.

라파마이신은 세포노화를 억제하는 것으로 알려진 세노모르픽스 (senomorphics)의 일종이며, ABT263은 노화세포 특이적 세포사멸을 유도하는 것으로 알려진 세포리틱스 (senolyitcs)의 일종으로 상기 두 약물을 양성대조군으로 사용하였다.

독소루비신 처리에 의해 조기 세포노화가 유도된 사람 섬유아세포에 호모해링토닌을 100 nM 처리한 결과, 도 1A 및 도 1B와 같이 DMSO 처리한 군에 비해 SAβG 활성이 유의하게 감소하였으며, 도 1C와 같이 세포생존도 역시 유의하게 (p<0.01) 감소하였다. 또한, 라파마이신과 ABT263가 처리된 실험군과 비교하여 현저하게 감소되는 것이 확인되었다.

상기 결과로부터 호모해링토닌의 세노리틱스 효과는 라파마이신, ABT263에 비해 더 현저한 것으로 확인되었다.

또한, 조기 노화 사람섬유아세포 뿐만 아니라, 복제노화 사람섬유아세포에서도 호모해링토닌이 노화세포 특이적인 세포독성을 나타내는지 확인하였다.

그 결과, 도 2A 및 도 2B와 같이 젊은 섬유아세포와 복제노화 섬유아세포에 호모해링토닌의 농도를 증가시키면서 처리하였을 때, 농도의존적으로 젊은 세포에 비해 노화세포에서 더 현저하게 세포성장이 감소하였다.

상기 결과로부터 노화세포에서 나타나는 호모해링토닌의 세포성장 저해 효능이 세포독성으로 인한 것인지 LDH 활성 분석으로 조사하였다.

그 결과, 도 2C와 같이 젊은 세포에 비해 복제노화세포에서만 호모해링토닌에 의한 LDH 활성이 증가가 확인됨에 따라, 호모해링토닌이 노화세포 특이적인 세포독성을 나타내는 것이 확인되었다.

한편, 복제노화 사람 섬유아세포에 대한 호모해링토닌의 세포독성과 노화세포의 세포사멸의 관련성을 확인하기 위해, PARP 및 caspase-3 발현을 웨스턴 블롯 분석으로 확인하였다.

그 결과, 도 2D와 같이 호모해링토닌 처리에 의해 노화세포에서만 PARP의 발현 감소와 caspase-3의 발현 증가가 나타나는 것이 확인됨에 따라, 호모해링토닌은 노화세포 특이적인 세포사멸을 유도하는 것이 확인되었다.

상기 결과들로부터, 호모해링토닌은 사람 섬유아세포에서 노화세포 특이적인 세포사멸을 유도하는 새로운 세노리틱스로 작용하는 약물로 확인되었다.

2. 사람 HK2 세포에서 호모해링토닌의 세노리틱스 작용 확인

사람 HK2 세포에 독소루비신 처리하여 조기 세포노화를 유도한 후, 조기 노화세포에 0.01% DMSO, 100 nM 호모해링토닌, 100 nM 라파마이신 및 100 nM ABT263을 각각 처리하고 4일 후, SAβG 염색을 수행하여 세포노화 정도를 확인하였으며, CCK-8 분석을 수행하여 세포의 세포생존도를 확인하였다.

그 결과, 도 3A 및 도 3B와 같이 호모해링토닌을 처리된 실험군은 DMSO 처리군에 비해 조기 노화 HK2세포의 생존이 유의하게 감소된 것을 확인할 수 있었다 (p<0.01)

상기 결과로부터 사람 HK2 세포에서 호모해링토닌은 세노리틱스로 작용하는 것이 확인되었다.

< 실시예 2> 호모해링토닌의 세노모르픽스 작용 확인

1. 사람 제대혈관내피세포에 대한 호모해링토닌의 세노모르픽스 작용 확인

사람 제대혈관내피세포에 독소루비신 처리하여 조기 세포노화를 유도한 후, 조기 노화세포에 0.01% DMSO, 100 nM 호모해링토닌, 100 nM 라파마이신 및 100 nM ABT263을 처리하고 4일 후, SAβG 염색을 수행하여 세포노화 수준을 확인하였으며, CCK-8 분석을 수행하여 세포의 세포생존도를 확인하였다.

그 결과, 도 4A 및 도 4B와 같이 독소루비신 처리에 의해 조기 세포노화가 유도된 사람 혈관내피세포에 호모해링토닌 100 nM이 처리된 실험군의 SAβG 활성이DMSO 처리한 군에 비해 유의하게 (p<0.01) 감소하였으며, 라파마이신보다 현저하게 감소된 것이 확인되었다.

반면, 도 4C와 같이 조기 노화된 혈관내피세포에 대한 세포생존은 DMSO 처리군과 비교하여 차이가 나타나지 않았다.

상기 결과로부터 호모해링토닌은 노화된 혈관내피세포의 기능과 형태를 젊은 세포로 복원할 수 있는 세노모르픽스로 작용하는 것을 확인할 수 있었다.

한편, 조기 노화세포뿐만 아니라 복제노화 혈관내피세포에서도 호모해링토닌이 세노모르픽스로 작용하는지 확인하였다.

그 결과, 도 5A 내지 도 5C와 같이 호모해링토닌 처리에 의해 복제노화 혈관내피세포에서 SAβG 활성이 감소하였으며, 노화세포에서 증가되는 것으로 알려진 p53과 p16 단백질 발현이 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 도 5D 및 도 5E와 같이 CCK-8 분석과 LDH 활성 분석을 통하여 조기 노화세포와 마찬가지로 호모해링토닌이 복제노화 혈관내피세포의 세포생존에는 영향을 미치지 않는 것을 확인할 수 있었다.

상기 결과로부터, 호모해링토닌은 사람 혈관내피세포에서 노화세포의 기능과 형태를 젊은 세포로 복원시킬 수 있는 새로운 세노리틱스로 작용하는 것이 확인되었다.

2. 사람 망막색소상피세포에 대한 호모해링토닌의 세노모르픽스 작용 확인

사람 망막색소상피세포에 독소루비신 처리하여 조기 세포노화를 유도한 후, 조기 노화세포에 0.01% DMSO, 100 nM 호모해링토닌, 100 nM 라파마이신 및 100 nM ABT263을 처리하고 4일 후, SAβG 염색을 수행하여 세포노화 수준을 확인하였으며, CCK-8 분석을 수행하여 세포의 세포생존도를 확인하였다.

그 결과, 도 6A 및 도 6B와 같이 조기 세포노화가 유도된 사람 망막색소상피세포에 호모해링토닌을 처리한 실험군은 DMSO 처리군과 비교하여 SAβG 활성 염색이 유의하게 (p<0.01) 감소하였으며, 도 6C와 같이 SAβG 활성뿐만 아니라, 노화세포에서 증가되는 것으로 알려진 p53과 p16 단백질 발현도 감소가 나타났다.

또한, 도 6D 및 도 6E와 같이 CCK-8 분석과 LDH 활성 분석을 통하여 호모해링토닌 처리에 의해 노화세포 특이적인 세포독성은 유도되지 않는 것이 확인되었다.

상기 결과로부터, 호모해링토닌은 사람 망막색소상피세포에서 노화세포의 기능과 형태를 젊은 세포로 복원시킬 수 있는 새로운 세노리틱스로 작용하는 것이 확인되었다.

3. 사람 상피 멜라닌세포에서 호모해링토닌의 세노모르픽스 작용 확인

사람 멜라닌 세포를 20회 정도 계대배양하여 복제노화를 유도하였다. 젊은 세포와 복제노화 세포에 0.01% DMSO, 100 nM 호모해링토닌 및 100 nM 라파마이신을 각각 처리하고 4일 후, CCK-8 분석을 수행하여 세포의 세포생존도를 확인하였으며, SAβG 염색과 세포모양 분석을 수행여 세포노화 정도를 확인하였다.

그 결과, 도 7A 내지 도 7D와 같이 호모해링토닌 100 nM이 처리된 복제노화 멜라닌세포에 실험군은 DMSO 처리한 군에 비해 SAβG 활성 염색과 노화특이적 세포모양을 나타내는 세포 수가 유의하게 (p<0.01) 감소하였다. 또한, 호모해링토닌의 세노모르픽스 효과가 라파마이신보다 현저한 것이 확인되었다.

한편, 도 7A 및 도 7E를 참고하면 젊은 멜라닌세포에 호모해링토닌을 처리한 경우, 세포 증식이 억제되는 것을 확인할 수 있었으며, 젊은 세포에서 증식 억제 효과는 약물 처리 전의 세포 수(BT)와 호모해링토닌 처리 후 세포 수를 측정하여 비교하였을 때 차이가 없는 것으로 확인됨에 따라, 상기 결과는 세포 죽음으로 인해 나타나는 현상은 아닌 것으로 확인되었다.

상기 결과로부터, 호모해링토닌은 멜라닌세포에서 노화세포의 기능과 형태를 젊은 세포로 복원시킬 수 있는 세노모르픽스로 작용할 수 있음이 확인되었다.

< 실시예 3> 신장 허혈- 재관류 손상으로 유도되는 신장 섬유화에 대한 호모 해링토닌의 효능 확인

신장 허혈-재관류 손상으로 유도되는 신장 섬유화는 조직의 세포노화와 관련 있는 것으로 보고됨에 따라(Luo C, Zhou S, et al., Journal of the American Society of Nephrology : JASN. 2018), 생쥐의 왼쪽 신장 혈관을 35분 동안 결찰하고 풀어 주어, 허혈-재관류 손상을 유도하였다.

4일 후부터 2일 간격으로 10 mM 호모헤링토닌 2.5 μl를 100 μl 인산완충용액에 희석하여 복강으로 3회 주사하였으며(HHT 군), 대조군으로 허혈-재관류 손상을 유도하지 않은 군 (Sham 군) 및 허혈-재관류 손상 군 (PBS)을 대조군으로 정하고, 도 8A와 같이 허혈-재관류 손상 10일째 오른쪽 신장을 제거하고, 11일째 희생시켰으며, 허혈-재관류 손상 전의 체중과 11일째 체중 변화를 조사하였다.

그 결과, 도 8B와 같이 Sham 군에 비해 PBS 처리군 또는 HHT 처리군의 체중 증가가 현저히 감소하였다. 그러나 HHT 군은 PBS 군에 비해 체중이 증가한 것을 확인할 수 있었다.

또한, 도 8C 및 8D와 같이 혈장 크레아티닌과 BUN은 PBS 군에 비해 HHT 처리군에서 감소한 것으로 나타났으며, 도 8E 및 8F와 같이 신장 조직 표본 검사결과, 신장 세뇨관의 손상이 HHT 군에서 PBS 군에 비해 현저히 감소하였으며, 트리크롬 염색 결과에서도 조직 섬유화 정도가 PBS 군에 비해 HHT 군에서 현저히 감소한 것을 확인할 수 있었다.

한편, 조직에서 세포노화가 나타나면 리포푸신이 증가하는 것으로 알려져 있으며, SAβG 염색을 대체할 수 있을 정도로 세포노화를 측정할 수 있는 것으로 보고됨에 따라, 조직 내 리포푸신을 Sudan Black B로 염색하여 확인하였다.

그 결과, 도 8G와 같이 PBS 군에 비해 HHT 군의 염색강도가 감소된 것을 확인할 수 있었다.

또한, 조직을 분쇄하여 지질의 산화 정도를 지질 하이드로퍼옥사이드(hydroperoxides)와 MDA로 측정한 결과, 도 8H 및 8I와 같이 PBS 군과 비교하여 HHT 군에서 지질 산화 정도가 현저히 감소된 것으로 확인되었으며, 도 8J와 같이 활성산소의 일종인 초산화물(superoxides) 역시 PBS 군보다 HHT 군에서 현저히 감소하였다.

한편, 조직으로부터 단백질을 분리하여, 세포노화 표지로 p16과 산화스트레스 표지로 4-HNE를 웨스턴 블롯으로 분석한 결과, 도 8K와 같이 HHT 군에서 PBS 군에 비해 현저히 감소하였으며, 도 8L과 같이 세포증식 표지로 pRb, 섬유화 표지로 1형 콜라겐 (COL1)과 세포노화 표지로 p53의 발현이 HHT 군에서 PBS 군에 비해 감소된 것을 확인할 수 있었으며, 항산화효소인 catalase와 SOD2의 발현은 도 8M과 같이 PBS 군과 비교하여 HHT 군에서 증가된 것으로 나타났다.

상기 결과로부터 호모해링토닌은 신장의 허혈-재관류 손상으로 유도된 신장 섬유화를 저해하는 효능이 있는 것이 확인되었다.

< 실시예 4> 클로르헥시딘 글루코네이트 ( CHG )에 의해 유도된 복막 섬유화에 대한 호모해링토닌의 효능 확인

복막 섬유화는 복막 투석을 받은 환자에서 많이 생기는 부작용으로서 복막 투석 효율을 감소시키는 문제점이 나타날 수 있다.

장기간의 복막 투석은 복막 투석액 구성 성분에 의해 활성산소를 증가시키고, 만성 염증으로 인해 복막 섬유화를 유도한다. 이 과정에서 TGF-β1에 의한 복막 중피세포 (mesothelial cells)의 상피-중간엽 전이 (epithelial to mesenchymal transition)가 중요하게 작용하는 것으로 알려졌으며, TGF-β1은 세포노화를 유도하는 것으로도 잘 알려져 있다.

이러한 복막 섬유화에 대한 호모해링토닌의 영향을 확인하기 위하여, 0.1% CHG 용액을 2일 간격으로 20일 동안 복강으로 주사하였으며, 9일째부터 호모해링토닌 또는 DMSO-인산완충용액을 복강 주사하였다.

복벽 조직 표본을 제작하여, 헤마톡실린-에오신 염색과 트리크롬 염색을 한 후, 복막 중피세포층 두께와 복막 섬유화 정도를 분석하였다.

그 결과, 도 9C 및 9D와 같이 호모해링토닌 처리군(HHT 군)에서 DMSO-인산완충용액 (DMSO 군)에 비해 복막 중피세포층의 두께가 유의하게 감소하였으며, 섬유화 정도 역시 감소하는 것을 확인할 수 있었다.

상기 결과로부터 호모해링토닌은 CHG에 의해 유도되는 복막 섬유화를 저해시키는 것이 확인되었다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

호모해링토닌을 유효성분으로 함유하며, 상기 호모해링토닌은 생체 외(in vitro)에서 노화된 세포를 선택적으로 사멸시키는 것을 특징으로 하는 세노리틱스용 시약조성물.
삭제
청구항 1에 있어서, 상기 노화세포는 약물처리 또는 계대배양으로 노화가 유도된 섬유아세포 및 신세뇨관상피세포로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 세노리틱스용 시약조성물.
호모해링토닌을 유효성분으로 함유하며, 상기 호모해링토닌은 생체 외(in vitro)에서 노화된 세포의 기능 또는 형태를 정상세포로 회복시키는 것을 특징으로 하는 세노모르픽스용 시약조성물.
삭제
청구항 4에 있어서, 상기 노화세포는 약물처리 또는 계대배양으로 노화가 유도된 혈관내피세포, 망막색소상피세포 및 멜라닌 세포로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 세노모르픽스용 시약조성물.
호모해링토닌을 유효성분으로 함유하는 조직 섬유증 예방 또는 치료용 약학조성물.
청구항 7에 있어서, 상기 호모해링토닌은 노화세포를 선택적으로 사멸시키거나 노화세포의 기능 또는 형태를 정상세포로 회복시켜 조직 섬유증을 예방하거나 치료하는 것을 특징으로 하는 약학조성물.
삭제
청구항 7에 있어서, 상기 조직 섬유증는 신장 섬유증 및 복막 섬유증으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약학조성물.
삭제
삭제
삭제