KR102246097B1 - 알파-리포익산(alpha-lipoic acid)을 유효성분으로 함유하는 시스플라틴에 의한 이독성 난청 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

알파-리포익산(alpha-lipoic acid)을 유효성분으로 함유하는 시스플라틴에 의한 이독성 난청 치료용 약학적 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 알파-리포익산(alpha-lipoic acid)을 유효성분으로 함유하는 시스플라틴에 의한 이독성 난청 치료용 약학적 조성물 또는 개선용 건강기능식품에 관한 것으로, 알파-리포익산(ALA)은 시스플라틴에 의한 이독성 난청이 발병한 마우스에 대해 청력 검사시 청력 손실을 감소시키고, 마우스의 내이를 추출하여 형태학적 관찰시 청각유모세포와 나선형 신경절 세포의 손상을 막아 주며, 청각유모세포에서 Bax 유전자 또는 단백질 발현은 감소시키고, Bcl-2 유전자 또는 단백질 발현은 증가시킴으로써 미토콘드리아의 기능 장애를 개선시키고, 활성산소 ROS를 감소시킴에 따라, 본 발명의 조성물은 이독성 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.

Description

알파-리포익산(alpha-lipoic acid)을 유효성분으로 함유하는 시스플라틴에 의한 이독성 난청 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition for treating ototoxicity hearing loss by additional effect of cisplatin comprising alpha-lipoic acid}
본 발명은 알파-리포익산(alpha-lipoic acid)을 유효성분으로 함유하는 시스플라틴에 의한 이독성 난청 치료용 약학적 조성물 및 건강기능식품에 관한 것이다.
1960 년대에 항암 효과가 발견된 이후 시스플라틴(cis-diamminedichloroplatinum II)은 난소, 폐, 방광 등에서 발견되는 고형 종양에 유효한 화학 요법 약물로 널리 사용되었다.
시스플라틴(cisplatin)은 확산(diffusion) 또는 운반체(transporter)에 의해 세포로 들어가고 수화(hydrate)되어 세포 내부의 염화 농도(chloride ions)를 낮추기 때문에 염화 이온(chloride ions)을 방출하게 한다. 수화된 형태의 시스플라틴은 핵과 미토콘드리아 DNA의 뉴클레오타이드와 교차결합(cross-links)하여 부가물(adducts)을 형성하여 암세포의 무제한적인 복제를 억제시킨다.
그러나, 시스플라틴을 이용한 임상 치료는 정상 조직의 부작용으로서 신독성(nephrotoxicity), 신경독성(neurotoxicity) 및 이독성(ototoxicity)을 유발하기 때문에 사용에 제한이 있다. 특히 시스플라틴에 의해 유발된 이독성(ototoxicity)은 돌이킬 수 없는 감각신경성 청력손실, 즉 난청(hearing loss)을 유발시킬 수 있으며, 특히 소아 집단에서 더욱 심각한 문제가 된다.
난청(hearing loss)은 환자의 삶의 질을 크게 저해시킬 수 있다. 특히 언어 습득 및 소아 환자의 말하기와 같은 사회 발전에 상당한 영향을 줄 수 있다.
비록 시스플라틴의 이독성을 일으키는 근원적인 분자 기전이 완전하게 밝혀지지 않았지만, 이전 연구에서는 시스플라틴이 정상 세포에서 사멸 수용체 경로(death receptor pathway), 소포체 스트레스 경로(endoplasmic reticulum-stress pathway) 및 미토콘드리아 반응성 산소종 (ROS) 생성 경로(mitochondrial reactive oxygen species (ROS)-generating pathway)를 활성화시킴을 보여 주었고, 결국 세포 죽음으로 이어짐을 밝힌 바 있다.
과도한 ROS의 생성은 시스플라틴으로부터 유도된 이독성 난청의 주요 원인으로 여겨지며, 또한 이는 DNA에 대한 시스플라틴의 직접적인 공격으로 간주된다.
특히 달팽이관(cochlea) 내의 코르티(corti) 기관, 나선형 신경절(spiral ganglion) 및 측벽(lateral wall)은 강력한 ROS 생성을 위한 시스플라틴의 주요 표적이라고 제안되어 왔다.
알파-리포익산(alpha-lipoic acid; ALA)은 티옥산(Thioctic acid) 또는 1,2-디치올란-3-펜타노익산(1,2-dithiolane-3-pentanoic acid; C8H14O2S2)으로 널리 알려져 있으며, 이는 세포막, 세포질 및 세포 외 공간에 광범위하게 분포하고, 물과 지질에서 용해되며, 미토콘드리아 탈수소 효소 반응에서 필수적인 보조 인자이다.
알파-리포익산(alpha-lipoic acid; ALA)의 보호 작용(protective action)은 1959년 Rosenberg와 Culik에 의해 처음 보고되었으며, Rosenberg와 Culik은 비타민 C와 비타민 E 결핍으로 인한 괴혈병의 증상을 줄이는 역할이 발견하였다.
나중에 알파-리포익산(ALA)이 비타민 C와 비타민 E 및 세포내 환원된 글루타티온(GSH)을 포함해 체내의 내인성 항산화 물질(endogenous antioxidants)을 재생하는 능력이 있다는 것이 밝혀졌다.
최근에는 알파-리포익산(ALA)이 레톡스 커플(redox couple)로서 환원된 형태의 디하이드로 리포익산(dihydrolipoic acid)과 함께 보편적인 항산화제로서 상당한 주목을 받고 있다.
한편 시스플라틴 화학 요법이 암 환자에게 필수적이지만, 종래의 연구는 알파-리포익산(ALA)의 예방적 차원에서의 전처리 효과(protective pre-treatment effects)에만 초점이 맞추어져 있었다.
또한 종래의 연구는 신독성(nephrotoxicity) 및 신경독성(neurotoxicity)을 포함한 시스플라틴에 의해 유발된 주요 부작용이 동물 모델에서의 알파-리포익산(ALA) 사전 투여에 의해 효과적으로 예방된다는 것을 입증하였을 뿐이며, 현재까지는 시스플라틴에 의해 유발된 이독성(ototoxicity) 난청(hearing loss)을 근본적으로 치료하는 치료제에 대해서는 전혀 보고되어 있지 않다.
본 발명의 발명자들은 시스플라틴에 의한 청력 손실이 된 마우스 모델에서 알파-리포익산(ALA)이 미치는 영향을 조사하였고, in vitro에서 청각유모세포를 이용하여 알파-리포익산(ALA)에 의해 프로아폽토틱 단백질(proapoptotic protein) Bax 유전자 또는 단백질 발현은 감소하고, 안티아폽토틱 단백질(antiapoptotic protein) Bcl-2 유전자 또는 단백질 발현은 증가함으로써 미토콘드리아의 기능 장애를 개선시켜 이독성에 의한 난청을 줄여주는 것을 확인하였다. 또한 항산화 효소인 글루타치온의 산화-환원 반응에 직접 관여하여 활성산소(ROS)를 낮춘다는 것을 확인하였다. 기존에 밝혀진 알파-리포익산(ALA)에 의한 예방효과 뿐 아니라 후처리를 통한 치료효과를 확인할 수 있었으며, 이러한 알파-리포익산(ALA)의 후처리 효과는 시스플라틴에 의해 유발된 난청을 치료하는 치료제 개발로의 가능성을 의미한다. 이를 통해 본 발명자들은 알파-리포익산(ALA)에 의해 활성화된 항세포사멸(antiapoptotic) 경로를 밝히면서 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
한국등록특허 제10-1891395호(2018.08.17. 등록)
Biologic activity of mitochondrial metabolites on aging and age-related hearing loss, The American Journal of Otology: March 2000 - Volume 21, Issue 2, p 161-167
본 발명은 알파-리포익산(ALA)을 유효성분으로 함유하는 시스플라틴에 의한 이독성 난청 치료용 약학적 조성물 또는 건강기능식품을 제공하고자 한다.
본 발명은 알파-리포익산(ALA)을 유효성분으로 함유하는 시스플라틴에 의한 이독성 난청 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 알파-리포익산(ALA)을 유효성분으로 함유하는 시스플라틴에 의한 이독성 난청 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명은 알파-리포익산(ALA)이 시스플라틴에 의한 이독성 난청이 발병한 마우스에서 청력 검사시 청력 손실을 확연히 감소시켰으며, 마우스의 내이를 추출하여 형태학적 관찰시 청각유모세포와 나선형 신경절 세포의 손상을 막아 주었고, 청각유모세포에서 Bax 유전자 또는 단백질 발현은 감소시키고, Bcl-2 유전자 또는 단백질 발현은 증가시킴으로써 미토콘드리아의 기능 장애를 개선시켜 이독성에 의한 난청을 줄여주었으며, 항산화 효소인 글루타치온의 산화-환원 반응에 직접 관여하여 활성산소(ROS)를 낮춘다는 것을 확인함으로써, 본 발명의 알파-리포익산은 시스플라틴 부작용으로 나타나는 이독성 난청의 치료 조성물 또는 개선용 건강기능식품으로 널리 사용될 수 있다.
도 1은 시스플라틴 주입 마우스(cisplatin-injected mice)에 ALA 전처리 또는 ALA 후처리하고 ABR 측정하여 얻은 청력 검사 결과이다(*p <0.05 vs 시스플라틴 단독, 대조군; control group, 시스플라틴 군; CP group, ALA 전처리 군; ALA pre-treatment group, ALA 후처리 군; ALA post-treatment group, ALA 군; ALA group, ABR; auditory brainstem response).
도 2는 ALA 전처리 또는 ALA 후처리한 시스플라틴 주입 마우스(cisplatin-injected mice)의 내부 귀(inner ear)의 조직학적 분석 결과로서(n = 3), 도 2A는 대조군 마우스의 내이의 Basal turn 모습을 나타낸 것이고, 도 2B는 혈관선조(stria vascularis)[위] 및 나선형 신경절(spiral ganglion)[아래]을 고배율로 관찰한 것이고(이중 화살표(↔)는 혈관선조의 두께, 별표(*)는 나선형 신경절 세포의 퇴행을 나타낸 것이고, 스케일 바는 50 μm임), 도 2C는 혈관선조 두께(단위: ㎛)의 정량적 비교한 결과이며, 도 2d는 기저부(basal), 중간(middle) 및 정점(apical) turn에서 각 그룹 간의 나선형 신경절 세포수를 상대적으로 비교한 결과이다(*p <0.05 vs 시스플라틴 단독).
도 3은 시스플라틴 주입 마우스(cisplatin-injected mice)에서 시스플라틴에 의해 유도된 청각유모세포 손상에 대한 ALA 투여 전후 치료 효과를 확인한 결과로서, 도 3A는 유모세포의 생존이나 변성을 확인하기 위해 내부 유모세포와 외부 유모세포를 포함한 코르티 기관의 Phalloidin 염색(적색) 결과를 타나낸 것이고(흰색 별표(*)는 퇴행성 유모세포를 나타낸 것이고, 스케일 바는 50 μm임), 도 3B는 각 그룹의 달팽이관(cochlea)의 기저부(basal), 중간(middle) 및 정점(apical) 회전(turn)에서 내부 및 외부 유모세포의 세포수를 히스토그램 정량화한 결과이다(*p <0.05 vs 시스플라틴 단독).
도 4는 시스플라틴 처리 HEI-OC1 세포(cisplatin-treated HEI-OC1 cells)에서 ALA 처리가 세포 생존 능력에 미치는 영향을 확인한 결과로서, 도 4A는 HEI-OC1 세포를 0.5, 1, 2, 3 및 4 mM의 ALA와 30 시간 동안 배양하고 세포 독성을 MTT assay로 측정한 결과이고, 도 4B는 HEI-OC1 세포를 30 분 동안 30 μM 시스플라틴의 처리한 후 1 시간 동안 0.5 내지 4 mM의 ALA로 처리하고 세포 독성을 MTT assay로 측정한 결과이다(*p <0.05 vs 시스플라틴 단독).
도 5는 시스플라틴 처리 HEI-OC1 세포(cisplatin-treated HEI-OC1 cells)에서 ALA가 세포주기 정지(cell cycle arrest) 및 세포사멸(apoptosis)에 미치는 영향을 확인한 결과로서, 도 5A는 유세포분석법(flow cytometry)에 의한 세포주기 분석 결과이고, 도 5B는 CP 단독 처리군과 ALA 단독 처리군 사이의 sub-G0/G1 비율을 비교한 결과이고, 도 5C는 세포사멸 세포(apoptotic cells)를 검출하기 위한 TUNEL assay 분석한 결과이고(형광 현미경(fluorescence microscope) 관찰 시, DNA-녹색, 핵-파란색으로 관찰되고, 스케일 바는 100 μm임), 도 5D는 시스플라틴 및 ALA로 처리한 세포에서 caspase-3 발현을 확인하기 위한 웨스턴 블롯(Western blot) 분석 결과이고, 도 5E는 덴시토미트리(densitometry)를 사용하여 caspase-3:β-actin 비율을 측정한 결과이다(*p <0.05 vs 시스플라틴 단독).
도 6은 시스플라틴 처리된 세포에서 ALA의 ROS 제거능(scavenging)을 나타낸 결과로서, 도 6A는 DCFH-DA probe를 이용한 세포 내 ROS 수치(level)를 측정한 결과이고(형광 강도는 flow cytometer를 사용하여 검출), 도 6B는 상대적인 FACS 형광 강도(FACS fluorescence intensities)를 측정한 결과이다(*p <0.05 vs 시스플라틴 단독).
도 7은 시스플라틴에 의한 Bax 매개 세포사멸(Bax-mediated apoptosis)에 대한 ALA의 항세포사멸 효과(antiapoptotic effect)를 확인한 결과로서, 도 7A는 로딩 대조군(loading control)인 β-actin과 Bax의 웨스턴 블롯 분석 결과이고(n = 3 per lane), 도 7B는 Bax와 β-actin의 상대적 발현 비율을 덴시토미트리(densitometry)를 이용하여 측정한 결과이고, 도 7C는 로딩 대조군(loading control)인 β-actin과 Bcl-2의 웨스턴 블롯 분석 결과이고(n = 3 per lane), 도 7D는 Bcl-2와 β-actin의 상대적 발현 비율을 덴시토미트리(densitometry)를 이용하여 측정한 결과이다(*p <0.05 vs 시스플라틴 단독).
도 8은 ALA 처리 전 또는 처리 후의 세포에서 항산화효소 GPx 및 GR의 발현 수준을 나타낸 결과로서, 도 8A는 로딩 대조군(loading control)인 β-actin와 GPx의 웨스턴 블롯 분석 결과이고(n = 3 per lane), 도 8B는 GR 및 β-actin의 상대적인 발현 비율을 덴시토미트리(densitometry)를 이용하여 측정한 결과이고, 도 8C는 로딩 대조군(loading control)인 β-actin와 GR의 웨스턴 블롯 분석 결과이고(n = 3 per lane), 도 8D는 GR 및 β-actin의 상대적인 발현 비율을 덴시토미트리(densitometry)를 이용하여 측정한 결과이고, 도 8E는 GSSG/GSH의 비율을 나타낸 결과이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 알파-리포익산(alpha-lipoic acid; ALA)을 유효성분으로 함유하는 시스플라틴에 의한 이독성 난청 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 청각유모세포 사멸을 억제시킬 수 있다.
또한, 상기 조성물은 청각유모세포에서 Bax 유전자 또는 단백질 발현은 감소시키고, Bcl-2 유전자 또는 단백질 발현은 증가시킴으로써 미토콘리아 기능장애로 인한 이독성 난청을 줄여줄 수 있다.
상기 조성물은 GPx 유전자 또는 단백질 발현을 증가시킬 수 있으며, 이는 GR 역할을 도와줌으로써 환원된 형태의 환원글루타티온(GSH)가 정상수준으로 유지될 수 있도록 기여할 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서, 상기 약학조성물은 통상적인 방법에 따라 주사제, 과립제, 산제, 정제, 환제, 캡슐제, 좌제, 겔, 현탁제, 유제, 점적제 또는 액제로이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 제형을 사용할 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, 약학조성물은 약학조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제, 붕해제, 감미제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제, 향미제, 항산화제, 완충액, 정균제, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.
구체적으로 담체, 부형제 및 희석제는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 사용할 수 있으며, 경구투여를 위한고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 있으며 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용 액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기재로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 약학 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 대상체로 투여할 수 있다.
본 발명에 따른 유효성분의 투여량은 대상체의 상태 및 체중, 질환의 종류 및 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 달라질 수 있으며 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면 이에 제한되는 것은 아니지만 1일 투여량이 0.01 내지 200 mg/kg, 구체적으로는 0.1 내지 200 mg/kg, 보다 구체적으로는 0.1 내지 100 mg/kg 일 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고 수회로 나누어 투여할 수도 있으며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 '대상체'는 인간을 포함하는 포유동물일 수 있으나,이들 예에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 알파-리포익산(alpha-lipoic acid; ALA)을 유효성분으로 함유하는 시스플라틴에 의한 이독성 난청 개선용 건강기능식품을 제공한다.
상기 건강기능식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.
그밖에 천연 과일 주스, 합성 과일 주스 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 또한, 건강기능식품 조성물은 육류, 소세지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 껌류, 아이스크림류, 스프, 음료수, 차, 기능수, 드링크제, 알코올 및 비타민 복합제 중 어느 하나의 형태일 수 있다.
또한, 상기 건강기능식품은 식품첨가물을 추가로 포함할 수 있으며, "식품첨가물"로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한 식품의약품안전청에 승인된 식품첨가물공전의 총칙 및 일반 시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.
상기 "식품첨가물공전"에 수재된 품목으로 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼륨, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성품, 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고랭색소, 구아검 등의 천연첨가물, L-글루타민산나트륨 제제, 면류 첨가 알칼리제, 보존료제제, 타르색소 제제 등의 혼합 제제류 등을 들 수 있다.
이때, 건강기능식품을 제조하는 과정에서 식품에 첨가되는 프라바스타틴 및 항혈소판제는 필요에 따라 그 함량을 적절히 가감할 수 있으며, 바람직하게는 식품 100 중량부에 1 중량부 내지 90 중량부 포함되도록 첨가될 수 있다.
더불어, 본 발명은 알파-리포익산(alpha-lipoic acid)을 유효성분으로 포함하는, 인 비트로(in vitro)에서 Bax 단백질 발현을 억제하거나, Bcl-2 단백질 발현을 증가시키거나, 또는 GPx 단백질 발현을 증가시키는 시약용 조성물을 제공한다.
또한, 인간을 제외한 동물에, 알파-리포익산(alpha-lipoic acid)을 유효성분으로 포함하는 조성물을 처리하는 것을 특징으로 하는, Bax 단백질 발현을 억제하거나, Bcl-2 단백질 발현을 증가시키거나, GPx 단백질 발현을 증가시키는 방법을 제공한다. 즉, 본 발명에 따른 알파-리포익산은 Bax 단백질 발현만 억제할 수도 있고, Bcl-2 단백질 발현만을 증가시킬 수도 있으며, GPx 단백질 발현만을 증가시킬 수도 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
<실험 방법>
1) 마우스 준비
암컷 및 수컷 마우스(8 주령)는 Hyochang Science(대구, 대한민국)에서 구입하였다. 모든 동물 절차는 경북대학교 동물 연구 위원회(Committee of Animal Research)가 발행한 Institutional Animal Care 지침에 부합하게 수행하였다.
2) 생체 내 실험 디자인(In vivo experimental design)
마우스를 대조군(control group), 시스플라틴 군(CP group), ALA 전처리 군(ALA pre-treatment group), ALA 후처리 군(ALA post-treatment group) 및 ALA 군(ALA group)으로 나누었다(총 5 군).
대조군(control group)은 0.9% 식염수로 3 일 동안만 처리하였다.
ALA 전처리 군(ALA pre-treatment group)은 마우스에 ALA를 2 일간 주사한 후 시스플라틴을 투여하였다.
ALA 후처리 군(ALA post-treatment group)은 마우스에 시스플라틴을 주사한 후 다음 2 일 동안 ALA를 주사하였다.
ALA 군은 마우스에 3 일 동안 ALA만 주사하였다.
시스플라틴 군(CP group)은 마우스에 시스플라틴만 주사하였다.
구체적으로 사용량은 20 m/kg 시스플라틴(Sigma, St. Louis, MO, USA) 및/또는 100 mg/kg ALA(Thioctacid inj®, Bukwang Pharmaceutical Co., Ltd., Seoul, 한국)을 복강 내 투여하였다.
아울러, 시스플라틴을 투여 받은 그룹의 경우, 청력 능력의 변화를 평가하기 위해, ABR 역치는 주입 전과 시스플라틴 주입 후 4.5 일에 측정하였다.
3) 청각의 뇌간 반응 측정(auditory brainstem response; ABR)
청각 기능을 평가하기 위해, ABR 측정기(System 3, Tucker Davis Technology, Inc., Alachua, FL, USA)를 사용하여 ABR 측정을 수행했다. 모든 테스트는 방음실에서 이루어졌다. ABR 측정에 앞서 alfaxalone(40 mg/kg)을 근육 내 주사하여 마우스를 마취시키고 체온을 37℃로 유지하기 위해 가열 패드 위에 마우스를 놓았다. 마우스 체온은 직장 온도계로 측정하고 모니터링 하였다. ABR을 기록하기 위해 피하 주사 전극을 정수리(+charge), 유양돌기(-e) 및 뒷다리(ground)에 삽입하였다. 음향 자극(Acoustic stimuli)은 8, 16, 및 32 kHz의 주파수, 또는 일시적인 클릭 자극(click stimuli)에서 1-ms rise/fall time 및 5-ms plateau를 갖는 톤-버스트 자극(tone-burst stimulus)으로 구성되며, 스피커를 통해 모노럴(monaural) 방식으로 적용하였다.
자극 신호(stimulus signals)는 SigGenRP 및 an RP2.1 real-time processor를 사용하여 생성시킨 다음 감쇠기(PA5, TDT), 스피커 드라이버(ED1, TDT) 및 정전 스피커(EC1, TDT)를 통해 전송되었다. 자극은 90-dB 음압 레벨부터 음향 임계값(acoustic threshold)까지 5-dB 감소율(decrement)로 500 회 반복하여 생성하였다.
4) 파라핀 절편(Paraffin sectioning) 및 조직학적 분석(histological analysis)
마우스를 1X 인산염 완충 식염수(PBS)로 관류시키고, 내이(inner ears)를 분리하였다. 파라핀 절편(Paraffin sectioning)의 경우 4℃에서 24 시간 동안 4% 파라포름알데히드(PFA)가 있는 PBS안에 내이를 고정시킨 후, 4℃에서 24 시간 동안 10% 에틸렌디아민테트라아세트산(ethylenediaminetetraacetic acid)이 있는 PBS로 탈석회화(decalcify)시켰다. 안쪽 귀(inner ears)를 에탄올 시리즈(graded ethanol series)로 탈수시키고, 자일렌(xylene)을 침투시키고, 실온에서 파라핀에 매립시켰다.
파라핀으로 봉입된 내이(paraffin-embedded inner ears)는 마이크로톰(microtome)(Leica RM2235, Leica Microsystems, Germany)을 사용하여 6 μm 두께의 조각으로 연속적으로 절편을 만들고, 염색을 위해 Superfrost Plus® 현미경 슬라이드(Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA)에 올렸다. 모든 슬라이드는 사용할 때까지 4℃로 유지하였다. 파라핀으로 봉입된 내이를 가진 슬라이드를 65℃에서 1 시간 동안 배양하고 자일렌(xylene)으로 탈파라핀화한 후 에탄올 시리즈(graded ethanol series)를 사용하여 재수화(rehydrattion)시켰다. 핵(Nuclei) 및 세포질(cytoplasm)은 헤마톡실린 및 에오신 시약(Sigma)으로 염색되었다.
나선형 신경절 세포(spiral ganglion cells)의 밀도를 확인하기 위해, 달팽이관(cochlea)의 각 회전(turn)[기저(basal), 중간(middle) 및 정점(apical)]에서, 파라핀 섹션의 1 mm2 영역 내 나선형 신경절 세포의 평균수(average number)를 계산하여 세포의 비율을 계산하였다.
5) 팔로이딘 염색(Phalloidin staining)
달팽이관(cochlea)을 4% PFA가 포함된 PBS로 실온에서 20 분간 고정하고, 1X PBS로 세척하며, 0.1% Triton X-100로 실온에서 15 분 동안 항온 배양하였다. 달팽이관으로부터 코르티 기관을 해부하여, 암실에서 2 시간 동안 Alexa Fluor 555 phalloidin(Invitrogen-Molecular Probes, Eugene, OR, USA, 1 : 1000)이 포함된 PBS로 염색하고, PBS로 3 번 세척하였다. 코르티 기관을 공초점 현미경(confocal microscope, LSM 700, Zeiss, Oberkochen, Germany)을 이용하여 홀 마운트(whole mounts) 관찰하여 달팽이관의 각 회전(turn)의 200 μm 영역 내에서 정상 유모세포(normal hair cells)의 수를 세었다.
6) 세포 배양 및 생존력 분석(Cell culture and viability assay)
HEI-OC1 청각유모세포를 항생제가 없는 10% 태아 소 혈청(Hyclone, Logan, UT, USA)을 함유한 Dulbecco's modified Eagle's medium(Hyclone, Logan, UT, USA) 및 50 units/mL IFN-γ(PeproTech, EC, London, UK)내에서 16 시간 동안 허용 조건(33℃, 10% CO2) 아래에서 배양하였다.
시험관 내 모든 실험에서 30 시간 동안 30 μM 시스플라틴 처리 전후에 각각의 세포 그룹(7 × 103 cells/well of 96-well plate)을 1 mM ALA로 전 처리 또는 사후 처리하였다.
세포 생존력은 3-(4,5-디메틸티아졸-2-yl)-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT; Sigma, St. Louis, MO, USA)]를 사용하여 측정하였다. 세포를 0.5, 1, 2, 3, 4 mM의 ALA 및/또는 30 μM 시스플라틴으로 30 시간 동안 처리한 후, 0.5 mg /mL의 MTT 용액을 세포 배양 배지에 첨가한 후, 33℃에서 10% CO2와 함께 2 시간 동안 배양하였다. 각 웰의 광학 밀도(optical density)를 550 nm에서 마이크로플레이트 판독기(microplate reader)를 사용하여 측정하였다.
7) 세포 내 ROS 생산 측정(Measurement of intracellular ROS production)
HEI-OC1 세포를 16 시간 동안 배양한 다음, ALA 전후 처리의 존재 또는 부재 하에 24 시간 동안 30 μM 시스플라틴으로 처리하였다. 형광 염료 인 DCFH-DA(Invitrogen-Molecular Probes, Eugene, OR, USA)를 사용하여 세포 내 ROS 수준을 측정하였다. 세포를 1 μM PBS로 2 회 세척하고 10 μM DCF-DA로 33℃, 10% CO2 조건에서 5 분간 배양하였다. 그런 다음, BD FACS Aria III 유세포분석기(BD Biosciences, San Diego, CA, USA)를 사용하여 DCFH-DA에서 배양된 세포의 유세 분석을 수행하였다(10,000 events per sample).
8) 세포주기 분석(Cell cycle analysis)
HEI-OC1 세포에 트립신을 처리하고, 수를 세고, 원심분리 하고, 30 μM 시스플라틴를 처리한 후 30 시간 동안 70% 에탄올에 고정시켰다. HEI-OC1 세포를 1X PBS로 2 회 세척하고 원심분리 시켰다. 원심분리된 펠렛을 RNase A (0.2 mg/mL) 및 프로피디움 요오드화물(PI, 10 μg / mL)의 용액에 재현탁 시키고 4℃에서 30 분 동안 항온 배양하였다. 세포주기 분포(Cell cycle distribution)는 BD FACS Aria III 유세포분석기(BD Biosciences, San Diego, CA, USA)를 사용하여 측정하였다.
9) DNA 단편의 검출(Detection of DNA fragmentation)
아파토시스(apoptosis)는 terminal TUNEL technique에 기초로 in situ 세포 사멸 검출 키트(Roche Biochemicals, Mannheim, Germany)를 사용하여 분석하였다. HEI-OC1 세포를 24-웰 배양 플레이트 상에서 배양하고, 시스플라틴으로 30 시간 동안 처리하였다. 그런 다음 각 실험 그룹의 세포를 실온에서 15 분 동안 4% PFA에 고정시킨 후 세척하고, 0.1% Triton X-100 및 0.1% 시트르산 나트륨이 포함된 물로 4℃에서 5 분간 침투(permeabilize)시켰다. TUNEL 반응 혼합물 50 μL을 샘플에 첨가하고 37℃에서 60 분 동안 항온 처리하였다. 모든 샘플을 각각 5 분 동안 1X PBS로 3 회 세척하였다. 그런 다음, 핵을 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(4′, 6-diamidino-2-phenylindole)로 5 분 동안 염색시켰다. 형광현미경(fluorescence microscopy, Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)을 사용하여 시편을 시각화하였다.
10) 단백질 준비(Protein preparation)
HEI-OC1 세포를 얼음처럼 차가운 1X PBS로 세척하고 프로테아제 억제제 (Calbiochem Protease Inhibitor Cocktail Set 1, La Jolla, CA, USA)의 칵테일(cocktail)이 들어있는 RIPA 완충액(Elpis Biotech, Daejeon, Korea) 100μL에 현탁시켰다. 이러한 현탁액을 미리 냉각시킨 1.5 mL 튜브에 옮기고 얼음에서 15 분 동안 배양한 다음 4℃에서 13,000 rpm으로 30 분간 원심분리하고 1 분 동안 볼텍싱 하였다. 상등액을 취하여 얼음 위의 새 튜브 안에 넣고 펠릿은 버렸다.
11) 웨스턴 블롯 분석(Western blot analysis)
HEI-OC1 세포 추출물을 12% 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 분석하였다. 분리된 단백질을 니트로 셀룰로오스 막(nitrocellulose membrane)에 전기 전이시켰다. 막을 5% 탈지유를 함유한 20 mM Tris-HCl(pH 7.6), 137 mM NaCl 및 0.01% Tween-20(TBS-T)의 용액으로 1 시간 동안 블럭(block)한 후, 1차 항체(1 : 100-1 : 2000 dilution)로 실온에서 탐침(probe)시켰다. 다음으로, 막(membrane)을 TBS-T로 각각 5 분 동안 3 회 세척하고, 2차 항체(1 : 2000 dilution)을 배양시켰다. 일련의 세척 과정을 진행한 후에, 향상된 화학발광검출시스템(chemiluminescent detection system)을 사용하여 측정하였다.
Rabbit anti-Bax 및 anti-caspase-3 항체는 Cell Signaling(Cell Signaling, Danvers, MA, USA), rabbit anti-Bcl-2, anti-GR, 및 anti-GPx 항체는 Abcam(Abcam, Cambridge, MA, UK)부터 구입하였다. 그리고 Goat anti-rabbit-lgG-HRP를 2 차 항체로 사용하였다(Cell Signaling, Danvers, MA, USA).
12) 글루타티온 수치 측정(Measuring glutathione levels)
GSH 수치(Cellular GSH levels)는 24 시간 동안 시스플라틴에 노출된 HEI-OC1 세포 용해물을 GSH colorimetric detection kit(BioVision Inc., Milpitas, CA, USA)를 사용하여 측정하였다. 간단히 말하면, 세포를 긁어서 얼음으로 차갑게 된 글루타티온 완충액 60 μL에 현탁시키고, 각 샘플을 과염소산 20 μL와 혼합하였다. 샘플을 얼음 상에서 5 분간 유지하고, 4℃에서 2 분 동안 13,000 rpm에서 원심 분리하였다. 상등액을 수집하고, 40 μL의 생성된 샘플에 20 μL의 차가운 6 N KOH 용액을 첨가하였다. 이들 샘플을 얼음 위에서 5 분간 유지하고 추운 곳에서 원심분리 하였다. 다음으로, 10 μL의 상등액(neutralized supernatant)을 96-웰 플레이트로 옮겼다. GSH를 검출하기 위해, 80 μL 분석 완충액을 각 웰에 첨가하였다. 총 GSH 샘플 70 μL을 10 μL reducing agent mix에 첨가하고 10 분간 배양하였다. GSSG 샘플을 60 μL 분석 완충액 및 10 μL GSH quencher에 10 분 동안 첨가한 다음, 10 μL 환원제(reducing agent)를 첨가하고, GSSG 샘플을 10 분 동안 배양하였다. 마지막으로, 10 μL의 σ-프탈알데히드(o-phthalaldehyde)를 모든 샘플에 첨가하고 실온에서 40 분 동안 배양하였다.
13) 통계분석(Statistical analyses)
SPSS 통계 소프트웨어 패키지(version 23; SPSS, Chicago, IL, USA)를 사용하여 데이터를 분석하였다. 연속 변수(Continuous variables)는 평균±표준 편차(mean±standard deviation)로 나타내었다. One-way ANOVA(일원분산분석)을 사용하여 5 개 또는 6 개 그룹의 변수를 분석하였다. Student 's t test를 사용하여 두 그룹을 분석하였다. 0.05 미만의 p 값(P<0.05)은 통계적으로 유의하다고 간주되었다.
<실시예 1> ALA의 청력 보호 및 시스플라틴 유도 이독성에 의한 감각세포 사멸 억제 효과 확인
1) 청각 뇌간 반응(auditory brainstem response) 측정을 통한 확인
시스플라틴에 의해 유발된 이독성 난청에 ALA가 미치는 영향을 마우스 모델을 통해 조사하였다. 대조군(control group)과 ALA 군(ALA group)의 경우, ABR 임계값의 변화는 클릭 음을 포함한 전체 주파수 범위에서 5 dB 미만이었다 라는 점에서, 정상 마우스에서 ALA 처리가 청각 능력에 영향을 미치지 않는다는 것을 알 수 있었다. 또한, 시스플라틴 군(CP group)은 ABR 역치의 유의한 변화를 나타내어 시스플라틴 치료가 심각한 난청을 유발한다는 것을 확인하였다(도 1).
ALA 전처리 군(ALA pre-treatment group)은 청력이 거의 완벽할 정도로 보호되었다는 것을 통해(ABR 임계값에서 5-10 dB 변화), ALA가 시스플라틴에 의한 청력 상실을 보호할 수 있다는 점을 입증하게 되었다. 가장 흥미로운 결과는 ALA 후처리 군(ALA post-treatment group)에 의해 알 수 있듯이 ALA의 경감 효과(alleviative effect)였다. ALA 전처리 군(ALA pre-treatment group)과 ALA 후처리 군(ALA post-treatment group)에 ABR 역치 변화가 5-10 dB로 작은 차이가 관찰되었지만, ALA 후처리 군(ALA post-treatment group)에서 시스플라틴 투여 후 대부분 청력 감소를 완화시켰다. 이러한 결과는 ALA가 치료 약물로서 효과가 있음을 시사한다.
2) 혈관선조(stria vascularis) 및 나선형 신경절(spiral ganglion)의 형태학적 관찰을 통한 확인
듣기(hearing) 능력의 변화가 형태학적 이상과 관련이 있는지를 알아보기 위해 헤마톡실린(hematoxylin)과 에오신(eosin) 염색을 이용한 조직학적 분석을 수행하였다. 혈관선조(stria vascularis)와 나선형 신경절(spiral ganglion)이 시스플라틴로 인한 이독성의 주요 표적이기 때문에 이 두 영역에 중점을 두고 조사하였다(도 2A).
혈관선조(stria vascularis)에서는 대조군과 다른 모든 군 사이의 두께를 포함하여 두드러진 조직학적 차이는 관찰되지 않았다(도 2B (위) 및 도 2C). 시스플라틴에 의한 가장 심한 손상은 나선형 신경절(spiral ganglion)에서 발견되었는데, 세포수가 대조군(control group) 보다 시스플라틴 군(CP group)의 basin turn에서 70% 더 낮았다. 대조적으로, ALA 전처리 군(ALA pre-treatment group) 및 ALA 후처리 군(ALA post-treatment group)에서 나선형 신경절 세포수는 대조군과 유사하였다(도 2B (아래) 및 도 2D).
이러한 결과는 나선형 신경절 세포의 손실이 시스플라틴으로부터 직접 난청을 유발시킬 수 있음을 시사하는 것이며, 이는 ABR 임계값 결과와 매우 일치함을 확인할 수 있었다.
3) 유모세포(hair cell)의 조직학적 변화 관찰을 통한 확인
유모세포(hair cell)가 시스플라틴에 의한 이독성 난청에 영향을 받는지 여부를 확인하기 위해 코르티(corti) 기관의 홀 마운트 팔로이딘(whole mount phalloidin) 염색을 하여 조사하였다. 그 결과, 시스플라틴 투여로 인한 내부 유모세포와 외부 유모세포의 현저한 변화를 확인할 수 있었다(도 3).
기저부 회전(basal turn)의 면적은 중간 회전(middle turn) 및 정점 회전(apical turn)의 영역보다 더 심한 손상을 보였으며, 바깥쪽 유모 세포(outer hair cell)는 안쪽 유모 세포(inner hair cell)보다 시스플라틴에 더 민감하였다(도 3A). 그러나 심각한 손상은 ALA로 전처리 또는 후처리함으로써 현저하게 보호(protect)되거나 경감(alleviate)된 것을 확인할 수 있었다(도 3B).
<실시예 2> ALA의 세포 독성 및 세포 생존율 확인
시스플라틴에 의해 유도된 세포 독성에 ALA가 영향을 미치는지 알아보기 위해 HEI-OC1(House Ear Institute-Organ of Corti 1) 세포를 사용하여 ALA가 조절하는 세포 내 메커니즘을 조사하고자 하였다. 이에 먼저 ALA가 처리되지 않은 세포와 ALA 처리된 세포의 세포생존력을 측정하여 ALA의 세포 독성을 시험했다.
0.5 ~ 4 mM 농도의 ALA에서 세포 독성이 없음을 관찰할 수 있었다(도 4A). 단, 시스플라틴만 처리된 경우(시스플라틴 군(CP group)) 세포 생존율을 40% 까지 감소하였다. 그러나, ALA의 전처리 또는 사후처리로, 세포 생존 능력은 유의하게 증가되었음을 확인할 수 있었다(도 4B). 세포에 2 mM ALA가 전처리 되었을 때 가장 높은 세포 생존률인 87%의 수치가 확인되었다. 또한, ALA가 후처리 되었을 때 시스플라틴에 의한 세포 손상을 상당히 완화되어 1 mM ALA에서 78%의 세포 생존률이 확인되었다. 이러한 결과를 고려하여, 다음 실험에서 1 mM ALA를 사용했다.
<실시예 3> ALA의 세포 주기(cell cycle)와 세포사멸(apoptosis)에 미치는 영향 확인
시스플라틴의 세포사멸(apoptosis)에 대한 ALA의 방어적인 역할을 입증하기 위해 세포 주기(cell cycle)와 세포사멸 신호 전달 경로(apoptotic signaling pathway)를 분석하여 조사하였다.
종래의 연구는 시스플라틴과 DNA의 교차 결합이 세포 주기 억류(cell cycle arrest)를 일으킨다고만 제안했기 때문에, 본 발명에서는 유세포분석(flow cytometry)을 통해 sub-G0/G1 fraciton ratio를 측정하였다.
시스플라틴 군(CP group)이 대조군(control group)보다 sub-G0/G1 단계에서 더 큰 세포 집단을 가지고 있음을 확인하였다(17% vs. 4%). 그러나, ALA 전처리 군(ALA pre-treatment group), ALA 후처리 군(ALA post-treatment group)은 세포 집단 중 6-7%만이 sub-G0/G1 단계에 있었다(도 5A 및 도 5B). 이러한 결과는 ALA가 세포를 보호하고 시스플라틴에 의해 유도된 세포 주기 억류(cell cycle arrest)를 완화시킬 수 있음을 시사한다.
시스플라틴 군(CP group)은 TUNEL assay 분석 시 대조군(control group)에서 보이지 않는 높은 TUNEL signal를 보였다. 대조적으로, ALA 전처리 군(ALA pre-treatment group)과 ALA 후처리 군(ALA post-treatment group)에서 최소 TUNEL 신호만 검출되어 시스플라틴 군(CP group) 보다 신호 강도가 현저히 낮았다(도 5C).
또한, caspase-3 발현 분석을 통해 ALA가 세포 사멸 신호를 감소시키는 능력이 있음을 웨스턴 블롯 분석을 통해 관찰할 수 있었다. 시스플라틴이 처리된 세포에서 caspase-3 발현이 많이 됨을 확인할 수 있었으나, 시스플라틴 처리되지 않은 대조군에서는 눈에 띄지 않을 만큼 발현되지 않았다. 대조적으로, ALA 전처리 군(ALA pre-treatment group) 및 ALA 후처리 군(ALA post-treatment group)의 경우 caspase-3 발현이 억제되는 것으로 관찰되었다(도 5D 및 도 5E).
이러한 결과는 ALA를 이용한 전처리가 시스플라틴 세포 독성에 대해 세포를 보호할 수 있을 뿐만 아니라, ALA를 이용한 후처리가 시스플라틴에 의해 유도된 caspase-3-의존성 세포사멸 시그널(caspase-3-dependent apoptosis signaling pathway)을 불활성화하여 세포 사멸을 완화시킬 수 있음을 의미한다.
<실시예 4> 미토콘드리아 내 ROS 감소 효과 및 관련 단백질의 증감 확인
시스플라틴에 의한 세포사멸(apoptosis)의 주요 원인 중 하나는 세포 내 ROS의 과도한 축적이며, ALA는 효과적인 항산화제로서 잘 알려져 있다. 이에, HEI-OC1 세포에서 ALA가 시스플라틴에 의해 생성된 세포 내 ROS를 감소시키는지를 확인하기 위해 DCFHDA(2′, 7′-dichlorofluorescein diacetate) 분석을 수행하였다.
시스플라틴 군(CP group)은 대조군(control group)에 비해 약 1.6 배의 형광 강도를 나타내었으며, 이는 ROS의 증가는 시스플라틴에 의한 것임을 알 수 있다. 대조적으로, ALA 전처리 군(ALA pre-treatment group)은 대조군(control group)과 유사한 형광 강도(fluorescent intensity)를 유지했다. 또한, ALA 후처리 군(ALA post-treatment group)은 시스플라틴 군(CP group)에 비해 현저히 낮은 형광 강도를 나타냈다(도 6A 및 도 6B). 이러한 결과는 ALA가 시스플라틴 처리 후 세포 내 과발현된 ROS를 감소시킬 뿐만 아니라, 처리 전에도 시스플라틴 유발된 ROS 생성을 예방한다는 것을 의미한다.
세포질에 존재하는 Bax는 산화 스트레스(oxidative stress)에 따라 미토콘드리아 막간 공간(mitochondrial intermembrane space)으로 이동하여 시토크롬 c를 방출함으로써 세포자멸(apoptosis)을 유도한다. 반면 Bcl-2는 Bax 활성을 억제하여 세포 사멸(apoptosis)을 억제하고 세포 생존을 촉진한다. 따라서 시스플라틴에 의해 증가된 ROS 축적은 Bax가 세포 사멸을 유도하는 미토콘드리아 기능 장애를 일으키도록 유도하는 것으로, ALA는 시스플라틴에 의해 유도된 산화 스트레스로부터 미토콘드리아를 보호하는데 중심적인 역할을 한다.
ALA의 ROS 스캐밴징(scavenging)은 전세포사멸(proapoptotic) 단백질인 Bax 및 항세포사멸(antiapoptotic) 단백질인 Bcl-2의 조절을 통해 결국 세포 사멸을 억제하는 것으로 나타났다. 시스플라틴 군(CP group)은 Bax 단백질 발현량이 대조군(control group)보다 1.6 배 이상 높았으나, ALA를 처리 세포군에서는 Bax 단백질 발현을 유의하게 완화시켰다(도 7A 및 도 7B). 반대로, 시스플라틴 처리는 Bcl-2 단백질 발현을 하향 조정하였고 ALA 처리 세포는 Bcl-2 단백질 발현을 회복시켰다(도 7C 및 도 7D).
여기서 중요한 것은 비록 세포가 시스플라틴에 의해 이미 손상되었지만(ALA 후처리 군(ALA post-treatment group)의 경우), ALA는 Bax 단백질 발현을 성공적으로 억제하여 세포사멸(apoptosis)을 줄인다는 사실이다. 즉, 이는 ALA가 시스플라틴에 의한 이독성 난청 발병 후에 치료제로서 효과가 있다는 것을 의미한다.
<실시예 5> 글루타티온의 산화-환원 반응에 관여하는 ALA 확인
대표적인 산화 방지제인 글루타티온(glutathione)의 산화 및 환원에 ALA가 관여하는 것으로 알려져 있다. 글루타티온의 환원된 형태인 GSH는 글루타티온 퍼옥시다아제(GPx)에 의해 글루타티온 디설파이드(Glutathione disulfide; GSSG)로 산화되어 세포 내 ROS를 감소시키며, GSSG는 글루타티온 환원 효소(glutathione reductase; GR)에 의해 GSH를 감소시킨다. 글루타티온 레독스 사이클(glutathione redox cycle)은 GSSG의 산화 형태를 GSH로 감소시키는데 핵심적인 역할을 하는 것으로 알려져 있으므로 웨스턴 블롯에 의한 GPx 및 GR의 발현 수준을 확인하였다.
놀랍게도 GPx 발현이 ALA를 처리한 모든 군에서 4-5 배 정도 증가하였으며, 이는 ALA에 의해 유도된 GPx 발현은 ROS를 능동적으로 제거할 수 있음을 시사한다(도 8A 및 도 8B). 흥미롭게도, GR 발현의 증가는 GPx 발현에 비해 유의하지 않았다(도 8C 및 도 8D). 이것은 GR의 불충분한 발현으로 인해 증가된 GSSG를 GSH로 감소시킬 수 없음을 나타낸다.
그러나, GR 발현이 유의하게 증가하지는 않았지만, ALA 전처리 군(ALA pre-treatment group) 및 ALA 후처리 군(ALA post-treatment group)의 GSSG/GSH 비율은 대조군(control group)과 유사하였다(도 8E). 이러한 결과는 ALA가 GSSG를 GSH로 감소시키기 위해 GR의 역할을 수행하여 ROS를 지속적으로 줄이는 역할을 한다는 것을 의미한다.
상기 결과들로부터 알파-리포익산(alpha-lipoic acid)은 시스플라틴에 의한이독성 난청을 개선시키는데 효과가 있음을 확인할 수 있었다. 따라서, 본 발명에 따른 알파-리포익산(alpha-lipoic acid)은 시스플라틴에 의한 이독성 난청 치료용 약학적 조성물 또는 개선용 건강기능식품으로 사용될 수 있다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

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  3. 알파-리포익산(alpha-lipoic acid)을 유효성분으로 포함하는, 인 비트로(in vitro) 상의 청각유모세포에서 Bax 유전자 또는 단백질 발현은 감소시키고, Bcl-2 유전자 또는 단백질 발현은 증가시키며, GPx 유전자 또는 단백질 발현을 증가시키는 시약용 조성물.
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