KR20230152605A - 미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는 난청 또는 이명의 예방 또는 치료용 약학 조성물 - Google Patents
미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는 난청 또는 이명의 예방 또는 치료용 약학 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는 난청 또는 이명의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 상기 약학 조성물은 손상에 의한 내이 세포의 사멸을 방지하고 청각 손실을 억제하는 효과가 있어, 결과적으로 난청을 효과적으로 완화 또는 치료할 수 있다.
Description
본 발명은 미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는 난청 또는 이명의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
귀는 귓바퀴와 외이도까지를 외이로 분류하고, 고막과 이소골은 중이, 그리고 달팽이관과 청신경을 내이로 분류한다. 소리는 음향학적 에너지로서 귓바퀴와 외이도를 통해 전달되어 고막을 진동시키고, 고막의 진동은 기계적인 에너지를 발생시켜 이소골로 전달된다. 이소골의 마지막 뼈인 등골은 달팽이관에 연결되어, 전달된 에너지를 달팽이관 내의 림프액으로 전달한다. 림프액으로 전달된 에너지는 림프액에 파동을 일으키고, 이러한 파동에 의해 달팽이관 내에 있는 유모세포가 자극을 받는다. 유모세포의 움직임으로 이온변화가 일어나면서 유모세포에 붙어있는 청신경으로 신경전달물질이 전달되고, 소리에너지는 청신경에서 전기적인 에너지 형태로 뇌까지 전달된다.
외이와 중이는 소리를 전달하는 기관으로서 염증 같은 질병에 감염되었을 때, 대부분 치료 또는 수술로 회복될 수 있고, 그로 인한 청력 손실 역시 치료에 의해 개선될 수 있다. 이러한 난청을 전음성 난청(conductive hearing loss)이라 한다. 한편, 소리를 감지하는 기관인 달팽이관과 전기적 에너지로 소리를 전달하는 청신경, 및 소리의 변별, 이해 등 종합적인 역할을 하는 뇌에 문제가 생겨 발생되는 난청을 감각신경성 난청(sensorineural hearing loss)이라 한다.
신체의 감각 기관 중 청각 기관은 의사소통에 가장 기초적인 감각으로 언어나 지식을 습득하고, 사회생활을 하며 인간적 삶을 사는데 가장 중요한 감각 중 하나이다. 대부분의 청력손실은 현재까지 예방 외에 치료방법이 없는 감각신경성 난청에 해당하며, 일단 난청이 발생하면 보청기 등의 보조수단을 이용하거나 기계적 장치를 체내에 이식하는 방법을 사용한다. 또한, 상기 난청은 이명을 동반하기도 한다.
이와 관련하여, 대한민국 특허출원 제10-2008-0044810호에는 황금 추출물이 소음성 난청 동물모델에서 유의적인 청각손상 예방 효과가 있음을 개시하고 있다. 이외에도, 난청의 예방 또는 치료에 효과적인 물질로서, 항산화제, NMDA(N-methyl-D-aspartate) 길항제, 세포사멸 억제제, 성장인자 등이 연구되고 있다. 그러나 이와 같은 물질들은 임상시험까지 진행되는데 한계를 보였다.
한편, 미토콘드리아는 에너지 공급원으로서 아데노신 트라이포스페이트(adenosine triphosphate, ATP) 합성 및 조절에 관여하는 진핵 세포의 생존에 필수적인 세포 소기관이다. 미토콘드리아는 생체 내 다양한 대사 경로, 예를 들어, 세포 신호처리, 세포 분화, 세포 사멸뿐만 아니라 세포 주기 및 세포 성장의 제어와 연관이 있는 중요한 세포 소기관이다. 이러한 미토콘드리아를 유효성분으로 하는 약학 조성물이 난청 또는 이명 치료와 연관성이 있을 수 있음은 연구된 바가 없었다.
이에, 본 발명자들은 난청 또는 이명의 치료를 위해 분리된 미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는 난청의 치료용 조성물을 개발함으로써 난청을 근본적으로 치료할 수 있는 방법을 개발하여 위와 같은 문제점을 해결하였다.
본 발명의 일 측면은, 분리된 미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는 난청 또는 이명의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는 난청 또는 이명의 예방 또는 치료용 약학 조성물은 손상에 의한 내이 세포의 사멸을 억제하여 결과적으로 청각 손실을 억제하는 효과가 있어, 난청 또는 이명을 효과적으로 완화 또는 치료할 수 있다.
도 1은 마우스 내이세포에 항생제(Gentamicin 및 Kanamycin), 항암제(Cisplatin) 또는 과산화수소를 처리하였을 경우, 내이세포 생존율 변화를 나타낸 그래프이다.
도 2는 항생제(Gentamicin)에 의해 손상된 마우스 내이세포에 미토콘드리아를 처리하였을 경우, 마우스 내이세포의 생존율 변화를 나타낸 그래프이다.
도 3은 항생제(Kanamycin)에 의해 손상된 마우스 내이세포에 미토콘드리아를 처리할 경우, 마우스 내이세포의 생존율 변화를 나타낸 그래프이다.
도 4는 항생제(Gentamicin)에 의해 손상된 마우스 내이세포에 미토콘드리아를 처리할 경우, 활성산소 발생 변화를 나타낸 그래프이다.
도 5는 항생제(Kanamycin)에 의해 손상된 마우스 내이세포에 미토콘드리아를 처리할 경우, 활성산소 발생 변화를 나타낸 그래프이다.
도 6은 소음으로 인한 청력상실 모델에 미토콘드리아를 처리하였을 경우, 청력 회복 정도를 나타낸 그래프이다.
도 2는 항생제(Gentamicin)에 의해 손상된 마우스 내이세포에 미토콘드리아를 처리하였을 경우, 마우스 내이세포의 생존율 변화를 나타낸 그래프이다.
도 3은 항생제(Kanamycin)에 의해 손상된 마우스 내이세포에 미토콘드리아를 처리할 경우, 마우스 내이세포의 생존율 변화를 나타낸 그래프이다.
도 4는 항생제(Gentamicin)에 의해 손상된 마우스 내이세포에 미토콘드리아를 처리할 경우, 활성산소 발생 변화를 나타낸 그래프이다.
도 5는 항생제(Kanamycin)에 의해 손상된 마우스 내이세포에 미토콘드리아를 처리할 경우, 활성산소 발생 변화를 나타낸 그래프이다.
도 6은 소음으로 인한 청력상실 모델에 미토콘드리아를 처리하였을 경우, 청력 회복 정도를 나타낸 그래프이다.
분리된 미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는 난청 치료제
본 발명의 일 측면은, 분리된 미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는 난청 또는 이명의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "미토콘드리아(mitochondria)"는 대부분의 진핵 생물에서 발견되는 이중막 결합 소기관으로, 세포 내 아데노신 삼인산(ATP)의 대부분을 생성한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "분리된 미토콘드리아"는 자가(autologous), 동종(allogeneic) 또는 이종(xenogeneic)으로부터 수득된 미토콘드리아를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "자가 미토콘드리아"는 동일 개체의 혈장, 조직, 골수 또는 세포로부터 수득된 미토콘드리아를 의미한다. 또한, 용어 "동종 미토콘드리아"는 개체와 같은 종에 속하고, 대립유전자에 대해서는 다른 유전자형을 가지는 개체의 혈장, 조직, 골수, 혈소판 또는 세포로부터 수득된 미토콘드리아를 의미한다. 또한, 용어 "이종 미토콘드리아"는 개체와 다른 종에 속하는 개체의 혈장, 조직, 골수 또는 세포로부터 수득된 미토콘드리아를 의미한다.
이때, 상기 개체는 포유동물일 수 있으며, 바람직하게는 인간일 수 있다.
상기 미토콘드리아는 개체의 세포로부터 분리된 것일 수 있다. 상기 미토콘드리아는 체외에서 배양된 자가 또는 타가 세포로부터 수득된 것일 수 있다. 이때, 세포는 생물학적 활성이 정상인 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "세포(cell)"은 생물을 구성하는 구조적 또는 기능적 단위로서, 세포막으로 둘러싸인 세포질로 구성되어 있고, 단백질 및 핵산 등의 생체분자를 포함하는 것을 의미한다. 상기 세포는 세포막 내부에 미토콘드리아를 포함하는 세포를 의미한다.
또한, 상기 미토콘드리아는 조직 또는 세포를 농축하여 파쇄 후 분리하여 사용하거나 동결 보관한 후 해동한 조직 또는 세포 시료로부터 파쇄 후 분리된 것일 수 있다.
상기 미토콘드리아는 온전한 형태, 파쇄된 형태 또는 이의 조합을 가지는 것일 수 있다. 일 구체예에 있어서, 상기 미토콘드리아는 파쇄된 형태인 경우에도 미토콘드리아의 활성을 가지는 경우에는 약리효과를 나타낼 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 세포는 줄기세포, 체세포, 생식세포 및 혈소판으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "줄기세포"는 여러 종류의 조직 세포로 분화할 수 있는 능력을 가진 미분화 세포를 의미한다. 상기 줄기세포는 중간엽줄기세포, 성체줄기세포, 역분화줄기세포, 배아줄기세포, 골수줄기세포, 신경줄기세포 및 조직 유래 줄기세포로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
이때, 상기 중간엽줄기세포는 탯줄, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막 및 태반으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다. 바람직하게는, 인간 탯줄 유래일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "체세포"는 개체를 구성하는 세포 중 생식세포를 제외한 세포를 의미한다. 상기 체세포는 근육세포, 간세포, 섬유아세포, 상피세포, 신경세포, 지방세포, 골세포, 골막세포, 백혈구, 림프구 및 점막세포로 구성된 군으로부터 선택되는 하나일 수 있다. 바람직하게는, 미토콘드리아 활성이 뛰어난 근육세포 또는 간세포로부터 수득된 것일 수 있다. 또한, 자가 또는 타가 혈액 PBMC 세포로부터 수득된 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "생식세포"는 유성 생식을 하는 개체에서 생식 시, 접합자(zygote)를 형성하는 세포를 의미한다. 상기 미토콘드리아는 자가 또는 타가 생식세포에서 수득된 것일 수 있다. 상기 생식세포는 정자 또는 난자일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "혈소판"은 혈액에서 섬유소 묶어 응혈을 형성함으로써 혈액 응고에 중요한 역할을 하는 고형 성분을 의미한다. 상기 미토콘드리아는 자가 또는 타가 혈소판에서 수득된 것일 수 있다.
또한, 상기 분리된 미토콘드리아는 생물학적 활성이 정상인 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 생물학적 활성이 정상인 미토콘드리아는 (i) 막 전위를 가지는 것, (ii) 미토콘드리아 내에서 ATP를 생성하는 것 및 (iii) 미토콘드리아 내에서 ROS를 제거하거나 ROS의 활성을 감소시키는 것으로 구성된 군으로부터 하나 이상의 특성을 가지는 것일 수 있다.
일 실시예에서, 본 발명의 분리된 미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물을 개체에 투여한 결과, 내이 세포의 사멸을 억제함을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 약학 조성물은 난청 또는 이명을 효과적으로 완화 또는 치료하는 효과가 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "이명(Tinnitus)"은 실제적인 외부 소리가 존재하지 않을 때, 소리를 인지하는 질병이다. 인지되는 소리는 딸각거리는 소리, 윙윙거리는 소리, 쉿하는 소리 또는 포효하는 소리일 수 있다. 상기 이명은 일반적으로 청력 상실과 관련성이 있다.
상기 이명은 난청, 중이염, 심장 질환, 혈관 질환, 메니에르병, 뇌종양, 청신경종, 편두통, 턱관절 장애, 약물에 대한 노출, 두부 손상, 귀지, 스트레스 또는 우울증에 의한 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "난청(hearing loss)"은 청각 저하, 청각 손실을 가지는 질환을 의미한다. 상기 난청은 전음성 난청 또는 감각신경성 난청일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "전음성 난청(conductive hearing loss)"은 외이, 고막, 중이 등 기관의 장애로 인하여 음파의 전달이 정상적으로 이루어지지 않는 상태로 발생하는 난청을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "감각신경성 난청(sensorineural hearing loss)"은 달팽이관의 기능에 이상이 생기거나 청각 자극을 뇌로 전달하는 청신경 또는 중추신경계의 이상으로 발생하는 난청을 의미한다.
상기 감각신경성 난청은 선천성 난청, 소음성 난청, 돌발성 난청, 감염성 난청, 외상성 난청, 노인성 난청, 이독성 난청, 자가면역성 난청, 메니에르병 또는 신경손상에 의한 난청일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "소음성 난청"은 외부 소음에 의한 와우의 손상으로 인해 발생한 난청이다.
본 명세서에서 사용된 용어, "돌발성 난청"은 약 3일 내에 3개 이상의 연속된 주파수에서 약 30dB 이상의 청력손실이 발생한 난청이다.
본 명세서에서 사용된 용어, "감염성 난청"은 풍진 바이러스(rubella virus), 선천성 거대세포 바이러스(cytomegalovirus, CMV) 감염 등의 바이러스 감염에 의해 발생한 난청이다.
본 명세서에서 사용된 용어, "외상성 난청"은 외상에 의해 외림프 누공 또는 내이기종(Pneumolabyrinth) 등이 발생하여 발생한 난청이다.
본 명세서에서 사용된 용어, "노인성 난청"은 노화에 따른 퇴행성 변화에 의한 난청이다.
본 명세서에서 사용된 용어, "자가면역성 난청"은 자가면역질환(autoimmune disease)으로 인해 발생한 난청이다.
본 명세서에서 사용된 용어, "메니에르병"은 회전감 있는 현기증, 청력 저하, 이명, 이 충만감(귀가 꽉 찬 느낌)과 같은 증상이 동시에 발현되는 질병이다.
본 명세서에서 사용된 용어, "신경손상에 의한 난청"은 달팽이관의 청각세포로부터 뇌의 청각을 담당하는 부위까지의 신경 부위에 이상이 생겨 발생한 난청이다.
본 명세서에서 사용된 용어, "이독성 난청"은 약물, 화학물질 또는 방사선 등에 의하여 내이기능이 저하되어 발생한 난청이다. 일 구체예에 있어서, 상기 이독성 난청은 항암제, 항생제 또는 방사선의 사용에 의한 것일 수 있다. 구체적으로, 항암제, 항생제 또는 방사선의 사용에 의해 ROS의 농도가 증가하고, 내이가 손상되어 발생하는 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "항암제"는 암세포의 분열을 억제하고 괴사시키는 약물을 의미한다. 상기 항암제는 신경독성을 일으키는 것일 수 있다.
또한, 상기 항암제는 탁산계(taxane) 항암제, 플래티늄계(platinum) 항암제 및 빈카 알칼로이드계(vinca alkaloids) 항암제로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 것일 수 있다. 바람직하게는, 상기 항암제는 플래티늄계 항암제 일 수 있다.
상기 탁산계 항암제는 도세탁셀(docetaxel), 오락솔(oraxol), 파클리탁셀(paclitaxel), 디탁셀(ditaxel), 탁솔(taxol) 및 탁소텔(taxotere)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 것일 수 있다.
상기 빈카 알칼로이드계 항암제는 빈블라스틴(vinblastine), 빈크리스틴(vincristine), 빈데신(vindesine) 및 비노렐빈(vinorelbine)으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 것일 수 있다.
상기 플래티늄계 항암제는 시스플라틴(cisplatin), 카보플라틴(carboplatin) 및 옥살리플라틴(oxaliplatin)으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "항생제"는 다른 미생물의 성장이나 생명을 막는 약물을 의미한다. 상기 항생제는 세포벽 합성 억제, 세포벽 투과의 변화, 단백질 합성 억제, 핵산 합성 억제 및 엽산 합성 억제로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 메커니즘을 통해 세균을 사멸하거나 억제하는 것일 수 있다.
상기 항생제는 베타-락탐계(Beta-Lactams), 설파제(Sulfonamides), 아미노글리코사이드계(Aminoglycosides), 테트라사이클린계(Tetracyclines), 글리코펩티드계(Glycopeptides), 안사마이신계(Ansamycins), 페니실린계(Penicillins), 마크로라이드계(Macrolides), 스트렙토그라민계(Streptogramins), 세팔로스포린계(Cephalosporins) 및 퀴놀론계(Quinolones)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 것일 수 있다. 바람직하게는, 상기 항생제는 아미노글리코사이드계(Aminoglycosides)일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 항생제는 스트렙토마이신(streptomycin), 네오마이신(neomycin), 카나마이신(kanamycin), 네오마이신(neomycin), 젠타마이신(gentamycin), 토브라마이신(tobramycin), 아미카신(amikacin), 네틸마이신(netilmicin), 디베카신(dibekacin), 시소마이신(sisomycin), 리보도마이신(livodomycin) 및 파로모마이신(paromomycin)으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 본 발명의 분리된 미토콘드리아를 유효성분으로 하는 약학 조성물은 항암제, 항생제 또는 방사선의 사용에 의해 증가된 ROS의 농도를 감소시키고, 내이의 손상을 방지하여 이독성 난청 또는 이명을 예방 또는 치료하는 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "치료"는 치료학적 처리 및 예방적 처리를 모두 포함하는 의미로 사용될 수 있다. 이때, 예방은 개체의 병리학적 상태 또는 질환을 완화시키거나 감소시키는 의미로 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "유효성분"은 단독으로 활성을 나타내거나 또는 그 자체로는 활성이 없는 보조제(담체)와 함께 활성을 나타내는 성분을 지칭한다. 일 구체예에 있어서, 상기 유효성분으로서 분리된 미토콘드리아는 손상에 의한 내이 세포의 사멸, ROS의 증가 또는 청각 손실을 억제할 수 있다.
상기 미토콘드리아를 특정 세포로부터 분리하는 경우에는, 예를 들어, 특정 버퍼 용액을 사용하거나 전위차 및 자기장을 이용하는 등 공지된 다양한 방법을 통해 분리할 수 있다. 또한, 상기 미토콘드리아 분리는 혈장을 원심분리 및 여과하여 모든 세포 성분을 제거하는 단계, 여과된 혈장을 원심분리하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 미토콘드리아 분리는 미토콘드리아 활성 유지 측면에서, 조직 또는 세포를 파쇄하고 원심분리하여 수득할 수 있다. 일 구체예로, 세포를 배양하고, 이러한 세포를 포함하는 조성물을 제1차 원심분리하여 펠렛을 생성하는 단계, 상기 펠렛을 버퍼 용액에 재현탁시키고, 균질화하는 단계, 상기 균질화된 용액을 제2차 원심분리하여 상층액을 제조하는 단계 및 상기 상층액을 제3차 원심분리하여 미토콘드리아를 정제하는 단계로 수행될 수 있다. 이때, 제2차 원심분리가 수행되는 시간은 제1차 및 제3차 원심분리가 수행되는 시간보다 짧도록 조절되는 것이 세포 활성 유지 면에서 바람직하며, 제1차 원심분리에서 제3차 원심분리로 갈수록 속도를 높일 수 있다.
구체적으로, 상기 제1차 내지 제3차 원심분리는 약 0℃내지 약 10℃의 온도, 바람직하게는 약 3℃내지 약 5℃의 온도에서 수행될 수 있다. 또한, 상기 원심분리가 수행되는 시간은 약 1분 내지 50분 동안 수행될 수 있으며, 원심분리 횟수 및 샘플의 함량 등에 따라 적절히 조정될 수 있다.
아울러, 상기 제1차 원심분리는 약 100xg 내지 약 1,000xg, 약 200xg 내지 약 700xg 또는 약 300xg 내지 약 450xg의 속도로 수행될 수 있다. 또한, 상기 제2차 원심분리는 약 1xg 내지 약 2,000xg, 약 25xg 내지 약 1,800xg 또는 약 500xg 내지 약 1,600xg의 속도로 수행될 수 있다. 또한, 상기 제3차 원심분리는 약 100xg 내지 약 20,000xg, 약 500xg 내지 약 18,000xg 또는 약 800xg 내지 약 15,000xg의 속도로 수행될 수 있다.
아울러, 상기 수득된 미토콘드리아의 안정화를 위하여 약학적으로 허용 가능한 당이 사용될 수 있다. 구체적으로, 수크로오스(sucrose), 만니톨(mannitol), 트레할로오스(trehalose) 등의 당일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, pH 완충제로서 이에 제한되지는 않으나, 약학적으로 혀용가능 한 트리스(tris), HEPES, phosphate 등이 사용될 수 있다.
한편, 상기 미토콘드리아 수득 후 이온(ion) 유출에 의한 손상을 제거하고, 산화 스트레스를 억제하기 위한, 킬레이터, 항산화제 등의 첨가제를 사용할 수 있으며, 이는 당업계에서 널리 알려진 시약을 제한없이 포함하여 사용할 수 있다. 예컨대, EDTA, EGTA, 시트레이트(citrate), 글라이신(glycine), 타우린(taurine), ATP 등일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 미토콘드리아 분리는 미토콘드리아 활성 유지 측면에서, 냉동된 세포 또는 조직을 해동하여 파쇄하고 원심분리하여 수득할 수 있다. 상기 미토콘드리아 수득 방법은 세포 또는 조직을 냉동하는 단계, 상기 세포 또는 조직을 해동하는 단계 및 해동된 세포 및 조직을 파쇄하는 단계로 수행될 수 있다.
상기 냉동은 이에 제한되지는 않으나, -1℃이하일 수 있다. 구체적으로, 약 -5℃ 내지 약 -200℃, 약 -15℃ 내지 약 -180℃, 약 -25℃ 내지 약 -160℃ 약 -40℃ 내지 약 -140℃, 약 -55℃ 내지 약 -120℃, 약 -60℃ 내지 약 -100℃ 또는 약 -70℃ 내지 약 -90℃의 온도 범위로 수행될 수 있다.
상기 냉동은 액체 질소(LN2) 또는 냉동 장치를 이용하여 수행될 수 있다. 구체적으로, 냉동(refrigeration) 또는 동결(freezing) 과정에서 LN2를 사용하여 급속 냉동하거나, 초저온냉동고(deep freezer), 냉동고, 냉동 컨테이너(freezing container) 등 냉동 장치를 이용하여 수행될 수 있다. 상기 냉동은 미토콘드리아를 냉동 또는 동결할 수 있는 방법인 한, 특별히 제한되지 않는다.
상기 냉동 시간은 냉동된 미토콘드리아가 정상적인 활성을 갖는 한, 특별히 제한되지 않는다.
상기 분리된 미토콘드리아의 막 단백질을 정량하여 미토콘드리아를 정량할 수 있다. 구체적으로, 상기 분리된 미토콘드리아를 BCA(bicinchoninic acid assay) 분석법을 통해 정량할 수 있다. 이때, 상기 약학 조성물 내 미토콘드리아는 0.1 ㎍/㎖ 내지 1,000 ㎍/㎖, 1 ㎍/㎖ 내지 750 ㎍/㎖, 25 ㎍/㎖ 내지 500 ㎍/㎖, 25 ㎍/㎖ 내지 150 ㎍/㎖ 또는 25 ㎍/㎖ 내지 100 ㎍/㎖의 농도로 포함될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는, 25 ㎍/㎖ 또는 50 ㎍/㎖ 농도로 사용하였다.
또한, 상기 분리된 미토콘드리아를 파티클 카운터(Multisizer 4e, Beckman Coulter)를 통해 개수를 측정할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 약학 조성물 내 미토콘드리아는 1×105 미토콘드리아 개수/㎖ 내지 9×109 미토콘드리아 개수/㎖의 함량으로 포함될 수 있다. 구체적으로, 상기 약학 조성물 내 미토콘드리아는 1×105/㎖ 내지 5×109/㎖, 2×105/㎖ 내지 2×109/㎖, 5×105/㎖ 내지 1×109/㎖, 1×106/㎖ 내지 5×108/㎖, 2×106/㎖ 내지 2×108/㎖, 5×106/㎖ 내지 1×108/㎖ 또는 1×107/㎖ 내지 5×107/㎖의 함량으로 포함될 수 있다.
이때, 상기 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 환자에게 전달하기에 적절한 비-독성 물질이면 어떠한 담체라도 가능하다. 증류수, 알코올, 지방, 왁스 및 비활성 고체가 담체로 포함될 수 있다. 약물학적으로 허용되는 애쥬번트(완충제, 분산제) 또한 약학 조성물에 포함될 수 있다.
구체적으로, 상기 약학 조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하여 당업계에 공지된 통상의 방법으로 투여 경로에 따라 비경구용 제형으로 제조될 수 있다. 여기서 "약제학적으로 허용되는" 의미는 유효성분의 활성을 억제하지 않으면서 적용(처방) 대상이 적응 가능한 이상의 독성을 지니지 않는다는 의미이다.
본 발명의 약학 조성물이 비경구용 제형으로 제조될 경우, 적합한 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 주사제, 경피 투여제 및 비강 흡입제의 형태로 제제화될 수 있다. 주사제로 제제화할 경우 적합한 담체로서는 멸균수, 에탄올, 글리세롤이나 프로필렌글리콜 등의 폴리올 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(phosphate buffered saline)나 주사용 멸균수, 5% 덱스트로스 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 주사용 제제일 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 약학 조성물은 주사제 처방의 유통에 따른 제품 안정성을 확보하기 위하여, 주사제로 사용 가능한 산수용액 또는 인산염 등의 완충용액을 사용하여 pH를 조절함으로써, 물리적으로나 화학적으로 매우 안정한 주사제로 제조될 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 약학 조성물은 주사용수를 포함할 수 있다.
상기 주사용수는 고형주사제의 용해나 수용성 주사제를 희석하기 위하여 만들어진 증류수로서, 글루코스 주사, 자일리톨 주사, D-만니톨 주사, 프룩토스 주사, 생리식염수, 덱스트란 40 주사, 덱스트란 70 주사, 아미노산 주사, 링거액, 락트산-링거액 또는 약 pH 3.5 내지 약 7.5 범위의 인산염 완충용액 또는 인산이수소나트륨-구연산 완충용액 등일 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 안정화제 또는 용해보조제를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 안정화제는 피로설파이트(pyrosulfite) 또는 에틸렌 디아민테트라아세트산(ethylene diaminetetraacetic acid)일 수 있고, 용해보조제는 염산, 아세트산, 인산수산화칼륨, 탄산수소칼륨, 탄산칼륨 또는 트리스(tris)일 수 있다. 일 구체예로, 상기 약학 조성물은 TTG(trehalose-tris-glycine) 용액과 같은 혼합 보존용액을 포함할 수 있으며, 약학적으로 허용되는 약품제재에 통상적으로 이용될 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 약학 조성물은 분리된 미토콘드리아 이외에 주사용 액상 조성물을 포함할 수 있다. 이때, 분리된 미토콘드리아는 상술한 바와 동일하다. 본 발명의 약학 조성물이 주사용 액상 조성물을 포함함으로써 미토콘드리아 기능 관련 질환의 예방 또는 치료를 위한 조성물로, 주사를 통해 미토콘드리아 투여 시 미토콘드리아의 응집, 혈소판의 감소 및 응집 등에 의해 야기될 수 있는 혈전 생성을 억제할 수 있고, 미토콘드리아의 안정성을 유지 및/또는 강화할 수 있으며, 미토콘드리아의 활성 또한 안정적으로 유지시킬 수 있다.
여기서, 상기 액상 조성물은 글라이신(glycine), 당류 및 버퍼(buffer)를 포함할 수 있다.
상기 글라이신(glycine)은 이에 제한되지는 않으나, 주사용 액상 조성물 중 약 15 mM 이상의 농도로 존재할 수 있고, 구체적으로는 약 15 mM 내지 약 150 mM의 농도, 약 17 mM 내지 약 130 mM의 농도, 약 20 mM 내지 약 120 mM의 농도, 약 22 mM 내지 약 110 mM의 농도 또는 약 25 mM 내지 약 100 mM의 농도로 존재할 수 있다. 또한, 상기 글라이신은 이에 제한되지는 않으나 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신아세테이트, 메티오닌, 페닐알라닌, 트레오닌, 트립토판, 발린, 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴산, 시스테인, 글루타민산, 프롤린, 세린 및 티로신으로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택되는 아미노산과 함께 사용 가능하다.
또한, 상기 주사용 액상 조성물 내 포함되는 상기 당류는 이에 제한되지는 않으나 수크로오스, 트레할로오스, 만니톨, 소르비톨, 글루코오스, 프락토오스, 만노오스, 말토오스, 락토오스, 이소말토오스, 덱스트란 및 덱스트린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것일 수 있다. 특히, 상기 당류는 트레할로오스, 만니톨 또는 수크로오스일 수 있다. 바람직하게, 상기 당류는 트레할로오스일 수 있다.
상기 주사용 액상 조성물 내 포함되는 상기 버퍼는 이에 제한되지는 않으나 트리스(tris) 버퍼, HEPES 버퍼, MOPS 버퍼 및 아세테이트 또는 포스페이트 함유 버퍼로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 바람직하게, 상기 버퍼는 주사가 가능한 트리스(tris) 버퍼일 수 있다.
이때, 상기 버퍼의 pH는 이에 제한되지는 않으나, 약 7.0 내지 약 7.8 범위, 약 7.2 내지 약 7.6 범위 또는 약 7.3 내지 약 7.5 범위일 수 있다.
또한, 상기 버퍼는 이에 제한되지는 않으나, 주사용 액상 조성물 중 약 5 mM 내지 약 50 mM의 농도, 약 8 mM 내지 약 40 mM의 농도, 약 10 mM 내지 약 35 mM의 농도, 약 13 mM 내지 약 30 mM의 농도 또는 약 15 mM 내지 약 25 mM의 농도로 존재할 수 있다.
상기 주사용 액상 조성물은 약 200 내지 약 400 mOsm, 약 230 내지 약 380 mOsm, 약 250 내지 약 350 mOsm, 약 260 내지 약 320 mOsm, 약 270 내지 약 330 mOsm 또는 약 280 내지 약 300 mOsm 범위의 오스몰농도(osmolarity)를 갖는 것일 수 있다. 이때, 상기 범위의 오스몰농도는 2℃ 내지 8℃또는 그 이상의 온도에서의 장시간 보관을 촉진하는 한편, 조성물을 비경구용 투여, 예컨대, 혈관내, 근육내 또는 피하 주사를 통해 개체에 부작용 유발없이 투여가 적합하도록 한 것이다.
본 명세서에서 사용된 용어 "오스몰농도(osmolarity)"는 용매의 킬로그램 당 용액의 삼투압에 기여하는 용질의 몰을 지칭하는 것으로, 오스몰농도는 삼투압계(osmometer)를 사용하여 샘플의 빙점강하(freezing point depression)를 측정함으로써 결정된다.
또한, 상기 주사용 액상 조성물은 킬레이트제를 더 포함할 수 있다.
상기 킬레이트제는 이에 제한되지는 않으나, 주사가능한 등급의 EGTA, EDTA 및 BAPTA로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택되는 것일 수 있다. 상기 킬레이트제는 상기 주사용 액상 조성물에 포함되는 미토콘드리아 수득 후 이온 유출에 의한 손상을 제거할 수 있다.
또한, 상기 약학 조성물은 첨가제로, 미토콘드리아의 기능 유지 및 활성에 유효한 항산화제, ATP, 마그네슘 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 바이알, 카트리지, 주사기 및 자동주사기(autoinjector)로 이루어진 군으로부터 선택된 용기에 보관될 수 있다. 또한, 상기 약학 조성물이 보관된 용기는 치료가 필요한 개체에게 투여될 때까지 실온, 약 2℃ 내지 약 8℃ 냉장온도 또는 약 25℃ 내지 약 40℃로 저장될 수 있다.
상기 개체는 이에 제한되지는 않으나, 사람, 개, 소, 말, 돼지, 양, 염소, 고양이, 마우스, 토끼, 래트(rat)와 같은 포유동물일 수 있으며, 바람직하게는 인간일 수 있다.
한편, 본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 상기 용어 "치료학적으로 유효한 양" 또는 "약학적으로 유효한 양"이란 난청을 예방 또는 치료하는데 유효한 화합물 또는 조성물의 양으로서, 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미한다. 상기 유효량의 수준은 환자의 건강상태, 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 일 구체예에서 치료학적으로 유효한 양은 난청을 치료하는데 효과적인 약물의 양을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "투여"란, 적절한 방법으로 개체에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 상기 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 상기 약학 조성물은 고실내 투여, 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 국소 투여, 비내 투여, 직장내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 고실내 투여는 고실내 직접 주입 또는 수술(예를 들어, 고실 개방술)을 통한 투여일 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 바람직한 투여량은 투여할 개체의 체중을 기준으로 1회 약 0.01 ㎎/㎏ 내지 약 5 ㎎/㎏, 약 0.1 ㎎/㎏ 내지 약 4 ㎎/㎏ 또는 약 0.25 ㎎/㎏ 내지 약 2.5 ㎎/㎏ 양의 미토콘드리아를 투여할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 즉, 상기 약학 조성물이 난청을 앓고 있는 개체의 체중을 기준으로 상기 범위의 함량으로 분리된 미토콘드리아가 투여되는 것이 세포 활성 측면에서 가장 바람직하다. 또한, 상기 약학 조성물은 1 내지 10회, 3 내지 8회 또는 5 내지 6회 투여할 수 있으며, 바람직하게는 5회 투여할 수 있다. 이때, 투여 간격은 1 내지 7일 또는 2 내지 5일 간격으로 할 수 있으며, 바람직하게는 3일 간격으로 투여할 수 있다. 이러한 투여량은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 아니 된다.
상기 용어 "개체"란 본 발명의 조성물이 적용(처방)될 수 있는 대상을 의미하며, 난청을 앓고 있는 개체일 수 있다. 또한 상기 개체는 인간을 포함한 쥐, 생쥐, 가축 등의 포유동물일 수 있으나, 바람직하게는 인간일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 약학 조성물은 공지된 난청의 예방 또는 치료제를 추가적으로 포함할 수 있고, 상기 약학 조성물의 투여는 추가적으로 난청 치료와 병행될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은, 분리된 미토콘드리아를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 난청을 치료 및/또는 예방하는 방법을 제공한다.
또한, 상기 약학 조성물은 공지된 난청의 예방 또는 치료제를 추가적으로 포함할 수 있고, 상기 약학 조성물의 투여는 추가적으로 난청 치료와 병행될 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
준비예 1. 미토콘드리아 준비
1x107 cells/ml의 농도로 보관중인 탯줄유래 중간엽 줄기세포를 가압방식으로 물리적으로 파쇄 및 균질화 한 후, 1,100Хg의 속도로 제1차 원심분리를 수행하였다. 이때 상청액을 4℃ 온도에서 15분 동안 12,000Хg의 속도로 원심분리시켜 세포주로부터 미토콘드리아를 분리하는 분별 원심 분리법을 이용하여 미토콘드리아를 수득하였다.
실시예 1. 항생제 또는 항암제 처리시 마우스 내이 세포주의 생존율 확인
실시예 1.1. 마우스 내이 세포주의 배양
마우스 유래 내이세포 (House Ear Institute-Organ of Corti 1, HEI-OC1)를 10% 우태혈청(Fetal bovine serum, FBS, Gibco), 100 ㎍/㎖ 스트렙 토마이신 및 100 U/㎖ 암피실린을 함유하는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium, Gibco) 배지에서 배양하였다
실시예 1.2. 내이 세포주의 생존율 확인
상기 실시예 1.1에서 수득한 마우스 내이 세포주에 항생제 또는 항암제 처리시 세포의 생존률을 확인하였다. 구체적으로, DMEM 배지에서 6Х103개의 마우스 내이 세포주 House Ear Institute-Organ of Corti 1(HEI-OC1)를 배양하고, 16시간 뒤에 젠타마이신(2 mM, 4 mM, 6 mM, 8 mM 및 10 mM), Cisplatin(5 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM 및 50 mM), Kanamycin(5 mM, 10 mM, 15 mM 및 20 mM) 또는 H2O2(25 mM, 50 mM 또는 100 mM)를 각 농도별로 24시간 동안 처리한 뒤, 세포의 생존율을 WST-1 분석법을 통해 측정하였다.
그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, 약물 비처리군(Con.)에 비해 젠타마이신, 시스플라틴, 카나마이신 및 H2O2 처리군 모두 농도 의존적으로 내이 세포주의 생존율이 감소하였다. 이러한 결과는, 약물 또는 활성 산소에 의해 내이 세포가 손상되어 난청이 유발될 수 있음을 의미한다.
실시예 2. 미토콘드리아 처리시 항생제에 의한 손상 감소 확인
실시예 2.1. 항생제에 의한 세포 생존률 감소 회복 확인
상기 실시예 1.2의 약물 처리로 인해 손상된 내이 세포주에 미토콘드리아를 처리할 경우, 생존률 감소를 회복시키는 효과가 있는지 확인하였다.
구체적으로, 항생제 DMEM 배지에서 6Х103개의 미토콘드리아 마우스 내이 세포주 House Ear Institute-Organ of Corti 1(HEI-OC1)를 배양하였다. 다음으로, 배양 후 16시간 뒤에 10 mM의 젠타마이신 또는 16.2 mM의 카나마이신을 24시간 처리한 뒤, 준비예 1의 미토콘드리아를 0 μg/ml, 0.1 μg/ml, 0.2 μg/ml. 0.4 μg/ml, 0.8 μg/ml 및 1.2 μg/ml 농도로 24시간 동안 처리하였다. 처리 후 내이 세포의 생존율을 WST-1 분석법을 통해 측정하였다.
그 결과, 도 2 및 도 3에 나타난 바와 같이, 미토콘드리아를 처리하지 않은 군(0 μg/ml)와 비교하여 미토콘드리아 처리시 세포의 생존율이 회복되는 것을 확인하였다. 더불어, 이러한 회복 효과는 미토콘드리아 농도 의존적으로 나타났다.
실시예 2.2. 항생제에 의한 활성산소 증가 억제 효과 확인
상기 실시예 1.2의 약물 처리로 인해 손상된 내이 세포주에 미토콘드리아를 처리할 경우, 활성산소의 증가를 억제하는 효과가 있는지 확인하였다.
구체적으로, DMEM 배지에서 6Х103개의 내이 세포주 House Ear Institute-Organ of Corti 1(HEI-OC1)를 배양하고, 16시간 뒤에 10 mM Gentamicin 또는 20 mM 카나마이신을 처리하였다. 처리 후 24시간 뒤에 미토콘드리아를 처리하였다. 젠타마이신을 처리한 군에서는 준비예 1의 미토콘드리아를 0 μg/ml, 0.1 μg/ml, 0.2 μg/ml. 0.4 μg/ml, 0.8 μg/ml, 1.2 μg/ml 및 1.8 μg/ml 농도로 처리하였고, 카나마이신을 처리한 군에서는 준비예 1의 미토콘드리아를 0 μg/ml 및 0.4 μg/ml 농도로 처리하였다. 이어서 24시간 뒤, 처리된 배지를 세포내 활성산소 특이적 염색시약인 DCF-DA(Invitrogen)로 1시간 염색한 뒤, Plate Reader(Biotek, synergy HTX)를 이용하여 측정하였다. 또한, 핵 특이적 염색 시약인 Hoechst33432(Invitrogen)으로 염색한 뒤에 세포수를 보정하였다.
그 결과, 도 4 및 도 5에 나타난 바와 같이, 미토콘드리아를 처리하지 않은 군(0 μg/ml)와 비교하여 미토콘드리아 처리시 활성산소의 증가율이 낮은 것을 확인하였다. 또한, 약물 처리에 의해 증가된 세포내 활성산소가 미토콘드리아의 처리에 의해서 정상 수준으로 감소한 것을 확인하였다.
실시예 3. 미토콘드리아에 의한 소음 유발된 청각소실 동물 모델에서 청력 회복 효과 확인
12주령 C57BL6 암컷 마우스를 이용하여 소음으로 청각소실을 유발한 실험군 및 청각소실을 유발하지 않은 대조군을 준비하였다. 구체적으로, 실험군에서는 12주령 C57BL6 암컷 마우스에 120dB의 소리를 2시간 노출하였다. 또한, 120dB의 소리에 2시간 노출하기 전, 후로 준비예 1의 미토콘드리아를 20μg씩 2회 꼬리 미정맥에 주사하였다. 대조군은 청각소실을 유발하지 않았으며, 미토콘드리아도 처리하지 않았다. 대조군 및 실험군은 주사 후 1, 4, 7 및 14일 뒤 청성뇌간반응(auditory brainstem responses, ABR)을 측정하였다.
그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 소음으로 인해 청력이 소실된 마우스는 20 내지 70dB의 소리에 반응이 전무하였지만, 미토콘드리아를 투여한 실험군은 대조군과 같이 30 내지 70dB에서 소리에 대한 반응을 보였다. 이러한 결과는, 미토콘드리아가 소음으로 유발된 난청에서 청력을 회복시키는 효과가 있음을 의미한다.
Claims (15)
- 분리된 미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는 난청 또는 이명의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제1항에 있어서,
미토콘드리아는 세포로부터 분리된 것인, 난청의 예방 또는 치료용 약학 조성물. - 제2항에 있어서,
상기 세포는 체세포, 생식세포, 줄기세포, 혈액세포 또는 이들의 조합인 것인, 난청의 예방 또는 치료용 약학 조성물. - 제3항에 있어서,
상기 줄기세포가 중간엽줄기세포, 역분화줄기세포, 배아줄기세포 또는 이들의 조합인 것인, 난청의 예방 또는 치료용 약학 조성물. - 제4항에 있어서,
상기 중간엽줄기세포가 탯줄, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막, 태반, 활액, 정소, 골막 또는 이들의 조합인 것인, 난청의 예방 또는 치료용 약학 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 분리된 미토콘드리아는 활성이 정상인 것인, 난청의 예방 또는 치료용 약학 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 난청은 전음성 난청 또는 감각신경성 난청인 것인, 난청의 예방 또는 치료용 약학 조성물. - 제7항에 있어서,
상기 감각신경성 난청은 소음성 난청, 돌발성 난청, 감염성 난청, 외상성 난청, 노인성 난청, 이독성 난청, 자가면역성 난청, 메니에르병 또는 신경손상에 의한 난청인 것인, 난청의 예방 또는 치료용 약학 조성물. - 제8항에 있어서,
상기 이독성 난청은 항암제, 항생제 또는 방사선의 사용에 의한 것인, 난청의 예방 또는 치료용 약학 조성물. - 제9항에 있어서,
상기 항암제는 탁산계(taxane) 항암제, 플래티늄계(platinum) 항암제 및 빈카 알칼로이드계(vinca alkaloids) 항암제로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 것인, 난청의 예방 또는 치료용 약학 조성물. - 제10항에 있어서,
상기 항암제는 플래티늄계 항암제인 것인, 난청의 예방 또는 치료용 약학 조성물. - 제11항에 있어서,
상기 플래티늄계 항암제는 시스플라틴(cisplatin), 카보플라틴(carboplatin) 및 옥살리플라틴(oxaliplatin)으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 것인, 난청의 예방 또는 치료용 약학 조성물. - 제9항에 있어서,
상기 항생제는 스트렙토마이신(streptomycin), 네오마이신(neomycin), 카나마이신(kanamycin), 젠타마이신(gentamycin), 토브라마이신(tobramycin), 아미카신(amikacin), 네틸마이신(netilmicin), 디베카신(dibekacin), 시소마이신(sisomycin), 리보도마이신 (livodomycin) 및 파로모마이신(paromomycin)으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 것인, 난청의 예방 또는 치료용 약학 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 분리된 미토콘드리아는 내이 세포의 사멸을 억제하는 것인, 난청의 예방 또는 치료용 약학 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 약학 조성물 내 미토콘드리아는 0.1 ㎍/㎖ 내지 1,000 ㎍/㎖ 농도로 포함되는 것인, 난청의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
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