JP2023540886A - 単離されたミトコンドリアを含有する注射組成物及びその使用 - Google Patents

Abstract

単離されたミトコンドリアを含有する注射用組成物が提供される。さらに具体的には、グリシン、糖類、緩衝液及びミトコンドリアを含有する注射用液体組成物、並びに活性成分として注射用液体組成物を含む医薬組成物が提供される。本開示による注射用液体組成物は、ミトコンドリア関連疾患の予防又は処置のためのミトコンドリアの安定性を増強し、同物を投与される対象の血液中の血栓の形成を予防及び抑制することによって、ミトコンドリア治療薬の安全性を確実にすることができ、ミトコンドリアの活性を維持することができる。したがって、本開示による医薬組成物は、ミトコンドリアが身体に投与された場合に生じる場合がある凝集を解決でき、ミトコンドリア機能障害によって生じる種々の疾患を予防し、処置する目的のために使用されるミトコンドリアを身体に安全かつ有効に注射できるようにする。【選択図】 図６

Description

[0001]本開示は、単離されたミトコンドリアを含有する注射用組成物及びその使用に関する。さらに具体的には本開示は、グリシン又はグリシンオリゴマー、糖類、緩衝液及びミトコンドリアを含有する注射用液体組成物並びに活性成分として注射用液体組成物を含有する医薬組成物に関する。

[0002]エネルギー源として、ミトコンドリアは、ＡＴＰ合成、反応性酸素種の産生及びアポトーシスなどの種々の生理的プロセスにおいて重要な役割を果たしている。したがって、ミトコンドリアへの損傷は、種々の疾患を生じる場合があり、大部分のミトコンドリア障害は、ミトコンドリアのＤＮＡに生じた遺伝性又は後天性の変異によって生じる。例えば、ミトコンドリアの機能は、ミトコンドリアの膜電位の異常による膨張、反応性酸素種によって生じる酸化ストレス、フリーラジカルなど、及びミトコンドリアにおけるエネルギー生成のための酸化的リン酸化の機能の欠損によって改変される場合がある。そのようなミトコンドリア機能障害の例として、ミトコンドリアの遺伝性疾患、炎症性疾患（例えば、関節リウマチ）、虚血性疾患、感染性疾患、心疾患、ミオパチー、変性疾患（例えば、パーキンソン病及びアルツハイマー病）、種々のがんの発生並びにその転移などが報告されている。

[0003]そのようなミトコンドリア機能障害と関連する疾患の処置のために、細胞又は組織からミトコンドリアを単離し、それらを処置の目的のために生体に注射して戻す試みは、近年増加している。

[0004]この目的での治療用使用のためのミトコンドリアについての研究の増加により、単離されたミトコンドリアのｅｘ ｖｉｖｏ安定性をどのように維持するか、及び標的細胞又は組織への単離されたミトコンドリアの効率的な送達についての研究も増加している。

[0005]しかし、ミトコンドリア関連疾患のためのミトコンドリア送達治療は、処置の範囲に制限があること又は単離されたミトコンドリアがｉｎ ｖｉｖｏで注射される場合に副作用の課題があることからまだ開発されていない。

[0006]標的細胞又は組織へのミトコンドリアの有効な送達は、ミトコンドリア関連疾患の処置のためのミトコンドリア含有薬の有効性における重要な要素である。単離されたミトコンドリアの良好な送達は、注射されるミトコンドリアの量及び品質並びに適切な送達経路に依存し、ミトコンドリアはそれらが物理的に又は機能的に損傷されていない場合に標的細胞又は組織に効率的に送達され、吸収されることが報告された。

[0007]その一方で、ミトコンドリアは、ミトコンドリアが標的器官に直接注射される局所注射の方法、及びミトコンドリアが血管注射を通じて注射される全身投与の方法によって送達されてもよい。血管注射を通じたミトコンドリアの投与に関する主な安全性への懸念は、血栓の形成及び微小血管の閉塞である。幹細胞治療などの細胞の血管投与の場合でさえ、投与される幹細胞と血小板との組合せは血栓を作り、それにより血流を妨害し、細胞への酸素供給が低下することから、抗凝固薬としてのヘパリンがこれらの課題を低減し、解決するために同時投与される。しかし、ヘパリンがミトコンドリアの細胞内送達を抑制するとの報告があり（Ｅ．Ｅ．Ｋｅｓｎｅｒら、）、そのため、ミトコンドリアの血管注射の際にヘパリンを同時に投与することは困難であり、好適な抗凝固薬は未知のままである。

[0008]このように、標的細胞又は組織への単離されたミトコンドリアを含有する薬物の効率的な送達のために、ミトコンドリア薬のｅｘ ｖｉｖｏ安全性を維持でき、血管内注射を介して薬物が投与される場合に生じる副作用である血小板凝集又は血栓形成を解決できる、単離されたミトコンドリアのための特別な製剤を開発する必要がある。

[0009]本環境下で、本発明者らは、ミトコンドリア関連疾患の処置のために単離されたミトコンドリアを含有する薬物の細胞又は組織への送達のための効率的な注射用製剤を開発するために広範な努力を行ってきた。結果として、抗凝固薬を使用しなくても本開示の注射用製剤が血小板凝集又は血栓形成を抑制できることが確認された。加えて、本開示の注射用製剤が、ミトコンドリア凝集の発生を抑制するだけでなく、ミトコンドリアの活性を損傷しないことも確認され、ミトコンドリアが注射によって身体に安定に投与でき、それにより本開示を達成することが確認された。

[0010]上に記載されるこの目的の達成のために、実施形態により本開示は、グリシン、糖類、緩衝液及びミトコンドリアを含有する注射用液体組成物を提供する。

[0011]別の実施形態により、本開示は、活性成分として注射用液体組成物を含有する、ミトコンドリア関連疾患を予防又は処置するための医薬組成物も提供する。

[0012]さらに別の実施形態により、本開示は、対象に注射用液体組成物を投与することを含む、ミトコンドリア関連疾患を予防又は処置するための方法も提供する。

[0013]ミトコンドリア機能障害関連疾患を予防又は処置するための本開示によるミトコンドリアを含有する注射用液体組成物は、細胞又は組織からそれらを単離した後にミトコンドリアを使用する場合に凝集を抑制することによってミトコンドリアの膜電位及び安定性を維持するだけでなく、同物を受けた対象における血栓の形成を抑制することによってミトコンドリア注射の安全性を確実にすることができる。本開示による組成物が、単離された同種又は自己ミトコンドリアが身体に投与された際に生じる場合がある血小板の低減及び凝集を予防できることから、ミトコンドリア機能の劣化又はミトコンドリア機能障害によって生じる種々の疾患の処置に単離されたミトコンドリアを広範に適用できるようにすることによって、ミトコンドリア注射の商業的利用可能性を顕著に改善することが期待される。

例示的実施形態は、添付の図と共に次の記載からより詳細に理解され得る。

単離されたミトコンドリアの自己凝固が観察された画像であり、ヒト臍帯由来間葉系幹細胞（ＵＣ－ｈＭＳＣ）及びチャイニーズハムスター卵巣由来細胞（ＣＨＯ）から単離されたミトコンドリアの凝集の程度は、ＳＨＥ保存溶液（２５０ｍＭショ糖、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）及び２ｍＭ ＥＧＴＡ）において本開示により確認された（特に、注射剤として使用された生理ＮａＣｌ溶液（生理食塩水）は対照として使用された）。 種々の細胞から単離されたミトコンドリアによって生じた血小板凝集がｅｘ ｖｉｖｏで観察されたことを示す画像であり、血小板凝集がヒト臍帯由来間葉系幹細胞（ＵＣ－ｈＭＳＣ）、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ＢＭ－ｈＭＳＣ）、ラット骨格筋由来細胞株（Ｌ６）又は全血（特に、ＣＴＲはミトコンドリアを用いて処置されていない対照を指す）から単離された血小板から得られたミトコンドリアによって誘導されたことが確認された。 ヒト臍帯由来間葉系幹細胞（ＵＣ－ｈＭＳＣ）から単離され、生理食塩水又はＳＨＥ保存溶液中に保存されたミトコンドリアが、血小板凝集を誘導したことが確認された画像である。特に、抗血栓剤としてのヘパリン（Ｈ）を用いた処置の際に血小板凝集が一部抑制されたことが確認された。 抗血栓剤による血小板凝集の抑制効果が確認された画像であり、全血から単離された血小板がヘパリン及びミトコンドリアを用いて同時に処置された場合、ミトコンドリアによって誘導される血小板凝集がヘパリン濃度の増加に応じて抑制されたことが確認された。 ミトコンドリアの血管注射のための製剤による血小板の数の変化を確認したグラフであり、注射溶液の組成物及び抗凝固薬の存在又は非存在による血液中の血小板数における変化は、ヒト臍帯由来間葉系幹細胞（ＵＣ－ｈＭＳＣ）から単離されたミトコンドリアの静脈内注射がマウスモデルに投与された場合と比較された（特に、ＭＴはミトコンドリアを示し、ＴＴＢはＴｒｉｓ－トレハロース緩衝液を示し、ＳＨＥはショ糖－ＨＥＰＥＳ－ＥＧＴＡ緩衝液を示す）。 組成物中のグリシンの濃度による、ミトコンドリア活性のレベルへの本開示による組成物の効果が確認されたグラフであり、ミトコンドリアについての膜電位マーカーの蛍光値の変化が、ミトコンドリアが種々の濃度でグリシンを含有する溶液中で２４時間保存された後に測定された（特に、ＴＭＲＥは、ミトコンドリアについての膜電位マーカーとしてのテトラメチルローダミンエチルエステルを指す）。 本開示による組成物中に含有されるグリシンのためにミトコンドリアによる血小板凝集が抑制される効果が確認された画像であり、ミトコンドリアによって誘導される血小板凝集が、本開示の組成物中のグリシンが２５ｍＭ以上の濃度で存在する場合に抑制される場合があることが確認された。 本開示によるグリシンを含有するミトコンドリア組成物製剤の血小板凝集への抑制効果の画像及び表であり、グリシンが添加されていない組成物と比較して本開示のグリシン含有組成物において、ミトコンドリアが血小板凝集を生じないことが確認された。 本開示によるグリシン又はそのオリゴマーを含有するミトコンドリア組成物製剤の血小板凝集への抑制効果の表であり、グリシンが添加されていない組成物と比較して本開示のグリシンオリゴマー含有組成物において、ミトコンドリアが血小板凝集を生じないことが確認された。

［実施形態の詳細な記載］
[0024]本明細書以下に具体的な実施形態が、添付の図を参照して詳細に記載される。
[0025]ミトコンドリアを含有する注射用液体組成物
[0026]一態様では本開示は、グリシン又はそのオリゴマー、糖類、緩衝液及びミトコンドリアを含有する注射用液体組成物を提供する。

[0027]本明細書において使用される場合、用語「ミトコンドリア」は、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の合成及び制御に関与する真核細胞のオルガネラを指し、それは細胞内エネルギー源であり、ｉｎ ｖｉｖｏでの種々の代謝経路（例えば、細胞シグナル伝達、細胞分化、アポトーシス、細胞周期及び細胞増殖）の調節に関連している。したがって、遺伝的、環境又は原因不明のミトコンドリア機能の劣化又はミトコンドリア機能障害が、種々の疾患、例えばミトコンドリア関連遺伝性疾患、炎症性疾患（例えば、関節リウマチ）、虚血性疾患、感染性疾患、心疾患、筋疾患、変性疾患（例えば、パーキンソン病及びアルツハイマー病）、種々の種類のがん、がん転移などの発症と関連することが報告されている。

[0028]本開示の注射用液体組成物は、ミトコンドリア機能に関連する疾患の予防又は処置のための組成物であり、ミトコンドリアが注射によって投与される場合、ミトコンドリアの凝集、血小板の低減及び凝集などによって生じる場合がある血栓の形成を抑制でき、ミトコンドリアの安定性を維持及び／又は増強でき、ミトコンドリアの活性も安定に維持することができる。

[0029]本開示の注射用液体組成物は、グリシン又はそのオリゴマー、糖類、緩衝液及びミトコンドリアを含有してもよい。

[0030]グリシンオリゴマーは、１つ又は複数のグリシンが結合しているオリゴマーを指す。グリシンオリゴマーは、２～２０個のグリシンであってもよい。具体的には、グリシンオリゴマーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０個のグリシンを含有してもよい。加えて、グリシンオリゴマーは、２～１０個又は３～５個のグリシンを含有してもよい。一例では、グリシンオリゴマーはグリシン二量体又はグリシン三量体であってもよい。

[0031]グリシン又はそのオリゴマーは、注射用脂質組成物中で１ｍＭ以上の濃度で存在してもよい。加えてグリシン又はそのオリゴマーは、注射用脂質組成物中で１５ｍＭ以上の濃度で好ましくは存在してもよい。具体的には、グリシン又はそのオリゴマーは、１５ｍＭから１５０ｍＭの濃度、１７ｍＭから１３０ｍＭの濃度、２０ｍＭから１２０ｍＭの濃度、２２ｍＭから１１０ｍＭの濃度又は２５ｍＭから１００ｍＭの濃度で存在してもよい。具体的には、グリシン又はそのオリゴマーは約１ｍＭ、約５ｍＭ、約１０ｍＭ、約１５ｍＭ、約２０ｍＭ、約２５ｍＭ、約３０ｍＭ、約３５ｍＭ、約４０ｍＭ、約４５ｍＭ、約５０ｍＭ、約５５ｍＭ、約６０ｍＭ、約６５ｍＭ、約７０ｍＭ、約７５ｍＭ、約８０ｍＭ、約８５ｍＭ又は約９０ｍＭの濃度で存在してもよい。

[0032]加えて、グリシンは、これらだけに限らないが、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジンアセテート、メチオニン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファン、バリン、アラニン、アルギニン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、プロリン、セリン及びチロシンからなる群から選択される１つ又は複数のアミノ酸と共に使用されてもよい。

[0033]加えてグリシンは、グリシンモノマー及びグリシンオリゴマーと共に使用されてもよい。一実施形態では、グリシンモノマー及びグリシン二量体は、注射用脂質組成物中で併せて使用されてもよい。加えてグリシンモノマー及びグリシン三量体は、注射用脂質組成物中で併せて使用されてもよい。加えてグリシン二量体及びグリシン三量体は、注射用脂質組成物中で併せて使用されてもよい。加えてグリシンモノマー、グリシン二量体及びグリシン三量体は、注射用脂質組成物中で併せて使用されてもよい。

[0034]本開示の注射用液体組成物に含有される糖類は、これらだけに限らないが、ショ糖、トレハロース、マンニトール、ソルビトール、グルコース、フルクトース、マンノース、マルトース、乳糖、イソマルトース、デキストラン及びデキストリンからなる群から選択される１つ又は複数であってもよい。特に糖類は、トレハロース、マンニトール又はショ糖であってもよい。好ましくは、糖類はトレハロースであってもよい。

[0035]本開示の注射用液体組成物中に含有される緩衝液は、これらだけに限らないが、Ｔｒｉｓ緩衝液、ヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液、３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）緩衝液及びアセテート又はホスフェートを含む緩衝液からなる群から選択されてもよい。好ましくは緩衝液は、注射可能なＴｒｉｓ緩衝液であってもよい。

[0036]緩衝液のｐＨは、これらだけに限らないが、約６．３～約９．５の範囲内であってもよい。加えてｐＨは、約７．０～約７．８又は約７．２～約７．６の範囲内であってもよい。好ましくはｐＨは、約７．３～約７．５の範囲内であってもよい。

[0037]加えて緩衝液は、これらだけに限らないが、注射用液体組成物中に５ｍＭ～５０ｍＭの濃度、８ｍＭ～４０ｍＭの濃度、１０ｍＭ～３５ｍＭの濃度、１３ｍＭ～３０ｍＭの濃度又は１５ｍＭ～２５ｍＭの濃度で存在してもよい。

[0038]本開示の注射用液体組成物は、非経口投与されてもよい。この場合、非経口投与は、血管投与、皮下投与、粘膜投与、筋肉内投与、関節内投与、点眼などの方法によって実施されてもよい。本開示の一実施形態では、組成物は、好ましくは血管注射によって投与されてもよい。

[0039]加えて、本開示の注射用液体組成物は、２００ｍＯｓｍ～４００ｍＯｓｍ、２３０ｍＯｓｍ～３８０ｍＯｓｍ、２５０ｍＯｓｍ～３５０ｍＯｓｍ、２６０ｍＯｓｍ～３２０ｍＯｓｍ、２７０ｍＯｓｍ～３３０ｍＯｓｍ又は２８０ｍＯｓｍ～３００ｍＯｓｍの範囲内のモル浸透圧濃度を有してもよい。

[0040]上に記載された範囲のモル浸透圧濃度は、２℃～８℃以上の温度での長期保存を容易にし、対象において副作用を生じることなく非経口投与（例えば、血管内、筋肉内又は皮下注射）を通じた投与に組成物を好適にできる。

[0041]本明細書において使用される場合、用語「モル浸透圧濃度」は、溶媒キログラムあたりでの、溶液の浸透圧に寄与する溶質のモル数を指し、モル浸透圧濃度は、浸透圧計を使用して試料の凝固点降下を測定することによって決定される。

[0042]対象は、これらだけに限らないが、ヒト、イヌ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、マウス、ウサギ及びラットなどの哺乳動物、好ましくはヒトであってもよい。

[0043]加えて、注射用液体組成物は、キレート剤をさらに含有してもよい。キレート剤は、これらだけに限らないが、注射可能グレードのエチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）及び１，２－ビス（ｏ－アミノフェノキシ）エタン－Ｎ，Ｎ，－Ｎ’，Ｎ’四酢酸（ＢＡＰＴＡ）からなる群から選択される１つ又は複数であってもよい。

[0044]キレート剤は、注射用液体組成物に含有されるミトコンドリアを得た後に、イオン漏出によって生じる損傷を除くことができる。

[0045]本開示の注射用液体組成物では、ミトコンドリアは、真核生物から得られたものであってもよく、哺乳動物又はヒトから得られたものであってもよい。具体的にはミトコンドリアは、細胞又は組織から単離されたものであってもよい。例えば、ミトコンドリアは、体細胞、生殖細胞又は幹細胞から得られたものであってもよく、血液細胞又は血小板から単離されたものであってもよい。加えて、ミトコンドリアは、組織若しくは細胞を濃縮することに続く破壊及び単離後に使用されてもよく、又はミトコンドリアは、凍結保存後に融解された、融解及び破壊後の組織又は細胞試料から単離されたものであってもよい。

[0046]具体的には、体細胞は、筋肉細胞、肝細胞、ニューロン、線維芽細胞、上皮細胞、脂肪細胞、骨細胞、白血球、リンパ球、血小板又は粘膜細胞であってもよい。

[0047]加えて、幹細胞は、種々の種類の組織細胞に分化する潜在力を有する未分化細胞であり、これらだけに限らないが、間葉系幹細胞、成体幹細胞、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞、骨髄幹細胞、神経幹細胞、角膜縁幹細胞及び組織由来幹細胞からなる群から選択されるいずれか１つであってもよい。特に、間葉系幹細胞は、臍帯、臍帯血、骨髄、脂肪、筋肉、神経、皮膚、滑膜液、精巣、羊膜及び胎盤からなる群から選択されるいずれか１つから得られたものであってもよい。

[0048]加えて、ミトコンドリアは、ｅｘ ｖｉｖｏで培養された細胞若しくは組織から単離されたもの、又は凍結保存後に融解された試料から単離されたものであってもよい。

[0049]加えて、ミトコンドリアは、自己、同種又は異種から得られたものであってもよい。具体的には自己ミトコンドリアは、同じ対象の組織又は細胞から得られるミトコンドリアを指す。加えて同種ミトコンドリアは、同じ種に属するが対立遺伝子について異なる遺伝子型を有する対象から得られるミトコンドリアを指す。加えて異種ミトコンドリアは、異なる種に属する対象から得られるミトコンドリアを指す。

[0050]一方、特定の細胞からミトコンドリアを単離する場合、例えば、ミトコンドリアは、特定の緩衝液又は電位差及び磁場を使用するなどの種々の周知の方法を含む、種々の改変された方法によって単離されてもよい。

[0051]ミトコンドリア単離は、ミトコンドリアの活性を維持する側面から細胞を破壊すること、及び遠心分離することによって得られてもよい。具体的な実施形態では、単離は、次のステップ：細胞を培養し、沈殿を生じるように細胞を含有する組成物の１回目の遠心分離を実施するステップ；沈殿を緩衝液中に再懸濁し、得られたものをホモジナイズするステップ；上清を調製するために、ホモジナイズされた溶液の２回目の遠心分離を実施するステップ；及びミトコンドリアを精製するために上清の３回目の遠心分離を実施するステップ、で実施されてもよい。特に、細胞活性を維持する側面から、２回目の遠心分離が実施される時間が１回目及び３回目の遠心分離が実施される時間よりも短くなるように調整されることは好ましい。遠心分離速度は、１回目の遠心分離から３回目の遠心分離に増加されてもよい。

[0052]具体的には、１回目から３回目の遠心分離は、０℃～１０℃の温度、好ましくは３℃～５℃の温度で実施されてもよい。加えて遠心分離は１～５０分間実施されてもよく、遠心分離時間は、遠心分離の回数、試料の内容物などに応じて適切に調整されてもよい。

[0053]加えて、１回目の遠心分離は、１００ｘｇ～１，０００ｘｇ、２００ｘｇ～７００ｘｇ又は３００ｘｇ～４５０ｘｇの速度で実施されてもよい。加えて、２回目の遠心分離は、１ｘｇ～２，０００ｘｇ、２５ｘｇ～１，８００ｘｇ又は５００ｘｇ～１，６００ｘｇの速度で実施されてもよい。加えて、３回目の遠心分離は、１００ｘｇ～２０，０００ｘｇ、５００ｘｇ～１８，０００ｘｇ又は８００ｘｇ～１５，０００ｘｇの速度で実施されてもよい。

[0054]本開示の注射用液体組成物は、バイアル、カートリッジ、シリンジ及び自己注射器からなる群から選択される容器中に保存されてもよい。

[0055]加えて、本開示の注射用液体組成物が保存される容器は、組成物が処置を必要とする対象に投与されるまで室温で、２℃～８℃の冷蔵温度又は２５℃～４０℃で保存されてもよい。

[0056]対象は、これらだけに限らないが、哺乳動物、例えばヒト、イヌ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、マウス、ウサギ又はラット、好ましくはヒトであってよい。

[0057]注射用液体組成物は、これらだけに限らないが、５ｍＬ以下、３ｍＬ以下又は２ｍＬ以下の体積で１８Ｇ～３２Ｇ針を使用して例えば、血管投与、皮下投与、粘膜投与、筋肉投与、点眼又は腹腔内投与によって非経口で投与されてもよい。

[0058]ミトコンドリアを含有する注射用液体組成物の使用
[0059]別の態様では、本開示は、単離されたミトコンドリアを含有する注射用液体組成物を含有する、疾患を予防又は処置するための医薬組成物を提供する。特に、医薬組成物の使用は、ミトコンドリア関連疾患を予防又は処置するためであってもよい。

[0060]本明細書において使用される場合、用語「ミトコンドリア関連疾患」は、ミトコンドリア機能の劣化又は遺伝的、環境若しくは原因不明のミトコンドリア機能障害が関与する疾患を集合的に指す。例えばこれらの疾患として、遺伝性疾患（例えば、レーバー遺伝性視神経萎縮症（ＬＨＯＮ）、リー症候群、赤色ぼろ線維を伴うミオクローヌスてんかん（ＭＥＲＲＦ）、ミトコンドリアミオパチー、脳症、高乳酸血症、脳卒中（ＭＥＬＡＳ）など）；変性神経性疾患（例えば、パーキンソン病及びアルツハイマー病）；代謝疾患（例えば、糖尿病及び肥満）；並びに炎症性疾患（例えば、敗血症、関節リウマチなど）が挙げられる。

[0061]活性成分として単離されたミトコンドリアを含有する本開示の医薬組成物は、これらだけに限らないが敗血症（ＫＲ１０－２０１９－００５００１７Ａ）、がん（ＫＲ１０－２１２６１９９Ｂ１）、心疾患、関節リウマチ（ＫＲ１０－２０１９－００９４１２４Ａ）、虚血性疾患（ＫＲ１０－２０１９２７７Ｂ１）、感染性疾患（ＫＲ１０－２０１８－００５４５２３Ａ）、パーキンソン病、アルツハイマー病及び筋肉疾患（ＫＲ１０－２０１９－００９０７５４Ａ）からなる群から選択されるいずれか１つの疾患を予防できるか、又は処置できる。

[0062]具体的にはがんは、これらだけに限らないが、胃がん、肝臓がん、肺がん、結腸がん、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、膵臓がん、子宮頸がん、甲状腺がん、喉頭がん、急性骨髄性白血病、脳腫瘍、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、頭頸部がん、唾液腺がん、リンパ腫などである場合がある。

[0063]加えて虚血性疾患は、これらだけに限らないが、重度の肢虚血、虚血性発作、虚血性心疾患、虚血性大腸炎などである場合がある。特に虚血性疾患は、ミトコンドリアの異常によって生じる疾患であってもよく、ミトコンドリア機能の劣化によって生じるすべての虚血性細胞障害を含む。

[0064]加えて、感染性疾患は、これらだけに限らないが、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）感染、サイトメガロウイルス感染、ウイルス性呼吸器疾患、インフルエンザウイルス感染などであってもよい。

[0065]加えて、筋肉疾患は、これらだけに限らないが、ＭＥＬＡＳ症候群、ＭＥＲＲＦ症候群、カーンズ・セイヤー症候群、ミオパチー、脳筋症、筋無力症、重症筋無力症、筋萎縮性側索硬化症、筋ジストロフィー、筋萎縮症、筋緊張低下、筋力低下、筋硬直などであってもよい。特に、筋肉疾患は、ミトコンドリア機能の低下によって生じる任意の筋肉細胞障害を含んでもよい。

[0066]本明細書において使用される場合、用語「予防」は、医薬組成物の投与を通じてミトコンドリア関連疾患の発症を抑制するか、又はミトコンドリア関連疾患の発症を遅らせる任意の作用を指す。本明細書において使用される場合、用語「処置」は、医薬組成物の投与を通じてミトコンドリア関連疾患の症状を改善するか、又は有益に変化させる任意の作用を指す。

[0067]医薬組成物は、治療有効量又は薬学的有効量を含んでもよい。

[0068]本明細書において使用される場合、用語「治療有効量」又は「薬学的有効量」は、標的疾患を予防又は処置するために有効な組成物の量を指し、医学的処置に適用できる合理的な利益／リスク比で疾患を処置するために十分であり、副作用を生じない量も指す。有効量のレベルは、患者の健康状態、疾患の種類、重症度、薬物の活性、薬物への感受性、投与方法、投与時期、投与経路、排出速度、処置持続期間、組合せ又は同時に使用される薬物及び医学分野において十分周知の他の要因が挙げられる要因に応じて決定されてもよい。

[0069]注射用液体組成物を含有する本開示の医薬組成物では、ミトコンドリアは、これらだけに限らないが、０．１μｇ／ｍＬから５００μｇ／ｍＬ、０．２μｇ／ｍＬから４５０μｇ／ｍＬ又は０．５μｇ／ｍＬから４００μｇ／ｍＬの濃度で含有されてもよい。上記の範囲でミトコンドリアを含有することによって、医薬組成物が投与される場合にミトコンドリアの用量を調整することは容易になり、患者のミトコンドリア関連疾患（例えば、がん、炎症性疾患、神経変性疾患、代謝疾患、感染性疾患、筋疾患、心疾患、虚血性疾患など）における症状改善の程度は、さらに改善される可能性がある。特に、ミトコンドリアの用量は、血液、細胞、組織などから単離されたミトコンドリアの膜タンパク質を定量することによって定量されてもよい。具体的には、単離されたミトコンドリアは、ブラッドフォードタンパク質アッセイによって定量されてもよい（Ｊａｍｅｓ Ｄ．ＭｃＣｕｌｌｙ，Ｊ．Ｖｉｓ．Ｅｘｐ．２０１４；（９１）：５１６８２）。

[0070]特に、本開示による医薬組成物として、ミトコンドリアは、対象の体重に基づいて１回の投与について０．０１ｍｇ／ｋｇ～５ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ～４ｍｇ／ｋｇ又は０．２５ｍｇ／ｋｇ～２．５ｍｇ／ｋｇの量で投与されてもよいが、これらに限定されない。すなわち、細胞活性の観点から、医薬組成物としてミトコンドリアが、ミトコンドリア関連疾患が生じている対象の体重に基づいて上記範囲内の量で投与されることは、最も好ましい。

[0071]加えて、医薬組成物は、１～１０回、３～８回又は５～６回、及び好ましくは５回投与されてもよい。特に投与間隔は、１～７日間又は２～５日間、及び好ましくは３日間の間隔であってもよい。

[0072]本明細書において使用される場合、用語「投与」は、任意の好適な方法による対象への特定の材料のプロセスを指し、組成物の投与経路は、組成物が標的組織に達することができる限り、任意の一般的経路を介して投与されてもよい。好ましくは、非経口投与であってもよいが、これらだけに限らない、例えば、腹腔内投与、血管内投与、筋肉投与、粘膜投与、皮下投与、皮内投与、点眼など。

[0073]加えて、本開示による医薬組成物はミトコンドリア関連疾患が生じる可能性があるか、又はかかる疾患若しくは障害を罹患しているヒト又は他の哺乳動物に投与されてもよい。

[0074]したがって、本開示による医薬組成物は、注射処方物の分布により、産生物安定性を確実にするように、注射のために使用されてもよい緩衝液を使用してｐＨを調整することによって、物理的及び化学的に非常に安定である注射剤として調製されてもよい。

[0075]具体的には、本開示の医薬組成物は、注射用水を含有してもよい。注射用水は、固体注射剤を溶解するか、又は水溶性注射剤を希釈するように調製された蒸留水であり、グルコース注射剤、キシリトール注射剤、Ｄ－マンニトール注射剤、フルクトース注射剤、生理食塩水、デキストラン４０注射剤、デキストラン７０注射剤、アミノ酸注射剤、リンゲル液、乳酸リンゲル液又は３．５～８の範囲のｐＨを有するＴｒｉｓ、ＨＥＰＥＳ、クエン酸、リン酸緩衝液、リン酸二水素ナトリウム－クエン酸緩衝液などであってもよい。

[0076]加えて、本開示の医薬組成物は、安定化剤又は可溶化剤を含有してもよい。例えば、安定化剤は、ピロサルファイト又はエチレンジアミン四酢酸であってもよく、可溶化剤は、塩酸、酢酸、リン酸カリウムヒドロキシド、炭酸水素カリウム、炭酸カリウム又はＴｒｉｓであってもよい。

[0077]具体的な実施形態では、医薬組成物は、混合保存溶液（例えば、トレハロース－Ｔｒｉｓ－グリシン（ＴＴＧ）溶液）を含有してもよく、薬学的に許容される薬学的調製物中で一般に使用されてもよい。医薬組成物の添加物として、活性ミトコンドリア機能を維持するために有効である抗酸化物質、ＡＴＰ、マグネシウムなどは、含有されてもよい。

[0078]さらなる態様では、本開示は、ミトコンドリア関連疾患の予防又は処置のための医薬組成物の使用を提供する。次いで医薬組成物は、注射用液体組成物であってもよい。これに関して、注射用液体組成物、ミトコンドリア関連疾患、予防及び処置は、前述されている。

[0079]さらなる態様では、本開示は、上に記載される医薬組成物を対象に投与することを含む、疾患を予防又は処置するための方法を提供する。

[0080]次いで、注射用液体組成物、投与、投与用量、予防及び処置は前述されている。対象は、疾患を罹患している患者、又は疾患を有する可能性がある個体であってもよい。対象は、哺乳動物、好ましくはヒトであってもよい。

[0081]加えて、注射用液体組成物は、血管に投与されてもよい注射剤であってもよく、又は局所的に投与されてもよい注射剤であってもよい。

[0082]疾患は、ミトコンドリア関連疾患であり、具体的な疾患は上に記載されている。特に投与は、静脈内、筋肉内又は皮内投与を介して実施されるものであってもよい。これを通じて、本開示による医薬組成物は、通常の活性を有する単離されたミトコンドリアを、疾患が生じている病変に直接供給でき、そのためミトコンドリア機能が劣化している細胞の活性を増加させるために、又はミトコンドリア機能障害を有する細胞を再生するために有用であり、上に記載されるミトコンドリア関連疾患の予防又は処置のために使用されてもよい。

[0083]またさらなる態様では、本開示は、ミトコンドリア関連疾患の予防又は処置のための医薬の製造のための注射用液体組成物の使用を提供する。これに関して、医薬組成物、ミトコンドリア関連疾患、予防及び処置は前述されている。

［発明についての様式］
[0084]本明細書以下で本開示は、続く実施例を通じてより詳細に記載される。しかし、これらの実施例は本開示の例示の目的のためであり、本開示の範囲はこれらの実施例に限定されるべきでない。

[0085]準備実施例１．細胞培養
[0086]ヒト臍帯由来間葉系幹細胞（ＵＣ－ｈＭＳＣ）及びヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ＢＭ－ｈＭＳＣ）のそれぞれを１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ）、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン及び１００Ｕ／ｍＬのペニシリンを含有するアルファ最小必須培地（α－ＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ）培地に接種し、７２時間培養した。

[0087]チャイニーズハムスター卵巣由来細胞株（すなわち、ＣＨＯ細胞）を１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ）を含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ）培地中に接種し、７２時間培養した。

[0088]ラット骨格筋由来筋芽細胞株であるＬ６細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－１４５８）を１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ）を含有するダルベッコ改変イーグル培地－高グルコース（ＤＭＥＭ－高グルコース）に接種し、７２時間培養した。

[0089]細胞のそれぞれの培養が完了後、各細胞をダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ、Ｇｉｂｃｏ）を使用して２回洗浄した。その後、細胞を０．２５％トリプシン－ＥＤＴＡ（ＴＥ）を用いた処置によって得た。得られた細胞をミトコンドリアを抽出するために細胞１×１０^７個／ｍＬの細胞濃度で再懸濁した。

[0090]準備実施例２．血小板の取得
[0091]準備実施例２．１．ブタの全血からの血小板の単離
[0092]ブタ全血を３００ｘｇ、５分間遠心分離して血小板及び血漿を含有する黄濁した上清を得た。得られた上清を１，５００ｘｇ、１５分間遠心分離して血小板沈殿物（沈殿）を得た。得られた血小板沈殿物を等量のダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）溶液を用いて置き換え、１，５００ｘｇ、１５分間での遠心分離によって洗浄し、等量の新鮮ＤＰＢＳ溶液に再懸濁した。

[0093]準備実施例２．２．ヒト全血からの血小板の単離
[0094]Ｋ２－エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）二カリウムを含有するヒト全血を３００ｘｇ、３分間遠心分離することによって黄色上清を得た。得られた上清を１，５００ｘｇ、１５分間遠心分離して血小板沈殿物（沈殿）を得た。得られた血小板沈殿物をダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）溶液に再懸濁した。

[0095]実施例１．ミトコンドリアの単離及び保存
[0096]実施例１．１．ミトコンドリアの単離
[0097]準備実施例１で培養した細胞を含むそれぞれの培養物を３８０ｘｇ、３分間遠心分離して上清を除いた。回収した細胞をＤＰＢＳ溶液と混合し、１，１００ｘｇ、３分間遠心分離した。特に、続く工程は、使用した溶液も含めて、すべて冷蔵温度条件下で実施した。

[0098]上清を除いた後、ホモジネーション緩衝液を加え、細胞を再懸濁し、新たなチューブに移し、１ｍＬシリンジを使用して細胞を物理的方法によって破壊し、ホモジナイズした。生じた上清を、細胞を２，０００ｘｇ、約４℃の温度で１０分間破壊することによって得られたホモジネートを遠心分離することによって回収した。回収した上清を２，０００ｘｇで再度遠心分離した。遠心分離後に得られた上清を１２，０００ｘｇ、１０分間遠心分離してミトコンドリアの沈殿物を回収した。

[0099]ミトコンドリアのための保存緩衝液として、表１の溶液を回収したミトコンドリア沈殿物に加え、１２，０００ｘｇ、１０分間遠心分離し、上清を除去した。沈殿したミトコンドリアが失われないように上清を除去し、ミトコンドリアのための保存緩衝液を再度加え、混合物を１２，０００ｘｇで再度遠心分離して上清を完全に除いた。上清を完全に除いた後、下記の表１のミトコンドリア保存のための組成物を得られたミトコンドリア沈殿物に加え、再懸濁した。
[00100]

[00101]実施例１．２．安定化製剤を使用するミトコンドリアの単離
[00102]ミトコンドリアを細胞から分離する際に、ＳＨＥ溶液（２５０ｍＭショ糖、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）及び２ｍＭ ＥＧＴＡ）を使用した。具体的には、上記準備実施例１において培養されたか、又は培養されている動物及びヒトの細胞に、糖類（ショ糖、マンニトール又はトレハロース）、緩衝液（ＨＥＰＥＳ又はＴｒｉｓ）、キレート剤（ＥＧＴＡ又はＥＤＴＡ）及びアミノ酸からなる表１の＃１～＃６の組成の緩衝液を加え、再懸濁した。次に、実施例１．１．と同じ様式で細胞を破壊した後に、ミトコンドリアを細胞から得た。

[00103]実施例２．単離されたミトコンドリアの自己凝集の観察
[00104]実施例２．１．ミトコンドリアの染色及び保存
[00105]ミトコンドリアの濃度を単離されたミトコンドリア溶液の一部を取り、タンパク質濃度を測定するビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイを使用して測定した。５０μｇの単離されたミトコンドリアをミトコンドリア特異的緑色マーカーであるＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｖｅ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）を使用して１００ｎＭ、４℃、１０分間染色した。５０μｇのミトコンドリアを１ｍＬの各溶液を用いて処置し、得られたものを共焦点ディシュ中、４℃、液体状態でそれぞれ保存した。１６時間後、ミトコンドリアの自己凝集の程度を共焦点レーザー走査顕微鏡（ＣａｒｌＺｅｉｓｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して共焦点ディシュ状態で観察した。特に、単離されたミトコンドリアを生理食塩水又はＳＨＥ溶液中でそれらを保存することによって検査した。

[00106]実施例２．２．単離されたミトコンドリアの凝集の確認
[00107]細胞から単離されたミトコンドリアの保存溶液中で誘導されるミトコンドリアの自己凝集の現象を確認するために、ヒト臍帯由来間葉系幹細胞（ＵＣ－ｈＭＳＣ）及びチャイニーズハムスター卵巣由来細胞（ＣＨＯ）由来のミトコンドリアの単離後に、単離されたミトコンドリアを、ＳＨＥ保存溶液（２５０ｍＭショ糖、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）及び２ｍＭ ＥＧＴＡ）並びにＮａＣｌ溶液（生理食塩水）中でそれぞれ保存した。１６時間保存後、単離されたミトコンドリア自体の凝集を共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて確認した。

[00108]結果として、図１に示すとおり、ミトコンドリア凝集が、注射溶液として使用される生理ＮａＣｌ溶液（生理食塩水）において形成された。これによりミトコンドリアの場合、ミトコンドリア凝集の現象が、高濃度のナトリウム塩を含有する生理食塩水を注射溶液として使用する場合に生じることから、凝集を生じない安定保存緩衝液を使用するべきであることが見出された。

[00109]実施例３．ミトコンドリアによって誘導される血小板凝集の観察
[00110]細胞から単離されたミトコンドリアによって誘導される血小板凝集を観察するために、ミトコンドリアをヒト臍帯由来間葉系幹細胞（ＵＣ－ｈＭＳＣ）、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ＢＭ－ｈＭＳＣ）、ラット骨格筋由来細胞株（Ｌ６）及び血小板細胞から単離し、ミトコンドリア特異的暗赤色マーカーであるＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ ＤｅｅｐＲｅｄを用いて染色した。

[00111]特に、準備実施例２のＤＰＢＳ溶液に再懸濁した血小板をミトコンドリア特異的緑色マーカーである０．５μＭのＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎを用いて、室温、１０分間染色し、次にＤＰＢＳ溶液を用いて洗浄した。

[00112]５μｇの染色したミトコンドリアを１ｍＬの血小板溶液（１０^７／ｍＬ）を用いて処置した後、得られたものを３７℃、１００ｒｐｍで振とうしながら１時間インキュベートした。３μＬのミトコンドリア処置血小板をスライドガラスに分注した後、カバーガラスを用いて覆い、共焦点レーザー走査顕微鏡（ＣａｒｌＺｅｉｓｓ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して観察した（図２ａ）。

[00113]結果として、血小板、ラット骨格筋由来細胞株（Ｌ６）、ヒト臍帯由来間葉系幹細胞（ＵＣ－ｈＭＳＣ）及びヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ＢＭ－ｈＭＳＣ）から単離されたすべてのミトコンドリアは、血小板凝集を誘導できた。このことから、ミトコンドリアが血管に注射された場合、血小板凝集を誘導する固有の危険があり、それにより血小板の数の減少又は血栓の形成を生じることが見出された。特に、単離されたミトコンドリアを生理食塩水中に保存して実験において使用した。

[00114]実施例４．血小板凝集の抑制へのミトコンドリアの保存溶媒及び抗血栓剤の効果の確認
[00115]血小板凝集の抑制へのミトコンドリアのための保存溶媒及び抗血栓剤の効果を確認するために、ヒト臍帯由来間葉系幹細胞（ＵＣ－ｈＭＳＣ）のミトコンドリアを単離し、生理食塩水及び保存溶媒であるＳＨＥ溶液中に１時間それぞれ保存し、得られたものブタ全血から単離した血小板を用いて処置し、次にヘパリンを用いて処置した。１時間後、結果を共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて確認した。

[00116]図２ｂに示すとおり、ヒト臍帯由来間葉系幹細胞（ＵＣ－ｈＭＳＣ）由来で、生理食塩水及びＳＨＥ溶液中に保存されたミトコンドリアは、血小板凝集を増加させ、凝集はヘパリンを用いて処置された場合に一部抑制された。加えて、図３に示すとおり、ヒト臍帯由来間葉系幹細胞（ＵＣ－ｈＭＳＣ）由来で、ＳＨＥ溶液中に保存されたミトコンドリアを用いて血小板を処置した場合に、ミトコンドリアによって誘導される血小板凝集が、抗血栓剤としてのヘパリンの濃度の増加と共に抑制されたことを見出した。

[00117]実施例５．ミトコンドリア注射のための製剤についての緩衝液スクリーニング
[00118]ヒト臍帯由来間葉系幹細胞（ＵＣ－ｈＭＳＣ）から単離されたミトコンドリアをＢＡＬＢ／ｃ－ｎｕ／ｎｕマウスに１回静脈内注射（５０μｇ／０．３ｍＬ）によって投与した場合の、注射溶液の組成及び抗凝固薬の存在／非存在による血液中の血小板の数の変化を比較し、評価した。マウスへのミトコンドリアの血管内注射の際の血小板の数の低減の効果を確認するために実施した具体的な実験設計を、下記表２に示す。
[00119]

[00120]生理食塩水を注射の組成物中で使用した場合に、減少した血小板の数は最も多く、一方血小板の数は、ショ糖又はトレハロースを含有する注射溶液においてはあまり減少しなかったことを確認した。加えて、ヘパリンを添加した場合、血小板の減少はある程度回復したが、血小板の減少は完全には抑制されなかった（図４）。

[00121]実施例６．ミトコンドリア活性へのグリシン濃度の効果
[00122]実施例１に記載されたミトコンドリアを安定化するための組成物において、ミトコンドリアの活性へのグリシン濃度の効果を決定するための試みを行った。

[00123]最初に、ミトコンドリアを上記実施例１に記載された単離方法によって単離し、単離したミトコンドリアを、テトラメチルローダミンエチルエステル（ＴＭＲＥ）をミトコンドリアの膜電位マーカーとして用いて染色し、次に洗浄した。洗浄後、得られたミトコンドリアを各溶液中に保存した、ここで、実施例１の溶液２並びにＴｒｉｓ（２０ｍＭ）及びトレハロース（１９５ｍＭ）の濃度条件は同じ様式で設定したが、グリシンの濃度は、０ｍＭ～１５０ｍＭの範囲で種々に調整した。２４時間保存後、蛍光値の変化を測定した（図５）。

[00124]実施例７．血小板凝集の抑制へのグリシンの効果
[00125]アミノ酸としてのグリシンによる、血小板凝集へのミトコンドリアの抑制効果を確認するために、ミトコンドリアをヒト臍帯由来間葉系幹細胞（ＵＣ－ｈＭＳＣ）から最初に単離し、次いでミトコンドリア特異的暗赤色マーカーであるＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ ＤｅｅｐＲｅｄを用いて染色した。その後、１μｇの染色したミトコンドリアを、各濃度（０ｍＭ、１ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、２５ｍＭ、５０ｍＭ及び１００ｍＭ）のＴｒｉｓ－トレハロース緩衝液（ＴＴＢ）グリシン１０μＬを用いて組成物溶液に懸濁し、１時間冷蔵し、１ｍＬの血小板溶液（１０^７／ｍＬ）を用いて処置した。処置後、得られたものを１００ｒｐｍで振とうしながら３７℃、１時間インキュベートした。３μＬのミトコンドリア処置血小板を共焦点レーザー走査顕微鏡（ＣａｒｌＺｅｉｓｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して観察した（図６）。

[00126]結果として、ミトコンドリアは、低濃度のグリシンでは血小板凝集を抑制できなかったが、グリシンが２５ｍＭ以上の濃度で存在する実験群では凝集が徐々に抑制されたことを見出した。上記の結果から、グリシンがミトコンドリアによって誘導される血小板凝集を有効に抑制できることが推測できた。

[00127]実施例８．グリシンを含有するミトコンドリア組成物製剤の血小板凝集への効果
[00128]アミノ酸としてグリシンを含有するミトコンドリア組成物製剤の血小板凝集に対する抑制効果を確認するために、ミトコンドリアをヒト臍帯由来間葉系幹細胞（ＵＣ－ｈＭＳＣ）から最初に単離し、ミトコンドリア特異的暗赤色マーカーであるＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ ＤｅｅｐＲｅｄを用いて染色した。次いで、１μｇの染色したミトコンドリアを１０μＬのＴｒｉｓ緩衝液（１、２、３、４及び５の具体的な組成物は図７に示す）に懸濁し、１ｍＬの血小板溶液（１０^７／ｍｌ）を用いて処置した。処置後、得られたものを１００ｒｐｍで振とうしながら３７℃、１時間インキュベートした。３μＬのミトコンドリア処置血小板を共焦点レーザー走査顕微鏡（ＣａｒｌＺｅｉｓｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して観察した（図７）。

[00129]結果として、血小板凝集を伴わないミトコンドリアの安定化のための重要な成分に糖類（ショ糖、トレハロース及びマンニトール）の種類における差異があるとしても、３種すべての糖について、グリシンが添加された組成物においては血小板凝集が観察されなかったことを確認した。しかし、グリシンが添加されていない組成物では、血小板凝集はミトコンドリアによって誘導された。

[00130]実施例９．ヒト血小板凝集へのグリシンの効果
[00131]細胞から単離されたミトコンドリアによって誘導される血小板凝集を観察するために、ミトコンドリアをヒト臍帯由来間葉系幹細胞（ＵＣ－ｈＭＳＣ）から単離した後に、ミトコンドリア特異的暗赤色マーカーであるＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ ＤｅｅｐＲｅｄを用いてそれらを染色した。特に、準備実施例２においてＤＰＢＳ溶液中に再懸濁した血小板を室温、１０分間、ミトコンドリアの－特異的緑色マーカーである０．５μＭ ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎを用いて染色し、ＤＰＢＳ溶液を用いて洗浄した。

[00132]１μｇの染色したミトコンドリアを１０μＬのＴｒｉｓ－トレハロース－グリシン（ＴＴＧ）緩衝液、Ｔｒｉｓ－トレハロース－グリシン－グリシン（ＴＴＧ－Ｇ）緩衝液又はＴｒｉｓ－トレハロース－グリシン－グリシン－グリシン（ＴＴＧ－Ｇ－Ｇ）緩衝液中に再懸濁し、１時間冷蔵し、次に１ｍＬの血小板溶液（１０^７／ｍＬ）を用いて処置した。

[00133]処置後、得られたものを１００ｒｐｍで振とうしながら３７℃、１時間インキュベートした。３μＬのミトコンドリア処置血小板をスライドガラスに分注した後、カバーガラスを用いて覆い、共焦点レーザー走査顕微鏡（ＣａｒｌＺｅｉｓｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して観察した（図８）。

[00134]結果として、グリシン二量体及びグリシン三量体並びにグリシンモノマーにおいて血小板凝集は観察されなかったことが確認された。したがって、グリシンオリゴマーが血小板凝集を伴わないミトコンドリアの安定化のための重要な成分であることを確認した。

[00135]単離されたミトコンドリアを含有する注射用組成物及びその使用が、具体的な実施形態を参照して記載されたが、注射用組成物及びその使用はこれらに限定されない。したがって、添付の特許請求の範囲によって定義される本開示の趣旨及び範囲から逸脱することなく、種々の改変及び変更がこれらに行われ得ることは、当業者によって容易に理解される。

Claims (17)

1. グリシン、糖類、緩衝液及びミトコンドリアを含む注射用液体組成物。
2. 前記グリシンが、グリシンモノマー又はグリシンオリゴマーである、請求項１に記載の液体組成物。
3. 前記グリシンオリゴマーが、グリシン二量体又はグリシン三量体である、請求項２に記載の液体組成物。
4. 前記グリシンが１５ｍＭ～１５０ｍＭの濃度を有する、請求項１に記載の液体組成物。
5. 前記糖類が、ショ糖、トレハロース、マンニトール、ソルビトール、グルコース、フルクトース、マンノース、マルトース、乳糖、イソマルトース、デキストラン及びデキストリンからなる群から選択される１つ又は複数である、請求項１に記載の液体組成物。
6. 前記糖類がトレハロース、マンニトール又はショ糖である、請求項５に記載の液体組成物。
7. 前記緩衝液が、Ｔｒｉｓ緩衝液、ヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液、３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）緩衝液及びアセテート又はホスフェートを含む緩衝液からなる群から選択される、請求項１に記載の液体組成物。
8. 前記緩衝液がＴｒｉｓ緩衝液である、請求項６に記載の液体組成物。
9. 前記緩衝液が７．０～７．８のｐＨを有する、請求項１に記載の液体組成物。
10. 前記緩衝液が５ｍＭ～５０ｍＭの濃度を有する、請求項１に記載の液体組成物。
11. 前記組成物が２００ｍＯｓｍ～４００ｍＯｓｍのモル浸透圧濃度を有する、請求項１に記載の液体組成物。
12. 前記ミトコンドリアが真核細胞又は組織から単離される、請求項１に記載の液体組成物。
13. 前記細胞が、哺乳動物又はヒトの体細胞、生殖細胞、幹細胞、血液細胞、血小板及びこれらの組合せからなる群から選択されるいずれか１つである、請求項１２に記載の液体組成物。
14. 請求項１～１３のいずれか一項に記載の注射用液体組成物を含む、ミトコンドリア機能障害疾患を予防又は処置するための医薬組成物。
15. 前記疾患が、慢性炎症性疾患、急性炎症性疾患、虚血性疾患、神経性疾患、心疾患、筋疾患、変性疾患、代謝疾患、線維性疾患、関節疾患、眼疾患、脱毛症及び免疫関連疾患からなる群から選択されるミトコンドリア機能障害疾患である、請求項１４に記載の医薬組成物。
16. ミトコンドリア機能障害疾患を予防又は処置するための、請求項１～１２のいずれか一項に記載の注射用脂質組成物の使用。
17. ミトコンドリア機能障害疾患を予防又は処置するための方法であって、請求項１～１２のいずれか一項に記載の注射用液体組成物を対象に投与するステップ
    を含む、方法。