WO2023191495A1 - 동결 및 동결건조된 미토콘드리아 및 이의 용도 - Google Patents

동결 및 동결건조된 미토콘드리아 및 이의 용도 Download PDF

Info

Publication number
WO2023191495A1
WO2023191495A1 PCT/KR2023/004181 KR2023004181W WO2023191495A1 WO 2023191495 A1 WO2023191495 A1 WO 2023191495A1 KR 2023004181 W KR2023004181 W KR 2023004181W WO 2023191495 A1 WO2023191495 A1 WO 2023191495A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
mitochondria
frozen
freezing
cells
freeze
Prior art date
Application number
PCT/KR2023/004181
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
강영철
한규범
김천형
김수민
Original Assignee
주식회사 파이안바이오테크놀로지
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 파이안바이오테크놀로지 filed Critical 주식회사 파이안바이오테크놀로지
Publication of WO2023191495A1 publication Critical patent/WO2023191495A1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0205—Chemical aspects
    • A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
    • A01N1/0221—Freeze-process protecting agents, i.e. substances protecting cells from effects of the physical process, e.g. cryoprotectants, osmolarity regulators like oncotic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/04—Preserving or maintaining viable microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues

Definitions

  • the present invention relates to a method for freezing and/or lyophilizing mitochondria isolated from cells, and the use of the frozen and/or lyophilized mitochondria. More specifically, it relates to a method of freezing and/or lyophilizing mitochondria, and a pharmaceutical composition and organ preservation solution composition containing mitochondria frozen and/or lyophilized by the above method as an active ingredient.
  • Freeze-drying is a drying method in which water-containing samples are frozen and placed under reduced pressure to sublimate and remove moisture in the sample. It is used to preserve water-containing materials such as plant or animal cells, tissues, or food for a long period of time.
  • Mitochondria are an energy source and play a key role in various physiological processes such as ATP synthesis, oxygen production, and apoptosis. Therefore, damage to mitochondria can cause various diseases, and most mitochondrial disorders are caused by hereditary or acquired mutations that occur in mitochondrial DNA. For example, mitochondrial function may be altered due to swelling due to abnormal mitochondrial membrane potential, oxidative stress caused by reactive oxygen species or free radicals, and defects in oxidative phosphorylation function for mitochondrial energy production.
  • mitochondrial dysfunctions have been reported to cause mitochondrial genetic diseases, inflammatory diseases such as rheumatoid arthritis, ischemic diseases, infectious diseases, heart diseases, muscle diseases, degenerative diseases such as Parkinson's disease and Alzheimer's disease, and the occurrence and metastasis of various cancers. there is.
  • the present inventors studied a method for efficiently preserving mitochondria for transplantation treatment as part of the treatment of mitochondria-related diseases.
  • the present invention was completed by confirming that mitochondria freeze-dried by the method of the present invention can be stored at room temperature and low temperature, and that frozen and/or freeze-dried mitochondria maintain their mitochondrial activity before freezing.
  • one aspect of the present invention provides frozen or lyophilized mitochondria, a pharmaceutical composition containing the same, and an organ preservation solution composition kit.
  • Another aspect of the present invention is a method for stably freezing or lyophilizing isolated mitochondria and a cryoprotectant; and a freezing composition comprising the cryoprotectant and mitochondria.
  • Another aspect of the present invention provides the use of isolated frozen or lyophilized mitochondria for the prevention or treatment of mitochondria-related diseases.
  • Another aspect of the present invention provides a method for preventing or treating mitochondria-related diseases, comprising administering isolated frozen or lyophilized mitochondria.
  • frozen and/or lyophilized mitochondria according to the present invention were similar to unfrozen mitochondria.
  • frozen and/or lyophilized mitochondria showed similar levels of anti-inflammatory activity and energy metabolism-related enzyme activity as non-lyophilized mitochondria.
  • freeze-dried mitochondria showed a similar level of long-term preservation efficacy as non-freeze-dried mitochondria. Therefore, the frozen and/or lyophilized mitochondria according to the present invention allow the isolated mitochondria to be widely applied in the treatment of various diseases caused by mitochondrial dysfunction or dysfunction, thereby greatly increasing the commercial availability of therapeutic agents containing mitochondria. It is expected to improve.
  • Figure 1 is a graph showing the results confirming the anti-inflammatory efficacy of platelet-derived frozen mitochondria.
  • Figure 2 is a graph showing the results of confirming the anti-inflammatory effect depending on whether umbilical cord-derived mesenchymal stem cells or platelet-derived mitochondria isolated from human blood were frozen.
  • Figure 3 is a graph showing the results of measuring the protein concentration of mitochondria before freeze-drying and the protein concentration of mitochondria whose volume was restored after freeze-drying.
  • Figure 4 is a diagram confirming the location of mitochondria after treating cells in culture with lyophilized mitochondria separated from HEK293 cells.
  • Figure 5 is a graph showing the results of measuring the activity of enzymes related to mitochondrial energy synthesis depending on whether mitochondria isolated from platelets were freeze-dried or not.
  • Figure 6 is a graph showing the results of confirming the anti-inflammatory effect depending on whether mitochondria isolated from platelets were freeze-dried or not.
  • Figure 7 is a graph showing the results of confirming the anti-inflammatory efficacy by concentration depending on whether mitochondria isolated from platelets or umbilical cord-derived mesenchymal stem cells were freeze-dried.
  • Figure 8 is a diagram (top) and graph (bottom) showing the results of comparing the heart protective efficacy according to whether or not the mitochondria contained in the organ preservation solution were freeze-dried.
  • Figure 9 shows the concentration of cytochrome C in the supernatant of each mixed preservation solution after freezing and thawing mitochondria isolated from umbilical cord-derived mesenchymal stem cells by mixing them with a TTG mixed preservation solution or a SHE mixed preservation solution. This is a diagram showing the results confirmed by Western blot.
  • Figure 10 shows mitochondria isolated from umbilical cord-derived mesenchymal stem cells in a TT mixed preservation solution, a TTG mixed preservation solution, a TT mixed preservation solution containing DMSO (TT+DMSO), and a TTG mixed preservation solution containing DMSO (TTG+DMSO). ) or SHE mixed preservation solution, respectively, frozen and thawed, and this is a graph showing the results of measuring the activity of enzymes related to energy synthesis in each mitochondria.
  • Figure 11 is a graph showing the results of confirming the anti-inflammatory efficacy of each mitochondria after freezing and thawing mitochondria isolated from umbilical cord-derived mesenchymal stem cells by mixing them with a TTG mixed preservation solution or a SHE mixed preservation solution. *p ⁇ 0.05, **p ⁇ 0.01, ***p ⁇ 0.001 vs CTR, #p ⁇ 0.05, ##p ⁇ 0.05, ###p ⁇ 0.001 vs TTG
  • Figure 12 is a diagram showing the results of confirming the platelet aggregation inhibitory effect of each mitochondria after freezing and thawing mitochondria isolated from umbilical cord-derived mesenchymal stem cells by mixing them with a TTG mixed preservation solution or a SHE mixed preservation solution.
  • Figure 13 shows the change in total mitochondrial protein amount, ATP synthesis rate, staining rate of mitochondria-specific staining reagent, and expression rate of Tom20 after mitochondria isolated from umbilical cord-derived mesenchymal stem cells were mixed with TTG mixed preservation solution and frozen and thawed one month later. This is a drawing showing the results of confirmation.
  • One aspect of the invention provides frozen and/or lyophilized mitochondria.
  • mitochondrial dysfunction or dysfunction due to genetic, environmental, or unknown causes is associated with mitochondrial-related genetic diseases, inflammatory diseases such as rheumatoid arthritis, ischemic diseases, infectious diseases, heart diseases, muscle diseases, Parkinson's disease and Alzheimer's disease, etc. It has been reported to be involved in the development of various diseases such as degenerative diseases, various cancers, and cancer metastasis.
  • ATP adenosine triphosphate
  • the mitochondria may be obtained from mammals or from humans. Specifically, the mitochondria may be separated from cells or tissues, and may be separated from blood cells or platelets. Additionally, the mitochondria may be normal mitochondria obtained from cells with normal mitochondrial biological activity. At this time, the mitochondria may be used by concentrating tissues or cells, crushing them, and then separating them, or they may be frozen and stored, then thawed, and then crushed and separated from tissue or cell samples. Additionally, the mitochondria may be isolated from cells and tissues cultured in vitro or from samples thawed after frozen storage. For example, the mitochondria may be obtained from somatic cells, germ cells, or stem cells.
  • the somatic cells may be muscle cells, liver cells, nerve cells, fibroblasts, epithelial cells, adipocytes, osteocytes, white blood cells, lymphocytes, platelets, or mucosal cells.
  • the stem cells are undifferentiated cells that have the ability to differentiate into various types of tissue cells, but are not limited to mesenchymal stem cells, adult stem cells, pluripotent stem cells, embryonic stem cells, bone marrow stem cells, It may be any one selected from the group consisting of neural stem cells, limbal stem cells, and tissue-derived stem cells.
  • the mesenchymal stem cells may be obtained from any one selected from the group consisting of umbilical cord, cord blood, bone marrow, fat, muscle, nerve, skin, synovial fluid, testis, amniotic membrane, and placenta.
  • the mitochondria may be obtained from autologous, allogenic, or xenogenic sources.
  • autologous mitochondria refer to mitochondria obtained from tissues or cells of the same individual.
  • homogeneous mitochondria refer to mitochondria obtained from an individual belonging to the same species as the individual but having a different genotype for alleles.
  • heterologous mitochondria refer to mitochondria obtained from an individual belonging to a different species.
  • heterologous mitochondria refer to mitochondria obtained from an individual belonging to a different species.
  • the mitochondria may be mitochondria isolated from cells. Additionally, the mitochondria may be intact and have mitochondrial activity.
  • Frozen mitochondria of the present invention can be thawed in refrigeration. Specifically, it may be thawed at about 0°C to about 10°C. Additionally, the thawed mitochondria can be stored in refrigeration. Specifically, it may be stored at about 0°C to about 10°C.
  • the freeze-dried mitochondria of the present invention can be stored at room temperature or refrigerated. Specifically, the mitochondria can be stored at about 0°C to about 37°C. The mitochondria can be stored at about 0°C to about 8°C, about 9°C to about 15°C, about 16°C to about 22°C, about 23°C to about 29°C, or about 30°C to about 37°C.
  • freeze-dried mitochondria can exhibit mitochondrial activity when repaired and used.
  • the term “repair” refers to restoring lyophilized mitochondria to their original state, and can be performed by adding an aqueous solution to the lyophilized mitochondria.
  • it may be water for injection, physiological saline, phosphate buffer solution, purified water, or deionized water.
  • it may be deionized water.
  • the restoration process may be performed at room temperature or refrigerated. Specifically, it may be performed at about 0°C to 37°C.
  • the mitochondria can be operated at about 0°C to about 8°C, about 9°C to about 15°C, about 16°C to about 22°C, about 23°C to about 29°C, or about 30°C to about 37°C.
  • the restoration process lasts from about 1 minute to about 1 hour, from about 1 minute to about 50 minutes, from about 1 minute to about 40 minutes, from about 1 minute to about 30 minutes, from about 1 minute to about 20 minutes, and from about 1 minute to about 1 minute. It may be performed for about 10 minutes or about 1 minute to about 5 minutes.
  • the repair process is not particularly limited as long as the freeze-dried mitochondria are repaired and are in a non-dried state.
  • frozen and/or lyophilized mitochondria can exhibit anti-inflammatory and protective effects on isolated organs.
  • inducing an inflammatory response after treating macrophages with frozen and/or lyophilized mitochondria derived from platelets or umbilical cord-derived mesenchymal stem cells it was confirmed that the induction of an inflammatory response was suppressed ( Figure 1 , Figures 2, 6 and 7).
  • FIG. 8 when the isolated heart was stored in a long-term storage solution containing the lyophilized mitochondria, it showed cardioprotective efficacy (FIG. 8).
  • Another aspect of the present invention provides a method for stably freezing and/or lyophilizing isolated mitochondria.
  • the freezing method includes the steps of isolating mitochondria; And it may include freezing the isolated mitochondria by treating them with a mitochondrial cryoprotectant containing glycine. At this time, the cryoprotectant may further include any one selected from the group consisting of trehalose, tris, and combinations thereof.
  • the freeze-drying method includes the steps of isolating mitochondria; Freezing the isolated mitochondria by treating them with a mitochondrial cryoprotectant containing glycine; And it may include the step of freeze-drying the frozen mitochondria.
  • the mitochondria are the same as described above.
  • the cryoprotectant may further include any one selected from the group consisting of trehalose, tris, and combinations thereof.
  • the mitochondria can be isolated through various known methods, such as using a specific buffer solution or using a potential difference and magnetic field, as well as various methods modified therefrom.
  • the mitochondrial isolation can be obtained by disrupting tissues or cells and centrifuging them in order to maintain mitochondrial activity.
  • culturing cells and first centrifuging a composition containing these cells to produce a pellet resuspending the pellet in a buffer solution and homogenizing the homogenized solution in a second It may be performed by first centrifuging to prepare a supernatant and purifying mitochondria by third centrifuging the supernatant.
  • it is preferable in terms of maintaining cell activity that the time for performing the second centrifugation is adjusted to be shorter than the time for performing the first and third centrifugation, and from the first centrifugation to the third centrifugation The speed can increase as you go further.
  • the first to third centrifugation may be performed at a temperature of about 0°C to about 10°C, preferably at a temperature of about 3°C to about 5°C.
  • the time for which the centrifugation is performed may be about 1 to 50 minutes, and may be appropriately adjusted depending on the number of centrifugations and the content of the sample.
  • the first centrifugation may be performed at a speed of about 100xg to about 1,000xg, about 200xg to about 700xg, or about 300xg to about 450xg.
  • the secondary centrifugation may be performed at a speed of about 1xg to about 2,000xg, about 25xg to about 1,800xg, or about 500xg to about 1,600xg.
  • the tertiary centrifugation may be performed at a speed of about 100xg to about 20,000xg, about 500xg to about 18,000xg, or about 800xg to about 15,000xg.
  • pharmaceutically acceptable sugars may be used to stabilize the obtained mitochondria. Specifically, it may be sucrose, mannitol, trehalose, etc., but is not limited thereto.
  • pharmaceutically acceptable tris HEPES (hydroxyethyl piperazine ethane sulfonic acid), phosphate, etc. may be used, but are not limited thereto.
  • additives such as chelators and antioxidants can be used to remove damage caused by ion leakage and suppress oxidative stress.
  • chelators and antioxidants can be used without limitation, including reagents widely known in the art. You can. For example, it may be EDTA, EGTA, citrate, glycine, taurine, ATP, etc., but is not limited thereto.
  • the mitochondrial isolation can be obtained by thawing, disrupting, and centrifuging frozen cells or tissues in terms of maintaining mitochondrial activity.
  • the method for obtaining mitochondria may be performed by freezing cells or tissues, thawing the cells or tissues, and disrupting the thawed cells and tissues.
  • the isolated mitochondria can be mixed with a mitochondrial cryoprotectant containing glycine and frozen.
  • the cryoprotectant may further include any one selected from the group consisting of trehalose, tris, and combinations thereof.
  • the cryoprotectant may be used in the form of an aqueous solution, and the aqueous solution may be water for injection, physiological saline, phosphate buffer solution, purified water, or deionized water.
  • the cryoprotectant can maintain and/or enhance the stability of mitochondria when freezing them, and can also stably maintain mitochondrial activity.
  • the cryoprotectant of the present invention may include glycine.
  • the glycine is not limited thereto, but may be included in the protective agent at a concentration of about 15 mM or more. Specifically, a concentration of about 15mM to about 150mM, a concentration of about 17mM to about 130mM, a concentration of about 20mM to about 120mM, a concentration of about 22mM to about 110mM, or a concentration of about 25mM to about 100mM. It may be included in a concentration of .
  • the glycine is not limited thereto, but is a group consisting of histidine, isoleucine, leucine, lysine acetate, methionine, phenylalanine, threonine, tryptophan, valine, alanine, arginine, aspartic acid, cysteine, glutamic acid, proline, serine, and tyrosine. It can be used with one or more amino acids selected from.
  • the cryoprotectant may additionally include sugars.
  • the sugar is one or more selected from the group consisting of sucrose, trehalose, mannitol, sorbitol, glucose, fructose, mannose, maltose, lactose, isomaltose, dextran, and dextrin. It may be.
  • the saccharide may be trehalose.
  • the trehalose in the cryoprotectant is at a concentration of about 40mM to about 400mM, about 50mM to about 350mM, about 60mM to about 300mM, about 70mM to about 250mM. Alternatively, it may be included at a concentration of about 80mM to about 200mM.
  • the cryoprotectant may further include a buffer.
  • the buffer included in the liquid composition for injection is not limited thereto, but is selected from the group consisting of tris buffer, HEPES buffer, MOPS (3-(N-morpholino)propanesulfonic acid) buffer, and acetate or phosphate containing buffer. It may be, but is not limited to this.
  • the pH of the buffer is not limited thereto, but may range from about 7.0 to about 7.8, about 7.2 to about 7.6, or about 7.3 to about 7.5.
  • the buffer may be a tris buffer.
  • the cryoprotectant is used at a concentration of about 5mM to about 50mM, a concentration of about 8mM to about 40mM, a concentration of about 10mM to about 35mM, a concentration of about 13mM to about 30mM, or a concentration of about 15mM to about 15mM. It may be included at a concentration of about 25mM.
  • the cryoprotectant of the present invention may include glycine and may further include any one selected from the group consisting of trehalose, tris, and combinations thereof.
  • the cryoprotectant may include glycine and trehalose.
  • the cryoprotectant may include glycine and Tris.
  • the cryoprotectant may include glycine, trehalose, and tris.
  • the mixed preservation solution (TTG) containing glycine, trihalose, and trisine has a lower energy content occurring in the freezing and thawing steps compared to the mixed preservation solution (TT) containing trehalose and tris. Mitochondrial damage was reduced ( Figures 9 to 12).
  • cryoprotectant may further include a chelating agent.
  • the chelating agent is, but is not limited to, injectable grade EGTA (ethylene glycol tetraacetic acid), EDTA (ethylene diamine tetraacetic acid), and BAPTA (1,2-bis(o-aminophenoxy)ethane-N,N,N' ,N'-tetraacetic acid). It may be one or more selected from the group consisting of
  • the chelating agent can inhibit damage caused by ion leakage after obtaining mitochondria included in the liquid composition for injection.
  • cryoprotectant may contain additives such as antioxidants, ATP, magnesium, etc., which are effective in maintaining the function and activity of mitochondria.
  • the freezing is not limited thereto, but may be -1°C or lower. Specifically, from about -5°C to about -200°C, from about -15°C to about -180°C, from about -25°C to about -160°C, from about -40°C to about -140°C, from about -55°C to about - It may be carried out at a temperature range of 120°C, about -60°C to about -100°C, or about -70°C to about -90°C.
  • the freezing may be performed using liquid nitrogen (LN 2 ) or a refrigeration device.
  • the refrigeration or freezing process may be performed by rapid freezing using LN 2 or by using a refrigeration device such as a deep freezer or freezer.
  • the freezing is not particularly limited as long as it is a method that can freeze or freeze mitochondria.
  • a freezing container can be used.
  • the freezing container can freeze cells by lowering the temperature by about 1°C per minute.
  • the refrigerated container can be used when using an ultra-low temperature freezer.
  • a freezing container may not be used.
  • the freezing may be performed for about 24 hours or more, about 48 hours or more, or about 96 hours or more, but is not particularly limited as long as the frozen mitochondria have normal activity.
  • the freeze-drying is not limited to this, but can be divided into a step of freezing the mitochondria and a step of drying the mitochondria. At this time, freeze-drying can be performed in vacuum.
  • the freeze-drying of the mitochondria can be performed by freezing the mitochondria in a vacuum and then gradually increasing the temperature.
  • the freezing step can be performed at about -40°C or lower. Specifically, it may be performed at about -80°C to about -40°C, about -70°C to about -40°C, about -60°C to about -40°C, or about -50°C to about -40°C. At this time, the freezing may be performed for about 5 minutes to about 120 minutes, about 10 minutes to about 100 minutes, about 15 minutes to about 80 minutes, about 20 minutes to about 60 minutes, or about 25 minutes to about 40 minutes. In one embodiment of the present invention, the freezing was performed at about -40°C for 30 minutes.
  • the drying step can be divided into three steps.
  • the first stage drying may be performed at about -30°C to about 0°C. More specifically, it may be performed at about -40°C to about 0°C, about -30°C to about -5°C, or about -20°C to about -10°C.
  • the first stage drying can be performed for about 1 hour to about 50 hours. Specifically, it may be performed for about 1 hour to about 50 hours, about 5 hours to about 50 hours, about 10 hours to about 50 hours, about 20 hours to about 50 hours, or about 30 hours to about 50 hours.
  • the first stage drying was performed at about -20°C for 25 hours, and was further performed at about -20°C for 8.3 hours depending on the mitochondrial condition.
  • the second stage drying can be performed at about 0°C to about 10°C or lower. More specifically, it may be carried out at about 0°C to about 10°C, about 2°C to about 9°C, about 4°C to about 8°C, or about 5°C to about 7°C. At this time, the second stage drying can be performed for about 1 hour to about 24 hours. Specifically, the second stage drying is performed for about 1 hour to about 16 hours, about 2 hours to about 16 hours, about 4 hours to about 16 hours, about 6 hours to about 16 hours, or about 8 hours to about 16 hours. You can. In one embodiment of the present invention, the second stage drying was performed at about 6°C for 8.3 hours.
  • the third stage drying can be performed at a temperature of about 11°C to about 30°C or lower. More specifically, it may be carried out at about 11°C to about 30°C, about 15°C to about 30°C, about 20°C to about 30°C, or about 25°C to about 30°C. At this time, the third stage drying can be performed for about 1 hour to about 18 hours. Specifically, the third stage drying may be performed for about 1 hour to about 18 hours, about 3 hours to about 18 hours, about 6 hours to about 18 hours, or about 9 hours to about 18 hours. In one embodiment of the present invention, the third stage drying was performed at about 25°C for 9 hours.
  • the concentration of mitochondria mixed with the cryoprotectant is about 0.1 mg to about 10 mg, about 0.2 mg to about 9 mg, about 0.3 mg to about 8 mg, about 0.4 mg to about 7 mg, about 0.5 mg to about 6 mg per ml. mg, about 0.6 mg to about 5 mg, about 0.7 mg to about 4 mg, about 0.8 mg to about 3 mg, or about 0.9 mg to about 2 mg.
  • the frozen mitochondria can be lyophilized.
  • Another aspect of the present invention provides a mitochondrial cryoprotectant comprising glycine, and a freezing composition comprising the cryoprotectant and mitochondria.
  • the cryoprotectant may further include any one selected from the group consisting of trehalose, tris, and combinations thereof.
  • the mitochondria and cryoprotectant are the same as described above.
  • Another aspect of the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating diseases containing the frozen and/or lyophilized mitochondria as an active ingredient.
  • the use of the pharmaceutical composition may be for the prevention or treatment of mitochondria-related diseases.
  • mitochondrial-related disease collectively refers to diseases involving mitochondrial dysfunction or dysfunction due to genetic, environmental, or unknown causes.
  • the above diseases include Leber's Hereditary Optic Neuropathy (LHON), Leigh syndrome, Myoclonic Epilepsy Associated with Ragged-Red Fibers (MERRF), and mitochondrial myopathy.
  • Genetic diseases such as encephalopathy, hyperlactatemia, and stroke (Mitochondrial Myopathy, Encephalopathy, Lactacidosis, Stroke; MELAS), degenerative diseases such as Parkinson's and Alzheimer's, metabolic diseases such as diabetes and obesity, sepsis, rheumatoid arthritis, osteoarthritis, and systemic diseases.
  • Inflammatory diseases such as inflammatory response syndrome (SIRS), hearing loss, cancer, ischemic disease, neurological disease, heart disease, muscle disease, degenerative disease, fibrotic disease, eye disease, hair loss, nervous system autoimmune disease, etc. may be included, but are limited to these. It doesn't work.
  • the cancers include, but are not limited to, breast cancer, lung cancer, pancreatic cancer, glioblastoma, stomach cancer, liver cancer, colon cancer, prostate cancer, ovarian cancer, cervical cancer, thyroid cancer, laryngeal cancer, acute myeloid leukemia, brain tumor, neuroblastoma, retinoblastoma, and It may be any one cancer selected from the group consisting of cervical cancer, salivary gland cancer, and lymphoma.
  • the ischemic disease is not limited thereto, but may include severe lower extremity ischemia, ischemic stroke, ischemic heart disease, ischemic colitis, etc.
  • the ischemic disease may be a disease caused by mitochondrial abnormalities, and includes all ischemic cell disorders caused by decreased mitochondrial function.
  • the above neurological diseases include epilepsy, drug-resistant epilepsy, bipolar disorder or manic depression of bipolar disorder, headaches, migraines, anxiety disorders, attention deficit disorder, addictive disorders, personality disorders, autism, traumatic brain injury, Friedreich's ataxia or optic atrophy. It may be, but is not limited to this.
  • infectious diseases include, but are not limited to, hepatitis B, hepatitis C, human papilloma virus (HPV) infection, cytomegalovirus infection, viral respiratory disease, influenza virus infection, etc. You can.
  • the muscle diseases are not limited thereto, but include MELAS syndrome, MERRF syndrome, Kearns-Sayre syndrome, myopathy, encephalomyopathy, myasthenia gravis, myasthenia gravis, amyotrophic lateral sclerosis, muscular dystrophy, muscular dystrophy, muscle hypotonia, and muscle weakness. , muscle stiffness, etc.
  • the muscle disease may include all muscle cell disorders caused by decreased mitochondrial function.
  • Degenerative diseases include Alzheimer's disease, Parkinson's disease, amyotrophic lateral sclerosis, Huntington's disease, multiple sclerosis, immune system abnormalities, brain dysfunction, progressive neurodegenerative diseases, and metabolic diseases. It may be, but is not limited to, brain disease, Niemann-Pick disease, or dementia caused by cerebral ischemia and cerebral hemorrhage.
  • the eye disease may include, but is not limited to, glaucoma, diabetic retinopathy, and age-related macular degeneration.
  • the nervous system autoimmune diseases include multiple sclerosis, neuromyelitis optica, acute disseminated encephalomyelitis, ascending myelitis, central myelitis, and descending myelitis.
  • myelitis transverse myelitis, myasthenia gravis, Guillain-Barre syndrome, autoimmune uveitis, autoimmune encephalopathy, and chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy ( chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy), etc., but is not limited thereto.
  • the mitochondria are present in an amount of about 0.1 to about 500 ⁇ g/ml, about 0.2 ⁇ g/ml to about 450 ⁇ g/ml, but are not limited thereto. Alternatively, it may be included at a concentration of about 0.5 ⁇ g/ml to about 400 ⁇ g/ml.
  • mitochondrial capacity can be quantified by thawing the frozen mitochondria or recovering the freeze-dried mitochondria and then quantifying the membrane protein.
  • the isolated mitochondria can be quantified using the Bradford protein assay [paper authored by James D. McCully ( J Vis Exp. 2014;(91): 51682)].
  • the pharmaceutical composition according to the present invention is administered in an amount of about 0.01 mg/kg to about 5 mg/kg, about 0.1 mg/kg to about 4 mg/kg, or about 0.25 mg/kg to about 0.25 mg/kg at a time, based on the body weight of the subject to be administered.
  • Mitochondria may be administered in an amount of about 2.5 mg/kg, but is not limited thereto. That is, it is most preferable in terms of cell activity that the pharmaceutical composition is administered with mitochondria in an amount within the above range based on the body weight of an individual suffering from a mitochondria-related disease.
  • the pharmaceutical composition can be administered 1 to 10 times, 3 to 8 times, or 5 to 6 times, and preferably 5 times.
  • the administration interval can be 1 to 7 days or 2 to 5 days, preferably 3 days.
  • prevention refers to all actions that inhibit the occurrence of cancer or delay its onset by administering the pharmaceutical composition.
  • treatment refers to any action that improves or beneficially changes cancer symptoms by administering the pharmaceutical composition.
  • the term "efficacy” means survival over a period of time, such as 1 year, 5 years, or 10 years, or disease-free survival. You can. Additionally, the parameter may include that the size of at least one tumor in the subject is suppressed.
  • the preferred dosage of the pharmaceutical composition varies depending on the patient's condition and weight, degree of disease, drug form, administration route and period, but can be appropriately selected by a person skilled in the art.
  • the active ingredient may be included in any amount (effective amount) depending on the use, formulation, purpose of formulation, etc., as long as it can exhibit anti-cancer activity.
  • “effective amount” refers to the amount of active ingredient that can induce an anticancer effect. Such effective amounts can be determined experimentally within the scope of the ordinary ability of those skilled in the art.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the pharmaceutically acceptable carrier may be any carrier that is a non-toxic material suitable for delivery to a patient. Distilled water, alcohol, fats, waxes and inert solids may be included as carriers. Pharmacologically acceptable adjuvants (buffers, dispersants) may also be included in the pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition may be prepared into a parenteral formulation according to the route of administration by a conventional method known in the art, including a pharmaceutically acceptable carrier in addition to the active ingredient.
  • pharmaceutically acceptable means that it does not inhibit the activity of the active ingredient and does not have toxicity beyond what is acceptable for the subject of application (prescription).
  • the pharmaceutical composition of the present invention when prepared as a parenteral formulation, it can be formulated in the form of injections, transdermal administration, and nasal inhalation according to methods known in the art along with a suitable carrier.
  • suitable carriers can be sterilized water, ethanol, polyols such as glycerol or propylene glycol, or mixtures thereof, preferably Ringer's solution, phosphate buffered saline (PBS) containing triethanolamine, or sterile for injection.
  • PBS phosphate buffered saline
  • Isotonic solutions such as water or 5% dextrose can be used.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be an injectable preparation. Therefore, in order to ensure product stability according to the distribution of injection prescriptions, the pharmaceutical composition according to the present invention is made into an injection that is physically and chemically very stable by adjusting the pH using a buffer solution such as an aqueous acid solution or phosphate that can be used as an injection. can be manufactured.
  • a buffer solution such as an aqueous acid solution or phosphate that can be used as an injection.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may include water for injection.
  • the water for injection is distilled water made to dissolve solid injections or dilute water-soluble injections, and includes glucose injection, xylitol injection, D-mannitol injection, fructose injection, saline solution, Dextran 40 injection, Dextran 70 injection, amino acid injection, It may be Ringer's solution, lactic acid-Ringer's solution, or a phosphate buffer solution or sodium dihydrogen phosphate-citric acid buffer solution with a pH ranging from about 3.5 to about 7.5.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include a stabilizer or solubilizing agent.
  • the stabilizer may be pyrosulfite or ethylene diaminetetraacetic acid
  • the solubilizing agent may be hydrochloric acid, acetic acid, potassium hydroxide phosphate, potassium bicarbonate, potassium carbonate, or tris. You can.
  • the pharmaceutical composition may include a mixed preservative solution such as TTG (trehalose-tris-glycine) solution, and can be commonly used in pharmaceutically acceptable drug preparations.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may include a liquid composition for injection in addition to frozen and/or lyophilized mitochondria.
  • frozen and/or lyophilized mitochondria are the same as described above.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is a composition for preventing or treating diseases related to mitochondrial function by including a liquid composition for injection. When administering mitochondria through injection, it prevents the formation of blood clots that may be caused by aggregation of mitochondria, reduction and aggregation of platelets, etc. It can inhibit, maintain and/or enhance the stability of mitochondria, and also maintain the activity of mitochondria stably.
  • the liquid composition may include glycine. Additionally, the liquid composition may additionally contain sugars and/or buffers.
  • the glycine is not limited thereto, but may be present in the liquid composition for injection at a concentration of about 15mM or more, specifically at a concentration of about 15mM to about 150mM, about 17mM to about 130mM, It may be present in a concentration of about 20mM to about 120mM, about 22mM to about 110mM, or about 25mM to about 100mM.
  • the glycine is not limited thereto, but is one or more from the group consisting of histidine, isoleucine, leucine, lysine acetate, methionine, phenylalanine, threonine, tryptophan, valine, alanine, arginine, aspartic acid, cysteine, glutamic acid, proline, serine, and tyrosine. Can be used with selected amino acids.
  • the sugars included in the liquid composition for injection are, but are not limited to, the group consisting of sucrose, trehalose, mannitol, sorbitol, glucose, fructose, mannose, maltose, lactose, isomaltose, dextran, and dextrin. It may be one or more selected from.
  • the saccharide may be trehalose, mannitol or sucrose.
  • the saccharide may be trehalose.
  • the buffer included in the liquid composition for injection is not limited thereto, but may be selected from the group consisting of tris buffer, HEPES buffer, MOPS buffer, and acetate- or phosphate-containing buffer.
  • the buffer may be a scannable tris buffer.
  • the liquid composition may include glycine, trehalose, and tris.
  • the pH of the buffer is not limited thereto, but may range from about 7.0 to about 7.8, about 7.2 to about 7.6, or about 7.3 to about 7.5.
  • the buffer is not limited thereto, but may be present in the liquid composition for injection at a concentration of about 5mM to about 50mM, about 8mM to about 40mM, about 10mM to about 35mM, about 13mM to about 13mM. It may be present at a concentration of about 30mM or at a concentration of about 15mM to about 25mM.
  • the liquid composition for injection has an ointment range of about 200 to about 400 mOsm, about 230 to about 380 mOsm, about 250 to about 350 mOsm, about 260 to about 320 mOsm, about 270 to about 330 mOsm, or about 280 to about 300 mOsm. It may have a small concentration (osmolarity). At this time, the osmolality in the above range promotes long-term storage at a temperature of 2°C to 8°C or higher, while the composition can be administered parenterally, such as intravascularly, intramuscularly, or subcutaneously, without causing side effects in the subject. This was done to ensure appropriate administration.
  • osmolarity refers to the moles of solute contributing to the osmotic pressure of the solution per kilogram of solvent. Osmolality is measured by measuring the freezing point depression of the sample using an osmometer. It is determined by measuring the freezing point depression.
  • liquid composition for injection may further include a chelating agent.
  • the chelating agent is not limited thereto, but may be one or more selected from the group consisting of injectable grades of EGTA, EDTA, and BAPTA.
  • the chelating agent can remove damage caused by ion leakage after obtaining mitochondria included in the liquid composition for injection.
  • the pharmaceutical composition may contain additives such as antioxidants, ATP, magnesium, etc., which are effective in maintaining the function and activity of mitochondria.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be stored in a container selected from the group consisting of vials, cartridges, syringes and autoinjectors. Additionally, the container in which the pharmaceutical composition is stored may be stored at room temperature, a refrigerated temperature of about 2°C to about 8°C, or a temperature of about 25°C to about 40°C until administered to an individual in need of treatment.
  • the subject is not limited thereto, but may be a mammal such as a human, dog, cow, horse, pig, sheep, goat, cat, mouse, rabbit, or rat, and preferably may be a human.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount.
  • the term "therapeutically effective amount” or “pharmaceutically effective amount” refers to an amount of a compound or composition effective in preventing or treating a target disease, which is sufficient to treat the disease with a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical treatment. It refers to an amount that does not cause side effects.
  • the level of the effective amount is determined by factors including the patient's health status, type and severity of the disease, activity of the drug, sensitivity to the drug, administration method, administration time, administration route and excretion rate, treatment period, combination or concurrent use of drugs, and It may be determined based on factors well known in the medical field.
  • a therapeutically effective amount refers to an amount of drug that is effective in treating a disease.
  • administration means introducing a predetermined substance into an individual by an appropriate method, and the composition may be administered through any general route as long as it can reach the target tissue. It may be administered intraperitoneally, intravenously, intramuscularly, subcutaneously, intradermally, locally, intranasally, or rectally, but is not limited thereto.
  • the preferred dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is about 0.01 mg/kg to about 5 mg/kg, about 0.1 mg/kg to about 4 mg/kg, or about 0.25 mg/kg to about 0.25 mg/kg once, based on the body weight of the subject to be administered.
  • Mitochondria may be administered in an amount of about 2.5 mg/kg, but is not limited thereto. That is, it is most preferable in terms of cell activity that the pharmaceutical composition is administered with frozen and/or lyophilized mitochondria in an amount within the above range based on the body weight of the subject suffering from the disease.
  • the pharmaceutical composition can be administered 1 to 10 times, 3 to 8 times, or 5 to 6 times, and preferably 5 times. At this time, the administration interval can be 1 to 7 days or 2 to 5 days, preferably 3 days.
  • the pharmaceutical composition is not limited thereto, but may be administered parenterally using a 18G to 32G needle in a volume of about 5 ml or less, about 3 ml or less, or about 2 ml or less.
  • the term “individual” refers to an object to which the composition of the present invention can be applied (prescribed), and may be an individual suffering from a disease. Additionally, the subject may be a mammal such as a rat, mouse, or livestock, including humans, but is preferably a human.
  • the composition of the present invention may further include any compounds or natural extracts that have been proven to be safe and are known to have preventive or therapeutic effects on each disease. At this time, the pharmaceutical composition and the active compound or natural extract can be administered simultaneously or sequentially.
  • Another aspect of the present invention provides the use of the frozen and/or lyophilized mitochondria for preparing a pharmaceutical composition for preventing or treating diseases. Additionally, the present invention can provide a method for preventing or treating a disease comprising administering the pharmaceutical composition to an individual.
  • the individual may be a mammal, preferably a human.
  • Frozen mitochondria, lyophilized mitochondria, prevention and treatment are the same as described above.
  • the disease is a mitochondria-related disease, and the specific disease is the same as described above.
  • administration may be administered to the affected area through injection, subcutaneous injection, or intravenous injection.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention can directly supply mitochondria with normal activity to the diseased area, thereby increasing the activity of cells with reduced mitochondrial function or being useful for regenerating cells with dysfunctional mitochondria. It can be used to prevent or treat related diseases.
  • Another aspect of the present invention provides an organ preservation solution composition kit for the preservation of isolated cells, tissues or organs comprising frozen and/or lyophilized mitochondria and organ preservation solution.
  • the frozen and lyophilized mitochondria are the same as described above.
  • the organ preservation solution may contain one or more selected from the group consisting of histidine, tryptophan, and ketoglutarate.
  • the ketoglutarate may be alpha-ketoglutarate.
  • the frozen and/or lyophilized mitochondria of the kit can be mixed with an organ preservation solution containing at least one selected from the group consisting of histidine, tryptophan, and ketoglutarate before use.
  • the concentration of the frozen and/or lyophilized mitochondria is about 0.01 ⁇ g/ml to about 1 mg/ml, and about 0.01 ⁇ g/ml to about 100 ⁇ g.
  • the concentration of histidine in the organ preservation solution is about 1mM to about 500mM, about 5mM to about 500mM, about 10mM to about 500mM, about 25mM to about 500mM, about 50mM to about 500mM, about 75mM. From about 100mM to about 500mM, from about 100mM to about 500mM, from about 125mM to about 500mM, from about 150mM to about 500mM, from about 175mM to about 500mM, from about 198mM to about 500mM, from about 100mM to It may be about 400mM, about 100mM to about 300mM, about 100mM to about 200mM or about 100mM to about 198mM.
  • the concentration of tryptophan in the organ preservation solution is about 1 ⁇ M to about 100mM, about 1 ⁇ M to about 90mM, about 1 ⁇ M to about 80mM, about 1 ⁇ M to about 70mM, about 1 ⁇ M to about 60mM, about 1 ⁇ M to about 50mM, about 1 ⁇ M to about 40mM, about 1 ⁇ M to about 30mM, about 1 ⁇ M to about 20mM, about 1 ⁇ M to about 10mM, about 1 ⁇ M to about 5mM, about 10 ⁇ M to It may be about 10mM, about 100 ⁇ M to about 10mM, about 0.5mM to about 10mM, about 1mM to about 10mM, about 1.5mM to about 10mM or about 2mM to about 10mM.
  • the concentration of ketoglutarate in the organ preservation solution is about 1 ⁇ M to about 100mM, about 1 ⁇ M to about 90mM, about 1 ⁇ M to about 80mM, about 1 ⁇ M to about 70mM, about 1 ⁇ M to about 60mM.
  • the cells, tissues or organs may be derived from mammals.
  • the mammal may be a human, cow, horse, pig, dog, sheep, goat, or cat.
  • the cells, tissues or organs may be for transplantation into living organisms.
  • the cells may be muscle cells, hepatocytes, fibroblasts, epithelial cells, nerve cells, adipocytes, osteocytes, white blood cells, lymphocytes, stem cells, or mucosal cells.
  • the tissue may be selected from skin, muscle, cornea, cartilage and bone.
  • the organ may be selected from heart, liver, kidney, small intestine, stomach, pancreas, lung, gallbladder, nerves, skin, blood vessels, teeth, eye and cornea.
  • the organ preservation solution composition kit may be for perfusion or re-perfusion.
  • the perfusion may be to replace protoplasm with artificial fluid by injecting or continuously flowing perfusion fluid into separated cells, tissues, or organs.
  • the re-perfusion may be a temporary interruption of blood supply to isolated cells, tissues, or organs and then restoration of blood flow.
  • the organ preservation solution composition kit may be for parenteral administration.
  • the composition may be a liquid.
  • the composition may include one or more additives.
  • the additives may include excipients, diluents, anti-adherents, preservatives, vehicles, surfactants, or combinations thereof.
  • the composition may further include salts, such as MgCl 2 , CaCl 2 , NaCl, KCl, or a combination thereof.
  • the organ preservation solution composition may contain additives that can increase the efficiency of long-term preservation of separated cells, tissues, or organs.
  • the additive may be water, sugars (e.g., sucrose, raffinose, starch), pH buffering substances (e.g., sodium phosphate, potassium phosphate), ATP, buffering agents, albumin, or antioxidants (e.g., vitamin E). .
  • Another aspect of the present invention provides the use of the frozen and/or lyophilized mitochondria for preparing an organ preservation solution composition kit.
  • another aspect of the present invention is to store the isolated cells, tissues or organs in the presence of an organ preservation solution composition containing the frozen and/or lyophilized mitochondria. Provides a storage method.
  • composition and storage of the mitochondria, frozen and/or lyophilized mitochondria, cells, tissues, organs, and organ preservation solution are the same as described above.
  • the storage may be performed in refrigerated conditions.
  • the refrigerated condition is about -4°C to about 25°C, about -4°C to about 20°C, about -4°C to about 15°C, about -4°C to about 10°C, about -2°C to about 10°C, about -2°C to about 8°C, about 0°C to about 15°C, about 0°C to about 10°C, about 0°C to about 8°C, about 0°C to about 6°C, about 0°C to about 5°C, about 0°C It may be from about 0°C to about 4°C, from about 0°C to about 3°C, or from about 2°C to about 5°C.
  • the storage is from about 0 hours to about 2 days, about 0 hours to about 42 hours, about 0 hours to about 36 hours, about 0 hours to about 30 hours, about 0 hours to about 24 hours, about 0 hours to about 18 hours. , may be performed for about 0 hours to about 12 hours, about 0 hours to about 9 hours, about 0 hours to about 6 hours, or about 0 hours to about 3 hours.
  • the method when using frozen mitochondria, includes the steps of isolating the mitochondria; And it may further include mixing the separated mitochondria with a cryoprotectant and freezing them. Additionally, when using lyophilized mitochondria, the method includes the steps of isolating the mitochondria; And mixing the isolated mitochondria with a cryoprotectant and freezing them; And it may further include a method of freeze-drying frozen mitochondria. The method of isolating the mitochondria, the method of freezing the isolated mitochondria, the method of lyophilizing the frozen mitochondria, and the cryoprotectant are the same as described above.
  • the obtained mitochondria were resuspended in TTG mixed preservation solution (0.195 M trehalose, 20 mM Tris, 65 mM glycine) at a concentration of 1 mg/ml. Afterwards, it was rapidly frozen using LN 2 or frozen at -80°C. When freezing mitochondria at -80°C, they were frozen with or without a freezing container (FC). In the case of freeze drying, the temperature was sequentially changed to -40°C, -20°C, 6°C, and 25°C in a vacuum using a freeze dryer. Specifically, the freezing process was performed at -40°C for 30 minutes and then reacted at -20°C for 25 hours. The reaction was continued for an additional 8.3 hours at -20°C while checking the condition of the mitochondria. Next, the reaction was performed at 6°C for 8.3 hours and at 25°C for 9 hours, respectively, to finally obtain freeze-dried mitochondria.
  • TTG mixed preservation solution (0.195 M trehalose, 20 mM Tris, 65 mM g
  • THP-1 human mononuclear cells were cultured in RPMI 1640 medium containing 1% FBS (fetal bovine serum). After 16 to 24 hours of culture, THP-1 cells were treated with platelet-derived mitochondria (40 ⁇ g) frozen for 24 to 96 hours.
  • FBS fetal bovine serum
  • an inflammatory cell model was constructed by treating the cells with lipopolysaccharide (LPS) at a concentration of 2 ⁇ g/ml.
  • LPS lipopolysaccharide
  • the medium of the THP-1 cells was collected and centrifuged at 20,000xg for 10 minutes, and the concentration of TNF- ⁇ , an inflammatory cytokine, in the supernatant was measured by ELISA ( Figure 1).
  • the anti-inflammatory efficacy of stem cell-derived mitochondria and platelet-derived mitochondria was confirmed using the same method. At this time, mitochondria were treated at a concentration of 40 ⁇ g.
  • the freeze-dried mitochondria were stored at room temperature and refrigerated, and immediately before use, ultrapure distilled water was added to restore the volume to the volume before freeze-drying.
  • Mitochondria were obtained from cells in which mitochondria were labeled with red fluorescent protein (HEK293-MT dsRED ), and were lyophilized and restored by the method of Example 3.
  • HEK293-MTS-GFP cells green fluorescent protein labeled on mitochondria
  • culturing the repaired mitochondria were treated at a concentration of 10 ⁇ g for 1 day, and the cells were observed under a confocal microscope.
  • the protein concentration of platelet-derived mitochondria that were lyophilized or not lyophilized was measured using the BCA method, and the activity of enzymes related to energy synthesis per the same amount of protein was compared.
  • the activity of oxidative phosphorylation complexes complex I and III present in the mitochondrial inner membrane is determined by measuring the intensity of the absorbance that changes as oxidized cytochrome c (Sigma aldrich, cat no. C2037) is reduced at 1 for 20 minutes at a wavelength of 550 nm. Evaluation was made by measuring at minute intervals.
  • the activity of complex IV was determined by reducing cytochrome c using sodium hydrosulfite (Sigma aldrich, cat no. 157953) and then measuring the intensity of absorbance that changes as it is oxidized at 1-minute intervals for 20 minutes at a wavelength of 550 nm. evaluated.
  • ATP synthesis ability was measured by adding ADP and measuring luminescence at 1-minute intervals for 20 minutes using the CellTiter-Glo luminescence kit (Promega).
  • Mitochondrial citrate synthase activity is achieved by converting Acetyl-CoA (Sigma aldrich, cat no. A2181) and Oxaloacetic acid (Sigma aldrich, cat no. O4126) into coenzyme A (CoA-SH) through citrate synthase within the mitochondria.
  • CoA-SH coenzyme A
  • THP-1 human mononuclear cells were cultured in RPMI 1640 medium containing 1% FBS (fetal bovine serum). After 16 to 24 hours of culture, THP-1 cells were treated with non-lyophilized mitochondria or lyophilized mitochondria (40 ⁇ g) isolated from platelets or umbilical cord-derived mesenchymal stem cells and prepared by the method of Example 3.
  • FBS fetal bovine serum
  • the cells were treated with LPS at a concentration of 2 ⁇ g/ml to induce an intracellular inflammatory response.
  • LPS Low-power plasma
  • the medium of the THP-1 cells was collected and centrifuged at 20,000xg for 10 minutes, and the concentration of TNF- ⁇ , an inflammatory cytokine, in the supernatant was measured by ELISA.
  • the anti-inflammatory efficacy of freeze-dried or non-freeze-dried mitochondria at different concentrations was confirmed using the same method.
  • Example 7.1 Heart extraction and stabilization
  • the heart was first removed from a rat and stabilized.
  • Sprague-Dawley rats (SD, 12 weeks old, male) were anesthetized with ketamine and sacrificed.
  • the rat's heart was removed, and the extracted heart was installed in Langendorff through an aortic catheter. Afterwards, the extracted heart was perfused with Krebs-Henseleit solution for about 20 minutes and washed.
  • the heart was stabilized by injecting a refrigerated histidine-tryptophan-ketoglutarate (HTK) solution through the aorta of the heart and perfusing it for about 10 minutes.
  • HTK histidine-tryptophan-ketoglutarate
  • the HTK solution contained 198mM histidine, 2mM tryptophan, 1mM ketoglutarate, 30mM mannitol, 4mM MgCl 2 , 15 ⁇ M CaCl 2 , 15mM NaCl, and 9mM KCl.
  • Example 7.2 Maintenance of perfusate by mitochondrial-containing solution in the excised heart.
  • Lyophilized mitochondria or mitochondria were added to the HTK solution to prepare 5 ⁇ g/ml lyophilized mitochondria-HTK and mitochondria-HTK solutions.
  • the stabilized heart prepared in Example 7.1 was injected with 5 ⁇ g/ml mitochondria-HTK solution (MT), 5 ⁇ g/ml lyophilized mitochondria-HTK solution (lyophilized MT), or mitochondria-free-HTK solution (control) for about 2 days. Infused for minutes. Thereafter, the heart was immersed in 150 ⁇ g/30 ml of mitochondrial-HTK solution (MT), lyophilized MT, or mitochondria-free HTK solution, respectively, and stored at about 4°C. After 9 hours, the stored heart was installed in Langendorff through the aorta-catheter, and Krebs-Henselite solution was passed through it. The amount of perfusate flowing through the heart was measured (Figure 8).
  • the perfusate of the heart increased by approximately 1.97 times when stored in the mitochondria-HTK solution and by approximately 1.48 times in the freeze-dried mitochondria-HTK solution. .
  • Example 8.1 Comparison of mitochondrial protection effects against freezing and thawing according to mixed preservation solutions
  • Mitochondria isolated from umbilical cord-derived mesenchymal stem cells were stored in SHE (250 mM sucrose, 20 mM HEPES, 2 mM EGTA) mixed preservation solution, TTG (20 mM tris, 195 mM trehalose, 66.6 mM glycine) mixed preservation solution, or TT ( 20mM tris, 195mM trehalose) mixed in a mixed preservation solution and frozen, then thawed and centrifuged at 12,000g for 10 minutes. After centrifugation, the supernatant was obtained, and the amount of cytochrome C leaked when mitochondrial damage was induced was confirmed using Western blot. For the control group, ultrasonically disrupted mitochondria were centrifuged under the same conditions as above and the supernatant was obtained and used.
  • Example 8.2 Comparison of activity of frozen and thawed mitochondria according to mixed preservation solutions
  • TTG mixed preservation solution In order to confirm the mitochondrial protection effect of TTG mixed preservation solution against stress occurring during freezing and thawing, mitochondria isolated from umbilical cord-derived mesenchymal stem cells were preserved in SHE mixed preservation solution alone, TTG mixed preservation solution only, and TT mixed preservation solution, respectively.
  • the solution was frozen alone, mixed with a TTG mixed preservation solution containing DMSO (TTG+DMSO), or mixed with a TT mixed preservation solution containing DMSO (TT+DMSO), and then thawed to compare mitochondrial activity.
  • TTG+DMSO TTG mixed preservation solution containing DMSO
  • TT+DMSO TT mixed preservation solution containing DMSO
  • the mitochondria mixed and frozen in the TTG mixed preservation solution showed higher citrate synthase and ATP synthase activities compared to the mitochondria mixed and frozen in the SHE mixed preservation solution.
  • Example 8.3 Comparison of anti-inflammatory efficacy of frozen and thawed mitochondria according to mixed preservation solutions
  • Mitochondria isolated from umbilical cord-derived mesenchymal stem cells were stored in SHE mixed preservation solution, TTG mixed preservation solution alone, TT mixed preservation solution alone, TTG mixed preservation solution containing DMSO (TTG+DMSO), or TT mixed preservation solution containing DMSO, respectively. It was mixed with (TT+DMSO), frozen, and then thawed to confirm the anti-inflammatory effect of mitochondria. At this time, the anti-inflammatory efficacy of mitochondria was confirmed in the same manner as in Example 2.
  • mitochondria mixed and frozen in TTG mixed preservation solution showed higher anti-inflammatory efficacy than mitochondria mixed and frozen in SHE mixed preservation solution, TT mixed preservation solution, and TT+DMSO mixed preservation solution. indicated.
  • the above results show that the activity of mitochondria frozen by mixing with TTG mixed preservation solution is superior to that of mitochondria frozen by mixing with other preservation solutions, and the TTG mixed preservation solution causes damage to mitochondria during the freezing and thawing process. This result suggests that mitochondria can be protected more reliably.
  • Example 8.4 Comparison of platelet aggregation inhibition effects of frozen and thawed mitochondria according to mixed preservation solutions
  • Mitochondria isolated from umbilical cord-derived mesenchymal stem cells were mixed in SHE mixed preservation solution or TTG mixed preservation solution, frozen, and then thawed to compare the inhibitory effect of mitochondria on platelet aggregation.
  • mitochondria thawed after freezing were stained with 0.1 ⁇ M MitoTracker Orange for 10 minutes and washed twice with a mitochondrial isolation solution.
  • the mitochondria (5 ⁇ g) were mixed with platelets (1 ⁇ 10 7 ) stained with 1 ⁇ M Mitotracker Green and cultured with shaking for one day.
  • the shake-cultured solution (5 ⁇ l) was applied to a glass slide and observed using a confocal laser scanning microscope.
  • Mitochondria isolated from umbilical cord-derived mesenchymal stem cells were mixed with TTG mixed preservation solution and frozen, and then thawed one month later to check for mitochondrial damage.
  • the total amount of mitochondrial protein, ATP synthesis rate, Mitotracker staining rate, and expression rate of Tom20, a specific protein in the outer membrane were measured, and then the same mitochondria were mixed with TTG mixed preservation solution and frozen. One month after freezing, the mitochondria were thawed and the above parameters were measured again. At this time, the total amount of mitochondrial protein was measured using a BCA assay kit, and the ATP synthesis rate was measured by the method in Example 5. Mitotacker staining rate and Tom20 expression rate were analyzed using flow cytometry after staining with 0.5 ⁇ M Mitotracker green or Mitotracker Orange or with Tom20 antibody (Santacruz, sc-17764-FITC) attached to a fluorescent protein.

Abstract

본 발명은 세포에서 분리된 미토콘드리아를 동결 및/또는 동결건조하는 방법, 및 동결 및/또는 동결건조된 미토콘드리아의 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따른 동결된 미토콘드리아는 동결되지 않은 미토콘드리아와 유사한 항염증 활성 및 에너지 대사 관련 효소의 활성을 나타내었다. 또한, 동결건조된 미토콘드리아도 수복 후 동결건조 전의 미토콘드리아와 유사한 수준의 항염증 활성, 에너지 대사 관련 효소들의 활성 및 장기 보존 효능을 나타내었다. 따라서, 본 발명에 따른 동결 및/또는 동결건조된 미토콘드리아는 미토콘드리아 기능저하 또는 기능장애로 인해 유발되는 다양한 질환 치료에 분리된 미토콘드리아를 폭넓게 적용할 수 있게 함으로써 미토콘드리아를 포함하는 치료제의 상업적 이용 가능성을 크게 향상시킬 것으로 기대된다.

Description

동결 및 동결건조된 미토콘드리아 및 이의 용도
본 발명은 세포에서 분리된 미토콘드리아를 동결 및/또는 동결건조하는 방법, 및 동결 및/또는 동결건조된 미토콘드리아의 용도에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 미토콘드리아를 동결 및/또는 동결건조하는 방법, 및 상기 방법에 의해 동결 및/또는 동결건조된 미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물 및 장기 보존액 조성물에 관한 것이다.
동결건조는 수분을 함유하는 시료를 동결하고 감압 하에 두어 시료 중의 수분을 승화시켜 제거하는 건조법으로서, 식물이나 동물의 세포, 조직, 또는 식품 등의 물을 포함하는 물질을 장기간 보존하기 위해 사용되고 있다.
그러나 물을 포함하는 물질을 동결하면 동결 중에 물 분자끼리 얼음 결정(빙정)을 형성하여, 물을 포함하는 물질 중에서 용질이나 혼입물의 매질이 불균일하게 확산되는 동결 농축이 발생하여 조직의 안정성을 높이기 위하여 동결 보호제를 사용한다. 그러나 진핵세포의 경우 동결 보호제를 사용하여도 동결건조 시 세포막 등의 세포 구조의 손상 없이 세포를 안정하게 보존하기 어렵고, 이에 따라 세포 내 유효 성분의 기능을 유지할 수 없게 되는 문제점이 있다.
미토콘드리아는 에너지 공급원으로서 ATP 합성, 활성산소 생산, 세포사멸 등 다양한 생리과정에서 핵심적인 역할을 한다. 따라서, 미토콘드리아가 손상되면 다양한 질병이 유발될 수 있는데, 대부분의 미토콘드리아 장애는 미토콘드리아 DNA에서 발생하는 유전성 또는 후천성 돌연변이에 기인한다. 예를 들어, 미토콘드리아 막전위 이상으로 인한 팽윤, 활성산소종 또는 자유라디칼 등에 의한 산화적 스트레스, 그리고 미토콘드리아의 에너지 생성을 위한 산화적 인산화 기능의 결함 등에 의해 미토콘드리아의 기능이 변형될 수 있다. 이러한 미토콘드리아의 기능 이상은 미토콘드리아 유전병, 류마티스 관절염과 같은 염증성 질환, 허혈성 질환, 감염성 질환, 심장질환, 근질환, 파킨슨병이나 알츠하이머병 등과 같은 퇴행성 질환 및 각종 암의 발생과 암전이 등이 보고된 바 있다.
이러한 미토콘드리아 기능장애와 관련된 질환을 치료하기 위하여, 세포나 조직으로부터 미토콘드리아를 분리하여 이를 치료의 목적으로 생체에 다시 주입하는 시도가 최근 증가하고 있다(대한민국 등록특허 제10-2126199호, 대한민국 등록특허 제10-2019277호).
이와 같이, 미토콘드리아를 이용한 특정 질환의 치료에 대한 가능성 제시 등 다양한 연구가 이루어지고 있음에도 불구하고, 미토콘드리아를 안정적으로 유지 및 보관할 수 있는 방법, 및 안정적인 제형과 관련한 응용기술의 개발은 미진한 상황이다. 따라서, 미토콘드리아와 이에 포함된 생체활성 인자들을 안정적으로 유지·보관할 수 있는 새로운 방법 개발이 필요하다.
이에 본 발명자들은 미토콘드리아 관련 질환 치료의 일환으로서 이식 치료를 위한 미토콘드리아를 효율적으로 보존하기 위한 방법을 연구하였다. 그 결과, 본 발명의 방법으로 동결건조된 미토콘드리아가 상온 및 저온에서 보관 가능하면서, 동결 및/또는 동결건조된 미토콘드리아는 동결 전의 미토콘드리아의 활성을 유지하는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명의 일 측면은 동결 또는 동결건조된 미토콘드리아 및 이를 포함하는 약학 조성물 및 장기 보존액 조성물 키트를 제공한다.
본 발명의 다른 측면은 분리된 미토콘드리아를 안정적으로 동결 또는 동결건조 시키는 방법 및 동결 보호제; 및 상기 동결 보호제 및 미토콘드리아를 포함하는 동결 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 분리된 동결 또는 동결건조된 미토콘드리아의 미토콘드리아 관련 질환의 예방 또는 치료용 용도를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 분리된 동결 또는 동결건조된 미토콘드리아를 투여하는 단계를 포함하는 미토콘드리아 관련 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 동결 및/또는 동결건조된 미토콘드리아는 동결되지 않은 미토콘드리아와 유사한 것을 확인하였다. 또한, 동결 및/또는 동결건조된 미토콘드리아는 동결건조되지 않은 미토콘드리아와 유사한 수준의 항염증 활성 및 에너지 대사 관련 효소들의 활성을 나타내었다. 또한, 동결건조된 미토콘드리아는 동결건조되지 않은 미토콘드리아와 유사한 수준의 장기 보존 효능을 나타내었다. 따라서, 본 발명에 따른 동결 및/또는 동결건조된 미토콘드리아는 미토콘드리아 기능저하 또는 기능장애로 인해 유발되는 다양한 질환 치료에 분리된 미토콘드리아를 폭넓게 적용할 수 있게 함으로써 미토콘드리아를 포함하는 치료제의 상업적 이용 가능성을 크게 향상시킬 것으로 기대된다.
도 1은 혈소판 유래 동결된 미토콘드리아의 항염증 효능을 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 탯줄 유래 중간엽 줄기세포 또는 인간 혈액으로부터 분리한 혈소판 유래 미토콘드리아의 동결 여부에 따른 항염증 효능을 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 동결건조 전 미토콘드리아의 단백질 농도 및 동결건조 후 부피를 수복한 미토콘드리아의 단백질 농도 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 배양 중인 세포에 HEK293 세포에서 분리하여 동결건조한 미토콘드리아를 처리한 뒤, 미토콘드리아의 위치를 확인한 도면이다.
도 5는 혈소판에서 분리한 미토콘드리아의 동결건조 여부에 따른 미토콘드리아의 에너지 합성 관련 효소의 활성을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 혈소판에서 분리한 미토콘드리아의 동결건조 여부에 따른 항염증 효능을 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 혈소판 또는 탯줄 유래 중간엽 줄기세포에서 분리한 미토콘드리아의 동결건조 여부에 따른 항염증 효능을 농도별로 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 장기 보존액에 포함된 미토콘드리아의 동결건조 여부에 따른 심장의 보호 효능을 비교한 결과를 나타낸 도면(상단) 및 그래프(하단)이다.
도 9는 탯줄 유래 중간엽 줄기세포에서 분리한 미토콘드리아를 TTG 혼합 보존용액 또는 SHE 혼합 보존용액과 혼합하여 동결 후 해동한 뒤, 각각의 혼합 보존용액의 상층액에서 사이토크롬 C(cytochrome C)의 농도를 웨스턴 블롯으로 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 10은 탯줄 유래 중간엽 줄기세포에서 분리한 미토콘드리아를 TT 혼합 보존용액, TTG 혼합 보존용액, DMSO를 포함하는 TT 혼합 보존용액(TT+DMSO), DMSO를 포함하는 TTG 혼합 보존용액(TTG+DMSO) 또는 SHE 혼합 보존용액과 각각 혼합하여 동결 후 해동한 뒤, 각각의 미토콘드리아의 에너지 합성 관련 효소의 활성을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 vs CTR, #p<0.05, ##p<0.05, ###p<0.001 vs TTG
도 11은 탯줄 유래 중간엽 줄기세포에서 분리한 미토콘드리아를 TTG 혼합 보존용액 또는 SHE 혼합 보존용액과 혼합하여 동결 후 해동한 뒤, 각각의 미토콘드리아의 항염증 효능을 확인한 결과를 나타낸 그래프이다. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 vs CTR, #p<0.05, ##p<0.05, ###p<0.001 vs TTG
도 12는 탯줄 유래 중간엽 줄기세포에서 분리한 미토콘드리아를 TTG 혼합 보존용액 또는 SHE 혼합 보존용액과 혼합하여 동결 후 해동한 뒤, 각각의 미토콘드리아의 혈소판 응집 억제 효과를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 13은 탯줄 유래 중간엽 줄기세포에서 분리한 미토콘드리아를 TTG 혼합 보존용액과 혼합하여 동결하고 한달 뒤에 해동한 뒤, 미토콘드리아 총 단백량의 변화, ATP 합성율, 미토콘드리아 특이적 염색 시약의 염색율 및 Tom20의 발현율을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
동결 및/또는 동결건조된 미토콘드리아
본 발명의 일 측면은 동결 및/또는 동결건조된 미토콘드리아를 제공한다.
본 명세서에 사용된 용어 "미토콘드리아(mitochondria)"는 세포 내 에너지 공급원인 아데노신 트라이포스페이트(ATP)의 합성 및 조절에 관여하는 진핵세포의 세포 소기관으로, 생체 내 다양한 대사 경로, 예를 들어, 세포 신호처리, 세포 분화, 세포 사멸 뿐만 아니라, 세포 주기 및 세포 성장의 제어와 연관이 있다. 따라서, 유전적, 환경적 또는 원인 불명의 원인으로 인한 미토콘드리아 기능저하 또는 기능장애는 미토콘드리아 관련 유전병, 류마티스 관절염과 같은 염증성 질환, 허혈성 질환, 감염성 질환, 심장 질환, 근 질환, 파킨슨병이나 알츠하이머병 등과 같은 퇴행성질환 및 각종 암의 발생과 암 전이 등과 같은 다양한 질환의 발병에 관련 있다고 보고된 바 있다.
상기 미토콘드리아는 포유동물로부터 수득된 것일 수 있으며, 인간으로부터 수득된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 미토콘드리아는 세포 또는 조직으로부터 분리된 것일 수 있으며, 혈액세포 또는 혈소판으로부터 분리된 것일 수 있다. 또한, 상기 미토콘드리아는 미토콘드리아의 생물학적 활성이 정상인 세포로부터 수득된 정상적인 미토콘드리아일 수 있다. 이때, 상기 미토콘드리아는 조직 또는 세포를 농축하여 파쇄 후 분리하여 사용하거나 동결 보관한 후 해동한 조직 또는 세포 시료로부터 파쇄 후 분리된 것일 수 있다. 또한, 상기 미토콘드리아는 세포 및 조직을 체외에서 배양하여 분리하거나 동결 보관한 후 해동한 시료로부터 분리된 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 미토콘드리아는 체세포, 생식세포 또는 줄기세포로부터 수득된 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 체세포는 근육세포, 간세포, 신경세포, 섬유아세포, 상피세포, 지방세포, 골세포, 백혈구, 림프구, 혈소판 또는 점막세포일 수 있다.
또한, 상기 줄기세포는 여러 종류의 조직 세포로 분화할 수 있는 능력을 가진 미분화 세포로서, 이에 제한되지는 않으나 중간엽줄기세포, 성체줄기세포, 역분화줄기세포, 배아줄기세포, 골수줄기세포, 신경줄기세포, 윤부줄기세포 및 조직 유래 줄기세포로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다. 이때, 상기 중간엽줄기세포는 탯줄, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 활액, 정소, 양막 및 태반으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나로부터 수득된 것일 수 있다.
또한, 상기 미토콘드리아는 자가(autologous), 동종(allogenic) 또는 이종(xenogenic)으로부터 수득된 것일 수 있다. 구체적으로, 자가 미토콘드리아는 동일 개체의 조직 또는 세포로부터 수득된 미토콘드리아를 의미한다. 또한, 동종 미토콘드리아는 개체와 같은 종에 속하면서 대립유전자에 대해서는 다른 유전자형을 가지는 개체로부터 수득된 미토콘드리아를 의미한다. 또한, 이종 미토콘드리아는 개체와 다른 종에 속하는 개체로부터 수득된 미토콘드리아를 의미한다. 또한, 이종 미토콘드리아는 개체와 다른 종에 속하는 개체로부터 수득된 미토콘드리아를 의미한다.
또한, 상기 미토콘드리아는 세포에서 분리된 미토콘드리아일 수 있다. 또한, 상기 미토콘드리아는 손상되지 않고, 미토콘드리아 활성을 가지고 있는 것일 수 있다.
본 발명의 동결된 미토콘드리아는 냉장에서 해동될 수 있다. 구체적으로 약 0℃ 내지 약 10℃에서 해동될 수 있다. 또한, 상기 해동된 미토콘드리아는 냉장에서 보관될 수 있다. 구체적으로 약 0℃ 내지 약 10℃에서 보관될 수 있다.
본 발명의 동결건조된 미토콘드리아는 상온 또는 냉장에서 보관할 수 있다. 구체적으로, 상기 미토콘드리아는 약 0℃ 내지 약 37℃에서 보관할 수 있다. 상기 미토콘드리아는 약 0℃ 내지 약 8℃, 약 9℃ 내지 약 15℃, 약 16℃ 내지 약 22℃, 약 23℃ 내지 약 29℃ 또는 약 30℃ 내지 약 37℃에서 보관할 수 있다.
또한, 상기 동결건조된 미토콘드리아는 수복하여 사용 시, 미토콘드리아 활성을 나타낼 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "수복"은 동결건조된 미토콘드리아를 원상태로 회복시키는 것을 의미하며, 수용액을 상기 동결건조된 미토콘드리아에 첨가함으로써 수행될 수 있다. 이때, 주사용수, 생리적 식염수, 인산염 완충용액, 정제수 또는 탈이온수일 수 있다. 바람직하게는 탈이온수일 수 있다.
이때, 상기 수복과정은 상온 또는 냉장에서 수행될 수 있다. 구체적으로, 약 0℃ 내지 37℃에서 수행될 수 있다. 상기 미토콘드리아는 약 0℃ 내지 약 8℃, 약 9℃ 내지 약 15℃, 약 16℃ 내지 약 22℃, 약 23℃ 내지 약 29 또는 약 30℃ 내지 약 37℃에서 수행될 수 있다. 또한, 상기 수복과정은 약 1분 내지 약 1시간, 약 1분 내지 약 50분, 약 1분 내지 약 40분, 약 1분 내지 약 30분, 약 1분 내지 약 20분, 약 1분 내지 약 10분 또는 약 1분 내지 약 5분 동안 수행될 수 있다. 상기 수복과정은 동결건조된 미토콘드리아가 수복되어 건조되어 있지 않은 상태로 되는 한, 특별히 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구체예에서 상기 동결건조된 미토콘드리아를 수복하여 사용 시, 미토콘드리아에 존재하는 에너지 합성 관련 효소들의 활성이 동결건조되지 않은 미토콘드리아와 유사한 것을 확인할 수 있었다(도 5).
또한, 동결 및/또는 동결건조된 미토콘드리아는 항염증 및 분리된 장기의 보호 효능을 나타낼 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서 혈소판 또는 탯줄 유래 중간엽 줄기세포 유래의 동결 및/또는 동결건조된 미토콘드리아를 대식세포에 처리 후 염증반응을 유도 시, 염증반응 유도가 억제된 것을 확인할 수 있었다(도 1, 도 2, 도 6 및 도 7). 또한, 상기 동결건조된 미토콘드리아를 포함하는 장기 보관 용액에 분리된 심장을 보관 시, 심장 보호 효능을 나타냈다(도 8).
동결 및 동결건조 방법
본 발명의 또 다른 측면은 분리된 미토콘드리아를 안정적으로 동결 및/또는 동결건조 시키는 방법을 제공한다.
상기 동결 방법은 미토콘드리아를 분리하는 단계; 및 분리된 미토콘드리아를 글라이신을 포함하는 미토콘드리아의 동결 보호제를 처리하여 냉동시키는 단계를 포함할 수 있다. 이때, 상기 동결 보호제는 트레할로오스, 트리스 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나를 추가로 포함할 수 있다.
또한, 상기 동결건조 방법은 미토콘드리아를 분리하는 단계; 분리된 미토콘드리아를 글라이신을 포함하는 미토콘드리아의 동결 보호제로 처리하여 냉동시키는 단계; 및 냉동된 미토콘드리아를 동결건조 시키는 단계를 포함할 수 있다. 여기서 미토콘드리아는 상술한 바와 동일하다. 이때, 상기 동결 보호제는 트레할로오스, 트리스 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나를 추가로 포함할 수 있다.
상기 미토콘드리아를 특정 세포로부터 분리하는 경우에는, 예를 들어, 특정 버퍼 용액을 사용하거나 전위차 및 자기장을 이용하는 등 공지된 다양한 방법을 비롯하여 이를 변형한 다양한 방법을 통해 미토콘드리아를 분리할 수 있다.
상기 미토콘드리아 분리는 미토콘드리아 활성 유지 측면에서, 조직 또는 세포를 파쇄하고 원심분리하여 수득할 수 있다. 일 구체예로, 세포를 배양하고, 이러한 세포를 포함하는 조성물을 제1차 원심분리하여 펠렛을 생성하는 단계, 상기 펠렛을 버퍼 용액에 재현탁시키고, 균질화하는 단계, 상기 균질화된 용액을 제2차 원심분리하여 상층액을 제조하는 단계 및 상기 상층액을 제3차 원심분리하여 미토콘드리아를 정제하는 단계로 수행될 수 있다. 이때, 제2차 원심분리가 수행되는 시간은 제1차 및 제3차 원심분리가 수행되는 시간보다 짧도록 조절되는 것이 세포 활성 유지 면에서 바람직하며, 제1차 원심분리에서 제3차 원심분리로 갈수록 속도를 높일 수 있다.
구체적으로, 상기 제1차 내지 제3차 원심분리는 약 0℃ 내지 약 10℃의 온도, 바람직하게는 약 3℃ 내지 약 5℃의 온도에서 수행될 수 있다. 또한, 상기 원심분리가 수행되는 시간은 약 1분 내지 50분 동안 수행될 수 있으며, 원심분리 횟수 및 샘플의 함량 등에 따라 적절히 조정될 수 있다.
아울러, 상기 제1차 원심분리는 약 100xg 내지 약 1,000xg, 약 200xg 내지 약 700xg 또는 약 300xg 내지 약 450xg의 속도로 수행될 수 있다. 또한, 상기 제2차 원심분리는 약 1xg 내지 약 2,000xg, 약 25xg 내지 약 1,800xg 또는 약 500xg 내지 약 1,600xg의 속도로 수행될 수 있다. 또한, 상기 제3차 원심분리는 약 100xg 내지 약 20,000xg, 약 500xg 내지 약 18,000xg 또는 약 800xg 내지 약 15,000xg의 속도로 수행될 수 있다.
아울러, 상기 수득된 미토콘드리아의 안정화를 위하여 약학적으로 허용 가능한 당이 사용될 수 있다. 구체적으로, 수크로오스(sucrose), 만니톨(mannitol), 트레할로오스(trehalose) 등의 당일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, pH 완충제로서 이에 제한되지는 않으나, 약학적으로 허용가능한 트리스(tris), HEPES(hydroxyethyl piperazine ethane sulfonic acid), 인산(phosphate) 등이 사용될 수 있다.
한편, 상기 미토콘드리아 수득 후 이온(ion) 유출에 의한 손상을 제거하고, 산화 스트레스를 억제하기 위한 킬레이터, 항산화제 등의 첨가제를 사용할 수 있으며, 이는 당업계에서 널리 알려진 시약을 제한없이 포함하여 사용할 수 있다. 예컨대, EDTA, EGTA, 시트레이트(citrate), 글라이신(glycine), 타우린(taurine), ATP 등일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 미토콘드리아 분리는 미토콘드리아 활성 유지 측면에서, 냉동된 세포 또는 조직을 해동하여 파쇄하고 원심분리하여 수득할 수 있다. 상기 미토콘드리아 수득 방법은 세포 또는 조직을 냉동하는 단계, 상기 세포 또는 조직을 해동하는 단계 및 해동된 세포 및 조직을 파쇄하는 단계로 수행될 수 있다.
구체적으로, 본 발명에서 상기 분리된 미토콘드리아는 글라이신을 포함하는 미토콘드리아의 동결 보호제와 혼합되어 냉동될 수 있다. 이때, 상기 동결 보호제는 트레할로오스, 트리스 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명에서 상기 동결 보호제는 수용액 형태로 사용할 수 있으며, 상기 수용액은 주사용수, 생리적 식염수, 인산염 완충용액, 정제수 또는 탈이온수일 수 있다.
상기 동결 보호제는 미토콘드리아를 동결시킬 시, 미토콘드리아의 안정성을 유지 및/또는 강화할 수 있으며, 미토콘드리아의 활성 또한 안정적으로 유지시킬 수 있다.
본 발명의 동결 보호제는 글라이신(glycine)을 포함할 수 있다. 상기 글라이신은 이에 제한되지는 않으나, 상기 보호제 내에 약 15 mM 이상의 농도로 포함될 수 있다. 구체적으로는 약 15 mM 내지 약 150 mM의 농도, 약 17 mM 내지 약 130 mM의 농도, 약 20 mM 내지 약 120 mM의 농도, 약 22 mM 내지 약 110 mM의 농도 또는 약 25 mM 내지 약 100 mM의 농도로 포함될 수 있다. 또한, 상기 글라이신(glycine)은 이에 제한되지는 않으나 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신아세테이트, 메티오닌, 페닐알라닌, 트레오닌, 트립토판, 발린, 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴산, 시스테인, 글루타민산, 프롤린, 세린 및 티로신으로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택되는 아미노산과 함께 사용 가능하다.
상기 동결 보호제는 당류를 추가로 포함할 수 있다. 이때, 당류는 수크로오스(sucrose), 트레할로오스(trehalose), 만니톨(mannitol), 소르비톨, 글루코오스, 프락토오스, 만노오스, 말토오스, 락토오스, 이소말토오스, 덱스트란 및 덱스트린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것일 수 있다. 바람직하게, 상기 당류는 트레할로오스일 수 있다. 구체적으로 상기 동결 보호제 내 트레할로오스는 약 40 mM 내지 약 400 mM의 농도, 약 50 mM 내지 약 350 mM의 농도, 약 60 mM 내지 약 300 mM의 농도, 약 70 mM 내지 약 250 mM의 농도 또는 약 80 mM 내지 약 200 mM의 농도로 포함될 수 있다.
상기 동결 보호제는 버퍼를 추가로 포함할 수 있다. 상기 주사용 액상 조성물 내 포함되는 상기 버퍼는 이에 제한되지는 않으나 트리스(tris) 버퍼, HEPES 버퍼, MOPS(3-(N-morpholino)propanesulfonic acid) 버퍼 및 아세테이트 또는 포스페이트 함유 버퍼로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이때, 상기 버퍼의 pH는 이에 제한되지는 않으나, 약 7.0 내지 약 7.8 범위, 약 7.2 내지 약 7.6 범위 또는 약 7.3 내지 약 7.5 범위일 수 있다. 바람직하게, 본 발명에서 상기 버퍼는 트리스(tris) 버퍼일 수 있다. 구체적으로 상기 동결 보호제는 약 5 mM 내지 약 50 mM의 농도, 약 8 mM 내지 약 40 mM의 농도, 약 10 mM 내지 약 35 mM의 농도, 약 13 mM 내지 약 30 mM의 농도 또는 약 15 mM 내지 약 25 mM의 농도로 포함될 수 있다.
보다 구체적으로, 본 발명의 동결 보호제는 글라이신을 포함할 수 있으며, 트레할로오스, 트리스 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나를 추가로 포함할 수 있다. 일 구체예로 상기 동결 보호제는 글라이신 및 트레할로오스를 포함할 수 있다. 상기 동결 보호제는 글라이신 및 트리스를 포함할 수 있다. 일 구체예로 상기 동결 보호제는 글라이신, 트레할로오스 및 트리스를 포함할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서 글라이신, 트리할로오스 및 트리신을 포함하는 혼합 보존용액(TTG)는 트레할로오스 및 트리스를 포함하는 혼합 보존용액(TT)와 비교하여 동결 및 해동 단계에서 발생하는 미토콘드리아의 손상을 감소시켰다(도 9 내지 도 12).
또한, 상기 동결 보호제는 킬레이트제를 더 포함할 수 있다.
상기 킬레이트제는 이에 제한되지는 않으나, 주사가능한 등급의 EGTA(ethylene glycol tetraacetic acid), EDTA(ethylene diamine tetraacetic acid) 및 BAPTA(1,2-bis(o-aminophenoxy)ethane-N,N,N',N'-tetraacetic acid)로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택되는 것일 수 있다. 상기 킬레이트제는 상기 주사용 액상 조성물에 포함되는 미토콘드리아 수득 후 이온(ion) 유출에 의한 손상을 저해할 수 있다.
또한, 상기 동결 보호제는 첨가제로, 미토콘드리아의 기능 유지 및 활성에 유효한 항산화제, ATP, 마그네슘(magnesium) 등을 포함할 수 있다.
상기 냉동은 이에 제한되지는 않으나, -1℃ 이하일 수 있다. 구체적으로, 약 -5℃ 내지 약 -200℃, 약 -15℃ 내지 약 -180℃, 약 -25℃ 내지 약 -160℃, 약 -40℃ 내지 약 -140℃, 약 -55℃ 내지 약 -120℃, 약 -60℃ 내지 약 -100℃ 또는 약 -70℃ 내지 약 -90℃의 온도 범위로 수행될 수 있다.
상기 냉동은 액체 질소(LN2) 또는 냉동 장치를 이용하여 수행될 수 있다. 구체적으로, 냉동(refrigeration) 또는 동결(freezing) 과정에서 LN2를 사용하여 급속 냉동하거나, 초저온냉동고(deep freezer), 냉동고 등 냉동 장치를 이용하여 수행될 수 있다. 상기 냉동은 미토콘드리아를 냉동 또는 동결할 수 있는 방법인 한, 특별히 제한되지 않는다. 상기 미토콘드리아를 냉동 장치를 이용하여 냉동시키는 경우, 냉동 컨테이너(freezing container)를 사용할 수 있다. 상기 냉동 컨테이너는 1분 당 약 1℃씩 온도를 낮추어 세포를 냉동시킬 수 있다. 바람직하게는, 초저온냉동고를 이용하는 경우 상기 냉동 컨테이너를 사용할 수 있다. 또한, 상기 미토콘드리아를 냉동 장치를 이용하여 냉동시키는 경우, 냉동 컨테이너(freezing container)를 사용하지 않을 수 있다.
상기 냉동은 약 24시간 이상, 약 48시간 이상 또는 약 96시간 이상 동안 수행될 수 있으나, 냉동된 미토콘드리아가 정상적인 활성을 갖는 한, 특별히 제한되지 않는다.
상기 동결건조는 이에 제한되지 않으나, 미토콘드리아를 냉동시키는 단계 및 상기 미토콘드리아를 건조하는 단계로 나누어 수행할 수 있다. 이때, 동결건조는 진공 상태에서 수행할 수 있다. 상기 미토콘드리아의 동결건조는 진공상태에서 미토콘드리아를 냉동한 뒤, 점차 온도를 상승시키면서 수행할 수 있다.
미토콘드리아의 동결건조 시, 상기 냉동 단계는 약 -40℃ 이하에서 수행할 수 있다. 구체적으로, 약 -80℃ 내지 약 -40℃, 약 -70℃ 내지 약 -40℃, 약 -60℃ 내지 약 -40℃ 또는 약 -50℃ 내지 약 -40℃에서 수행할 수 있다. 이때, 상기 냉동은 약 5분 내지 약 120분, 약 10분 내지 약 100분, 약 15분 내지 약 80분, 약 20분 내지 약 60분 또는 약 25분 내지 약 40분 동안 수행할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서 상기 동결은 약 -40℃에서 30분 동안 수행하였다.
미토콘드리아 동결건조 시, 상기 건조 단계는 3단계로 나누어 수행할 수 있다. 제1 단계 건조는 약 -30℃ 내지 약 0℃에서 수행할 수 있다. 보다 구체적으로 약 -40℃ 내지 약 0℃, 약 -30℃ 내지 약 -5℃ 또는 약 -20℃ 내지 약 -10℃에서 수행할 수 있다. 이때, 제1 단계 건조는 약 1시간 내지 약 50시간 동안 수행할 수 있다. 구체적으로 약 1시간 내지 약 50시간, 약 5시간 내지 약 50시간, 약 10시간 내지 약 50시간, 약 20시간 내지 약 50시간 또는 약 30시간 내지 약 50시간 동안 수행할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서 상기 제1 단계 건조는 약 -20℃에서 25시간 동안 수행하였고, 미토콘드리아 상태에 따라 약 -20℃에서 8.3시간 동안 추가 수행하였다.
제2 단계 건조는 약 0℃ 내지 약 10℃ 이하에서 수행할 수 있다. 보다 구체적으로, 약 0℃ 내지 약 10℃, 약 2℃ 내지 약 9℃, 약 4℃ 내지 약 8℃ 또는 약 5℃ 내지 약 7℃에서 수행할 수 있다. 이때, 제2 단계 건조는 약 1시간 내지 약 24시간 동안 수행할 수 있다. 구체적으로, 상기 2단계 건조는 약 1시간 내지 약 16시간, 약 2시간 내지 약 16시간, 약 4시간 내지 약 16시간, 약 6시간 내지 약 16시간 또는 약 8시간 내지 약 16시간 동안 수행할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서 상기 제2 단계 건조는 약 6℃에서 8.3시간 동안 수행하였다.
제3 단계 건조는 약 11℃ 내지 약 30℃ 이하에서 수행할 수 있다. 보다 구체적으로, 약 11℃ 내지 약 30℃, 약 15℃ 내지 약 30℃, 약 20℃ 내지 약 30℃ 또는 약 25℃ 내지 약 30℃에서 수행할 수 있다. 이때, 제3 단계 건조는 약 1시간 내지 약 18시간 동안 수행할 수 있다. 구체적으로, 상기 제3 단계 건조는 약 1시간 내지 약 18시간, 약 3시간 내지 약 18시간 또는 약 6시간 내지 약 18시간 또는 약 9시간 내지 약 18시간 동안 수행할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서 상기 제3 단계 건조는 약 25℃에서 9시간 동안 수행하였다.
상기 동결 보호제와 혼합된 미토콘드리아의 농도는 ㎖당 약 0.1 mg 내지 약 10 mg, 약 0.2 mg 내지 약 9 mg, 약 0.3 mg 내지 약 8 mg, 약 0.4 mg 내지 약 7 mg, 약 0.5 mg 내지 약 6 mg, 약 0.6 mg 내지 약 5 mg, 약 0.7 mg 내지 약 4 mg, 약 0.8 mg 내지 약 3 mg 또는 약 0.9 mg 내지 약 2 mg일 수 있다.
또한, 상기 냉동된 미토콘드리아는 동결건조될 수 있다.
동결 보호제 및 동결 조성물
본 발명의 또 다른 측면은 글라이신을 포함하는 미토콘드리아 동결 보호제, 및 상기 동결 보호제 및 미토콘드리아을 포함하는 동결 조성물을 제공한다. 이때, 상기 동결 보호제는 트레할로오스, 트리스 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나를 추가로 포함할 수 있다.
상기 미토콘드리아 및 동결 보호제는 상술한 바와 동일하다.
약학 조성물
본 발명의 또 다른 측면은 상기 동결 및/또는 동결건조된 미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
이때, 약학 조성물의 용도는 미토콘드리아 관련 질환의 예방 또는 치료를 위한 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "미토콘드리아 관련 질환"은 유전적, 환경적 또는 원인 불명의 원인으로 인한 미토콘드리아 기능저하 또는 기능장애가 관련된 질환을 총체적으로 의미한다. 예컨대, 상기 질환에는 레버씨 선천성 시신경병증(Leber's Hereditary Optic Neuropathy; LHON), 레이 증후군(Leigh syndrome), 불균일 적색근육 섬유를 갖는 근간대성 간질(Myoclonic Epilepsy Associated with Ragged-Red Fibers; MERRF), 미토콘드리아 근병증, 뇌병증, 고젖산혈증, 뇌졸중(Mitochondrial Myopathy, Encephalopathy, Lactacidosis, Stroke; MELAS) 등의 유전 질환과 파킨슨, 알츠하이머와 같은 퇴행성질환, 당뇨병, 비만과 같은 대사성 질환, 패혈증, 류마티스 관절염, 골 관절염, 전신성 염증 반응 증후군(SIRS)과 같은 염증성 질환, 난청, 암, 허혈성 질환, 신경 질환, 심장 질환, 근 질환, 퇴행성 질환, 섬유화 질환, 눈 질환, 탈모, 신경계 자가면역 질환 등이 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 암은 이에 제한되지 않으나, 유방암, 폐암, 췌장암, 신경교모종, 위암, 간암, 대장암, 전립선암, 난소암, 자궁경부암, 갑상선암, 후두암, 급성 골수성 백혈병, 뇌종양, 신경모세포종, 망막 모세포종, 두경부암, 침샘암 및 림프종으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 암일 수 있다.
또한, 상기 허혈성 질환은 이에 제한되지는 않으나, 중증하지허혈증, 허혈성 뇌졸중, 허혈성 심장 질환, 허혈성 대장염 등일 수 있다. 이때, 상기 허혈성 질환은 미토콘드리아 이상에 의해 발병하는 질환일 수 있으며, 미토콘드리아 기능 저하로 인해 발생하는 허혈성 세포 장애를 모두 포함한다.
상기 신경 질환은 간질, 약물-내성 간질, 양극성 장애 또는 양극성 장애의 조울증, 두통, 편두통, 불안 장애, 주의력 결핍 장애, 중독성 질환, 인격장애, 자폐, 외상성 뇌 손상, 프리히드라이히 운동실조증 또는 시신경 위축 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 감염성 질환은 이에 제한되지는 않으나, B형 간염, C형 간염, 인간 파필로마 바이러스(human papilloma virus: HPV) 감염, 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus) 감염, 바이러스성 호흡기 질환, 인플루엔자 바이러스 감염 등일 수 있다.
또한, 상기 근 질환은 이에 제한되지는 않으나, MELAS 증후군, MERRF 증후군, Kearns-Sayre 증후군, 근병증, 뇌근육병증, 근무력증, 중증 근무력증, 근위축성 측삭 경화증, 근육퇴행위축, 근위축증, 근긴장저하, 근력약화, 근경직증 등일 수 있다. 이때, 상기 근 질환은 미토콘드리아 기능 저하로 인해 발생하는 근육 세포 장애를 모두 포함할 수 있다.
퇴행성질환은 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 파킨슨병(Parkinson's disease), 루게릭병(amyotrophic lateral sclerosis), 헌팅턴병(Huntington's Disease), 다발성 경화증(Multiple sclerosis), 면역계이상 뇌기능 부전, 진행성 신경퇴행질환, 대사성 뇌질환, 니만-픽병(Niemann-Pick disease), 뇌 허혈 및 뇌출혈로 인한 치매(dementia)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 눈 질환은 녹내장, 당뇨병성 망막병증과 에이지 관련 황반 변성 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 신경계 자가면역 질환은 다발성경화증(multiple sclerosis), 시신경척수염(neuromyelitis optica), 급성 파종성뇌척수염(acute disseminated encephalomyelitis), 상행성 척수염(ascending myelitis), 중심성 척수염(central myelitis), 하행성 척수염(descending myelitis) 횡단성 척수염(transverse myelitis), 중증근무력증(myasthenia gravis), 길랑바레증후군(guillain-barre syndrome), 자가면역성 포도막염(autoimmuneuveitis), 자가면역성뇌증(autoimmune encephalopathy) 및 만성 염증성 탈수초성 다발신경병증(chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy) 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 동결 및/또는 동결건조된 미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물에 있어서, 상기 미토콘드리아는 이에 제한되지는 않으나 약 0.1 내지 약 500 ㎍/㎖, 약 0.2 ㎍/㎖ 내지 약 450 ㎍/㎖ 또는 약 0.5 ㎍/㎖ 내지 약 400 ㎍/㎖의 농도로 포함될 수 있다. 상기 범위로 미토콘드리아를 포함함으로써, 투여 시 미토콘드리아 용량 조절이 용이하고, 환자의 미토콘드리아 관련 질환, 구체적으로 염증성 질환의 증상 개선 정도가 보다 향상될 수 있다. 이때, 미토콘드리아의 용량은 상기 동결된 미토콘드리아를 해동하거나 동결건조된 미토콘드리아를 수복시킨 후, 막 단백질을 정량함으로써, 미토콘드리아를 정량할 수 있다. 구체적으로, 상기 분리된 미토콘드리아를 브래드포드 분석법(bradford protein assay)을 통해 정량할 수 있다[James D. McCully가 저술한 논문(J Vis Exp. 2014;(91): 51682)].
특히, 본 발명에 따른 상기 약학 조성물은 투여할 개체의 체중을 기준으로 1회 약 0.01 ㎎/㎏ 내지 약 5 ㎎/㎏, 약 0.1 ㎎/㎏ 내지 약 4 ㎎/㎏ 또는 약 0.25 ㎎/㎏ 내지 약 2.5 ㎎/㎏ 양의 미토콘드리아를 투여할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 즉, 상기 약학 조성물이 미토콘드리아 관련 질환이 유발된 개체의 체중을 기준으로 상기 범위의 함량으로 미토콘드리아가 투여되는 것이 세포 활성 측면에서 가장 바람직하다.
또한, 상기 약학 조성물은 1회 내지 10회, 3회 내지 8회 또는 5회 내지 6회 투여할 수 있으며, 바람직하게는 5회 투여할 수 있다. 이때, 투여 간격은 1일 내지 7일 또는 2일 내지 5일 간격으로 할 수 있으며, 바람직하게는 3일 간격으로 투여할 수 있다.
본 명세서에서 사용하는 용어, "예방"은 상기 약학적 조성물의 투여에 의해 암 발생을 억제하거나 그의 발병을 지연시키는 모든 행위를 말한다. 또한, "치료"는 상기 약학적 조성물의 투여에 의해 암 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 말한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "효능(efficacy)"은 1년, 5년 또는 10년과 같이 일정 기간에 걸쳐 생존 또는 질병이 없는 상태에서 생존(disease-free survival)과 같은 하나 이상의 파라미터에 의해 결정될 수 있다. 뿐만 아니라, 상기 파라미터는 개체에서 적어도 하나의 종양의 크기가 억제되는 것을 포함할 수 있다.
상기 약학 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 본 발명의 암 예방 또는 치료용 약학 조성물에서 그 유효성분은 항암 활성을 나타낼 수 있는 한, 용도, 제형, 배합 목적 등에 따라 임의의 양(유효량)으로 포함될 수 있다. 여기서 "유효량"이란 항암 효과를 유도할 수 있는 유효성분의 양을 말한다. 이러한 유효량은 당업자의 통상의 능력 범위 내에서 실험적으로 결정될 수 있다.
본 발명의 상기 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 환자에게 전달하기에 적절한 비-독성 물질이면 어떠한 담체라도 가능하다. 증류수, 알코올, 지방, 왁스 및 비활성 고체가 담체로 포함될 수 있다. 약물학적으로 허용되는 애쥬번트(완충제, 분산제) 또한 약학 조성물에 포함될 수 있다.
구체적으로, 상기 약학 조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하여 당업계에 공지된 통상의 방법으로 투여 경로에 따라 비경구용 제형으로 제조될 수 있다. 여기서 "약제학적으로 허용되는" 의미는 유효성분의 활성을 억제하지 않으면서 적용(처방) 대상이 적응 가능한 이상의 독성을 지니지 않는다는 의미이다.
본 발명의 약학 조성물이 비경구용 제형으로 제조될 경우, 적합한 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 주사제, 경피 투여제 및 비강 흡입제의 형태로 제제화될 수 있다. 주사제로 제제화할 경우 적합한 담체로서는 멸균수, 에탄올, 글리세롤이나 프로필렌글리콜 등의 폴리올 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(phosphate buffered saline)나 주사용 멸균수, 5% 덱스트로스 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 주사용 제제일 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 약학 조성물은 주사제 처방의 유통에 따른 제품 안정성을 확보하기 위하여, 주사제로 사용 가능한 산수용액 또는 인산염 등의 완충용액을 사용하여 pH를 조절함으로써, 물리적으로나 화학적으로 매우 안정한 주사제로 제조될 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 약학 조성물은 주사용수를 포함할 수 있다.
상기 주사용수는 고형주사제의 용해나 수용성 주사제를 희석하기 위하여 만들어진 증류수로서, 글루코스 주사, 자일리톨 주사, D-만니톨 주사, 프룩토스 주사, 생리식염수, 덱스트란 40 주사, 덱스트란 70 주사, 아미노산 주사, 링거액, 락트산-링거액 또는 약 pH 3.5 내지 약 7.5 범위의 인산염 완충용액 또는 인산이수소나트륨-구연산 완충용액 등일 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 안정화제 또는 용해보조제를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 안정화제는 피로설파이트(pyrosulfite) 또는 에틸렌 디아민테트라아세트산(ethylene diaminetetraacetic acid)일 수 있고, 용해보조제는 염산, 아세트산, 인산수산화칼륨, 탄산수소칼륨, 탄산칼륨 또는 트리스(tris)일 수 있다. 일 구체예로, 상기 약학 조성물은 TTG(trehalose-tris-glycine) 용액과 같은 혼합 보존용액을 포함할 수 있으며, 약학적으로 허용되는 약품제재에 통상적으로 이용될 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 약학 조성물은 동결 및/또는 동결건조된 미토콘드리아 이외에 주사용 액상 조성물을 포함할 수 있다. 이때, 동결 및/또는 동결건조된 미토콘드리아는 상술한 바와 동일하다. 본 발명의 약학 조성물이 주사용 액상 조성물을 포함함으로써 미토콘드리아 기능 관련 질환의 예방 또는 치료를 위한 조성물로, 주사를 통해 미토콘드리아 투여 시 미토콘드리아의 응집, 혈소판의 감소 및 응집 등에 의해 야기될 수 있는 혈전 생성을 억제할 수 있고, 미토콘드리아의 안정성을 유지 및/또는 강화할 수 있으며, 미토콘드리아의 활성 또한 안정적으로 유지시킬 수 있다.
여기서, 상기 액상 조성물은 글라이신을 포함할 수 있다. 또한, 상기 액상 조성물은 당류 및/또는 버퍼(buffer) 추가로 포함할 수 있다.
상기 글라이신(glycine)은 이에 제한되지는 않으나, 주사용 액상 조성물 중 약 15 mM 이상의 농도로 존재할 수 있고, 구체적으로는 약 15 mM 내지 약 150 mM의 농도, 약 17 mM 내지 약 130 mM의 농도, 약 20 mM 내지 약 120 mM의 농도, 약 22 mM 내지 약 110 mM의 농도 또는 약 25 mM 내지 약 100 mM의 농도로 존재할 수 있다. 또한, 상기 글라이신은 이에 제한되지는 않으나 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신아세테이트, 메티오닌, 페닐알라닌, 트레오닌, 트립토판, 발린, 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴산, 시스테인, 글루타민산, 프롤린, 세린 및 티로신으로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택되는 아미노산과 함께 사용 가능하다.
또한, 상기 주사용 액상 조성물 내 포함되는 상기 당류는 이에 제한되지는 않으나 수크로오스, 트레할로오스, 만니톨, 소르비톨, 글루코오스, 프락토오스, 만노오스, 말토오스, 락토오스, 이소말토오스, 덱스트란 및 덱스트린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것일 수 있다. 특히, 상기 당류는 트레할로오스, 만니톨 또는 수크로오스일 수 있다. 바람직하게, 상기 당류는 트레할로오스일 수 있다.
상기 주사용 액상 조성물 내 포함되는 상기 버퍼는 이에 제한되지는 않으나 트리스(tris) 버퍼, HEPES 버퍼, MOPS 버퍼 및 아세테이트 또는 포스페이트 함유 버퍼로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 바람직하게, 상기 버퍼는 주사가 가능한 트리스(tris) 버퍼일 수 있다.
바람직하게, 상기 액상 조성물은 글라이신, 트레할로오스 및 트리스를 포함할 수 있다.
이때, 상기 버퍼의 pH는 이에 제한되지는 않으나, 약 7.0 내지 약 7.8 범위, 약 7.2 내지 약 7.6 범위 또는 약 7.3 내지 약 7.5 범위일 수 있다.
또한, 상기 버퍼는 이에 제한되지는 않으나, 주사용 액상 조성물 중 약 5 mM 내지 약 50 mM의 농도, 약 8 mM 내지 약 40 mM의 농도, 약 10 mM 내지 약 35 mM의 농도, 약 13 mM 내지 약 30 mM의 농도 또는 약 15 mM 내지 약 25 mM의 농도로 존재할 수 있다.
상기 주사용 액상 조성물은 약 200 내지 약 400 mOsm, 약 230 내지 약 380 mOsm, 약 250 내지 약 350 mOsm, 약 260 내지 약 320 mOsm, 약 270 내지 약 330 mOsm 또는 약 280 내지 약 300 mOsm 범위의 오스몰농도(osmolarity)를 갖는 것일 수 있다. 이때, 상기 범위의 오스몰농도는 2℃ 내지 8℃ 또는 그 이상의 온도에서의 장시간 보관을 촉진하는 한편, 조성물을 비경구용 투여, 예컨대, 혈관내, 근육내 또는 피하 주사를 통해 개체에 부작용 유발없이 투여가 적합하도록 한 것이다.
본 명세서에서 사용된 용어 "오스몰농도(osmolarity)"는 용매의 킬로그램 당 용액의 삼투압에 기여하는 용질의 몰을 지칭하는 것으로, 오스몰농도는 삼투압계(osmometer)를 사용하여 샘플의 빙점강하(freezing point depression)를 측정함으로써 결정된다.
또한, 상기 주사용 액상 조성물은 킬레이트제를 더 포함할 수 있다.
상기 킬레이트제는 이에 제한되지는 않으나, 주사가능한 등급의 EGTA, EDTA 및 BAPTA로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택되는 것일 수 있다. 상기 킬레이트제는 상기 주사용 액상 조성물에 포함되는 미토콘드리아 수득 후 이온 유출에 의한 손상을 제거할 수 있다.
또한, 상기 약학 조성물은 첨가제로, 미토콘드리아의 기능 유지 및 활성에 유효한 항산화제, ATP, 마그네슘 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 바이알, 카트리지, 주사기 및 자동주사기(autoinjector)로 이루어진 군으로부터 선택된 용기에 보관될 수 있다. 또한, 상기 약학 조성물이 보관된 용기는 치료가 필요한 개체에게 투여될 때까지 실온, 약 2℃ 내지 약 8℃ 냉장온도 또는 약 25℃ 내지 약 40℃로 저장될 수 있다.
상기 개체는 이에 제한되지는 않으나, 사람, 개, 소, 말, 돼지, 양, 염소, 고양이, 마우스, 토끼, 래트(rat)와 같은 포유동물일 수 있으며, 바람직하게는 인간일 수 있다.
한편, 본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 상기 용어 "치료학적으로 유효한 양" 또는 "약학적으로 유효한 양"이란 대상 질환을 예방 또는 치료하는데 유효한 화합물 또는 조성물의 양으로서, 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미한다. 상기 유효량의 수준은 환자의 건강상태, 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 일 구체예에서 치료학적으로 유효한 양은 질환을 치료하는데 효과적인 약물의 양을 의미한다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "투여"란, 적절한 방법으로 개체에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 상기 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 국소 투여, 비내 투여, 직장내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 약학 조성물의 바람직한 투여량은 투여할 개체의 체중을 기준으로 1회 약 0.01 ㎎/㎏ 내지 약 5 ㎎/㎏, 약 0.1 ㎎/㎏ 내지 약 4 ㎎/㎏ 또는 약 0.25 ㎎/㎏ 내지 약 2.5 ㎎/㎏ 양의 미토콘드리아를 투여할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 즉, 상기 약학 조성물이 질환을 앓고 있는 개체의 체중을 기준으로 상기 범위의 함량으로 동결 및/또는 동결건조된 미토콘드리아가 투여되는 것이 세포 활성 측면에서 가장 바람직하다. 또한, 상기 약학 조성물은 1 내지 10회, 3 내지 8회 또는 5 내지 6회 투여할 수 있으며, 바람직하게는 5회 투여할 수 있다. 이때, 투여 간격은 1 내지 7일 또는 2 내지 5일 간격으로 할 수 있으며, 바람직하게는 3일 간격으로 투여할 수 있다. 이러한 투여량은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 아니 된다.
이때, 상기 약학 조성물은 이에 제한되지는 않으나, 약 5 ㎖ 이하, 약 3 ㎖ 이하 또는 약 2 ㎖ 이하의 부피로 18G 내지 32G 바늘을 사용하여 비경구 투여될 수 있다.
상기 용어 "개체"란 본 발명의 조성물이 적용(처방)될 수 있는 대상을 의미하며, 질환을 앓고 있는 개체일 수 있다. 또한 상기 개체는 인간을 포함한 쥐, 생쥐, 가축 등의 포유동물일 수 있으나, 바람직하게는 인간일 수 있다. 본 발명의 조성물은 상기 동결 및/또는 동결건조된 미토콘드리아 이외에, 안전성이 검증되고 각 질환에 대한 예방 또는 치료효과를 갖는 것으로 공지된 임의의 화합물이나 천연 추출물을 추가로 포함할 수 있다. 이때, 상기 약학 조성물 및 상기 활성을 갖는 화합물 또는 천연 추출물은 동시 또는 순차적으로 투여할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제조하기 위한 상기 동결 및/또는 동결건조된 미토콘드리아의 용도를 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 약학 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공할 수 있다. 여기서 개체는 포유동물일 수 있으며, 바람직하게는 인간일 수 있다. 동결된 미토콘드리아, 동결건조된 미토콘드리아, 예방 및 치료는 상술한 바와 동일하다.
상기 질환은 미토콘드리아 관련 질환으로, 구체적 질환은 상술한 바와 동일하다. 이때, 투여는 주사제를 통해 환부나 피하주사, 정맥 주사를 통해 투여될 수 있다. 이를 통해, 본 발명에 따른 약학 조성물은 질환이 발생한 환부에 직접적으로 정상적인 활성을 미토콘드리아를 공급할 수 있어, 미토콘드리아 기능이 저하된 세포의 활성을 증가시키거나 미토콘드리아 기능 이상 세포 재생에 유용하며, 미토콘리아 관련 질환의 예방 또는 치료에 이용될 수 있다.
장기 보존액 조성물 키트
본 발명의 또 다른 측면은 동결 및/또는 동결건조된 미토콘드리아 및 장기 보존액을 포함하는 분리된 세포, 조직 또는 장기(organ)의 보존을 위한 장기 보존액 조성물 키트를 제공한다. 상기 동결 및 동결건조된 미토콘드리아는 상술한 바와 동일하다.
상기 장기 보존액은 히스티딘, 트립토판 및 케토글루타레이트로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다. 상기 케토글루타레이트는 알파-케토글루타레이트(alpha-ketoglutrate)일 수 있다.
상기 키트의 동결 및/또는 동결건조된 미토콘드리아는 사용하기 전에 히스티딘, 트립토판 및 케토글루타레이트로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 장기 보존액과 혼합하여 사용할 수 있다.
상기 키트의 동결 및/또는 동결건조된 미토콘드리아를 보존액에 혼합하여 사용시, 동결 및/또는 동결건조된 미토콘드리아의 농도는 약 0.01 ㎍/㎖ 내지 약 1 mg/㎖, 약 0.01 ㎍/㎖ 내지 약 100 ㎍/㎖, 약 0.01 ㎍/㎖ 내지 약 90 ㎍/㎖, 약 0.01 ㎍/㎖ 내지 약 80 ㎍/㎖, 약 0.01 ㎍/㎖ 내지 약 70 ㎍/㎖, 약 0.01 ㎍/㎖ 내지 약 60 ㎍/㎖, 약 0.01 ㎍/㎖ 내지 약 50 ㎍/㎖, 약 0.01 ㎍/㎖ 내지 약 40 ㎍/㎖, 약 0.01 ㎍/㎖ 내지 약 30 ㎍/㎖, 약 0.01 ㎍/㎖ 내지 약 20 ㎍/㎖, 약 0.01 ㎍/㎖ 내지 약 10 ㎍/㎖, 약 0.01 ㎍/㎖ 내지 약 9 ㎍/㎖, 약 0.01 ㎍/㎖ 내지 약 8 ㎍/㎖, 약 0.01 ㎍/㎖ 내지 약 7 ㎍/㎖, 약 0.01 ㎍/㎖ 내지 약 6 ㎍/㎖, 약 0.01 ㎍/㎖ 내지 약 5 ㎍/㎖, 약 0.1 ㎍/㎖ 내지 약 10 ㎍/㎖, 약 0.5 ㎍/㎖ 내지 약 10 ㎍/㎖, 약 1 ㎍/㎖ 내지 약 10 ㎍/㎖, 약 2.5 ㎍/㎖ 내지 약 10 ㎍/㎖ 또는 약 5 ㎍/㎖ 내지 약 10 ㎍/㎖일 수 있다.
상기 장기 보존액 중 히스티딘의 농도는 약 1 mM 내지 약 500 mM, 약 5 mM 내지 약 500 mM, 약 10 mM 내지 약 500 mM, 약 25 mM 내지 약 500 mM, 약 50 mM 내지 약 500 mM, 약 75 mM 내지 약 500 mM, 약 100 mM 내지 약 500 mM, 약 125 mM 내지 약 500 mM, 약 150 mM 내지 약 500 mM, 약 175 mM 내지 약 500 mM, 약 198 mM 내지 약 500 mM, 약 100 mM 내지 약 400 mM, 약 100 mM 내지 약 300 mM, 약 100 mM 내지 약 200 mM 또는 약 100 mM 내지 약 198 mM일 수 있다.
상기 장기 보존액 중 트립토판의 농도는 약 1 μM 내지 약 100 mM, 약 1 μM 내지 약 90 mM, 약 1 μM 내지 약 80 mM, 약 1 μM 내지 약 70 mM, 약 1 μM 내지 약 60 mM, 약 1 μM 내지 약 50 mM, 약 1 μM 내지 약 40 mM, 약 1 μM 내지 약 30 mM, 약 1 μM 내지 약 20 mM, 약 1 μM 내지 약 10 mM, 약 1 μM 내지 약 5 mM, 약 10 μM 내지 약 10 mM, 약 100 μM 내지 약 10 mM, 약 0.5 mM 내지 약 10 mM, 약 1 mM 내지 약 10 mM, 약 1.5 mM 내지 약 10 mM 또는 약 2 mM 내지 약 10 mM일 수 있다.
상기 장기 보존액 중 케토글루타레이트의 농도는 약 1 μM 내지 약 100 mM, 약 1 μM 내지 약 90 mM, 약 1 μM 내지 약 80 mM, 약 1 μM 내지 약 70 mM, 약 1 μM 내지 약 60 mM, 약 1 μM 내지 약 50 mM, 약 1 μM 내지 약 40 mM, 약 1 μM 내지 약 30 mM, 약 1 μM 내지 약 20 mM, 약 1 μM 내지 약 10 mM, 약 1 μM 내지 약 5 mM, 약 10 μM 내지 약 10 mM, 약 100 μM 내지 약 10 mM, 약 250 μM 내지 약 10 mM, 약 500 μM 내지 약 10 mM, 약 750 μM 내지 약 10 mM, 약 1 mM 내지 약 10 mM, 약 1 mM 내지 약 5 mM 또는 약 1 mM 내지 약 2 mM일 수 있다.
상기 세포, 조직 또는 장기는 포유동물로부터 유래된 것일 수 있다. 상기 포유동물은 사람, 소, 말, 돼지, 개, 양, 염소 또는 고양이일 수 있다.
상기 세포, 조직 또는 장기는 생체 이식을 위한 것일 수 있다.
상기 세포는 근육세포, 간세포, 섬유아세포, 상피세포, 신경세포, 지방세포, 골세포, 백혈구, 림프구, 줄기세포 또는 점막세포일 수 있다.
상기 조직은 피부, 근육, 각막, 연골 및 뼈로부터 선택된 것일 수 있다.
상기 장기는 심장, 간, 신장, 소장, 위, 췌장, 폐, 쓸개, 신경, 피부, 혈관, 치아, 안구 및 각막으로부터 선택된 것일 수 있다.
상기 장기 보존액 조성물 키트는 관류(perfusion) 또는 재관류(re-perfusion)을 위한 것일 수 있다. 상기 관류(perfusion)은 분리된 세포, 조직 또는 장기에 관류액을 주입하거나 계속 흘려보내 원형질을 인공액으로 치환하는 것일 수 있다. 상기 재관류(re-perfusion)는 분리된 세포, 조직 또는 장기에 혈액 공급이 일시적으로 중단되었다가 다시 혈액의 흐름을 복구하는 것일 수 있다.
상기 장기 보존액 조성물 키트는 비경구 투여용일 수 있다. 상기 조성물은 액제일 수 있다. 또한, 상기 조성물은 하나 이상의 첨가제(additives)를 포함할 수 있다. 상기 첨가제는 부형제(excipients), 희석제(diluents), 부착방지제(anti-adherents), 보존제(preservatives), 담체(vehicles), 계면활성제 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 또한, 상기 조성물은 염류, 예를 들어 MgCl2, CaCl2, NaCl, KCl 또는 이들의 조합을 더 포함할 수 있다.
상기 장기 보존액 조성물은 분리된 세포, 조직 또는 장기의 장기보존 효율을 높일 수 있는 첨가제를 포함할 수 있다. 상기 첨가제는 물, 당류(예, 수크로스, 라피노스(raffinose), 전분), pH 완충물질(예, 인산나트륨, 인산칼륨), ATP, 완충제, 알부민 또는 항산화물질(예, 비타민 E)일 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 장기 보존액 조성물 키트를 제조하기 위한 상기 동결 및/또는 동결건조된 미토콘드리아의 용도를 제공한다. 또한, 본 발명의 또 다른 측면은 분리된 세포, 조직 또는 장기를 상기 동결 및/또는 동결건조된 미토콘드리아가 포함된 장기 보존액 조성물의 존재 하에서 보관하는 단계를 포함하는, 분리된 세포, 조직 또는 장기를 보관하는 방법을 제공한다.
상기 미토콘드리아, 동결 및/또는 동결건조된 미토콘드리아, 세포, 조직, 장기, 장기 보존액 조성물 및 보관은 상술한 바와 동일하다.
상기 보관은 냉장 상태에서 수행되는 것일 수 있다. 상기 냉장 상태는 약 -4℃ 내지 약 25℃, 약 -4℃ 내지 약 20℃, 약 -4℃ 내지 약 15℃, 약 -4℃ 내지 약 10℃, 약 -2℃ 내지 약 10℃, 약 -2℃ 내지 약 8℃, 약 0℃ 내지 약 15℃, 약 0℃ 내지 약 10℃, 약 0℃ 내지 약 8℃, 약 0℃ 내지 약 6℃, 약 0℃ 내지 약 5℃, 약 0℃ 내지 약 4℃, 약 0℃ 내지 약 3℃ 또는 약 2℃ 내지 약 5℃일 수 있다.
상기 보관은 약 0시간 내지 약 2일, 약 0시간 내지 약 42시간, 약 0시간 내지 약 36시간, 약 0시간 내지 약 30시간, 약 0시간 내지 약 24시간, 약 0시간 내지 약 18시간, 약 0시간 내지 약 12시간, 약 0시간 내지 약 9시간, 약 0시간 내지 약 6시간 또는 약 0시간 내지 약 3시간 동안 수행될 수 있다.
이때, 동결된 미토콘드리아를 사용할 경우, 상기 방법은 미토콘드리아를 분리하는 단계; 및 분리한 미토콘드리아를 동결 보호제와 혼합하여 냉동하는 단계를 더 포함할 수 있다. 또한, 동결건조된 미토콘드리아를 사용할 경우, 상기 방법은 미토콘드리아를 분리하는 단계; 및 분리한 미토콘드리아를 동결 보호제와 혼합하여 냉동하는 단계; 및 냉동된 미토콘드리아를 동결건조하는 방법을 더 포함할 수 있다. 상기 미토콘드리아를 분리하는 방법, 분리된 미토콘드리아를 냉동하는 방법 및 냉동된 미토콘드리아를 동결건조하는 방법 및 동결 보호제는 상술한 바와 동일하다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
준비예 1. 미토콘드리아 준비
농축된 혈소판, 탯줄 유래 중간엽 줄기세포 또는 HEK293 세포를 물리적으로 파쇄한 후, 분별원심분리법을 이용하여 침전된 미토콘드리아를 수득하였다.
실시예 1. 미토콘드리아 동결 및 동결건조
수득한 미토콘드리아를 1 mg/㎖의 농도로 TTG 혼합 보존용액(0.195 M 트레할로오스, 20 mM 트리스, 65 mM 글라이신)으로 재현탁 하였다. 이후, LN2를 이용하여 급속 냉동하거나, -80℃에서 냉동하였다. 미토콘드리아를 -80℃에서 냉동할 시, 냉동 컨테이너(freezing container, FC)를 사용 또는 사용하지 않는 조건으로 동결하였다. 동결 건조의 경우, 동결 건조기를 이용하여 진공상태에서 순차적으로 온도를 -40℃, -20℃, 6℃ 및 25℃로 변경하여 수행하였다. 구체적으로 -40℃에서 30분 동안 동결과정을 수행한 뒤, -20℃에서 25시간 동안 반응시켰다. 미토콘드리아의 상태를 확인하면서 -20℃에서 추가적으로 8.3시간 반응시켰다. 그 다음으로 각각 6℃에서 8.3시간 및 25℃에서 9시간 동안 반응을 수행하여 최종적으로 동결건조된 미토콘드리아를 수득하였다.
실시예 2. 동결된 미토콘드리아의 항염증 효능 확인
1% FBS(fetal bovine serum)가 포함된 RPMI 1640 배지로 4×105개의 THP-1 인간 단핵구 세포를 배양하였다. 배양 16시간 내지 24시간 뒤, 24시간 내지 96시간 동안 동결한 혈소판 유래 미토콘드리아(40 ㎍)를 THP-1 세포에 처리하였다.
처리 1시간 후, 2 ㎍/㎖ 농도의 LPS(lipopolysaccharide)를 처리하여 염증 세포 모델을 구축하였다. LPS를 처리하고 4시간 뒤, 상기 THP-1 세포의 배지를 채취하여 20,000xg에서 10분간 원심분리 하여 상층액 내 염증성 사이토카인인 TNF-α의 농도를 ELISA로 측정하였다(도 1). 또한, 동일 방법으로 줄기세포 유래 미토콘드리아 및 혈소판 유래 미토콘드리아(3명의 혈액으로부터 각각 분리하였음)의 항염증 효능도 확인하였다. 이때, 미토콘드리아는 40 ㎍의 농도로 처리하였다.
그 결과, 도 1 및 도 2에 나타난 바와 같이, 부형제(컨트롤)만 처리한 경우에 비해 동결한 혈소판 유래 미토콘드리아 또는 줄기세포 유래 미토콘드리아의 항염증 효과를 확인할 수 있었다.
실시예 3. 동결건조된 미토콘드리아의 수복
동결건조된 미토콘드리아는 상온 및 냉장에서 보관하고 사용하기 직전, 초순수 증류수를 첨가하여 동결건조전의 부피로 수복하여 사용하였다.
동결건조 전의 미토콘드리아의 단백질 농도와 수복 후 미토콘드리아의 단백질 농도는 BCA(bicinchoninic acid) 방법으로 측정하였다(도 3).
실시예 4. 동결건조된 미토콘드리아의 세포 내 이동 확인
적색 형광 단백질이 미토콘드리아에 표지된 세포(HEK293-MTdsRED)로부터 미토콘드리아를 수득하여 실시예 3의 방법으로 동결건조 후 수복하였다. 상기 수복된 미토콘드리아를 배양 중인 HEK293-MTS-GFP 세포(녹색형광 표지 단백질이 미토콘드리아에 표지됨)에 10 ㎍의 농도로 1일간 처리한 뒤, 공초점 현미경으로 세포를 관찰하였다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 동결건조 후 수복된 미토콘드리아는 이식한 세포 내부로 이동하였다.
실시예 5. 동결 및 동결건조된 미토콘드리아의 에너지 합성 관련 효소 활성 확인
동결 또는 동결건조에 따른 미토콘드리아 활성 변화를 확인하기 위하여, 동결건조 또는 동결건조하지 않은 혈소판 유래 미토콘드리아를 BCA 방법을 이용하여 단백질 농도를 측정하고, 동일 단백질량 당 에너지 합성 관련 효소의 활성을 비교하였다.
구체적으로, 미토콘드리아 내막에 존재하는 산화적 인산화 복합체 complex Ⅰ및 Ⅲ의 활성은 산화된 cytochrome c(Sigma aldrich, cat no. C2037)가 환원됨에 따라 변화하는 흡광도의 세기를 550 nm 파장에서 20분 동안 1분 간격으로 측정하여 평가하였다. 또한, complex Ⅳ의 활성은 cytochrome c를 sodium hydrosulfite(Sigma aldrich, cat no. 157953)를 이용하여 환원시킨 후, 산화됨에 따라 변화하는 흡광도의 세기를 550 nm 파장에서 20분 동안 1분 간격으로 측정하여 평가하였다. ATP 합성능은 ADP를 첨가한 후 CellTiter-Glo luminescence kit(Promega)를 이용하여 발광도를 20분간 1분 간격으로 측정하였다. 미토콘드리아의 시트르산 합성효소 활성능은 Acetyl-CoA(Sigma aldrich, cat no. A2181) 및 Oxaloacetic acid(Sigma aldrich, cat no. O4126)가 미토콘드리아 내 시트르산 합성효소를 통해 조효소 A(CoA-SH)로 전환되고, 상기 조효소 A가 DTNB(5,5'-Dithiobis(2-nitrobenzoic acid), Sigma aldrich, cat no. D218200)와 반응하여 450 nm 파장에서 발색이 되는 원리를 이용하여 20분 동안 1분 간격으로 측정하였다(도 5).
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 동결 또는 동결건조 이후에도 상기 미토콘드리아에 존재하는 효소들의 활성이 유지되는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 6. 동결건조된 미토콘드리아의 항염증 효능 확인
1% FBS(fetal bovine serum)가 포함된 RPMI 1640 배지로 4×105개의 THP-1 인간 단핵구 세포를 배양하였다. 배양 16시간 내지 24시간 뒤, 동결건조되지 않은 미토콘드리아 또는 혈소판 또는 탯줄 유래 중간엽 줄기세포에서 분리하여 상기 실시예 3의 방법으로 준비한 동결건조된 미토콘드리아(40 ㎍)를 THP-1 세포에 처리하였다.
처리 1시간 후, 2 ㎍/㎖ 농도의 LPS를 처리하여 세포 내 염증 반응을 유도하였다. LPS를 처리하고 4시간 뒤, 상기 THP-1 세포의 배지를 채취하여 20,000xg에서 10분간 원심분리하여 상층액 내 염증성 사이토카인인 TNF-α의 농도를 ELISA로 측정하였다. 또한, 동일 방법으로 동결건조 또는 동결건조하지 않은 미토콘드리아의 농도별 항염증 효능도 확인하였다.
그 결과, 도 6 및 도 7에 나타난 바와 같이, 부형제(컨트롤)만 처리한 경우에 비해 동결건조하지 않은 미토콘드리아 또는 동결건조 미토콘드리아 처리군에서 미토콘드리아 농도 의존적으로 항염증 효과를 확인할 수 있었다.
실시예 7. 동결건조된 미토콘드리아의 심장 기능 보호 효과 측정
실시예 7.1. 심장 적출 및 안정화
심장의 기능을 확인하기 위하여, 먼저 래트에서 심장을 적출하여 안정화시켰다.
구체적으로, Sprague-Dawley 래트(SD, 12주령, 수컷)를 케타민으로 마취한 뒤 희생시켰다. 래트의 심장을 적출하고, 적출된 심장은 대동맥-카테터를 통해 랑겐도르프(langendorff)에 설치하였다. 그 뒤, 적출한 심장을 크렙스-헨셀라이트(Krebs-Henseleit) 용액으로 약 20분간 관류시켜 세척하였다. 심장의 대동맥을 통해 냉장 보관된 히스티딘-트립토판-케토글루타레이트(histidine-tryptophan-ketoglutarate: HTK) 용액을 주사하고 약 10분간 관류하여 심장을 안정화시켰다. 이때, 상기 HTK 용액은 198 mM 히스티딘, 2 mM 트립토판, 1 mM 케토글루타레이트, 30 mM 만니톨, 4 mM MgCl2, 15 μM CaCl2, 15 mM NaCl 및 9 mM KCl을 포함하였다.
실시예 7.2. 적출된 심장에서 미토콘드리아-함유 용액에 의한 관류액의 유지
동결건조된 미토콘드리아 또는 미토콘드리아를 HTK 용액에 첨가하여 5 ㎍/㎖의 동결건조 미토콘드리아-HTK 및 미토콘드리아-HTK 용액을 준비하였다.
실시예 7.1에서 준비된 안정화된 심장에 5 ㎍/㎖의 미토콘드리아-HTK 용액(MT), 5 ㎍/㎖의 동결건조된 미토콘드리아-HTK 용액(lyophilized MT) 또는 미토콘드리아 불포함-HTK 용액(컨트롤)을 약 2분 동안 주입하였다. 그 후, 심장을 각각 150 ㎍/30 ㎖의 미토콘드리아-HTK 용액(MT), 동결건조 미토콘드리아-HTK 용액(lyophilized MT) 또는 미토콘드리아-불포함 HTK 용액에 담그고, 약 4℃에서 보관하였다. 9시간 경과 후, 보관된 심장을 대동맥-카테터를 통해 랑겐도르프에 설치하고, 크렙스-헨셀라이트 용액의 흘려주었다. 심장을 통해 흘러나오는 관류액의 양을 측정하였다(도 8).
그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, HTK 용액(컨트롤)에서만 보관한 경우에 비해 미토콘드리아-HTK 용액에 보관한 경우 심장의 관류액이 약 1.97배, 동결건조 미토콘드리아-HTK 용액에서 약 1.48배 증가하였다.
실시예 8. 동결 보존 시 혼합 보존용액에 따른 미토콘드리아의 손상 감소 효과 확인
실시예 8.1. 혼합 보존용액에 따른 동결 및 해동 작용에 대한 미토콘드리아 보호 효과 비교
탯줄 유래 중간엽 줄기세포에서 분리된 미토콘드리아를 각각 SHE(250 mM sucrose, 20 mM HEPES, 2 mM EGTA) 혼합 보존용액, TTG(20 mM tris, 195 mM trehalose, 66.6 mM glycine) 혼합 보존용액 또는 TT(20 mM tris, 195 mM trehalose) 혼합 보존용액에 혼합하여 동결한 뒤, 해동하여 12,000g에서 10분간 원심분리 하였다. 원심분리 후 상층액을 수득하여 미토콘드리아 손상 유발시 유출되는 사이토크롬 C(cytochrome C)의 양을 웨스턴 블롯을 이용하여 확인하였다. 대조군은 초음파로 파쇄된 미토콘드리아도 상기와 동일한 조건으로 원심분리하고 상층액을 수득하여 사용하였다.
그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, 미토콘드리아를 TTG 혼합 보존용액에 혼합하여 동결한 미토콘드리아를 해동시킨 상층액에 비하여 SHE 또는 TT 혼합 보존용액에 혼합하여 동결한 미토콘드리아의 상층액에서 사이토크롬 C의 유출이 증가한 것을 확인할 수 있었다. 상기 결과를 통해, TTG 혼합 보존용액이 동결 및 해동 과정에서의 미토콘드리아 손상으로부터 보다 안정적으로 미토콘드리아를 보호할 수 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 8.2. 혼합 보존용액에 따른 동결 후 해동된 미토콘드리아의 활성 비교
동결 및 해동 과정에서 발생하는 스트레스에 대한 TTG 혼합 보존용액의 미토콘드리아 보호 효과를 확인하기 위하여, 탯줄 유래 중간엽 줄기세포에서 분리된 미토콘드리아를 각각 SHE 혼합 보존용액 단독, TTG 혼합 보존용액 단독, TT 혼합 보존용액 단독, DMSO를 포함하는 TTG 혼합 보존용액(TTG+DMSO) 또는 DMSO를 포함하는 TT 혼합 보존액(TT+DMSO)과 혼합하여 동결한 뒤, 해동하여 미토콘드리아의 활성을 비교하였다. 이때, DMSO는 통상적으로 사용되는 동결 보존액으로서 10%의 농도로 사용하였다. 미토콘드리아 활성은 미토콘드리아 특이적 효소인 시트르산 합성효소(citrate synthase) 및 ATP 합성효소(ATP synthase)의 활성을 실시예 5와 동일한 방법으로 확인하여TEk.
그 결과, 도 10에 나타낸 바와 같이, TTG 혼합 보존용액에 혼합되어 동결된 미토콘드리아가 SHE 혼합 보존용액에 혼합되어 동결된 미토콘드리아에 비하여 높은 시트르산 합성효소 및 ATP 합성효소의 활성을 나타내었다.
실시예 8.3. 혼합 보존용액에 따른 동결 후 해동된 미토콘드리아의 항염증 효능 비교
탯줄 유래 중간엽 줄기세포에서 분리된 미토콘드리아를 각각 SHE 혼합 보존용액, TTG 혼합 보존용액 단독, TT 혼합 보존용액 단독, DMSO를 포함하는 TTG 혼합 보존용액(TTG+DMSO) 또는 DMSO를 포함하는 TT 혼합 보존액(TT+DMSO)과 혼합하여 동결한 뒤, 해동하여 미토콘드리아의 항염증 효능을 확인하였다. 이때, 미토콘드리아의 항염증 효능은 실시예 2와 동일한 방법으로 확인하였다.
그 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이, TTG 혼합 보존용액에 혼합되어 동결된 미토콘드리아가 SHE 혼합 보존용액, TT 혼합 보존용액, TT+DMSO 혼합 보존용액에 혼합되어 동결된 미토콘드리아에 비하여 높은 항염증 효능을 나타내었다. 상기 결과는 TTG 혼합 보존용액과 혼합하여 동결된 미토콘드리아의 활성이 다른 보존 용액과 혼합되어 동결된 미토콘드리아의 활성보다 우수함을 나타낸 결과로서, TTG 혼합 보존용액이 동결 및 해동 과정에서의 발생하는 미토콘드리아의 손상으로부터 보다 안정적으로 미토콘드리아를 보호할 수 있음을 시사하는 결과이다.
실시예 8.4. 혼합 보존용액에 따른 동결 후 해동된 미토콘드리아의 혈소판 응집 억제 효과 비교
탯줄 유래 중간엽 줄기세포에서 분리된 미토콘드리아를 SHE 혼합 보존용액 또는 TTG 혼합 보존용액에 혼합하여 동결한 뒤, 해동하여 미토콘드리아의 혈소판 응집에 대한 억제효과를 비교하였다.
구체적으로, 동결 후 해동된 미토콘드리아를 0.1 μM의 MitoTracker Orange로 10분간 염색하고 미토콘드리아 분리용 용액으로 2회 세척하였다. 상기 미토콘드리아(5 ㎍)를 1 μM의 Mitotracker Green으로 염색된 혈소판(1×107)과 혼합하여 하루 동안 진탕배양 하였다. 상기 진탕배양된 용액(5 ㎕)을 슬라이드 글라스에 도포한 뒤, 공초점 레이저 주사 현미경을 사용하여 관찰하였다.
그 결과, 도 12에 나타낸 바와 같이, TTG 혼합 보존용액에 혼합되어 동결된 미토콘드리아의 경우에는 혈소판의 응집을 유발하지 않았다. 반면, SHE 혼합 보존용액에 혼합되어 동결된 미토콘드리아의 경우, 혈소판 응집이 유발되었다.
실시예 9. TTG 혼합 보존용액과 혼합하여 동결 및 해동된 미토콘드리아 동의 손상 확인
탯줄 유래 중간엽 줄기세포에서 분리된 미토콘드리아를 TTG 혼합 보존용액에 혼합하여 동결한 뒤, 한달 뒤 해동하여 미토콘드리아의 손상을 확인하였다.
구체적으로, 미토콘드리아의 총 단백량, ATP 합성율, Mitotracker 염색 비율, 외막내 특이 단백질인 Tom20의 발현 비율을 측정한 뒤, 동일 미토콘드리아를 TTG 혼합 보존용액과 혼합하여 동결하였다. 동결 후 한달 뒤, 상기 미토콘드리아를 해동하여 상기 항목을 다시 측정하였다. 이때, 미토콘드리아의 총 단백량은 BCA assay kit을 이용하여 측정하였고, ATP 합성율은 실시예 5의 방법으로 측정하였다. Mitotacker 염색 비율 및 Tom20 발현율은 0.5 μM의 Mitotracker green 또는 Mitotracker Orange로 염색하거나, 형광단백질이 부착된 Tom20 항체(Santacruz, sc-17764-FITC)로 염색한 뒤에 유세포 분석기를 이용하여 분석하였다.
그 결과, 도 13과 같이 TTG 혼합 보존용액에서 동결 보관 시, 미토콘드리아의 총 단백량, ATP 합성율, Mitotracker 염색 비율 및 Tom20의 발현율에 있어서 미토콘드리아 동결 전 및 후에 큰 변화가 없음을 확인할 수 있었다.

Claims (22)

  1. 동결 및/또는 동결건조된 미토콘드리아.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 동결건조된 미토콘드리아는 37℃ 이하에서 보관하는 것인, 동결 및/또는 동결건조된 미토콘드리아.
  3. 분리된 미토콘드리아를 안정적으로 동결시키는 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 미토콘드리아를 동결시키는 방법은
    미토콘드리아를 분리하는 단계; 및
    분리된 미토콘드리아를 글라이신을 포함하는 미토콘드리아의 동결 보호제를 처리하여 냉동시키는 단계를 포함하는, 미토콘드리아를 동결시키는 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 동결 보호제는 트레할로오스, 트리스 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나를 추가로 포함하는 것인, 미토콘드리아를 동결시키는 방법.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 냉동은 -1℃ 이하의 온도에서 수행되는 것인, 미토콘드리아를 동결시키는 방법.
  7. 제4항에 있어서,
    상기 미토콘드리아는 혈소판, 근육세포, 간세포, 섬유아세포, 상피세포, 신경세포, 지방세포, 골세포, 백혈구, 림프구, 줄기세포 또는 점막세포로부터 수득되는 것인, 미토콘드리아를 동결시키는 방법.
  8. 분리된 미토콘드리아를 안정적으로 동결건조 시키는 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 미토콘드리아를 동결건조 시키는 방법은
    미토콘드리아를 분리하는 단계;
    분리된 미토콘드리아를 글라이신을 포함하는 미토콘드리아의 동결 보호제를 처리하여 냉동시키는 단계; 및
    냉동된 미토콘드리아를 동결건조 시키는 단계를 포함하는, 미토콘드리아를 동결건조 시키는 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 동결 보호제는 트레할로오스, 트리스 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나를 추가로 포함하는 것인, 미토콘드리아를 동결건조 시키는 방법.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 냉동은 -1℃ 이하의 온도에서 수행되는 것인, 미토콘드리아를 동결건조 시키는 방법.
  12. 제9항에 있어서,
    상기 미토콘드리아는 혈소판, 근육세포, 간세포, 섬유아세포, 상피세포, 신경세포, 지방세포, 골세포, 백혈구, 림프구, 줄기세포 또는 점막세포로부터 수득되는 것인, 미토콘드리아를 동결건조 시키는 방법.
  13. 글라이신을 포함하는 미토콘드리아 동결 보호제.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 미토콘드리아 동결 보호제는 트레할로오스, 트리스 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나를 추가로 포함하는 것인, 미토콘드리아 동결 보호제.
  15. 글라이신을 포함하는 미토콘드리아 동결 보호제; 및 미토콘드리아를 포함하는 미토콘드리아 동결 조성물.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 동결 보호제는 트레할로오스, 트리스 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나를 추가로 포함하는 것인, 미토콘드리아 동결 조성물.
  17. 동결 및/또는 동결건조된 미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 질환은 미토콘드리아 관련 질환들로 만성 염증성 질환, 급성 염증성 질환, 허혈성 질환, 신경 질환, 심장 질환, 근 질환, 퇴행성 질환, 대사 질환, 섬유화 질환, 관절 질환, 눈 질환, 탈모, 암, 난청, 면역 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  19. 동결 및/또는 동결건조된 미토콘드리아 및 장기 보존액을 포함하는 분리된 세포, 조직 또는 장기의 보존을 위한 장기 보존액 조성물 키트.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 동결 및/또는 동결건조된 미토콘드리아는 사용하기 전에 장기 보존액과 혼합하여 사용하는 것인, 장기 보존액 조성물 키트.
  21. 동결 및/또는 동결건조된 미토콘드리아의 미토콘드리아 관련 질환의 예방 또는 치료용 용도.
  22. 동결 및/또는 동결건조된 미토콘드리아를 투여하는 단계를 포함하는 미토콘드리아 관련 질환의 예방 또는 치료 방법.
PCT/KR2023/004181 2022-03-29 2023-03-29 동결 및 동결건조된 미토콘드리아 및 이의 용도 WO2023191495A1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2022-0038921 2022-03-29
KR20220038921 2022-03-29

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2023191495A1 true WO2023191495A1 (ko) 2023-10-05

Family

ID=88202807

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2023/004181 WO2023191495A1 (ko) 2022-03-29 2023-03-29 동결 및 동결건조된 미토콘드리아 및 이의 용도

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO2023191495A1 (ko)

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20070069583A (ko) * 2005-12-28 2007-07-03 삼성전자주식회사 시료 중의 독성물질의 존재를 검출하는 방법 및 그를 위한장치
WO2019220654A1 (ja) * 2018-05-17 2019-11-21 旭化成ファーマ株式会社 Ｎ－ホルミルピぺリジン含有量が低減されている、及び／又は、凍結乾燥ケーキの崩潰又は収縮が抑制されている、製剤
KR20200035915A (ko) * 2017-05-17 2020-04-06 유니버시다데 노바 데 리스보아 동결보호제 및/또는 동결보존제 조성물, 방법 및 그의 용도
WO2021015298A1 (en) * 2019-07-24 2021-01-28 Luca Science Inc. Method of obtaining mitochondria from cells and obtained mitochondria
KR20220037435A (ko) * 2019-06-18 2022-03-24 유나이티드 쎄러퓨틱스 코포레이션 이식용 장기의 미토콘드리아 처리

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20070069583A (ko) * 2005-12-28 2007-07-03 삼성전자주식회사 시료 중의 독성물질의 존재를 검출하는 방법 및 그를 위한장치
KR20200035915A (ko) * 2017-05-17 2020-04-06 유니버시다데 노바 데 리스보아 동결보호제 및/또는 동결보존제 조성물, 방법 및 그의 용도
WO2019220654A1 (ja) * 2018-05-17 2019-11-21 旭化成ファーマ株式会社 Ｎ－ホルミルピぺリジン含有量が低減されている、及び／又は、凍結乾燥ケーキの崩潰又は収縮が抑制されている、製剤
KR20220037435A (ko) * 2019-06-18 2022-03-24 유나이티드 쎄러퓨틱스 코포레이션 이식용 장기의 미토콘드리아 처리
WO2021015298A1 (en) * 2019-07-24 2021-01-28 Luca Science Inc. Method of obtaining mitochondria from cells and obtained mitochondria

Also Published As

Publication number Publication date
KR20230140438A (ko) 2023-10-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2017135631A1 (ko) 세포의 동결보존용 배지 조성물 및 이의 용도
WO2022055134A1 (ko) 분리된 미토콘드리아를 포함하는 주사용 조성물 및 이의 용도
WO2013035101A1 (en) Compositions of functional mitochondria and uses thereof
WO2019212324A1 (ko) 멜리틴-기반 세포사멸 유발 펩타이드로 m2 유사 종앙관련 대식세포의 표적화
WO2014051173A1 (ko) 식물 유래의 재조합 인간 혈청 알부민, 지질 및 식물 단백질 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 줄기세포 또는 일차배양세포의 동결보존용 조성물
WO2023191495A1 (ko) 동결 및 동결건조된 미토콘드리아 및 이의 용도
Shibuya et al. Stabilization and enhancement of primary cytostatic factor (CSF) by ATP and NaF in amphibian egg cytosols
WO2018056706A1 (ko) 티오레독신 결합단백질 유래 펩타이드 또는 이를 암호화 하는 폴리뉴클레오타이드를 유효성분으로 함유하는 노화 줄기세포의 역노화용 조성물 및 이의 용도
WO2016006782A1 (ko) 줄기세포의 보관 안정성 증진용 조성물
WO2014185620A1 (ko) 정맥 투여용 줄기세포 조성물
WO2020222483A1 (ko) 분리된 미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는 패혈증 또는 전신성 염증 반응 증후군 치료용 약학 조성물
KR102665782B1 (ko) 동결 및 동결건조된 미토콘드리아 및 이의 용도
WO2020091463A1 (ko) 분리된 미토콘드리아를 포함하는 건병증 예방 또는 치료용 약학 조성물
WO2012161519A1 (en) An adult stem cell line introduced with hepatocyte growth factor gene and neurogenic transcription factor gene with basic helix-loop-helix motif and uses thereof
WO2022158915A1 (ko) 우태아혈청 성분의 유해함을 극복하기 위한 화학적으로 정의된 줄기세포배양액 개발
JP2017520275A (ja) 膵臓細胞の健康、生存を高め、移植転帰を改善するための抗老化グリコペプチドの使用
WO2017014513A1 (ko) Nt세포의 보관방법 및 뱅킹 시스템
Kim et al. Efficient cryopreservation of human mesenchymal stem cells using silkworm hemolymph‐derived proteins
HSU et al. Investigation into the Presence of Insulin‐degrading Enzyme in Cultured Type II Alveolar Cells and the Effects of Enzyme Inhibitors on Pulmonary Bioavailability of Insulin in Rats
WO2020149538A1 (ko) 클로날 줄기세포를 포함하는 아토피 피부염 예방 또는 치료용 약학적 조성물
WO2022055090A1 (ko) 혈소판 유래 미토콘드리아의 수득 방법 및 이의 용도
WO2021107234A1 (ko) Hiv 감염 치료 또는 예방을 위한 ccr5/cxcr4 유전자 동시 넉아웃 환자맞춤형 조혈모세포 및 이의 제조방법
WO2023211226A1 (ko) 미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는 난청 또는 이명의 예방 또는 치료용 약학 조성물
WO2015108372A1 (ko) 오스모틴을 포함하는 흥분독성 또는 시냅스 기능 장애에 의한 신경 질환의 예방 또는 치료용 조성물, 및 이를 이용한 신경 질환의 예방 또는 치료 방법
WO2023033500A1 (ko) 세포 밖 소포체 함유 안표면 염증 질환 예방 또는 치료용 조성물

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 23781350

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1