KR20180062387A

KR20180062387A - 미토콘드리아를 포함하는 근질환 예방 또는 치료용 약학 조성물

Info

Publication number: KR20180062387A
Application number: KR1020170160664A
Authority: KR
Inventors: 최용수; 윤창구; 김미진; 황정욱
Original assignee: 차의과학대학교 산학협력단
Priority date: 2016-11-30
Filing date: 2017-11-28
Publication date: 2018-06-08
Also published as: KR20210096052A; KR20190090754A

Abstract

본 발명은 근질환 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이며, 보다 상세하게는 미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는 근질환 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 약학 조성물은 외래 미토콘드리아 또는 외래 미토콘드리아를 포함하는 세포를 포함함으로써, 이를 투여받는 세포의 미토콘드리아 활성을 향상시킬 수 있다. 이를 통해, 본 발명에 따른 약학 조성물은 미토콘드리아 기능저하와 관련하여 발병하는 근질환에 대한 근본적인 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

미토콘드리아를 포함하는 근질환 예방 또는 치료용 약학 조성물{PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING MUSCLE DISEASES COMPRISING MITOCHONDRIA}

본 발명은 근질환 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이며, 보다 상세하게는 미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는 근질환 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

미토콘드리아는 에너지 공급원으로서 아데노신 트라이포스페이트(adenosine triphosphate: ATP) 합성 및 조절에 관여하는 진핵세포의 생존에 필수적인 세포 소기관이다. 미토콘드리아는 생체 내 다양한 대사 경로, 예를 들어, 세포 신호처리, 세포 분화, 세포 사멸뿐만 아니라 세포 주기 및 세포 성장의 제어와 연관이 있다.

따라서, 미토콘드리아가 손상되면 다양한 질병이 유발될 수 있는데, 대부분의 공지된 미토콘드리아 장애는 미토콘드리아 DNA에서 발생하는 유전성 또는 후천성 돌연변이에 기인한다.

예를 들어, 미토콘드리아 막전위 이상으로 인한 팽윤, 활성산소종, 자유라디칼 등에 의한 산화적 스트레스, 미토콘드리아의 에너지 생성을 위한 산화적 인산화 기능의 결함 등에 의해 미토콘드리아의 기능이 변형될 수 있다.

구체적으로, 미토콘드리아의 기능이상은 다발성경화증, 뇌척수염, 뇌신경근염, 말초신경변증, 라이증후군, 알퍼증후군, MELAS, 편두통, 정신병, 우울증, 발작과 치매, 중풍성 에피소드, 시신경위축, 시신경병증, 망막색소변성, 백내장, 고알도스테론혈증, 부갑상선기능저하증, 근육질환, 미오글로빈뇨, 근육긴장저해, 근육통, 운동내성저하, 세뇨관증, 신부전, 간부전, 간기능부전, 간비대, 철적혈구빈혈, 호중성백혈구 감소증, 저혈소판증, 설사, 융모위축, 다발성구토, 연하곤란, 변비, 감각신경난청, 간질, 정신지체, 간질, 알츠하이머, 파킨슨, 헌팅턴 질환 등의 다양한 질병에 직접 또는 간접적인 원인이 되는 것으로 알려져 있다(Schapira AH et al., Lancet., 1;368(9529):70-82, 2006 및 Pieczenik et al., Exp . Mol . Pathol ., 83(1):84-92, 2007).

특히, 근육은 고에너지 수준을 필요로 하여 미토콘드리아를 상대적으로 다량 함유하고 있는 조직으로, 미토콘드리아의 기능 저하에 따라 근육에서 다소 빠르게 병증이 진행될 수 있다. 예를 들어, 미토콘드리아성 근육 질환으로 MELAS 증후군, MERRF 증후군, Kearns-Sayre 증후군, 근병증, 뇌근육병증, 근무력증, 중증 근무력증, 근위축성 측삭 경화증, 근육퇴행위축, 근위축증, 근긴장저하, 근력약화, 근경직증 등이 있다.

이러한 미토콘드리아 질환을 치료하기 위하여, 미토콘드리아를 보호하거나 미토콘드리아의 기능장애를 회복하는데 사용될 수 있는 물질 또는 이러한 물질을 효율적으로 표적 전달할 수 있는 방법 등에 대한 연구가 진행되고 있으나, 치료범위가 다소 제한적이거나 부작용이 발생하는 문제가 있는 등 아직은 획기적인 치료법이 개발되지 않은 실정이다.

Schapira AH et al., Lancet., 1;368(9529):70-82, 2006 Pieczenik et al., Exp. Mol. Pathol., 83(1):84-92, 2007

본 발명은 근질환을 치료하기 위한 약학 조성물 및 이를 이용한 근질환을 치료하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 과제를 해결하기 위하여,

본 발명은 미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는 근질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 외래 미토콘드리아가 도입된 세포를 유효성분으로 포함하는 근질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

나아가, 본 발명은 상기 약학 조성물을 동물의 환부에 투여하는 단계를 포함하는 근질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

본 발명의 약학 조성물은 외래 미토콘드리아 또는 외래 미토콘드리아를 포함하는 세포를 유효성분으로 포함한다. 이를 투여받는 개체의 미토콘드리아 활성이 향상되므로, 본 발명에 따른 약학 조성물은 미토콘드리아 기능저하와 관련하여 발병하는 근질환에 대한 근본적인 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 덱사메타손을 투여하여 근위축을 유도한 래트의 체중 변화를 나타낸 도면이다.
도 2는 래트 골격근 유래 세포 내 미토콘드리아를 형광 염색한 사진이다. 이때, 사용된 표지자(Mitotracker CMXRos Red)는 미토콘드리아의 막 전위에 의존적으로 축적되는 시료이다.
도 3은 미토콘드리아 기능이 손상된 근육세포에 외래 미토콘드리아를 전달한 후, 세포의 증식능력을 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는 미토콘드리아 기능이 손상된 근육세포에 외래 미토콘드리아를 전달한 후, 세포의 ATP 합성 능력을 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 근위축을 유도한 근육세포에 외래 미토콘드리아를 전달한 후, 세포 내 미토콘드리아의 막 전위를 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 6은 근위축을 유도한 근육세포에 외래 미토콘드리아를 전달한 후, 미토콘드리아 유래 활성산소를 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 7은 근위축을 유도한 근육세포에 외래 미토콘드리아를 전달한 후, 세포 내 미토콘드리아 생합성 능력을 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 8a는 근위축을 유도한 근육세포에 외래 미토콘드리아를 전달한 후, 세포의 AMPK 활성을 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 8b는 근위축을 유도한 근육세포에 외래 미토콘드리아를 전달한 후, 세포의 FoxO 단백질 축적 양을 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 9는 근위축을 유도한 근육세포에 외래 미토콘드리아를 전달한 후, 근위축 마커인 MuRF-1의 발현량을 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 10은 근위축을 유도한 래트에 외래 미토콘드리아를 전달한 후, 가자미근의 무게 변화를 나타낸 도면이다.
도 11a는 근위축을 유도한 래트에 외래 미토콘드리아를 전달한 후, 미토콘드리아 생합성과 관련된 단백질인 PGC-1의 발현량을 웨스턴 블랏을 통해 확인한 도면이다.
도 11b는 근위축을 유도한 래트에 외래 미토콘드리아를 전달한 후, 미토콘드리아 생합성과 관련된 단백질인 PGC-1의 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 12a는 근위축을 유도한 래트에 외래 미토콘드리아를 전달한 후, 근위축 마커인 MuRF-1의 발현량을 웨스턴 블랏을 통해 확인한 도면이다.
도 12b는 근위축을 유도한 래트에 외래 미토콘드리아를 전달한 후, 근위축 마커인 MuRF-1의 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 13은 외래 미토콘드리아 이식에 따른 근 섬유의 재생과정을 조직학적으로 확인한 사진이다.

이하, 본 발명에 대하여 상세히 설명하도록 한다.

본 발명의 일 측면은 미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는 근질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 명세서에서 특별한 언급이 없는 한,　"유효성분"은　단독으로 활성을 나타내거나 또는 그 자체로는 활성이 없는 보조제(담체)와 함께 활성을 나타내는 성분을 지칭한다.

상기 미토콘드리아는 포유동물로부터 수득된 것일 수 있으며, 인간으로부터 수득된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 미토콘드리아는 세포 또는 조직으로부터 분리된 것일 수 있다. 상기 세포는 체세포, 생식세포, 줄기세포 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다. 예를 들어, 상기 미토콘드리아는 체세포, 생식세포 또는 줄기세포로부터 수득된 것일 수 있다. 또한, 상기 미토콘드리아는 미토콘드리아의 생물학적 활성이 정상인 세포로부터 수득된 정상적인 미토콘드리아일 수 있다. 또한, 상기 미토콘드리아는 체외에서 배양된 것일 수 있다.

구체적으로, 상기 체세포는 근육세포, 간세포, 신경세포, 섬유아세포, 상피세포, 지방세포, 골세포, 백혈구, 림프구, 혈소판, 점막세포 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다. 바람직하게는, 미토콘드리아 활성이 뛰어난 근육세포 또는 간세포로부터 수득된 것일 수 있다.

또한, 상기 생식세포는 감수분열과 체세포 분열을 하는 세포로서 정자 또는 난자일 수 있다.

또한, 상기 줄기세포는 중간엽줄기세포, 성체줄기세포, 역분화줄기세포, 배아줄기세포, 골수줄기세포, 신경줄기세포, 윤부줄기세포 및 조직 유래 줄기세포로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다. 이때, 상기 중간엽줄기세포는 탯줄, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막 및 태반으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나로부터 수득된 것일 수 있다.

한편, 상기 미토콘드리아를 특정 세포로부터 분리하는 경우에는, 예를 들어, 특정 버퍼 용액을 사용하거나 전위차 및 자기장을 이용하는 등 공지된 다양한 방법을 통해 미토콘드리아를 분리할 수 있다.

상기 미토콘드리아 분리는 미토콘드리아 활성 유지 측면에서, 세포를 파쇄하고 원심분리하여 수득할 수 있다. 일 구체예로, 세포를 배양하고, 이러한 세포를 포함하는 약학 조성물을 제1차 원심분리하여 펠렛을 생성하는 단계, 상기 펠렛을 버퍼 용액에 재현탁시키고, 균질화하는 단계, 상기 균질화된 용액을 제2차 원심분리하여 상청액을 제조하는 단계 및 상기 상청액을 제3차 원심분리하여 미토콘드리아를 정제하는 단계로 수행될 수 있다. 이때, 제2차 원심분리가 수행되는 시간은 제1차 및 제3차 원심분리가 수행되는 시간보다 짧도록 조절되는 것이 세포 활성 유지 면에서 바람직하며, 제1차 원심분리에서 제3차 원심분리로 갈수록 속도를 높일 수 있다.

구체적으로, 상기 제1차 내지 제3차 원심분리는 0 내지 10℃의 온도, 바람직하게는 3 내지 5℃의 온도에서 수행될 수 있다. 또한, 상기 원심분리가 수행되는 시간은 1 내지 50분 동안 수행될 수 있으며, 원심분리 횟수 및 샘플의 함량 등에 따라 적절히 조정될 수 있다.

아울러, 상기 제1차 원심분리는 100 내지 1,000×g, 또는 200 내지 700×g, 또는 300 내지 450×g의 속도로 수행될 수 있다. 또한, 상기 제2차 원심분리는 1 내지 2,000×g, 또는 25 내지 1,800×g, 또는 500 내지 1,600×g의 속도로 수행될 수 있다. 또한, 상기 제3차 원심분리는 100 내지 20,000×g, 또는 500 내지 18,000×g, 또는 800 내지 15,000×g의 속도로 수행될 수 있다.

또한, 상기 약학 조성물이 유효하게 적용될 수 있는 근질환은 미토콘드리아 기능이상을 포함하는 질환일 수 있다. 예를 들어, 근질환은 MELAS 증후군, MERRF 증후군, Kearns-Sayre 증후군, 근병증, 뇌근육병증, 근무력증, 중증 근무력증, 근위축성 측삭 경화증, 근육퇴행위축, 근위축증, 근긴장저하, 근력약화, 근경직증일 수 있으며, 미토콘드리아 기능 저하로 인해 발생하는 근육 세포 장애를 모두 포함할 수 있다.

즉, 본 발명의 약학 조성물은 세포 활성이 유지되는 미토콘드리아를 유효성분으로 포함함으로써, 상기 약학 조성물이 적용되는 세포의 미토콘드리아 활성을 향상시켜 미토콘드리아성 병증이 개선될 수 있다.

또한, 상기 약학 조성물에 대하여, 미토콘드리아는 0.1 내지 500 ㎍/㎖, 0.2 내지 450 ㎍/㎖ 또는 0.5 내지 400 ㎍/㎖의 농도로 포함될 수 있다. 상기 범위로 미토콘드리아를 포함함으로써, 투여 시 미토콘드리아 용량 조절이 용이하고, 환부의 근육 병증 개선 정도가 보다 향상될 수 있다.

특히, 본 발명에 따른 상기 약학 조성물은, 미토콘드리아를 전달받을 세포를 기준으로 세포 1x10⁵ 개당 미토콘드리아를 0.005 내지 50 ㎍ 또는 0.05 내지 25 ㎍로 투여될 수 있도록 미토콘드리아를 포함할 수 있다. 즉, 상기 약학 조성물이 투여될 세포 또는 근질환이 유발된 환부의 세포의 개수를 기준으로 상기 범위의 함량으로 미토콘드리아가 투여되는 것이 세포 활성 측면에서 가장 바람직하다. 또한, 상기 약학 조성물은 1회 투여시 1 내지 80 ㎕, 10 내지 70 ㎕, 또는 40 내지 60 ㎕의 용량으로 투여될 수 있다.

또한, 본 발명의 다른 측면은 외래 미토콘드리아가 도입된 세포를 유효성분으로 포함하는 근질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 상기 외래 미토콘드리아란 상기 미토콘드리아가 도입되는 세포를 제외한 별개의 세포로부터 유래된 미토콘드리아를 지칭한다. 상기 외래 미토콘드리아 및 이를 분리하는 방법에 대한 구체적인 내용은 전술한 바와 같다.

또한, 상기 세포는 외래 미토콘드리아를 세포질 내에 포함하고 있는 세포로서, 세포 활성이 유지되는 정상세포일 수 있다. 또한, 상기 세포는 근육세포 또는 줄기세포인 것이 바람직하다. 이때, 상기 근육세포는 근육조직에서 분리한 세포일 수 있고, 분리한 세포를 추가적으로 배양하여 수득한 세포일 수 있다. 또한, 상기 줄기세포는 중간엽줄기세포, 성체줄기세포, 역분화줄기세포, 배아줄기세포, 골수줄기세포, 신경줄기세포, 윤부줄기세포 및 조직 유래 줄기세포로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다. 이때, 상기 중간엽줄기세포는 탯줄, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막 및 태반으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나로부터 수득된 것일 수 있다.

또한, 상기 외래 미토콘드리아가 도입된 세포와 상기 외래 미토콘드리아를 제공한 세포는 동종 세포 또는 이종 세포일 수 있다. 또한, 상기 외래 미토콘드리아가 도입된 세포와 상기 외래 미토콘드리아를 제공한 세포는 동일한 개체 또는 다른 개체로부터 수득된 것일 수 있다.

한편, 상기 외래 미토콘드리아와 이를 전달받을 세포가 혼합된 약학 조성물을 원심분리하여, 상기 외래 미토콘드리아를 세포 내로 전달시킬 수 있다. 또한, 상기 원심분리는 0 내지 40℃, 20 내지 38℃, 또는 30 내지 37℃의 온도에서 수행될 수 있다. 또한, 0.5 내지 20분, 1 내지 15분, 또는 3 내지 7분 동안 수행될 수 있다. 또한, 1 내지 2,400×g, 25 내지 1,800×g, 또는 200 내지 700×g으로 수행될 수 있다.

상기 조건으로 세포와 외래 미토콘드리아에 함께 원심력을 가해줌으로써, 세포에 다른 손상이 발생하지 않으면서도 높은 효율로 외래 미토콘드리아를 세포로 전달할 수 있다.

또한, 상기 약학 조성물은 하단으로 갈수록 점진적으로 직경이 좁아지는 시험관 내에서 원심분리되는 것이 세포와 미토콘드리아에 가해지는 원심력 및 접촉 효율 측면에서 보다 효율적일 수 있다. 상기 원심분리는 동일한 조건으로 1회 내지 3회 추가로 수행될 수 있다.

아울러, 상기 원심분리를 수행하기 전에, 상기 약학 조성물을 인큐베이션을 하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 인큐베이션은 0 내지 40℃, 20 내지 38℃, 또는 30 내지 37℃의 온도에서 수행될 수 있다. 또한, 0.1 내지 4시간, 0.5 내지 3.8시간 또는 0.8 내지 3.5시간 동안 수행될 수 있다. 또한, 인큐베이션은 세포에 미토콘드리아가 전달된 후에 소정의 시간 동안 수행될 수 있다. 또한, 인큐베이션 시간은 세포의 종류 및 미토콘드리아의 양에 따라 적절히 선택될 수 있다.

아울러, 상기 약학 조성물에 계면활성제를 첨가하는 단계를 더 포함할 수 있다. 계면활성제는 세포의 세포막 투과성을 증진시키기 위해 사용되며, 첨가 시점은 세포와 미토콘드리아를 혼합하기 전, 혼합시점 또는 혼합 후에 첨가될 수 있다. 또한, 계면활성제를 세포에 첨가한 후 세포의 세포막 투과성을 높이기 위해 일정 시간 세포를 방치할 수 있다. 구체적으로, 상기 약학 조성물에 PF-68(Pluronic F-68)을 첨가하는 단계를 포함할 수 있다.

구체적으로, 상기 계면활성제는 PF-68과 같은 비이온성 계면활성제인 것이 바람직하며, 폴록사머(poloxamers) 즉, 폴리옥시에틸렌의 두 개의 친수성 사슬에 의해 옆으로 배치된 폴리옥시프로필렌의 중심 소수성 사슬로 구성된 삼블록 공중합체일 수 있다. 또한, 상기 약학 조성물에서 계면활성제의 농도는 1 내지 100 ㎍/㎖, 3 내지 80 mg/㎖ 또는 5 내지 40 ㎍/㎖ 일 수 있으며, 바람직하게는 10 내지 30 ㎍/㎖이다.

또한, 상기 약학 조성물에 포함되는 세포는, 10⁵개 세포당 0.1 내지 500 ㎍, 0.2 내지 450 ㎍ 또는 0.5 내지 400 ㎍의 미토콘드리아가 도입된 것일 수 있다. 상기 약학 조성물은 이와 같은 함량으로 외래 미토콘드리아가 전달된 세포를 포함함으로써 투여시 근육 병증 환부의 세포 기능이 개선될 수 있다.

또한, 미토콘드리아를 전달받은 세포를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물의 경우, 투여량은 2x10³ 내지 2x10⁷ 세포 수/㎏(체중), 보다 바람직하게는 1x10⁴ 내지 1x10⁷ 세포 수/㎏(체중)이 될 수 있다. 상기 범위 내의 농도로 외래 미토콘드리아가 주입된 세포를 함유하는 것이 투여 용량 조절 및 근육 병증 개선 측면에서 효율적이다.

또한, 본 발명에 따른 약학 조성물은 미토콘드리아성 근육 질환 또는 질병에 걸릴 수 있거나, 그러한 질환 또는 질병을 앓고 있는 인간 또는 다른 포유동물에 대하여 투여될 수 있다. 또한, 상기 약학 조성물은 환부에 직접적으로 투여될 수 있는 주사제일 수 있고, 바람직하게는 근육주사용 제제일 수 있다.

따라서, 본 발명에 따른 약학 조성물은 주사제 처방의 유통에 따른 제품 안정성을 확보하기 위하여, 주사제로 사용 가능한 산수용액 또는 인산염 등의 완충용액을 사용하여 pH를 조절함으로써, 물리적으로나 화학적으로 매우 안정한 주사제로 제조될 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 약학 조성물은 주사용수를 포함할 수 있다. 상기 주사용수는 고형주사제의 용해나 수용성 주사제를 희석하기 위하여 만들어진 증류수로서, 글루코스 주사, 자일리톨 주사, D-만니톨 주사, 프룩토스 주사, 생리식염수, 덱스트란 40 주사, 덱스트란 70 주사, 아미노산 주사, 링거액, 락트산-링거액 또는 pH 3.5 내지 7.5 범위의 인산염 완충용액 또는 인산이수소나트륨-구연산 완충용액 등 일 수 있다.

또한, 본 발명의 약학 조성물은 안정화제 또는 용해보조제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 안정화제는 나트륨 피로설파이트(sodium pyrosulfite) 또는 에틸렌 디아민테트라아세트산(ethylenediaminetetraacetic acid)일 수 있고, 용해보조제는 염산, 아세트산, 수산화나트륨, 탄산수소나트륨, 탄산나트륨 또는 수산화칼륨일 수 있다.

또한, 본 발명은 전술한 약학 조성물을 개체의 환부에 직접적으로 투여하는 단계를 포함하는 근질환의 예방 또는 치료 방법을 제공할 수 있다. 여기서 개체는 포유동물일 수 있으며, 바람직하게는 인간일 수 있다.

이를 통해, 본 발명에 따른 약학 조성물은 근육 질환이 발생한 환부에 직접적으로 정상적인 활성을 갖는 외래 미토콘드리아를 공급할 수 있어, 미토콘드리아 기능이 저하된 세포의 활성을 증가시키거나 미토콘드리아 기능 이상 세포 재생에 유용하며, 미토콘드리아 이상 근육 질환의 치료 또는 예방에 이용될 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 근위축 유발 동물모델 확립과 무게 변화 측정

실험동물은 5주령 SD-래트 암컷을 오리엔트 바이오(Orient Bio., Ltd., Seoul, Kors)로부터 구매하였다. 구입한 래트는 차의과학대학교 실험동물센터의 청정구역에서 적응기간을 거친 후 실험을 진행하였다. 적응기간 동안 래트가 지내는 환경은 12시간 간격으로 낮과 밤이 조성되고, 23±2℃의 실내온도 및 40 내지 60 %의 습도가 유지되었다. 이러한 적응기간을 7일 거친 후 실험에 투입되었다.

근위축을 유도하기 위해, 덱사메타손을 5일간 5 ㎎/㎏ 농도로 5일간 복강 내에 투여하였다. 매일 간격으로 동물 무게를 확인하였고, 덱사메타손 투여 5일에는 정상군 대비 덱사메타손 투여 군의 무게가 30 % 가량 감소하는 것을 확인하였다(도 1).

실시예 2. 이식을 위한 미토콘드리아 준비

미토콘드리아의 공여 세포는 실험 동물의 종과 동일한 래트 골격근 유래 세포주인(CRL1458, ATCC, Manassas, VA, USA)를 배양하고, 상기 세포들을 빨간색을 띄는 미토콘드리아 특이적 표지자(Mitotracker CMXRos Red)로 염색시켰다.

미토콘드리아를 추출하기 위하여, 혈구계산기를 이용하여 세포수를 측정하여 2x10⁷ cells/㎖ 정도의 세포를 회수하였다. 이후 상기 세포주를 약 4℃의 온도에서 10분 동안 350×g의 속도로 제1차 원심분리를 수행하였고, 이때 얻어진 펠렛을 회수하여 버퍼 용액에 재현탁시켜 균질화시켰다. 상기 펠렛을 포함하는 약학 조성물을 약 4℃의 온도에서 3분 동안 1,100×g의 속도로 제2차 원심분리시켜 상청액을 수득하였다. 이후, 상기 상청액을 약 4℃의 온도에서 15분 동안 12,000×g의 속도로 제3차 원심분리시켜 세포주로부터 미토콘드리아를 분리하였다.

분리된 미토콘드리아를 확인하기 위하여, 분리 수행 전 빨간색 형광으로 표지된 세포 내 미토콘드리아를 형광현미경으로 촬영하여 도 2에 나타내었고, 분리된 미토콘드리아를 확인하였다. 특히, 이때 사용된 표지자(Mitotracker CMXRos Red)는 미토콘드리아의 막 전위에 의존적으로 축적되는 시료로서, 분리된 미토콘드리아의 생존력을 보여준다(도 2).

실시예 3. 미토콘드리아를 전달받은 세포의 증식 능력 평가

일반적으로 세포관련 실험에 많이 사용되어온 래트 골격근 유래 세포주인 L6 세포를 대조군(control)으로 사용하였다. 또한, L6 세포에 미토콘드리아 ATP합성 억제제(올리고마이신, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 처리하여 미토콘드리아 기능을 인위적으로 억제시켰다. 그 후, WRL-68 간세포(CRL1458, ATCC)로부터 추출한 건강한 미토콘드리아를 1x10⁵ 개의 세포에 대하여 농도 별(0.05, 0.5, 5 ㎍)로 전달한 뒤, 24-웰-플레이트(24-well-plate)에 접종(seeding)시켜 37℃ CO₂ 인큐베이터에서 배양시켰다.

세포의 증식 능력을 비교하기 위해 Colorimetric Cyto X™ Cell Viability Assay Kit (LPS solution, Daejeon, Korea)를 사용하였다. 배양 후 24, 48시간에 각각의 샘플에 실험 키트에 포함된 반응용액을 섞어준 뒤, 37℃ CO₂ 인큐베이터에서 2시간 동안 반응 시켰다. 그 후, 450 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.

도 3에 나타난 바와 같이, 미토콘드리아 기능이 억제된 세포군에 비하여, 미토콘드리아를 전달한 세포주의 흡광도가 증가한 것을 확인하였다. 이때, 흡광도의 증가는 시료의 생존세포수가 증가하면서 미토콘드리아의 탈수소효소(mitochondrial dehydrogenase)의 활성이 증가하였음을 의미하는 것으로, 원심분리를 통한 미토콘드리아 전달을 통해 세포의 증식 능력이 향상된 것을 확인하였다.

실시예 4. 미토콘드리아를 전달받은 세포의 ATP 합성 능력 평가

실시예 3.과 동일한 방법으로 ATP 합성 억제제에 의해 미토콘드리아 기능을 손상시킨 뒤 외래 미토콘드리아를 전달받은 세포를 배양 후 24, 48시간에 각각 수득하였다.

각 시료 내에 ATP 양을 측정하기 위해 ATP bioluminescent somatic cell assay kit(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 사용하였다. 준비된 시료에 ATP 방출(releasing) 용액을 첨가하여 상온에서 20초 동안 반응시켜 시료로부터 ATP를 방출시켰다. 그 후, 시료에 ATP assay mix 용액을 첨가하여 상온에서 10분 동안 반응시켜 루미노미터(Luminometer) 장비를 이용하여 ATP의 양을 측정하였다. 각 시료의 ATP의 양은 ATP 표준곡선(standard curve)으로부터 산출할 수 있다.

도 4에 나타난 바와 같이, 시료 내의 단백질 안의 존재하는 ATP 양을 계산하여 대조군에 대비한 ATP 양의 변화를 분석한 결과, 미토콘드리아 기능이 억제된 세포에 비하여, 외래 미토콘드리아를 전달받은 세포의 ATP 합성 능력이 증가된 것을 확인하였다.

이러한 결과를 통해, 세포의 미토콘드리아 기능이 손상된 경우, 해당 세포로 건강한 미토콘드리아를 전달하여 줌으로써 이러한 손상이 회복되는 것을 확인하였다.

실시예 5. 근위축을 유도한 근육세포에서 외래 미토콘드리아 전달 후 세포의 막 전위 평가

실제, 미토콘드리아 기능 저하를 동반하는 근위축의 치료 효능 평가를 위하여, 래트 골격근 유래 세포주인 L6에 근위축 유도제(덱사메타손, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 이용하여 근위축을 유도하였다. 그 후, WRL-68 간세포로부터 추출한 건강한 미토콘드리아(Intact MT)와 미토콘드리아 ATP 합성 억제제를 처리하여 미토콘드리아 기능이 손상시킨 동일 세포로부터 추출한 손상된 미토콘드리아(Damaged MT)를 각각 확보하였다. 근위축을 유도한 근육세포에 미토콘드리아를 1x10⁵ 개의 세포에 대하여 농도 별(0.05, 0.5, 5 ㎍)로 전달하고 24-웰-플레이트에 접종시켜 37℃ CO₂ 인큐베이터에서 배양시켰다.

배양 48시간 뒤, 각 시료 내에 미토콘드리아 막 전위를 측정하기 위하여 JC-1 염료를 사용하였다. 시료는 JC-1 염료와 반응 시킨 뒤, 막 전위의 변화에 따라 다른 스펙트럼을 가지는 성질을 이용하여 흡광도를 측정하였다.

저농도에서는 모노머(monomer)로 존재하며 녹색 형광을 띄고, 높은 농도에서는 염료가 응집(J-aggregate)되어 빨간색 형광을 나타내는 바, 미토콘드리아의 막 전위는 빨간색 흡광도에 대한 녹색 흡광도의 비율로 계산하여 분석하였다.

도 5에 나타난 바와 같이, 근위축이 유도되어 미토콘드리아의 막 전위가 변화한 세포에 비하여, 외래 미토콘드리아를 전달받은 세포의 막 전위가 약 12 내지 22 % 회복되는 것을 확인하였다. 특히 손상된 미토콘드리아를 전달받은 그룹과 비교하였을 때, 유의미한 효과를 나타내었다.

이러한 결과는 외부의 미토콘드리아 전달을 통해 세포의 활성화를 의미하는 바, 외래 미토콘드리아를 전달받음으로써 세포의 ATP 생성 능력이 증가될 수 있음을 확인하였다.

실시예 6. 근위축을 유도한 근육세포에서 외래 미토콘드리아 전달 후 미토콘드리아 유래 활성산소 평가

근위축으로 유도된 근육세포 내의 미토콘드리아 내 활성산소에 대하여 평가하기 위해, 실시예 5.와 동일한 방법으로 각각의 미토콘드리아를 전달 후, 배양 48시간 뒤에 활성산소를 평가하였다.

미토콘드리아 유래 활성 산소를 분석을 위해 MitoSOX red 염료(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 사용하였다. 세포는 완충용액을 이용하여 세척해주고, MitoSOX red 염료를 배지에 섞어 세포에 첨가하고 37℃ CO₂ 인큐베이터에서 20분간 반응시켰다. 반응 후 세포는 완충액을 이용하여 세척 후, 웰(well) 안의 세포가 접종된 커버슬라이드를 회수하여 슬라이드에 얹어 형광현미경으로 관찰하였다. 손상으로 인해 미토콘드리아 내 활성산소가 증가하였을 때 레드(red) 형광 시그널이 증가하며, 각 시료의 형광 밀도는 분석프로그램으로 분석하였다.

도 6에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 방법으로 근위축이 유도되어 미토콘드리아의 유래 활성산소가 증가한 세포에 비하여, 미토콘드리아를 전달받은 세포군은 미토콘드리아를 전달받지 않은 세포군에 비하여 활성산소가 월등히 줄어든 것을 확인하였다. 특히 이는 손상된 미토콘드리아를 전달받은 그룹과 비교하였을 때, 유의미한 효과를 나타내었다.

이러한 결과로부터 외래 미토콘드리아 전달이 전달 받은 세포의 미토콘드리아의 ATP 합성과 활성산소 생성의 균형에 영향을 미치는 것을 확인하였다.

실시예 7. 근위축을 유도한 근육세포에서 외래 미토콘드리아 전달 후 미토콘드리아의생합성 능력 평가

단백질 내의 PGC-1(Peroxisome proliferator-activated receptor Gamma Coactivator-1) 발현을 비교하여 세포 내에 미토콘드리아 생합성의 활성을 비교하였다. 이를 위하여, 실시예 5.와 동일한 방법으로 각각의 미토콘드리아를 근위축이 유도된 세포 내로 전달하였다. 배양 48시간 뒤에 세포를 수합하고, 단백질을 추출하였다. 각 시료의 추출된 단백질 내의 변화는 PGC-1 항체(Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA, Cat no: sc-13067)를 이용하여 웨스턴 블랏(Western blot)을 통해 분석하였다.

미토콘드리아 기능이 정상 수준에서는 미토콘드리아 생합성이 활성화되어, PGC-1의 발현이 높게 나타나지만, 미토콘드리아 기능이 손상된 수준에서는 이러한 PGC-1의 발현이 저하됨으로써 미토콘드리아 생합성이 감소되는 것을 의미한다.

도 7에 나타난 바와 같이, 근위축이 유도되어 미토콘드리아의 생합성 활성이 저하된 세포에 비하여, 외래 미토콘드리아를 전달받은 세포의 미토콘드리아 생합성 능력이 정상 세포와 유사한 수준으로 향상된 것을 확인하였다. 특히, 이는 손상된 미토콘드리아를 전달받은 그룹과 비교하였을 때, 유의미한 효과를 나타내었다.

이러한 결과로부터, 외래 미토콘드리아 전달을 통해 미토콘드리아 생합성을 활성화시킬 수 있으며, 이에 따라 세포 내 미토콘드리아의 기능이 개선되는 것을 확인하였다.

실시예 8. 근위축을 유도한 근육세포에서 외래 미토콘드리아 전달 후 세포의 AMPK 활성화 및 FoxO 축적 양 평가

단백질 내의 AMPK 활성화와 FoxO 축적 양을 비교하여 세포 내의 미토콘드리아 기능 변화에 따른 수준을 비교하였다. 이를 위하여, 실시예 5.와 동일한 방법으로 각각의 미토콘드리아를 근위축이 유도된 세포 내로 전달하였다. 배양 48시간 뒤에 세포를 수합하고, 단백질을 추출하였다. 각 시료의 추출된 단백질 내의 변화는 AMPKα 항체(Cell Signaling Technology, Beverly, MA, #2535), Phospho-AMPKα 항체(Cell Signaling Technology, Beverly, MA, #2532) 및 FoxO3α 항체(Cell Signaling Technology, Beverly, MA, (#2497)를 이용하여 웨스턴 블랏을 통해 분석하였다.

미토콘드리아 기능이 손상되면 세포 내에 ATP의 부족하게 되고, 이로 인해 세포 내 에너지 대사의 센서인 AMPK(Adeno Mono Phosphate Kinase)가 활성화되고, 이러한 신호로 활성화된 FoxO가 핵 내에 FoxO가 축적됨으로써 MuRF-1 또는 MAFbx와 같은 근조직의 위축에 영향을 미치는 중요 유전자(atrogenes)들의 발현을 촉진하여 근위축증을 유발한다.

도 8a 및 도 8b에 나타난 바와 같이, 미토콘드리아 기능이 억제된 세포에 비하여, 외래 미토콘드리아를 전달받은 세포의 AMPK 활성화와 FoxO 축적 양이 정상 세포와 유사한 수준으로 줄어든 것을 확인하였다. 특히, 이는 손상된 미토콘드리아를 전달받은 그룹과 비교하였을 때, 유의미한 효과를 나타내었다.

이러한 결과로부터, 외래 미토콘드리아 전달을 통해 세포 내 에너지 센서인 AMPK 의 신호 전달을 억제하고, 그에 따른 FoxO의 활성화를 억제해 줌으로써, 근위축 신호 전달 기전을 억제할 수 있는 것을 확인하였다.

실시예 9. 근위축을 유도한 근육세포에 외래 미토콘드리아 전달 후 근위축 마커인 MuRF -1 발현량 평가

단백질 내의 MuRF-1(muscle ring finger-1) 발현을 비교하여 세포 내 전달된 미토콘드리아에 의한 근위축 보호 효능을 비교하였다. 실시예 5.와 동일한 방법으로 각각의 미토콘드리아를 근위축이 유도된 세포 내로 전달하였다. 배양 48시간 뒤에 세포를 수합하고, 단백질을 추출하였다. 각 시료의 추출된 단백질 내의 변화는 MuRF-1 항체(Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA, Cat no: sc-27642)를 이용하여 웨스턴 블랏을 통해 분석하였다.

근위축 유도 시 미토콘드리아 기능이 손상되어 도 8b에 나타난 바와 같이, 핵 내에 축적된 FoxO에 의해 근위축 전사인자(예, MuRF-1)가 활성화되어 근위축이 유도된다.

도 9에 나타난 바와 같이, 근위축 유도 군에서 MuRF-1의 발현량의 증가에 비하여, 건강한 외래 미토콘드리아를 전달받은 군에서는 MuRF-1의 발현량이 정상세포와 유사한 수준으로 줄어든 것을 확인하였다. 특히, 이는 손상된 미토콘드리아를 전달받은 그룹과 비교하였을 때, 유의미한 효과를 나타내었다.

이는 근위축이 유도 시 동반되는 미토콘드리아 기능 손상으로 인해 이와 같은 경로(AMPK-FoxO/Atrogene pathway)를 자극함으로써 근 위축 질환을 유도할 수 있다는 이론과 부합하는 내용이며, 실제 본 연구를 통해 건강한 미토콘드리아를 외부에서 전달하여 줌으로써, 이러한 경로를 막아 근 위축 질환으로부터 회복될 수 있음을 확인하였다.

실시예 10. 미토콘드리아 이식에 의한 가자미근의 무게 변화 측정

실시예 1.에서 분리한 미토콘드리아는 BCA 어세이를 통해 미토콘드리아 단백질 양을 측정한 뒤, 투여 농도는 저농도(MT low; 0.5 ㎍)와 고농도(MT high; 5 ㎍)로 설정하였다. 이러한 농도는 근위축이 유도된 세포에서 회복 효능을 검증한 유효한 농도 범위로 사용되었다. 준비된 미토콘드리아는 100 ㎕의 식염수에 현탁하여 0.25 mm(31G) × 8 mm(Insulin syringe, BD ULtra-Fine II) 주사기에 넣고 비복근(gastronemius muscle) 사이에 아래와 위로 두 번 주사하였다. 근위축 유발군은 동일한 용량의 0.9%(v/v) 식염수를 주사하였다.

미토콘드리아 이식 후 1, 7, 14일째에 부검을 실시하였다. 각 실험군 별로 몸무게와 가자미근의 무게를 측정하고, 측정된 무게를 기준으로 몸무게에 대비하여 가자미근 무게 변화를 분석하였다.

그 결과, 근위축 유발 동물에 식염수를 투여한 경우, 정상생활을 한 그룹보다 가자미근의 무게가 약 2배 정도 감소하였다. 미토콘드리아 이식 후 1일째부터 무게의 변화가 회복됨을 확인할 수 있었으며, 전달된 MT의 농도에 의존적으로 가자미근의 무게가 증가함을 확인하였다. 덱사메타손 처리 이후 14일째에는 근위축 그룹의 경우도 자연회복 되는 것을 확인하였다. 또한, 미토콘드리아의 이식을 통해 가자미근의 무게가 정상군보다도 증가하였음을 확인하였다(도 10).

실시예 11. 미토콘드리아 이식에 의한 미토콘드리아 생합성 단백질 발현 확인

미토콘드리아 이식 후 1, 7, 14일째에 수합한 가자미근으로부터 미토콘드리아 생합성의 합성을 비교하기 위해 PGC-1의 단백질 양을 웨스턴 블롯을 통해 확인하였다. 근위축이 유도된 후의 1일째에서는 근위축으로 인한 PGC-1의 발현량이 감소하였다. 반면, 미토콘드리아 전달군에서는 이식 농도에 의존적으로 PGC-1의 발현량이 회복됨을 확인하였다. 그에 반해 자연회복 단계인 7, 14일째의 근위축 유도군에서는 PGC-1의 발현량이 정상군과 유사하게 회복되는 것을 확인하였다(도 11a 및 도 11b).

즉, 근위축 유도로 인한 미토콘드리아 생합성의 저해를 확인하였고, 외래 미토콘드리아 이식 후 조직 내 미토콘드리아의 PGC-1의 발현량이 증가됨을 확인하였다. 따라서, 이러한 결과를 통해 외래 미토콘드리아 이식함으로써 조직 내 미토콘드리아 생합성의 활성을 증가시킬 수 있음을 확인하였다.

실시예 12. 미토콘드리아 이식에 의한 근위축 관련 단백질 발현

미토콘드리아 이식 후 1, 7, 14일째에 수합한 가자미근으로부터 근위축 특이 마커인 MuRF-1의 단백질 발현량을 웨스턴 블롯을 통해 확인하였다. 근위축이 유도된 후의 7일째에서는 근위축 유도로 인한 MuRf-1의 발현량이 증가함을 확인하였다. 반면, 미토콘드리아 전달군에서는 이식 농도에 의존적으로 MuRF-1의 발현 억제를 확인하였다. 또한, 14일째의 근위축 유도군에서도 MuRF-1의 발현이 나타나지 않음은 근위축으로부터 자연회복이 되는 시점을 의미한다(도 12a 및 12b).

즉, 근위축 유도된 근육 내 MuRF-1의 발현을 확인하였고, 이는 7일째까지 지속되었다. 반면, 외래 미토콘드리아 이식 후 MuRF-1의 발현을 억제되는 것을 확인하였다. 따라서, 이러한 결과를 통해 외래 미토콘드리아를 이식함으로써 근위축을 회복시킬 수 있음을 확인하였다.

실시예 13. 미토콘드리아 이식에 의한 근 섬유 재생의 조직학적 분석

근위축 유발 후 외래 미토콘드리아 이식을 통해 근위축의 치료 효과를 조직학적으로 분석하였다. H&E 염색 결과, 근위축 유발 그룹에서는 7일째까지 근섬유의 크기가 작아지고 근 내막(endomysium)이 정상군에 비해 넓게 퍼져있는 것을 확인하였다. 한편, 외래 미토콘드리아를 이식한 그룹에서는 근 섬유의 크기가 증가하고 밀도도 높게 나타났다. 14일째에는 근위축 유도군은 근 섬유의 크기와 근내막이 정상군과 유사해진 것으로 보아 자연회복 되는 것을 확인하였다(도 13).

이러한 결과를 통해 근위축 유도로 인한 손상된 근육에 외래 미토콘드리아를 이식함으로써 근 재생을 촉진시킬 수 있음을 확인하였다.

이상, 본 발명의 일 실시예에 대하여 설명하였으나, 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서, 구성 요소의 부가, 변경, 삭제 또는 추가 등에 의해 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있을 것이며, 이 또한 본 발명의 권리범위 내에 포함된다고 할 것이다.

Claims

미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는,
근질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서,
상기 미토콘드리아는 세포 또는 조직으로부터 분리된 것인,
근질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제2항에 있어서,
상기 세포는 체세포, 생식세포, 줄기세포 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인,
근질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제3항에 있어서,
상기 체세포가 근육세포, 간세포, 신경세포, 섬유아세포, 상피세포, 지방세포, 골세포, 백혈구, 림프구, 혈소판 또는 점막세포 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인,
근질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제3항에 있어서,
상기 생식세포가 정자, 난자 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인,
근질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제3항에 있어서,
상기 줄기세포가 중간엽줄기세포, 성체줄기세포, 역분화줄기세포, 배아줄기세포, 골수줄기세포, 신경줄기세포, 윤부줄기세포, 조직 유래 줄기세포 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인,
근질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제6항에 있어서,
상기 중간엽줄기세포가 탯줄, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막, 태반, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나로부터 수득된 것인,
근질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서,
상기 약학 조성물에 대하여, 상기 미토콘드리아는 0.1 내지 500 ㎍/㎖의 농도로 포함되는,
근질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서,
상기 근질환은, MELAS 증후군, MERRF 증후군, Kearns-Sayre 증후군, 근병증, 뇌근육병증, 근무력증, 중증 근무력증, 근위축성 측삭 경화증, 근육퇴행위축, 근위축증 또는 근경직증인,
근질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
외래 미토콘드리아가 도입된 세포를 유효성분으로 포함하는,
근질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제10항에 있어서,
상기 세포는 근육세포 또는 줄기세포인,
근질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제11항에 있어서,
상기 줄기세포가 중간엽줄기세포, 성체줄기세포, 역분화줄기세포, 배아줄기세포, 골수줄기세포, 신경줄기세포, 윤부줄기세포, 조직 유래 줄기세포 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인,
근질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제12항에 있어서,
상기 중간엽줄기세포가 탯줄, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막, 태반, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나로부터 수득된 것인,
근질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제10항에 있어서,
세포와 외래 미토콘드리아 혼합물을 원심분리하여, 외래 미토콘드리아를 세포 내로 전달시킨,
근질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제10항에 있어서,
상기 약학 조성물은, 10⁵개 세포당 0.1 내지 500 ㎍의 미토콘드리아가 도입된 세포를 포함하는,
근질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제10항에 있어서,
상기 근질환은, MELAS 증후군, MERRF 증후군, Kearns-Sayre 증후군, 근병증, 뇌근육병증, 근무력증, 중증 근무력증, 근위축성 측삭 경화증, 근육퇴행위축, 근위축증 또는 근경직증인,
근질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 약학 조성물을 개체의 환부에 투여하는 단계를 포함하는,
근질환의 예방 또는 치료 방법.