WO2022231083A1 - 미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는 자가면역질환 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는 자가면역질환 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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WO2022231083A1
WO2022231083A1 PCT/KR2021/016458 KR2021016458W WO2022231083A1 WO 2022231083 A1 WO2022231083 A1 WO 2022231083A1 KR 2021016458 W KR2021016458 W KR 2021016458W WO 2022231083 A1 WO2022231083 A1 WO 2022231083A1
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mitochondria
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cells
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조미라
박성환
김석중
이선영
문정현
이아람
나현식
조근형
전주연
최종영
황선희
양승천
박진실
최정원
이한희
이보인
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가톨릭대학교 산학협력단
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    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection

Definitions

  • the present invention relates to a composition for preventing or treating autoimmune diseases comprising mitochondria as an active ingredient.
  • Mitochondria are eukaryotic organelles involved in the synthesis and regulation of adenosine triphosphate (ATP), an intracellular energy source. Mitochondria are implicated in the control of various metabolic pathways in vivo, such as cell signaling, cell differentiation, apoptosis, as well as the cell cycle and cell growth. Mitochondria contain their own genomes and are organelles that play a pivotal role in the energy metabolism of cells. Mitochondria play important roles, including producing energy through electron transport and oxidative phosphorylation, and participating in apoptosis signaling pathways.
  • ATP adenosine triphosphate
  • human diseases caused by mitochondrial dysfunction include mitochondrial-related genetic diseases (Wallace DC 1999), diabetes (Maechler P 2001), heart disease (Sorescu D 2002), and senile dementia such as Parkinson's disease or Alzheimer's disease (Lin MT 2006). ), and the occurrence of various cancers (Petros JA, 2005) and cancer metastasis (Ishikawa K, 2008) have been reported.
  • the characteristics commonly found in more than 200 types of various cancers consisted of impaired apoptosis function, increased inflammatory response, and increased abnormal metabolism.
  • research on the relationship between mitochondria and immune diseases is currently in progress.
  • Mitochondria are essential organelles for the survival of eukaryotic cells involved in the synthesis and regulation of adenosine triphosphate (ATP) as an energy source. Mitochondria are implicated in the control of various metabolic pathways in vivo, such as cell signaling, cell differentiation, apoptosis, as well as the cell cycle and cell growth.
  • ATP adenosine triphosphate
  • mitochondrial function may be modified by swelling caused by abnormal mitochondrial membrane potential, oxidative stress caused by reactive oxygen species or free radicals, and defects in oxidative phosphorylation for mitochondrial energy generation.
  • mitochondrial dysfunction includes multiple sclerosis, encephalomyelitis, neuromyositis, peripheral neuropathy, Reye's syndrome, Alper's syndrome, MELAS, migraine, psychosis, depression, seizures and dementia, paralytic episode, optic nerve atrophy, optic neuropathy, retinal color.
  • Urinary cataract, hyperaldosteronemia, hypoparathyroidism, muscular atrophy, myoglobinuria, muscle dystonia, myalgia, decreased exercise tolerance, tubulopathy, renal failure, liver failure, hepatic insufficiency, hepatomegaly, iron erythrocyte anemia, neutropenia , thrombocytopenia, diarrhea, villous atrophy, multiple vomiting, dysphagia, constipation, sensorineural deafness, ischemic disease, mental retardation, epilepsy, Alzheimer's, Parkinson's, Huntington's disease, etc. is known
  • ischemic disease is irreversible damage to cells constituting tissues due to a decrease in blood flow, and a process called ischemic cascade is triggered to cause permanent loss of function of brain, heart, or peripheral tissues.
  • the ischemic disease includes, for example, severe leg ischemia, myocardial infarction, ischemic stroke and ischemic colitis.
  • Mitochondrial dysfunction is not a single symptom or disease, but can appear as various diseases in various organs in the human body, so the possibility of lesion and disease-specific treatment related to diseased mitochondria is being raised.
  • T cells are one of the cell groups that play a central role in the immune system as a biological defense system against various pathogens.
  • T cells are generated in the thymus of the human body and differentiate into T cells with unique characteristics through a series of differentiation processes. differentiated into helper cells (Th2).
  • Th2 helper cells
  • Th1 cells the main function of Th1 cells is involved in cell-mediated immunity
  • Th2 cells are involved in humoral immunity
  • these two cell populations maintain the balance of the immune system by checking each other so that they do not overactivate each other.
  • the immune diseases can be attributed to the imbalance between these two immune cells. For example, when the activity of Th1 cells is abnormally increased, autoimmune diseases may occur, and the activity of Th2 cells is abnormally increased. It is known that immune diseases caused by hypersensitivity reactions occur.
  • Treg cells have the property of controlling the inflammatory response by suppressing the function of abnormally activated immune cells, and many studies are being conducted to treat immune diseases by increasing the activity of Treg cells.
  • Th17 cells are known to be formed through a process similar to the differentiation of Treg cells in the differentiation process of undifferentiated T cells. That is, differentiation of Treg cells and Th17 cells is commonly performed in the presence of TGF- ⁇ , but Treg cells do not require IL-6, whereas Th17 cells present IL-6 together with TGF- ⁇ . differentiate in a situation where In addition, differentiated Th17 cells are characterized in that they secrete IL-17.
  • Th17 cells unlike Treg cells, are involved in the forefront of the inflammatory response seen in immune diseases and accelerate disease progression by maximizing the signal of the inflammatory response. Therefore, in the case of autoimmune diseases that are not controlled by Treg cells among autoimmune diseases, the development of therapeutic agents for autoimmune diseases targeting the inhibition of Th17 cell activity has been highlighted.
  • Osteoarthritis is a type of arthritis, also called degenerative arthritis, refers to arthritis caused by degenerative changes in cartilage and surrounding bones in synovial joints. That is, osteoarthritis is a disease characterized by gradual loss of articular cartilage, hypertrophy of the bones located below the cartilage, bone formation at the joint edge, and non-specific inflammation of the synovial membrane. Osteoarthritis is a disease caused by damage to cartilage due to aging or excessive physical pressure (eg, obesity, trauma, etc.).
  • osteoarthritis causes severe pain and movement disorders in joints that receive a lot of weight, ie, knee (knee) joints, hip (hip) joints, and the like, and when left unattended for a long period of time, it leads to joint deformation.
  • Immunosuppressive agents refer to various substances used to reduce or block the ability of the host to make antibodies (humoral immune response) or cellular immune response against the action of an antigen. These immunosuppressive agents can be usefully used not only in the field of organ transplantation, but also in autoimmune diseases such as lupus and rheumatoid arthritis, and skin hypersensitivity reactions such as atopy and allergies. A good immunosuppressant should be able to control the imbalance of immune response, ensure safety for the human body, and have a low frequency of disease recurrence during long-term treatment.
  • immunosuppressants include cyclosporine A and FK506, which are compounds derived from natural products with complex chemical structures. There is a risk that there is Therefore, there is an urgent need to develop a new immunosuppressant that can be economically produced with low toxicity and immune tolerance induction.
  • An object of the present invention is to provide a method for preventing or treating autoimmune diseases, comprising mitochondria as an active ingredient, (1) inhibiting Th17 activity, (2) activating Treg, (3) inflammatory cytokine IL- It is possible to provide a method for reducing 1 ⁇ , IL-6 and the chemokine MCP-1, and (4) inhibiting the expression of COX2.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating autoimmune diseases comprising mitochondria as an active ingredient.
  • the present invention also provides a method for preventing or treating an autoimmune disease mediated by IL-17, comprising mitochondria as an active ingredient.
  • the present invention also provides a method for increasing mitochondrial STAT3 in a method for preventing or treating autoimmune diseases, including mitochondria as an active ingredient.
  • the present invention also provides a method for preventing or treating autoimmune diseases, comprising mitochondria as an active ingredient, (1) inhibiting Th17 activity, (2) activating Treg, (3) inflammatory cytokine IL-1 ⁇ , reducing IL-6 and the chemokine MCP-1, and (4) inhibiting the expression of COX2.
  • the composition according to the present invention can effectively prevent and treat osteoarthritis by alleviating the pain of osteoarthritis, alleviating symptoms, reducing joint damage, promoting the differentiation of chondrocytes, and inhibiting inflammatory cell death of chondrocytes.
  • muscle-derived mitochondria have the ability to regulate inflammatory cytokines and Treg/Th17 cells in the osteoarthritis animal model, encephalomyelitis model, Sjogren's syndrome animal model and transplant rejection model, and also inflammatory cytokines IL-6, IL
  • FIG 1 shows the pain measurement results in an animal model of osteoarthritis caused by MSC-derived mitochondria in an embodiment of the present invention.
  • Figure 2 shows the safranin O staining image and clinical arthritis evaluation index in the group administered with MSC-derived mitochondria in an embodiment of the present invention.
  • FIG. 3 is an IHC staining image and a result of confirming the expression of IL-1 ⁇ , MMP13 and MCP1 in an animal to which MSC-derived mitochondria were administered, according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 5 is a CT analysis result confirming the ability to inhibit cartilage damage by MSC-derived mitochondria in an embodiment of the present invention.
  • MSC-derived mitochondria help the proliferation and recovery ability of chondrocytes damaged by IL-1 ⁇ .
  • FIG. 7 is a view confirming the osteoarthritis treatment effect of MSC-derived mitochondria, which are enhanced by zinc, in one embodiment of the present invention.
  • FIG. 10 is a Western blotting result of analyzing the protein expression levels of cells and mitochondria according to an embodiment of the present invention.
  • 11 is an analysis result confirming the regulating effect of zinc-treated MSC administration on inflammatory apoptosis inhibition in chondrocytic cells according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 13 shows the safranin o staining image and clinical arthritis evaluation index in the group administered with muscle-derived mitochondria in an embodiment of the present invention.
  • FIG. 14 is an IHC staining image and a result of confirming the expression of IL-1 ⁇ , MMP13, MCP1 and cox4 in an animal to which muscle-derived mitochondria are administered, according to an embodiment of the present invention.
  • 16 is an analysis result of MMP1, MMP3, MMP12 inhibition regulation in chondrocytes in muscle-derived mitochondria according to an embodiment of the present invention.
  • 17 is a result of inhibition of IL-17/Th17 cell activity by the administration of muscle-derived mitochondria into PBMC of a patient with immunoinflammatory disease, according to an embodiment of the present invention.
  • 19 is a diagram confirming the therapeutic effect on autoimmune diseases of the nervous system, such as encephalomyelitis, by administration of muscle-derived mitochondria according to an embodiment of the present invention.
  • 20 is a diagram confirming the therapeutic effect of Sjogren's syndrome by the administration of muscle-derived mitochondria in one embodiment of the present invention.
  • Figure 21 confirms the change in body weight according to the transplantation of mitochondria in inflammatory bowel disease induced mice.
  • Figure 22 confirms the change in the length of the intestine according to the transplantation of mitochondria in inflammatory bowel disease induced mice.
  • FIG. 23 is a diagram confirming the protection of intestinal tissue according to mitochondrial transplantation in the intestinal tissue of a mouse induced with inflammatory bowel disease (A: H&E staining observation, B: histological index quantification).
  • FIG. 24 is a diagram confirming the expression of inflammatory cytokines according to mitochondrial transplantation by immunohistochemical staining in the intestinal tissue of mice induced with inflammatory bowel disease (A: immunohistochemical staining observation, B: cytokine expression quantification) .
  • 25 is a diagram illustrating quantification of the regulation of regulatory B cells according to mitochondrial transplantation by flow cytometry analysis in the mesenteric lymph nodes of mice induced with inflammatory bowel disease.
  • 26 is a diagram confirming changes in intestinal flora according to mitochondrial transplantation in the appendix of mice induced with inflammatory bowel disease.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating autoimmune diseases comprising mitochondria as an active ingredient.
  • prevention refers to any action that suppresses or delays the occurrence of autoimmune diseases and complications resulting therefrom by administration of the pharmaceutical composition according to the present invention.
  • treatment refers to any action that improves or beneficially changes the symptoms of an autoimmune disease-suspecting and onset individual by administration of the pharmaceutical composition.
  • Those of ordinary skill in the art to which the present invention pertains with reference to the data presented by the Korean Medical Association, etc., know the exact criteria of the disease for which the composition of the present application is effective, and can determine the degree of improvement, improvement and treatment will be.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include an adjuvant in addition to the active ingredient.
  • the adjuvant may be used without limitation as long as it is known in the art, for example, Freund's complete adjuvant or incomplete adjuvant may be further included to increase the immunity thereof.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may be prepared in a form in which the active ingredient is incorporated into a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the pharmaceutically acceptable carrier includes carriers, excipients and diluents commonly used in the pharmaceutical field.
  • Pharmaceutically acceptable carriers that can be used in the pharmaceutical composition of the present invention include, but are not limited to, lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia gum, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be formulated in the form of oral dosage forms such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, etc., external preparations, suppositories, or sterile injection solutions according to conventional methods, respectively. .
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, etc., and such solid preparations include at least one excipient in the active ingredient, for example, starch, calcium carbonate, sucrose, lactose, gelatin. It can be prepared by mixing and the like. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate and talc may also be used.
  • Liquid formulations for oral administration include suspensions, solutions, emulsions, syrups, etc.
  • compositions for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, lyophilized formulations and suppositories.
  • non-aqueous solvent and suspending agent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and injectable esters such as ethyl oleate may be used.
  • base of the suppository witepsol, tween 61, cacao butter, laurin, glycerogelatin, and the like can be used.
  • composition according to the present invention may be administered to an individual by various routes. Any mode of administration can be envisaged, for example, by oral, intravenous, intramuscular, subcutaneous, intraperitoneal injection.
  • the dosage of the pharmaceutical composition according to the present invention is selected in consideration of the individual's age, weight, sex, physical condition, and the like. It is self-evident that the concentration of the active ingredient included in the pharmaceutical composition can be variously selected depending on the subject, and is preferably included in the pharmaceutical composition at a concentration of 0.01 to 5,000 ⁇ g/ml. If the concentration is less than 0.01 ⁇ g/ml, pharmaceutical activity may not appear, and if it exceeds 5,000 ⁇ g/ml, it may be toxic to the human body.
  • the pharmaceutical composition may be formulated in various oral or parenteral dosage forms.
  • Formulations for oral administration include, for example, tablets, pills, hard, soft capsules, solutions, suspensions, emulsifiers, syrups, granules, and the like. crose, mannitol, sorbitol, cellulose and/or glycine), lubricants (eg silica, talc, stearic acid and its magnesium or calcium salts and/or polyethylene glycol).
  • the tablet may contain a binder such as magnesium aluminum silicate, starch paste, gelatin, tragacanth, methylcellulose, sodium carboxymethylcellulose and/or polyvinylpyrrolidine, and optionally starch, agar, alginic acid. or disintegrants such as sodium salts thereof or effervescent mixtures and/or absorbents, coloring, flavoring and sweetening agents.
  • the formulation may be prepared by conventional mixing, granulating or coating methods.
  • a representative formulation for parenteral administration is an injection formulation
  • examples of the solvent for the injection formulation include water, Ringer's solution, isotonic saline or suspension.
  • the sterile, fixed oil of the injectable preparation may be used as a solvent or suspending medium, and any non-irritating fixed oil including mono- and di-glycerides may be used for this purpose.
  • the injection preparation may use a fatty acid such as oleic acid.
  • the mitochondria may be isolated from mammals including humans, and may be isolated from cells of excess tissue such as fat of mammals including humans.
  • the mitochondria may be isolated from one or more cells selected from the group consisting of somatic cells, germ cells, and stem cells of osteoarthritis patients, but is not limited thereto.
  • the stem cells may be one or more cells selected from the group consisting of mesenchymal stem cells, adult stem cells, dedifferentiated stem cells, embryonic stem cells, bone marrow stem cells, neural stem cells, limbal stem cells, and tissue-derived stem cells, for example
  • it may be a mesenchymal stem cell (MSC), but is not limited thereto.
  • MSC mesenchymal stem cell
  • the mitochondria may be isolated through various known methods, such as, for example, using a specific buffer solution or using a potential difference and a magnetic field.
  • the mitochondrial separation may be performed by disrupting cells and centrifuging in terms of maintaining mitochondrial activity.
  • culturing the cells generating a pellet by first centrifuging a composition containing the cells, resuspending the pellet in a buffer solution, and homogenizing, the homogenized solution is subjected to a second
  • the steps of preparing a supernatant by secondary centrifugation and third centrifugation of the supernatant may be performed to purify mitochondria.
  • it is preferable in terms of maintaining cell activity that the time for the second centrifugation is adjusted to be shorter than the time for the first and the third centrifugation, and from the first centrifugation to the third centrifugation You can increase the speed as you go
  • the mitochondria can be obtained in the culture solution obtained after culturing the cells.
  • a culture medium may contain cytokines, chemokines, exosomes, microvesicles, and the like secreted by cells, and mitochondria.
  • the mitochondrial separation comprises culturing cells, first centrifuging the composition containing the obtained culture solution to remove cell debris and obtaining a supernatant, and second centrifuging the supernatant to obtain mitochondria It can be carried out as a step of purification. It may be appropriately adjusted depending on the number of centrifugations and the content of the sample.
  • the mitochondria may be isolated from cells or cell culture, but is not limited thereto.
  • the cell or cell culture medium may be one or more selected from the group consisting of somatic cells, germ cells and stem cells, but is not limited thereto.
  • the stem cell may be one type of impression selected from the group consisting of mesenchymal stem cells, adult stem cells, dedifferentiated stem cells, embryonic stem cells, bone marrow stem cells, neural stem cells, limbal stem cells, and tissue-derived stem cells, It is not limited thereto.
  • the cell or cell culture medium is at least one selected from the group consisting of muscle, liver, umbilical cord, umbilical cord blood, bone marrow, fat, epithelium, leukocyte, mucosa, nerve, skin, amniotic membrane, placenta, synovial fluid, testis, periosteum, and combinations thereof. may be, but is not limited thereto.
  • the cell may be a cell whose biological activity is lowered by an autoimmune disease, but is not limited thereto.
  • composition may further include zinc, but is not limited thereto.
  • the mitochondria of the composition may have improved amounts and functions of mitochondria due to increased expression of STAT3, but is not limited thereto.
  • the autoimmune disease of the composition may be a disease mediated by the inflammatory cytokine IL-17, but is not limited thereto.
  • the transplant rejection reaction of the composition may be one or more transplant rejection reactions selected from the group consisting of cells, tissues and organs, but is not limited thereto.
  • the transplant rejection reaction of the composition may be one or more rejection reactions selected from the group consisting of bone marrow transplantation, heart transplantation, corneal transplantation, intestinal transplantation, liver transplantation, lung transplantation, pancreatic transplantation, kidney transplantation, and skin transplantation. , but not limited thereto.
  • the graft rejection reaction may be graft-versus-host disease (GVHD).
  • GVHD graft-versus-host disease
  • the nervous system autoimmune diseases of the composition include multiple sclerosis, neuromyelitis optica, acute disseminated encephalomyelitis, ascending myelitis, central myelitis, descending myelitis. (descending myelitis) transverse myelitis, myasthenia gravis, guillain-barre syndrome, autoimmune uveitis, autoimmune encephalopathy, encephalomyelitis and chronic It may be one or more selected from the group consisting of inflammatory demyelinating polyneuropathy, but is not limited thereto.
  • the inflammatory bowel disease provides a composition for preventing or treating inflammatory bowel disease, characterized in that it is selected from the group consisting of Crohn's disease, intestinal lesions accompanying Behcet's disease, ulcerative colitis, hemorrhagic rectal ulcers and ileal capsuleitis.
  • the composition may inhibit the inflammatory cytokine IL-17 by inhibiting the activity of Th17, and regulate the immune response by activating Treg, but is not limited thereto.
  • the composition may decrease the inflammatory cytokines IL-1 ⁇ , IL-6 and the chemokine MCP-1, and increase COX4, but is not limited thereto.
  • composition may be to control the intestinal flora, but is not limited thereto.
  • the intestinal flora control Firmicutes phylum ( Firmicutes phylum ) and Bacteroidetes phylum ( Bacteroidetes phylum ) provides a composition for preventing or treating inflammatory bowel disease, characterized in that it controls the ratio of the flora.
  • the composition provides a method for preventing and treating autoimmune diseases, comprising administering to an individual a pharmaceutical composition for preventing or treating autoimmune diseases comprising mitochondria in a pharmaceutically effective amount as an active ingredient.
  • the present invention provides a method for preventing or treating an autoimmune disease mediated by IL-17, comprising mitochondria as an active ingredient.
  • the present invention provides a method for increasing mitochondrial STAT3 in a method for preventing or treating autoimmune diseases, including mitochondria as an active ingredient.
  • the present invention provides a method for preventing or treating autoimmune diseases, comprising mitochondria as an active ingredient, (1) inhibiting Th17 activity, (2) activating Treg, (3) inflammatory cytokine IL-1 ⁇ , A method is provided for reducing IL-6 and the chemokine MCP-1, and (4) inhibiting the expression of COX2.
  • the treatment method of the present invention comprises administering the composition for preventing or treating autoimmune diseases to an individual in a therapeutically effective amount.
  • a specific therapeutically effective amount for a particular subject will depend on the type and extent of the response to be achieved, the specific composition, including whether other agents are used, if necessary, the subject's age, weight, general health, sex and diet, administration time; It is preferable to apply differently depending on various factors including the route of administration and secretion rate of the composition, the duration of treatment, the drug used together with or concurrently with the specific composition, and similar factors well known in the pharmaceutical field. Therefore, it is preferable to determine the effective amount of the composition suitable for the purpose of the present invention in consideration of the foregoing.
  • the present invention also provides a method for treating osteoarthritis, IL-17-mediated inflammatory disease or immune disease comprising administering a pharmaceutically effective amount of the composition to a subject.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is administered in a therapeutically effective amount or a pharmaceutically effective amount.
  • pharmaceutically effective amount means an amount sufficient to treat a disease with a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical treatment, and the effective dose level depends on the subject type and severity, age, sex, activity of the drug, and the drug. Sensitivity, administration time, administration route and excretion rate, treatment duration, factors including concurrent drugs, and other factors well known in the medical field may be determined.
  • Example 1 Composition for preventing or treating osteoarthritis containing mitochondria
  • Example 1-1 Preparation of MSC mitochondria derived from osteoarthritis patients
  • Adipose tissue from osteoarthritis patients was chopped, filtered through a 100um filter, and centrifuged at 200g for 3 minutes at 4°C. Only the yellow fat floating on the top was collected, and the tissue was separated into a single cell unit using collagenase. After one hour, 200 g was centrifuged at 4° C. for 3 minutes, leaving only the settled pellets, washed, and the cells were separated with a 40 ⁇ m filter. The isolated cells were cultured in MEM medium containing 10% FBS. After centrifuging the culture at 200 g for 3 minutes at 4° C., the pellet was suspended in IBM buffer and the cell membrane was ruptured using a homogenizer. Then centrifuged to obtain a mitochondrial pellet.
  • Example 1-2 The therapeutic effect of MSC mitochondria from osteoarthritis patients on osteoarthritis
  • the present inventors performed an experiment to analyze the therapeutic effect after injecting stem cell-derived mitochondria into osteoarthritis-induced animal models.
  • mesenchymal stem cell-derived mitochondria isolated as in Example 1-1 were injected into the joint cavity of the MIA model (i.a) once a week at a concentration of 10ug/100ul intra-articularly for a total of 3 weeks. . Weight bearing evaluation was evaluated after MIA induction and was measured once a week.
  • mice were sacrificed 3 weeks after MIA induction, and the degree of damage to the articular cartilage tissue was analyzed by staining the joint cartilage with safranin O.
  • the present inventors performed an experiment to confirm whether the antibody modulating effect by the mesenchymal stem cell-derived mitochondria in the osteoarthritis-induced animal model.
  • mice were sacrificed 3 weeks after MIA induction in animal models, and IHC immunostaining was performed to analyze inflammatory factor-expressing immune cell infiltration in joint tissues.
  • IL-1 ⁇ , MMP13, and MCP-1 expressing cells in joint tissues were analyzed using each specific antibody.
  • FIG. 5 is a knee through CT in 3 groups of rats that did not induce osteoarthritis (WT), rats induced with osteoarthritis (MIA), and rats administered mesenchymal stem cell-derived mitochondria after induced osteoarthritis (MIA+MSC mitochondria)
  • WT osteoarthritis
  • MIA rats induced with osteoarthritis
  • MIA+MSC mitochondria mesenchymal stem cell-derived mitochondria after induced osteoarthritis
  • the present inventors analyzed whether TH17/Treg cells were controlled by mesenchymal stem cell-derived mitochondria in an animal model in which osteoarthritis was induced. Rats were sacrificed 3 weeks after MIA induction, cells were isolated from the spleen tissue of each rat, and Th17 and Treg cell activities were analyzed by flow cytometry. For flow cytometry, CD4-PerCP, IL-17 APC, Foxp3-ECD, and CD25-FITC were stained, and the stained cells were analyzed by flow cytometry.
  • Example 1-6 Control of chondrocyte proliferation by mesenchymal stem cell-derived mitochondria
  • the experiment was conducted for a total of 3 days by dividing them into groups treated with no treatment, conditions treated with IL-1 ⁇ , and mesenchymal stem cell-derived mitochondria after treatment with IL-1 ⁇ .
  • Example 1-7 Osteoarthritis treatment effect by zinc-treated mesenchymal stem cell-derived mitochondria
  • mesenchymal stem cell-derived mitochondria isolated as in Example 1-1 were injected into the joint cavity of the MIA model (i.a) once a week at a concentration of 10ug/100ul intra-articularly for a total of 3 weeks. . Weight bearing evaluation was evaluated after MIA induction and was measured once a week.
  • Adipose tissue from osteoarthritis patients was chopped, filtered through a 100um filter, and centrifuged at 200g for 3 minutes at 4°C. Only the yellow fat floating on the top was collected, and the tissue was separated into a single cell unit using collagenase. After one hour, 200 g was centrifuged at 4° C. for 3 minutes, leaving only the settled pellets, washed, and the cells were separated with a 40 ⁇ m filter. The isolated cells were cultured in MEM medium containing 10% FBS. Zinc sulfide was added to the cell medium for 3 days at a concentration of 10 nM and treated. After centrifuging the culture at 200 g for 3 minutes at 4°C, the pellet was suspended in IBM buffer and the cell membrane was ruptured using a homogenizer. Then, the mitochondrial pellet was obtained by centrifugation using a mitochondrial isolation kit.
  • Example 2-2 Therapeutic effect of zinc-treated MSC-derived mitochondrial osteoarthritis
  • the present inventors performed an experiment to analyze the therapeutic effect after injecting the vector into an osteoarthritis-induced animal model in order to confirm the osteoarthritis treatment effect of the zinc-treated MSC-derived mitochondria.
  • muscle-derived mitochondria isolated as in Example 2-1 were injected into the joint cavity of the MIA model (i.a) once a week at a concentration of 5 ug/100 ul once a week for a total of 3 weeks. Weight bearing evaluation was evaluated after MIA induction and was measured once a week.
  • Example 2-3 Protective effect on knee joint damage by zinc-treated MSC-derived mitochondria
  • Figure 8 shows the 4 groups of rats (WT) that did not induce osteoarthritis, vehicle treated group (Vehicle), MSC-derived mitochondrial treatment group without zinc treatment (MSC Mito), and zinc-treated MSC-derived mitochondrial treatment group (Zinc MSC Mito)
  • WT vehicle treated group
  • MSC Mito MSC-derived mitochondrial treatment group without zinc treatment
  • Zinc MSC Mito zinc-treated MSC-derived mitochondrial treatment group
  • Example 2-4 Effect of TH17/Treg cell regulation by zinc-treated MSC-derived mitochondria
  • TH17/Treg cells were controlled by the zinc-treated MSC-derived mitochondria in the osteoarthritis-induced animal model. Rats were sacrificed 3 weeks after MIA induction, cells were isolated from the spleen tissue of each rat, and Th17 and Treg cell activities were analyzed by flow cytometry. For flow cytometry, CD4-PerCP, IL-17 APC, Foxp3-ECD, and CD25-FITC were stained, and the stained cells were analyzed by flow cytometry.
  • Example 2-6 Confirmation of inhibition of inflammatory apoptosis of chondrocytes by administration to zinc-treated MSC-derived mitochondria
  • each MSC-derived mitochondria (5ug) was treated and cell cultured for 1 day, followed by apoptosis through Annexin V/PI facs staining. was analyzed.
  • the zinc-treated MSC increased the survival rate of chondrocytes and suppressed apoptosis (necroptosis) compared to the zinc-untreated MSC ( FIG. 11 ).
  • Example 3 Composition for preventing or treating immune diseases including muscle-derived mitochondria
  • the present inventors performed an experiment to analyze the therapeutic effect after injecting the muscle-derived mitochondria into an osteoarthritis-induced animal model.
  • muscle-derived mitochondria isolated as in Example 3-1 were injected into the joint cavity of the MIA model (i.a) at a concentration of 10ug/100ul once a week for a total of 3 weeks. Weight bearing evaluation was evaluated after MIA induction and was measured once a week.
  • mice were sacrificed 3 weeks after MIA induction, and the degree of damage to the articular cartilage tissue was analyzed by staining the cartilage with safranin O.
  • the present inventors performed an experiment to determine whether the antibody modulating effect by muscle-derived mitochondria in an animal model induced with osteoarthritis.
  • mice were sacrificed 3 weeks after MIA induction in animal models, and IHC immunostaining was performed to analyze the infiltration of inflammatory factor-expressing immune cells in the articular synobium tissue.
  • IL-1 ⁇ , MMP13, MCP-1, and COX4 expressing cells were analyzed in synobium tissues using each specific antibody.
  • mice injected with muscle-derived mitochondria the number of cells expressing IL-1 ⁇ , MMP13 and MCP1, which are factors known to worsen the condition of osteoarthritis, was reduced compared to the MIA group, which is an osteoarthritis induction model.
  • COX4 a marker for measuring the amount of mitochondria, rather showed an increase in the muscle-derived mitochondrial injection group ( FIG. 14 ), which is thought to be an effect due to the increased mitochondria.
  • the present inventors analyzed whether TH17/Treg cells were controlled by muscle-derived mitochondria in an animal model in which osteoarthritis was induced.
  • mice were sacrificed at 3 weeks, cells were isolated from the spleen tissue of each animal model, and Th17 and Treg cell activities were analyzed by flow cytometry.
  • flow cytometry CD4-PerCP, IL-17 APC, Foxp3-ECD, and CD25-FITC were stained, and then the stained cells were analyzed by flow cytometry.
  • RNA samples were obtained.
  • the obtained RNA was synthesized as cDNA, and the amounts of MMP1, MMP3, and MMP13, which are metabolic markers of chondrocytes, at the mRNA level were measured and analyzed using QPCR.
  • PBMC blood cells
  • IL-7 and IL-10 were measured by ELISA.
  • PBMC blood cells
  • muscle-derived mitochondria changes in immune cells were observed after co-culturing blood cells (PBMC) and muscle-derived mitochondria from male transplant disease patients and the general public who had undergone liver transplantation for 3 days. As can be seen in FIG. 17 , it was confirmed that the expression of Th17 cells was inhibited by muscle-derived mitochondria.
  • Example 3-4 Confirmation of therapeutic effect on autoimmune diseases of the nervous system by muscle-derived mitochondria
  • an experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) animal model was prepared using the MOG peptide. Specifically, the animal model was stabilized for one week by preparing 8-week-old female C57BL/6 mice (Narabiotechnology, Korea; weight 22-24 g) after birth. Mice were mixed with an emulsion containing 200 ug of MOG peptide 35-55 (Sigma-Aldrich, USA) and IFA (Incomplete Freund's adjuvant; Difco, USA) containing 200 ug of mycobacterium tuberculosis (Difco, USA).
  • EAE experimental autoimmune encephalomyelitis
  • 0.1 ml of the emulsion was subcutaneously injected into both waists of the EAE group, and 500 ng of pertussis toxin (PTX, pertussis toxin; List Biologic, USA) was intraperitoneally injected at the same time. After 48 hours, the same amount of pertussis toxin was re-injected intraperitoneally.
  • the clinical symptoms of the chronic EAE animal model induced by the MOG were divided into eight categories and confirmed. i.e. no response (stage 0), tail tip drooping (stage 1), full tail drooping (stage 2), tail drooping and paralysis of one hind leg (stage 3), paralysis of both hind legs (stage 4), death (Step 5) Separated.
  • muscle cell-derived mitochondria were administered to mice twice a week at a concentration of 10ug/200ul for a total of 6 times, and the result of confirming the disease score is shown in FIG. 19A. As a result, the effect in the group treated with muscle-derived mitochondria confirmed
  • 19B is flow cytometry analysis of immune cells in spleen tissue at the time of mouse sacrifice, IL-17 in CD4 T cells (IL-17 + CD4 + ), IL-17 in CD8 T cells (IL-17+CD8+) , IL-17 (IL-17 + CD19 + ) immune cell subtypes in CD19 B cells were analyzed. Results It was confirmed that each T and B cell subtype expressing IL-17 in the muscle-derived mitochondrial transplantation EAE group decreased, and the expression of mitochondrial ROS generation (mitoSOX) was significantly reduced.
  • 19C shows that the degree of destruction of the spinal cord tissue at the time of mouse sacrifice was analyzed through H&E and LFB (Luxol fast blue) staining, and it was confirmed that the white matter and gray matter of the spinal cord tissue in the mitochondrial administration group were clearly distinguished, and tissue damage was suppressed.
  • Example 3-5 Confirmation of treatment effect of Sjogren's syndrome by muscle-derived mitochondria
  • the present inventors injected muscle-derived mitochondria into a non-obese diabetic (NOD) mouse, an animal model of Sjogren's syndrome, and then Salivation ability and secretion retention were investigated. After the onset of Sjogren's syndrome by intraperitoneal injection into a control (vehicle) or 10ug/200ug mitochondrial NOD/ShiLtJ mice, a total of 5 injections were performed once a week.
  • NOD non-obese diabetic
  • the amount of saliva was measured by collecting saliva after administration of 0.1 mg of pilocarpine.
  • mitochondria were administered a total of 5 times after disease onset, and in the group treated with mitochondria at 13 weeks after disease onset, compared to the control group (vehicle), salivation capacity (FIG. 20A, measured by flow rate, saliva/weight per minute) was higher It was confirmed that there was a significant increase.
  • the present inventors performed flow cytometry analysis to identify Th17 cells (immunostaining with CD4 and IL-17 antibodies), B17 cells, and Th1 cells in the spleen tissue of a mouse model of Sjogren's syndrome. In addition, it was confirmed that the activity of IL-17 + CD4 + Th17 cells in the salivary gland tissue was reduced. As a result, it was confirmed that mitochondria decreased Th17 cells, B17 cells, and Th1 cells in the spleen tissue and salivary gland tissue ( FIG. 20B ).
  • the present inventors determined whether or not to maintain the shape of cells in the lacrimal and salivary glands of mice, which are animal models of Sjogren's syndrome, and the infiltration of inflammatory cells. An experiment was performed to confirm whether or not it was through the H & E staining method known in the art.
  • an inflammatory bowel disease animal model was prepared. Specifically, 7-week-old male C57BL/6 mice were watered with 3% dextran sodium sulfate (DDS). Water was replaced with general drinking water on the 5th day. As a control group, it was classified into a normal group untreated and a vehicle group administered with physiological saline.
  • DDS dextran sodium sulfate
  • mice of each group of Example 4-1-1 were humanely sacrificed on the 17th day after DSS administration, and the intestine (large intestine) was extracted, and the length of the intestine was measured for each group.
  • the intestinal tissue obtained in Example 4-1-2 was prepared as a paraffin block, cut, and stained with hematoxylin and eosin, and histopathological evaluation was performed. Specifically, after observing the tissue with the staining, the degree of crypt damage, infiltration, and reduction of epithelium and goblet cells were expressed as histological scores.
  • Example 4-1-2 The intestinal tissue obtained in Example 4-1-2 was prepared as a paraffin block and then cut, and the expression of inflammatory cytokines IL-6, IL-17 and chemokine MCP-1 was confirmed through immunohistochemical staining. As a result, it was confirmed that the expression of IL-6, IL-17 and MCP-1 in the tissues was increased in the Vehicle group compared to the Normal group, and the increased expression of these factors was significantly decreased in the mitochondrial injection group. was confirmed (FIG. 24).
  • the frequency of regulatory B cells in the mesenteric lymph node obtained at the time of mouse sacrifice in Example 4-1-2 was confirmed. Specifically, the obtained mesenteric lymph nodes were stained with CD19, CD5, CD1d and IL-10 antibodies, and then IL-10-expressing regulatory B cells (IL-10-producing B cells) were analyzed through flow cytometry. .
  • Example 4-5 Check the regulation of intestinal flora
  • the cecal content was obtained from the cecum of the mice sacrificed in Example 4-1-2 and the intestinal microbiota was analyzed. After colony analysis, as an abundance ratio of the phyla Bacteroidetes and Firmicutes, the effect of regulating the flora according to mitochondrial transplantation was confirmed.
  • the flora belonging to the Bacteroidetes phylum increased in the inflammatory bowel disease induced group, and the flora of the Firmicutes phylum increased in the mitochondrial injection group, confirming that mitochondrial transplantation regulates the intestinal flora. .
  • the mitochondrial transplantation of the present invention suppressed weight loss and intestinal damage caused by inflammatory bowel disease, and it was confirmed that the expression of inflammatory cytokines IL-6, IL-17 and chemokine MCP-1 was effectively inhibited. did. In addition, it was confirmed that by increasing regulatory B cells and regulating the intestinal flora, it was possible to effectively improve inflammatory bowel disease.

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Abstract

본 발명은 미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는 자가면역질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 조성물은 골관절염의 통증을 경감시키고 증상을 완화시키며 관절 손상이 감소시키고, 연골세포의 분화를 촉진하며 연골세포의 염증성세포 사멸을 억제하여 골관절염을 효과적으로 예방하고 치료할 수 있다. 또한, 본 발명에 근육 유래 미토콘드리아는, 골관절염 동물모델 뇌척수염 모델 쇼그렌 증후군 동물모델 및 이식거부반응 모델에서도 염증성 사이토카인 및 Treg/Th17 세포의 조절능력을 가져, 이를 다양한 염증성 질환 또는 면역질환에 이용가능하다.

Description

미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는 자가면역질환 예방 또는 치료용 조성물
본 발명은 미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는 자가면역질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
미토콘드리아는 세포 내 에너지 공급원인 아데노신 트라이포스페이트(ATP)의 합성 및 조절에 관여하는 진핵세포의 세포 소기관이다. 미토콘드리아는 생체 내 다양한 대사 경로, 예를 들어, 세포 신호처리, 세포 분화, 세포사멸 뿐만 아니라, 세포 주기 및 세포 성장의 제어와 연관이 있다. 미토콘드리아는 자신의 유전체를 보유하고 있으며, 세포의 에너지 대사에 중추적 역할을 하는 소기관이다. 미토콘드리아는 전자 전달 및 산화적 인산화 과정을 통해 에너지를 생산하며, 세포사멸 신호 전달 경로에 관여하는 등 중요한 역할을 한다.
미토콘드리아의 기능 저하에 의한 에너지 생산 감소는 다양한 질병을 유발하는 것으로 보고된 바 있다. 미토콘드리아 유전체 및 단백체의 변이에 따라 전자전달연쇄반응의 기능이 저하될 경우, ATP 생산 감소, 활성산소 과다 생성, 칼슘 조절 기능의 저하 등이 일어나게 된다. 이러한 경우 미토콘드리아의 막 투과성에 변화가 일어나 세포사멸의 기능이 비정상적으로 일어나게 되고 이에 따른 암 및 난치성 질환이 야기될 수 있다.
이와 같이 미토콘드리아 기능 이상에 의해 발생하는 인간 질병으로는 미토콘드리아 관련 유전병(Wallace DC 1999), 당뇨병(Maechler P 2001), 심장질환(Sorescu D 2002), 파킨슨병이나 알츠하이머병 등과 같은 노인성 치매(Lin MT 2006), 그리고 각종 암의 발생(Petros JA, 2005)과 암전이(Ishikawa K, 2008) 등이 보고된 바 있다. 또한, 200여종 이상의 다양한 암에서 공통적으로 발견되는 특징은 세포사멸(apoptosis) 기능의 손상, 염증반응의 증가, 그리고 비정상적인 대사 작용의 증가로 이루어졌다. 또한, 현재 미토콘드리아와 면역질환과의 관련성에 대한 연구가 진행되고 있다.
미토콘드리아는 에너지 공급원으로서 아데노신 트라이포스페이트(adenosine triphosphate: ATP) 합성 및 조절에 관여하는 진핵 세포의 생존에 필수적인 세포 소기관이다. 미토콘드리아는 생체 내 다양한 대사 경로, 예를 들어, 세포 신호처리, 세포 분화, 세포 사멸뿐만 아니라 세포 주기 및 세포 성장의 제어와 연관이 있다.
따라서, 미토콘드리아가 손상되면 다양한 질병이 유발될 수 있는데, 대부분의 공지된 미토콘드리아 장애는 미토드리아 DNA에서 발생하는 유전성 또는 후천성 돌연변이에 기인한다. 예를 들어, 미토콘드리아 막전위 이상으 로 인한 팽윤, 활성산소종, 또는 자유라디칼 등에 의한 산화적 스트레스, 그리고 미토콘드리아의 에너지 생성을 위한 산화적 인산화 기능의 결함 등에 의해 미토콘드리아의 기능이 변형될 수 있다.
구체적으로, 미토콘드리아의 기능이상은 다발성경화증, 뇌척수염, 뇌신경근염, 말초신경변증, 라이증후군, 알퍼 증후군, MELAS, 편두통, 정신병, 우울증, 발작과 치매, 중풍성 에피소드, 시신경위축, 시신경병증, 망막색소변 성, 백내장, 고알도스테론혈증, 부갑상선기능저하증, 근위축증, 미오글로빈뇨, 근육긴장저해, 근육통, 운동내성 저하, 세뇨관증, 신부전, 간부전, 간기능부전, 간비대, 철적혈구빈혈, 호중성백혈구 감소증, 저혈소판증, 설사, 융모위축, 다발성구토, 연하곤란, 변비, 감각신경난청, 허혈성 질환, 정신지체, 간질, 알츠하이머, 파킨슨, 헌 팅턴 질환 등의 다양한 질병에 직접 또는 간접적인 원인이 되는 것으로 알려져 있다.
한편, 허혈성 질환은 혈류의 공급 감소로 인해 조직을 구성하는 세포의 비가역적인 손상이 발생된 것으로, 허혈 연쇄반응(ischemic cascade)이라 불리는 과정들이 촉발되어 뇌, 심장 또는 말초 조직이 영구적으로 기능을 상실하는 질병이다. 허혈성 질환은 예를 들어, 중증하지허혈증, 심근경색, 허혈성 뇌졸중 및 허혈성 대장염 등이 있다.
특히, 미토콘드리아 기능 장애로 인해 증가된 활성산소(수퍼옥사이드, 퍼옥시나이트라이트, 하이드록시 라디칼, 과산화수등)는 과산화지방질(lipid peroxidation)을 유발하는데, 이는 허혈성 질환에서 나타나는 세포 손상의 주요인으로 알려져 있다.
미토콘드리아 내부에 세포사와 밀접한 관계를 갖는 신호전달기전들이 존재하고 이들 신호를 해석하고 제어할 수 있다면 질병치료에 응용할 수 있다 (Biochimica et Biophysica Acta, 2006; Cell, 2005; Trends Biochem Sci, 2005; Nature Med, 2005; Nature, 2005; J Clin Invest, 2005; Heart Lung Circ, 2005; J Nat Cancer Inst, 2005, Science, 2005). 미토콘드리아 기능저하는 단일한 증상이나 질병이 아닌 인체내 다양한 기관에서 다양한 질병으로 나타날 수 있어, 병든 미토콘드리아와 연관된 병소 및 질병 특이적이 치료법의 가능성이 제기되고 있으나 현재까지 정확한 타깃이나 합당한 치료기술 개발이 시급한 상태이다. 특히 세포내 증가한 활성산소종으로 인한 산화스트레스의 증가는 최근 심혈관·대사질환은 물론 퇴행성신경 질환에서의 세포학적·분자생물학적 근본 기전으로 제시되고 있으나, 현재까지 임상 및 전임상 단계에서 사용되는 대사성치료제 또는 항산화제 치료는 효과는 아직 논란의 여지가 있다. 미토콘드리아 기능을 직접 제어할 수 있는 막단백질 및 기질 단백질의 발현을 조절할 수 있는 미세표적화치료(micro-targetingtherapy)로서의 유전자 치료법은 영구적 또는 반영구적 치료법으로서 가능성이 높은 전략이다.
한편, 각종 병원체에 대한 생체 방어 시스템으로 면역계에서 중심적 역할을 담당하는 세포군의 하나로 T 세포가 있다. T 세포는 인체의 흉선에서 생성되며 일련의 분화 과정을 거치면서 고유의 특성을 지닌 T 세포로 분화하게 되는데, 분화를 완료한 T 세포는 그 기능에 따라 크게 1형 보조 세포(Th1)와 2형 보조 세포(Th2)로 구분된다. 이 중에서 Th1 세포의 주된 기능은 세포 매개성 면역에 관여하고, Th2 세포는 체액성 면역에 관여하며, 면역계에서 이러한 두 세포 집단은 서로 과 활성화되지 않도록 서로 견제를 통해 면역계의 균형을 유지하고 있다.
따라서 면역질환의 대부분은 이러한 두 가지 면역 세포간의 불균형에 기인하는 것으로 볼 수 있는데, 예를 들어 Th1 세포의 활성이 비정상적으로 증가하는 경우 자가면역질환이 발생할 수 있고, Th2 세포의 활성이 비정상적으로 증가하는 경우 과민반응에 의한 면역질환이 발생하는 것으로 알려져 있다.
한편, Th1 세포의 분화에 대한 최근 연구 결과에 따르면, Th1 세포의 활성을 조절할 수 있는 새로운 그룹인 면역조절 T 세포(Treg)의 존재가 알려지면서 이를 이용한 면역질환의 치료에 대한 연구가 대두되고 있는데, Treg 세포는 비정상적으로 활성화된 면역세포의 기능을 억제하여 염증 반응을 제어하는 특성이 있어, Treg 세포의 활성을 증가시키는 작용을 통해 면역질환을 치료하고자 하는 연구들이 많이 진행되고 있다.
또한, Treg 세포 이 외에 T 세포의 분화 과정에서 만들어지는 또 다른 그룹으로 Th17 세포가 있는데, Th17 세포는 미분화 T세포의 분화 과정에서 Treg 세포의 분화와 유사한 과정을 거치며 형성되는 것으로 알려져 있다. 즉, Treg 세포와 Th17 세포의 분화는 공통적으로 TGF-β의 존재 하에서 이루어지지만, Treg 세포의 경우 IL-6을 필요로 하지 않는 반면, Th17 세포의 경우에는 TGF-β와 함께 IL-6가 존재하는 상황에서 분화를 한다. 또한, 분화된 Th17 세포는 IL-17을 분비하는 것을 특징으로 한다.
Th17 세포는 Treg 세포와는 달리 면역질환에서 보이는 염증반응의 최전방에서 관여하여 염증 반응의 신호를 최대화시켜 질병의 진행을 가속화시키는 것이 밝혀지고 있다. 그러므로 자가면역질환 중 Treg 세포에 의해 제어되지 않는 자가면역질환의 경우, Th17 세포 활성의 억제를 표적으로 한 자가면역질환의 치료제 개발이 크게 부각되고 있다.
골관절염(osteoarthritis)은 퇴행성 관절염으로 칭해지기도 하는 관절염의 일종으로서, 윤활 관절에서 연골과 주위골에 퇴행성 변화가 나타나서 생기는 관절 염을 말한다. 즉, 골관절염은 관절 연골의 점차적인 소실과 더불어 연골 하방에 위치한 뼈의 비대, 관절 가장자리 부위의 골 생성, 및 비특이적인 활막 염증을 특징으로 하는 질환이다. 골관절염은 노화나 과도한 물리적 압박(예를 들어, 비만, 외상 등)에 의해서 연골이 손상되어 발생하는 질환이다. 따라서, 골관절염은 체중을 많이 받는 관절, 즉, 무릎(슬)관절, 엉덩이 (고)관절 등에 심한 통증과 운동 장애를 나타내며, 장기간 방치할 경우에는 관절의 변형까지 초래하게 된다.
면역억제제란 항원의 작용에 대하여 숙주가 항체를 만드는 능력(체액성 면역반응) 또는 세포성 면역반응을 일으키는 능력을 저하시키거나 차단하기 위해 사용되는 다양한 물질들을 말한다. 이러한 면역억제제는 장기이식분야 뿐만 아니라 루푸스, 류마티스 관절염 등과 같은 자가면역질환과, 아토피, 알러지 등의 피부과민 반응에도 유용하게 사용될 수 있다. 우수한 면역억제제는 면역반응의 불균형을 조절할 수 있어야 하고, 인체에 대한 안전성이 확보되어야 하며, 장기간 치료시에 질환의 재발 발생 빈도가 낮아야 한다.
현재 사용되고 있는 면역억제제로는 사이클로스포린 A와 FK506 등이 있는데, 이들은 복잡한 화학구조를 가진 천연물 유래의 화합물로서 원료 수급의 측면에서 고비용이 드는 문제점이 있어 비경제적이고, 장기투여로 인해 각종 부작용이 야기될 수 있다는 위험성을 내포하고 있다. 따라서 낮은 독성 및 면역관용 유도와 함께 경제적인 생산이 가능한 새로운 면역억제제의 개발이 절실히 요구되고 있는 실정이다.
본 발명의 목적은 미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는 자가면역질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명의 목적은 미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는, IL-17이 매개하는 자가면역질환의 예방 또는 치료방법을 제공할 수 있다.
본 발명의 목적은 미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는, 자가면역질환의 예방 또는 치료방법에 있어서, 상기 미토콘드리아의 STAT3를 증가시키는 방법을 제공할 수 있다.
본 발명의 목적은 미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는, 자가면역질환의 예방 또는 치료방법에 있어서, (1) Th17의 활성을 저해하고, (2) Treg를 활성화시키고, (3)염증성 사이토카인 IL-1β, IL-6와 케모카인 MCP-1을 감소시키며, 및, (4) COX2의 발현을 억제시키는 방법을 제공할 수 있다.
상기 목적의 달성을 위해, 본 발명은 미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는 자가면역질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는, IL-17이 매개하는 자가면역질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
또한 본 발명은 미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는, 자가면역질환의 예방 또는 치료방법에 있어서, 상기 미토콘드리아의 STAT3를 증가시키는 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는, 자가면역질환의 예방 또는 치료방법에 있어서, (1) Th17의 활성을 저해하고, (2) Treg를 활성화시키고, (3)염증성 사이토카인 IL-1β, IL-6와 케모카인 MCP-1을 감소시키며, 및, (4) COX2의 발현을 억제시키는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 조성물은 골관절염의 통증을 경감시키고 증상을 완화시키며 관절 손상이 감소시키고, 연골세포의 분화를 촉진하며 연골세포의 염증성세포 사멸을 억제하여 골관절염을 효과적으로 예방하고 치료할 수 있다. 또한, 본 발명에 근육 유래 미토콘드리아는, 골관절염 동물모델 뇌척수염 모델, 쇼그렌 증후군 동물모델 및 이식거부반응 모델에서도 염증성 사이토카인 및 Treg/Th17 세포의 조절능력을 가지며, 또한 염증성 사이토카인인 IL-6, IL-17 및 케모카인 MCP-1의 발현을 효과적으로 억제 조절 B 세포를 증가시키고, 장내 균총을 조절하여, 효과적으로 염증성 장질환을 개선시킬 수 있어, 이를 다양한 염증성 질환 또는 면역질환에 이용가능하다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 있어서, MSC 유래 미토콘드리아에 의한 골 관절염 동물모델의 통증 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 있어서, MSC 유래 미토콘드리아가 투여된 군에서의 safranin O 염색 이미지 및 임상적 관절염 평가지수를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 있어서, MSC 유래 미토콘드리아가 투여된 동물에서 IHC 염색 이미지 및 IL-1β, MMP13 및 MCP1 의 발현을 확인한 결과이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 있어서, MSC 유래 미토콘드리아에 의한 TH17/Treg 세포 동시 조절 능력을 확인한 분석 결과이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 있어서, MSC 유래 미토콘드리아에 의한 연골손상 억제 능력을 확인한 CT 분석 결과이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 있어서, MSC 유래 미토콘드리아가 IL-1β에 의해 손상된 연골세포의 증식 회복 능력을 돕는다는 것을 확인한 결과이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 있어서, 아연에 의해 기능이 강화된 MSC 유래 미토콘드리아의 골관절염 치료 효과를 확인한 도이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 있어서, 아연 처리 MSC 유래 미토콘드리아에 의한 연골손상 억제 능력을 확인한 CT 분석 결과이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 있어서, 아연 처리 MSC 유래 미토콘드리아에 의한 TH17/Treg 세포 동시 조절 능력을 확인한 분석 결과이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 있어서, 세포와 미토콘드리아의 단백질 발현도를 분석한 웨스턴 블롯팅 결과이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 있어서, 아연 처리 MSC 투여에 의한 콘드로사이트 세포 내 염증성 세포 사멸 억제 조절 효과를 확인한 분석 결과이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 있어서, 근육 유래 미토콘드리아에 의한 골 관절염 환자의 통증 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 있어서, 근육 유래 미토콘드리아가 투여된 군에서의 safranin o 염색 이미지 및 임상적 관절염 평가지수를 나타낸 것이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 있어서, 근육 유래 미토콘드리아가 투여된 동물에서 IHC 염색 이미지 및 IL-1β, MMP13, MCP1 및 cox4의 발현을 확인한 결과이다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에 있어서, 근육 유래 미토콘드리아에 의한 TH17/Treg 세포 동시 조절 능력을 확인한 분석 결과이다
도 16은 본 발명의 일 실시예에 있어서, 근육 유래 미토콘드리아에 연골 세포에서의 MMP1, MMP3, MMP12의 억제 조절에 분석 결과이다.
도 17은 본 발명의 일 실시예에 있어서, 면역염증질환 환자 PBMC 내에 근육 유래 미토콘드리아 투여에 의한 IL-17/Th17 세포 활성 억제에 대한 결과이다.
도 18은 본 발명의 일 실시예에 있어서, 면역염증질환 환자 PBMC 내에 근육 유래 미토콘드리아 투여에 의한 IL-17/IL-10 동시 조절 효력 분석에 대한 결과이다.
도 19는 본 발명의 일 실시예에 있어서, 근육 유래 미토콘드리아 투여에 의한 뇌척수염등 신경계 자가면역질환에 대한 치료효과를 확인한 도이다.
도 20은 본 발명의 일 실시예에 있어서, 근육 유래 미토콘드리아 투여에 의한 쇼그렌 증후군의 치료효과를 확인한 도이다.
도 21은 염증성 장질환이 유도된 마우스에, 미토콘드리아의 이식에 따른 체중 변화를 확인한 것이다.
도 22는 염증성 장질환이 유도된 마우스에, 미토콘드리아의 이식에 따른 장 길이의 변화를 확인한 것이다.
도 23은 염증성 장질환이 유도된 마우스의 장 조직에서, 미토콘드리아 이식에 따른 장 조직 보호를 확인한 도이다(A: H&E 염색 관찰, B: 조직학적 지수 정량화).
도 24는 염증성 장질환이 유도된 마우스의 장 조직에서, 미토콘드리아의 이식에 따른 염증성 사이토카인의 발현을 면역조직화학염색으로 확인한 도이다(A: 면역조직화학 염색 관찰, B: 사이토카인 발현 정량화).
도 25는 염증성 장질환이 유도된 마우스의 장막간 림프절에서, 미토콘드리아 이식에 따른 조절 B 세포의 조절을 유세포분석으로 분석하여 정량화한 도이다.
도 26은 염증성 장질환이 유도된 마우스의 맹장에서, 미토콘드리아 이식에 따른 장내 균총의 변화를 확인한 도이다.
이하, 본 발명의 구현예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 구현예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않으며 본 발명은 후술하는 특허청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.
본 발명은 미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는 자가면역질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물한다.
본 발명에서, 용어 "예방"이란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 자가면역질환 발생 및 이로 인한 합병증을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를의미한다.
본 발명에서 사용된 용어 "치료"란 상기 약학적 조성물의 투여에 의해 자가면역질환의심 및 발병 개체의 증상이 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를의미한다. 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면, 대한의학협회 등에서 제시된 자료를 참조하여 본원의 조성물이 효과가 있는 질환의 정확한 기준을 알고, 개선, 향상 및 치료된 정도를 판단할 수 있을 것이다.
본 발명의 약학 조성물에는 유효성분 이외에 보조제(adjuvant)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 보조제는 당해 기술분야에 알려진 것이라면 어느 것이나 제한 없이 사용할 수 있으나, 예를 들어 프로인트(Freund)의 완전 보조제 또는 불완전 보조제를 더 포함하여 그 면역성을 증가시킬 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 유효성분을 약학적으로 허용된 담체에 혼입시킨 형태로 제조될 수 있다. 여기서, 약학적으로 허용된 담체는 제약 분야에서 통상 사용되는 담체, 부형제 및 희석제를 포함한다. 본 발명의 약학 조성물에 이용할 수 있는 약학적으로 허용된 담체는 이들로 제한되는 것은 아니지만, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀전, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
제제화할 경우에는 통상 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 그러한 고형 제제는 유효성분에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면 전분, 칼슘 카르보네이트, 수크로스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 일반적으로 사용되는 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수용성용제, 현탁제로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브유와 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 개체에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식이 예상될 수 있는데, 예를 들면 경구, 정맥, 근육, 피하, 복강내 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물의 투여량은 개체의 연령, 체중, 성별, 신체 상태 등을 고려하여 선택된다. 상기 약학 조성물 중 포함되는 유효성분의 농도는 대상에 따라 다양하게 선택할 수 있음은 자명하며, 바람직하게는 약학 조성물에 0.01 ~ 5,000 ㎍/ml의 농도로 포함되는 것이다. 그 농도가 0.01 ㎍/ml 미만일 경우에는 약학 활성이 나타나지 않을 수 있고, 5,000 ㎍/ml를 초과할 경우에는 인체에 독성을 나타낼 수 있다.
상기 약학 조성물은 다양한 경구 또는 비경구 투여 형태로 제형화될 수 있다.
경구 투여용 제형으로는 예를 들면 정제, 환제, 경질, 연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 과립제 등이 있는데, 이들 제형은 유효성분 이외에 희석제(예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/또는 글리신), 활택제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/ 또는 폴리에틸렌 글리콜)를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 정제는 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 트라가칸스, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및/또는 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 함유할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제 또는 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 향미제 및 감미제를 함유할 수 있다. 상기 제형은 통상적인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 의해 제조될 수 있다.
또한, 비경구 투여용 제형의 대표적인 것은 주사용 제제이며, 주사용 제제의 용매로서 물, 링거액, 등장성 생리식염수 또는 현탁액을 들 수 있다. 상기 주사용 제제의 멸균 고정 오일은 용매 또는 현탁 매질로서 사용할 수있으며 모노-, 디-글리세라이드를 포함하여 어떠한 무자극성 고정오일도 이러한 목적으로 사용될 수 있다.
또한, 상기 주사용 제제는 올레산과 같은 지방산을 사용할 수 있다.
상기 미토콘드리아는 인간을 포함하는 포유동물로부터 분리된 것일 수 있으며, 인간을 포함하는 포유동물의 지방 등의 잉여조직의 세포로부터 분리된 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 미토콘드리아는 골관절염 환자의 체세포, 생식세포 및 줄기세포로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 세포로부터 분리된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 줄기세포는 중간엽줄기세포, 성체줄기세포, 역분화줄기세포, 배아줄기세포, 골수줄기세포, 신경줄기세포, 윤부줄기세포 및 조직 유래 줄기세포로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 세포일 수 있으며, 예를 들어 중간엽줄기세포(MSC)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
한편, 상기 미토콘드리아를 특정 세포로부터 분리하는 경우에는, 예를 들어, 특정 버퍼 용액을 사용하거나 전위차 및 자기장을 이용하는 등 공지된 다양한 방법을 통해 미토콘드리아를 분리할 수 있다.
상기 미토콘드리아 분리는 미토콘드리아 활성 유지 측면에서, 세포를 파쇄하고원심분리를 하여 수행할 수 있다. 일 구체예로, 세포를 배양하고, 이러한 세포를 포함하는 조성물을 제1차 원심분리하여 펠렛을 생성하는 단계, 상기 펠렛을 버퍼 용액에 재현탁시키고, 균질화하는 단계, 상기 균질화된 용액을 제2차 원심분리하여 상청액을 제조하는 단계 및 상기 상청액을 제3차 원심분리하여 미토콘드리아를 정제하는 단계로 수행될 수 있다. 이때, 제2차 원심분리가 수행되는 시간은 제1차 및 제3차 원심분리가 수행되는 시간보다 짧도록 조절되는 것이 세포 활성 유지 면에서 바람직하며, 제1차 원심분리에서 제3차 원심분리로 갈수록 속도를 높일 수 있다.
또한, 상기 미토콘드리아는 세포를 배양한 후 얻어진 배양액 내에서 수득할 수 있다. 이러한 배양액에는 세포가 분비한 사이토카인, 케모카인, 엑소좀 및 미세소포체 등과 미토콘드리아가 포함될 수 있다. 일 구체예로, 상기미토콘드리아 분리는 세포를 배양하고, 얻어진 배양액을 포함하는 조성물을 제1차 원심분리하여 세포잔해 등을 제거하고 상청액을 수득하는 단계, 상기 상청액을 제2차 원심분리하여 미토콘드리아를 정제하는 단계로 수행될 수 있다. 원심분리 횟수 및 샘플의 함량에 따라 적절히 조정될 수 있다.
상기 미토콘드리아는 세포 또는 세포 배양액으로부터 분리된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 세포 또는 세포 배양액은 체세포, 생식세포 및 줄기세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 줄기 세포는 중간엽줄기세포, 성체줄기세포, 역분화줄기세포, 배아줄기세포, 골수줄기세포, 신경줄기세포, 윤부줄기세포, 조직 유래 줄기세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 인상인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 세포 또는 세포 배양액은 근육, 간, 탯줄, 제대혈, 골수, 지방, 상피, 백혈구, 점막, 신경, 피부, 양막, 태반, 활액, 정소, 골막 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 세포는 자가면역질환에 의해 생물학적 활성이 저하된 세포인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 조성물은 아연을 더 포함하는 것 일수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 조성물의 미토콘드라아는 STAT3의 발현이 증가하여 미토콘드리아의 양 및 기능이 향상된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 조성물의 자가면역질환은 염증성 사이토카인 IL-17에 의해 매개된 질환인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 조성물의 상기 자가면역질환은 이식 거부 반응, 신경계 자가면역질환, 골관절염, 류마티스 관절염(Rheumatoid Arthritis), 천식(Asthma), 피부염(Dermititis), 건선(Psoriasis), 낭섬유증(Cystic Fibrosis), 고형장기 이식 후기 및 만성 거부증(Post transplantation late and chronic solid organ rejection), 다발성 경화증(Multiple Sclerosis), 전신성 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus), 쇼그렌 증후군(Sjogren syndrome), 하시모토 갑상선(Hashimoto thyroiditis), 다발성근염(polymyositis), 경피증(scleroderma), 아디슨병(Addison disease), 백반증(vitiligo), 악성빈혈(pernicious anemia), 사구체신염(glomerulonephritis) 및 폐섬유증(pulmonary fibrosis), 염증성장질환(Inflammatory Bowel Diesese), 크론병(Crohns disease), 자가면역성 당뇨(Autoimmune Diabetes), 당뇨 망막증(Diabetic retinopathy), 비염(Rhinitis), 허혈-재관류 손상(Ischemiareperfusion injury), 혈관성형술후 재협착(Post angioplasty restenosis), 만성 폐색성 심장 질환(Chronic obstructive pulmonary disease; COPD), 그레이브병(Graves disease), 위장관 알러지(Gastrointestinal allergy), 결막염(Conjunctivitis), 죽상경화증(Atherosclerosis), 관상동맥질환(Coronary artery disease),협심증(Angina), 암 전이, 소동맥 질환 및 미토콘드리아 질환(mitochondrial disease)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 조성물의 이식 거부 반응은 세포, 조직 및 장기로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 이식 거부 반응인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 조성물의 이식 거부 반응은 골수 이식, 심장 이식, 각막 이식, 장 이식, 간 이식, 폐 이식, 췌장 이식, 신장 이식 및 피부이식의 거부반응으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 거부 반응인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 이식 거부 반응은 이식편대숙주병(GVHD,graft-versus-host disease)인 것일 수 있다.
상기 조성물의 신경계 자가면역질환은 다발성경화증(multiple sclerosis), 시신경척수염(neuromyelitis optica), 급성 파종성뇌척수염(acute disseminated encephalomyelitis), 상행성 척수염(ascending myelitis), 중심성 척수염(central myelitis), 하행성 척수염(descending myelitis) 횡단성 척수염(transverse myelitis), 중증근무력증(myasthenia gravis), 길랑바레증후군(guillain-barre syndrome), 자가면역성 포도막염(autoimmuneuveitis), 자가면역성뇌증(autoimmune encephalopathy), 뇌척수염(encephalomyelitis) 및 만성 염증성 탈수초성 다발신경병증(chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 염증성 장질환은 크론병, 베체트병에 수반되는 장 병변, 궤양성 대장염, 출혈성 직장 궤양 및 회장 낭염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 염증성 장질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 Th17의 활성을 저해하여 염증성 사이토카인 IL-17을 억제하고, Treg를 활성화시켜 면역반응을 조절하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 조성물은 염증성 사이토카인 IL-1β, IL-6와 케모카인 MCP-1을 감소시키고, COX4를 증가시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 조성물은 장내 균총을 조절하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 장내 균총 조절은, 퍼미큐티스 문(Firmicutes phylum) 및 박테로이데테스 문(Bacteroidetes phylum) 균총의 비를 조절하는 것을 특징으로 하는 염증성 장질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 약학적으로 유효한 양의 미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는 자가면역질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 자가면역질환의 예방 및 치료방법을 제공한다.
본 발명은 미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는, IL-17이 매개하는 자가면역질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
본 발명은 미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는, 자가면역질환의 예방 또는 치료방법에 있어서, 상기 미토콘드리아의 STAT3를 증가시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는, 자가면역질환의 예방 또는 치료방법에 있어서, (1) Th17의 활성을 저해하고, (2) Treg를 활성화시키고, (3)염증성 사이토카인 IL-1β, IL-6와 케모카인 MCP-1을 감소시키며, 및, (4) COX2의 발현을 억제시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 치료 방법은 상기 자가면역질환 예방 또는 치료용 조성물을 치료적 유효량으로 개체에 투여하는 것을 포함한다. 특정 개체에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 개체의 연령, 체중, 일반건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다. 따라서 본 발명의 목적에 적합한 조성물의 유효량은 전술한 사항을 고려하여 결정하는 것이 바람직하다.
또한 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 상기 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 골관절염, IL-17이 매개하는 염증질환 또는 면역질환 치료방법을 제공한다. 본 발명의 약학 조성물은 치료적 유효량 또는 약학으로 유효한 양으로 투여한다. 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 미토콘드리아를 포함하는 골관절염의 예방 또는 치료용 조성물
실시예 1-1. 골관절염 환자 유래 MSC 미토콘드리아의 제조
골관절염 환자의 지방 조직을 잘게 자르고 100um 필터로 조직 부산물을 걸러주고, 4℃에서 3분간 200g에서 원심분리하였다. 위에 뜬 노란색 지방만을 수거하여, 콜라게나아제(Collagenase)를 이용하여 조직을 하나의 세포단위로 분리시켰다. 한 시간 후에, 4℃에서 3분간 200g을 원심분리하여 가라앉은 펠렛만 남기고 세척하고 40um 필터로 세포를 분리하였다. 분리된 세포는 10% FBS를 포함하는 MEM 배지에서 배양하였다. 배양물을 4℃에서 3분간 200g으로 원심분리한 후, 펠렛은 IBM buffer에 현탁하고 Homogenizer를 이용하여 세포막을 터트렸다. 그런 다음 원심분리하여 미토콘드리아 펠렛을 수득하였다.
실시예 1-2. 골관절염 환자 유래 MSC 미토콘드리아의 골관절염의 치료 효과
본 발명자들은 골관절염 환자 유래 MSC 미토콘드리아의 골관절염 치료 효과를 확인하기 위하여, 골관절염이 유발된 동물모델에 줄기세포 유래 미토콘드리아를 주입한 후 치료 효과를 분석하는 실험을 수행하였다.
동물모델에게 MIA 유도 후, 하루 뒤에 MIA 모델의 관절강으로(i.a) 실시예 1-1에서와 같이 분리한 중간엽줄기세포 유래 미토콘드리아를 10ug/100ul의 농도로 주 1회 총 3주 관절강내로 주입하였다. weight bearing 평가는 MIA 유도 후부터 평가 하였으며, 주 1회 측정하였다.
그런 다음, MIA 유도 후 3주차에 마우스를 희생하였으며, 관절의 연골을 safranin O 염색하여 관절 연골 조직의 손상정도를 조직 분석하였다.
그 결과, 골관절염이 유도된 랫트에 골관절염 환자 유래 MSC 미토콘드리아를 주입한 경우 1차 실험 및 2차 실험 모두에서 골관절염 유발 모델인 MIA 그룹에 비해 통증이 감소됨을 확인하였다(도 1). 또한, 골관절염이 유도된 랫트에 골관절염 환자 유래 MSC 미토콘드리아를 주입한 경우 골관절염 유발 모델인 MIA 그룹에 비해 임상적 관절염 지수가 낮아짐을 확인하였다(도 2).
실시예 1-3. 중간엽줄기세포 유래 미토콘드리아에 의한 골관절염 관련 인자 억제 효과
본 발명자들은 골관절염이 유도된 동물모델에서 중간엽줄기세포 유래 미토콘드리아에 의하여 항체 조절 효과를 있는지 확인하는 실험을 수행하였다.
동물모델에게 MIA 유도 후 3주차에 마우스를 희생하였으며, 관절 조직 내의 염증성 인자 발현 면역 세포 침윤을 분석하기 위해 IHC 면역 염색하였다. 각 특이적 항체를 이용하여 관절 조직 내에 IL-1β, MMP13, MCP-1 발현 세포를 분석하였다.
그 결과, 중간엽줄기세포 유래 미토콘드리아가 주입된 랫트에서는 골관절염 유발 모델인 MIA 그룹에 비해 골관절염의 상황을 악화시킨다고 알려진 인자인 IL-1b, MMP13 및 MCP1을 발현하는 세포들의 침윤이 감소함을 확인하였다(도 3).
실시예 1-4. 중간엽줄기세포 유래 미토콘드리아에 의한 무릎관절 손상 보호효력
골관절염이 유도된 동물모델에서 중간엽줄기세포 유래 미토콘드리아에 의하여 관절의 손상이 저해되는지 확인하였다.
도 5는 골관절염을 유도하지 않은 랫트 (WT), 골관절염을 유도한 랫트 (MIA) 그리고 골관절염을 유도후 중간엽줄기세포 유래 미토콘드리아를 투여한 랫트(MIA+MSC mitochondria)의 3그룹에서 CT를 통해 무릎 관절을 비교한 것으로, WT 에서는 관절이 거의 손상되지 않았지만 MIA 에서는 굉장히 많이 손상된 모습을 관찰할 수 있다. 반면 MSC 미토콘드리아를 투여한 그룹에서는 MIA 대비 손상도가 덜 한 것을 알 수 있다.
실시예 1-5. 중간엽줄기세포 유래 미토콘드리아에 의한 TH17/Treg 세포 조절 효과
본 발명자들은 골관절염이 유도된 동물모델에서 중간엽줄기세포 유래 미토콘드리아에 의하여 TH17/Treg 세포가 제어되는지를 분석하였다. MIA 유도후 3주차에 랫트을 희생하고, 각 랫트의 비장 조직에서 세포를 분리하였으며, Th17, Treg 세포 활성을 유세포 분석하였다. 유세포 분석을 위해서 CD4-PerCP, IL-17 APC, Foxp3-ECD, CD25-FITC 염색하고, 염색된 세포는 유세포 분석하였다.
그 결과, MIA 유도된 골관절염 동물몰델의 비장 조직내에 IL-17을 발현하는 Th17 세포의 활성이 증가되었으며, 중간엽줄기세포 유래 미토콘드리아의 관절강 주입에 의해서 IL-17 발현 염증성 Th17 세포의 활성이 비장 조직 내에서 감소됨을 확인하였다(도 4). 이러한 결과는 중간엽줄기세포 유래 미토콘드리아에 의해 관절 염증뿐만 아니라 전신 면역 시스템 병인 조절을 할 수 있음을 시사하는 것이다.
실시예 1-6. 중간엽줄기세포 유래 미토콘드리아에 의한 연골세포 증식 조절
사람의 연골세포 (Chondrocyte)에서 중간엽줄기세포 유래 미토콘드리아가 세포수준에서 효력이 있는지 검증하였다.
같은 수의 연골세포를 배양시킨 후, 아무것도 처리하지 않은 조건, IL-1β를 처리한 조건 그리고 IL-1β 처리 후 중간엽줄기세포 유래 미토콘드리아를 복합 처리한 그룹으로 나누어 총 3일간 실험을 진행하였다.
그 결과, IL-1β 에 의해 연골세포는 손상되어 증식력이 아무것도 처리하지 않은 연골세포에 비해 떨어지는 것을 확인하였지만, IL-1β 로 손상을 준 연골세포에 중간엽줄기세포유래 미토콘드리아를 처리했을 때 증식력이 회복되어 손상을 주지 않은 세포와 동등한 수준으로 올라가는 것을 확인하였다 (도 6).
실시예 1-7. 아연 처리된 중간엽줄기세포 유래 미토콘드리아에 의한 골관절염치료효과
골관절염이 유발된 동물모델에 아연에 의해 기능 강화된 중간엽줄기세포 유래 미토콘드리아를 주입한 후 치료 효과를 분석하는 실험을 수행하였다.
골관절염 환자로부터 분리한 중간엽줄기세포는 황화아연 ZnSO4 10uM로 24시가 자극하였으며, 배양 24시간 후 미토콘드리아를 위아 동일한 방법으로 분리하였다.
동물모델에게 MIA 유도 후, 하루 뒤에 MIA 모델의 관절강으로(i.a) 실시예 1-1에서와 같이 분리한 중간엽줄기세포 유래 미토콘드리아를 10ug/100ul의 농도로 주 1회 총 3주 관절강내로 주입하였다. weight bearing 평가는 MIA 유도 후부터 평가 하였으며, 주 1회 측정하였다.
그 결과, 골관절염이 유도된 랫트에 아연이 처리된 골관절염 환자 유래 MSC 미토콘드리아를 주입한 경우 줄기세포 유래 미토콘드리아 단독 군 보다 통증이 감소됨을 확인하였다(도 7).
<실시예 2> Mitochondrial STAT3 발현 유도된 미토콘드리아를 포함하는 면역질환 치료용 조성물
실시예 2-1. 아연 처리 MSC 유래 미토콘드리아의 제조
골관절염 환자의 지방 조직을 잘게 자르고 100um 필터로 조직 부산물을 걸러주고, 4℃에서 3분간 200g에서 원심분리하였다. 위에 뜬 노란색 지방만을 수거하여, 콜라게나아제(Collagenase)를 이용하여 조직을 하나의 세포단위로 분리시켰다. 한 시간 후에, 4℃에서 3분간 200g을 원심분리하여 가라앉은 펠렛만 남기고 세척하고 40um 필터로 세포를 분리하였다. 분리된 세포는 10% FBS를 포함하는 MEM 배지에서 배양하였다. 황화아연은 10nM 의 농도로 3일 동안 세포배지에 함께 첨가하여 처리하였다. 배양물을 4℃에서 3분간 200g으로 원심분리한 후, 펠렛은 IBM buffer에 현탁하고 Homogenizer를 이용하여 세포막을 터트렸다. 그런 다음 미토콘드리아 분리 키트를 사용하여 원심분리하여 미토콘드리아 펠렛을 수득하였다.
실시예 2-2. 아연 처리 MSC 유래 미토콘드리아의 골관절염의 치료 효과
본 발명자들은 아연 처리 MSC 유래 미토콘드리아의 골관절염 치료 효과를 확인하기 위하여, 골관절염이 유발된 동물모델에 상기 벡터를 주입한 후 치료 효과를 분석하는 실험을 수행하였다.
동물모델에게 MIA 유도 후, 하루 뒤에 MIA 모델의 관절강으로(i.a) 실시예 2-1에서와 같이 분리한 근육 유래 미토콘드리아를 5ug/100ul의 농도로 주 1회 총 3주 관절강내로 주입하였다. weight bearing 평가는 MIA 유도 후부터 평가하였으며, 주 1회 측정하였다.
그 결과, 골관절염이 유도된 동물에 아연 처리 MSC 유래 미토콘드리아를 주입한 경우 1차 실험 및 2차 실험 모두에서 골관절염 유발 모델인 MIA 그룹에 비해 통증이 감소되었으며, 아연을 처리하지 않은 MSC 유래 미토콘드리아보다도 더 우수한 통증 감소 효과를 나타냄을 확인하였다.
실시예 2-3. 아연 처리 MSC 유래 미토콘드리아에 의한 무릎관절 손상 보호효과
골관절염이 유도된 동물모델에서 아연 처리 MSC 유래 미토콘드리아에 의하여 관절의 손상이 저해되는지를 CT 촬영을 통해 확인하였다.
도 8은 골관절염을 유도하지 않은 랫트(WT), 부형제 처리군(Vehicle), 아연을 처리하지 않은 MSC 유래 미토콘드리아 처리군(MSC Mito) 및 그리고 아연 처리 MSC 유래 미토콘드리아 처리군(Zinc MSC Mito)의 4개 군에서 CT를 통해 무릎 관절을 비교한 것으로, WT 에서는 관절이 거의 손상되지 않았지만 부형제 처리군에서는 굉장히 많이 손상된 모습을 관찰할 수 있다. 반면 아연 처리 MSC 유래 미토콘드리아를 투여한 그룹에서는 부형제 처리군에 비해 대비 손상도가 적으며, 아연을 처리하지 않은 MSC 유래 미토콘드리아 처리군에 비해서도 손상도가 적은 것을 알 수 있다.
실시예 2-4. 아연 처리 MSC 유래 미토콘드리아에 의한 TH17/Treg 세포 조절 효과
골관절염이 유도된 동물모델에서 아연 처리 MSC 유래 미토콘드리아에 의하여 TH17/Treg 세포가 제어되는지를 분석하였다. MIA 유도 후 3주차에 랫트을 희생하고, 각 랫트의 비장 조직에서 세포를 분리하였으며, Th17, Treg 세포 활성을 유세포 분석하였다. 유세포 분석을 위해서 CD4-PerCP, IL-17 APC, Foxp3-ECD, CD25-FITC 염색하고, 염색된 세포는 유세포 분석하였다.
그 결과, 아연을 처리하지 않은 MSC 유래 미토콘드리아에 비해 아연 처리 MSC 유래 미토콘드리아의 관절강 주입에 의해서 IL-17 발현 염증성 Th17 세포의 활성이 비장 조직 내에서 감소됨을 확인하였다(도 9). 이러한 결과는 아연 처리 MSC 유래 미토콘드리아에 의해 관절 염증뿐만 아니라 전신 면역 시스템 병인 조절을 할 수 있음을 시사하는 것이다.
실시예 2-5. 아연 처리 MSC에서의 미토콘드리아의 양 및 기능강화 확인
미토콘드리아의 정량적 정성적 기능 향상을 확인하기 위해 western bolt 기법을 이용하여 세포와 미토콘드리아 각각의 단백질 발현도를 분석하였다.
그 결과, 아연을 처리한 MSC 에서 미토콘드리아의 양 및 기능과 관련한 COX4 유전자의 증가가 확인되었고, 미토콘드리아의 기능강화와 세포사멸을 억제한다고 알려진 STAT3 역시 증가한 것을 확인하였다. 이 결과는 아연 처리가 세포의 미토콘드리아의 양을 증가시키고 기능을 강화 할 수 있음을 시사한다(도 10).
실시예 2-6. 아연 처리 MSC 유래 미토콘드리아에 투여에 의한 연골세포(chondrocyte)의 염증성 세포 사멸 억제 조절 확인
2x104 cell의 연골세포(chondrocyte)에 10ng/ml의 농도의 Il-1b로 자극한 후 각 MSC 유래 미토콘드리아 (5ug)을 처리하여 1일 동안 세포 배양한 후 Annexin V/PI facs 염색을 통해 세포 사멸을 분석하였다.
그 결과, 아연을 처리한 MSC 가 아연을 처리하지 않은 MSC에 비해 연골세포의 생존률이 증가하고 세포사멸(necroptosis)이 억제되는 것을 확인하였다(도 11).
실시예 3. 근육 유래 미토콘드리아를 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물
실시예 3-1. 근육 유래 미토콘드리아의 제조
골관절염 환자로부터의 관절 근육 조직을 IBM buffer상에서 잘게 자르고 100um 필터로 조직 부산물을 여과한 후, 4℃에서 3분간 200g으로 원심분리하였다. 펠렛은 IBM buffer에 현탁하고 Homogenizer를 이용하여 세포막을 터트렸다. 그런 다음 원심분리하여 미토콘드리아 펠렛을 수득하였다(reference: Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements).
실시예 3-2. 근육 유래 미토콘드리아의 골관절염의 치료 효과 확인
3-2-1. 통증 수치 개선 및 관절염 지수 확인
본 발명자들은 근육 유래 미토콘드리아의 골관절염 치료 효과를 확인하기 위하여, 골관절염이 유발된 동물모델에 상기 근육 유래 미토콘드리아를 주입한 후 치료 효과를 분석하는 실험을 수행하였다.
동물모델에게 MIA 유도 후, 하루 뒤에 MIA 모델의 관절강으로(i.a) 실시예 3-1에서와 같이 분리한 근육 유래 미토콘드리아를 10ug/100ul의 농도로 주 1회 총 3주간 관절강내로 주입하였다. weight bearing 평가는 MIA 유도 후부터 평가하였으며, 주 1회 측정하였다.
그런 다음, MIA 유도 후 3주차에 마우스를 희생하였으며, 관절의 연골을 safranin O 염색하여 관절 연골 조직의 손상정도를 조직 분석하였다.
그 결과, 골관절염이 유도된 마우스에 근육 유래 미토콘드리아를 주입한 경우 골관절염 유발 모델인 MIA 그룹에 비해 통증수치와 weight bearing이 개선됨을 확인하였다(도 12). 또한, 골관절염이 유도된 마우스에 근육 유래 미토콘드리아를 주입한 경우 골관절염 유발 모델인 MIA 그룹에 비해 조직이 개선되고 임상적 관절염 지수가 낮아짐을 확인하였다(도 13).
3-2-2. 근육 유래 미토콘드리아에 의한 골관절염 관련 인자 억제 효과
본 발명자들은 골관절염이 유도된 동물모델에서 근육 유래 미토콘드리아에 의하여 항체 조절 효과를 있는지 확인하는 실험을 수행하였다.
동물모델에게 MIA 유도 후 3주차에 마우스를 희생하였으며, 관절 시노비움 조직 내의 염증성 인자 발현 면역 세포 침윤을 분석하기 위해 IHC 면역 염색하였다. 각 특이적 항체를 이용하여 시노비움 조직내에 IL-1β, MMP13, MCP-1, COX4 발현 세포를 분석하였다.
그 결과, 근육 유래 미토콘드리아가 주입된 마우스에서는 골관절염 유발 모델인 MIA 그룹에 비해 골관절염의 상황을 악화시킨다고 알려진 인자인 IL-1β, MMP13 및 MCP1을 발현하는 세포들의 수가 감소하여 침윤이 감소되었다(도 14). 또한, 미토콘드리아의 양을 측정하는 마커인 COX4는 오히려 근육 유래 미토콘드리아 주입 그룹에서 증가를 보였으며(도 14), 이는 증가된 미토콘드리아로 인한 효과인 것으로 생각된다.
3-2-3. 근육 유래 미토콘드리아에 의한 TH17/Treg 세포 조절 효과
본 발명자들은 골관절염이 유도된 동물모델에서 근육 유래 미토콘드리아에 의하여 TH17/Treg 세포가 제어되는지를 분석하였다.
동물모델에게 MIA 유도한 후 3주차에 마우스를 희생하였으며, 각 동물모델의 비장 조직에서 세포를 분리하여 Th17, Treg 세포 활성을 유세포 분석하였다. 유세포 분석을 위해서 CD4-PerCP, IL-17 APC, Foxp3-ECD, CD25-FITC 염색한 후, 염색된 세포를 유세포 분석하였다.
그 결과, MIA 유도된 골관절염 동물모델의 비장 조직내에 IL-17을 발현하는 Th17 세포의 활성이 증가되었으며, 근육 유래 미토콘드리아의 관절강 주입에 의해서 IL-17 발현 염증성 Th17 세포의 활성이 비장 조직 내에서 감소됨을 확인하였다(도 15). 이러한 결과는 근육 유래 미토콘드리아에 의해 관절 염증뿐만 아니라 전신 면역 시스템 병인 조절을 할 수 있음을 시사하는 것이다.
3-2-4. 근육 유래 미토콘드리아에 의한 IL-17/IL-10 동시 조절 효과
골관절염 연골세포를 24 well plate에 3x105 cells로 접종한 후, 실시예 3-1에서와 같이 분리한 근육 유래 미토콘드리아 5ug을 1일간 공조배양하고, RNA 시료를 수득하였다. 수득한 RNA는 cDNA로 합성한 후, 연골세포의 대사 인자(Catabolic marker)인 MMP1, MMP3, MMP13을 QPCR을 이용하여 mRNA level에서의 양을 측정 및 분석하였다.
그 결과, 도 16에서 볼 수 있는 바와 같이, 근육 유래 미토콘드리아 의해서 연골 세포의 대사 인자의 활성이 저해됨을 확인하였으며, 이러한 결과로부터 근육 유래 미토콘드리아가 연골세포 손상/연골 조직 손상을 제어할 수 있는 것임을 알 수 있었다.
실시예 3-3. 근육 유래 미토콘드리아에 의한 이식 거부 질환 치료효과 확인
이식질환 환자와 일반인의 혈액 세포(PBMC)와 근육 유래 미토콘드리아를 3일간 공조배양한 후, 배양액의 상청액만 모아 ELISA로 IL-7과 IL-10을 측정하였다.
또한, 간이식을 한 남성 이식 질환 환자와 일반인의 혈액 세포(PBMC)와 근육 유래 미토콘드리아를 3일간 공조배양한 후 면역세포 변화를 관찰하였다. 도 17에서 볼 수 있는 바와 같이, 근육 유래 미토콘드리아에 의해 Th17 세포의 발현이 저해됨을 확인할 수 있었다.
그 결과, 근육 유래 미토콘드리아가 주입된 그룹에서 IL-17은 감소하고 IL-10은 증가함을 확인할 수 있었다(도 18). 상기 결과를 바탕으로, 근육 유래 미토콘드리아는 이식 거부질환 치료에 이용할 수 있음을 확인하였다.
실시예 3-4. 근육 유래 미토콘드리아에 의한 신경계 자가면역질환 치료효과 확인
본 발명의 미토콘드리아의 신경계 자가면역질환 치료효과를 확인하기 위하여, MOG 펩타이드을 사용하여 실험적 자가면역성 뇌척수염(EAE, experimental autoimmune encephalomyelitis) 동물 모델을 제조하였다. 구체적으로, 동물 모델은 출생 후 8주령의 암컷 C57BL/6 마우스(Narabiotechnology, 대한민국; 체중 22-24g)를 준비하여 일주일 동안 안정시켰다. 마우스에 MOG 펩타이드 35-55 (Sigma-Aldrich, 미국) 200ug이 포함된 에멀전(emulsion)과 결핵균(mycobacterium tuberculosis; Difco, 미국) 200ug이 포함된 IFA (Incomplete Freund's adjuvant; Difco, 미국)를 혼합하여 도합 0.1 ml의 에멀전을 EAE군의 양쪽 허리부위에 피하로 주사하였고, 동시에 백일해독소(PTX, pertussis toxin; List Biologic, 미국) 500 ng을 복강으로 주사하였다. 48시간 후에 동일한 양의 백일해독소를 복강으로 다시 주사하였다. 상기 MOG에 의해 유도된 만성 EAE 동물모델의 임상 증상의 척도를 8가지로 구분하여 확인하였다. 즉, 반응이 없음(0 단계), 꼬리 끝이 쳐짐(1 단계), 꼬리 전체가 쳐짐(2 단계), 꼬리 처짐과 한쪽 뒷다리의 마비(3 단계), 양쪽 뒷다리의 마비(4 단계), 사망 (5 단계) 구분하였다.
이 후, 근육 세포 유래 미토콘드리아를 10ug/200ul의 농도로 주에 2회 총 6회 마우스에 투여하였으며, 질환 스코어를 확인한 결과를 도 19A에 나타내었고, 이의 결과, 근육 유래 미토콘드리아를 처리한 군에서 효과를 확인하였다
도 19B는 마우스 희생당시의 비장 조직에서의 면역 세포를 유세포 분석 하였으며, CD4 T세포에서의 IL-17 (IL-17+ CD4+), CD8 T 세포에서의 IL-17 (IL-17+CD8+), CD19 B세포에서의 IL-17 (IL-17+CD19+) 면역 세포 아형을 분석하였다. 결과 근육 유래 미토콘드리아 이식 EAE 군에서의 IL-17 을 발현하는 각 T, B세포아형이 감소함을 확인하였으며, 미토콘드리아 ROS 생성 (mitoSOX) 발현이 현저히 감소하였다.
도 19C 는 마우스 희생당시의 척수 조직 파괴정도를 H&E 와 LFB(Luxol fast blue) 염색을 통해서 분석하였으며, 미토콘드리아 투여군에서의 척수 조직의 백질, 회백질의 구분이 선명하며, 조직 손상이 억제됨을 확인 하였다.
실시예 3-5. 근육 유래 미토콘드리아에 의한 쇼그렌 증후군 치료효과 확인
3-5-1. 쇼그렌 증후군 동물모델에서 근육 유래 미토콘드리아의 타액 분비능 확인
본 발명자들은 쇼그렌 증후군의 치료에 위한 근육 유래 미토콘드리아의 효과를 확인하기 위하여, 쇼그렌 증후군의 동물 모델인 NOD(Non-obese diabetic) 마우스에 근육 유래 미토콘드리아를 주입한 후, 마우스의 쇼그렌 증후군의 발병척도인 타액분비능 및 분비유지능을 조사하였다. 대조군(vehicle) 또는 10ug/200ug의 미토콘드리아의 NOD/ShiLtJ 마우스에 복강내주사(intraperitoneal injection)로 쇼그렌 증후군 발병 후 주 1회 총 5회 주입하여 실험하였다.
타액량은 0.1mg의 필로카르핀(pilocarpine)을 투여한 후 타액을 수집하여 측정하였다. 그 결과, 질환 발병 후 미토콘드리아 총 5회 투여 하였으며, 질환 발병 후 13주차에 미토콘드리아를 처리한 군에서는 대조군(vehicle)에 비하여 타액분비능(도 20A, 분 당 saliva/weight 수치인 flow rate으로 측정)이 현저히 증가함을 확인하였다.
3-5-2. 쇼그렌 증후군 동물모델에서 근육 유래 미토콘드리아의 Th17/Treg 세포 조절 효과 확인
본 발명자들은 쇼그렌 증후군 마우스 모델의 비장 조직에서 Th17 세포 (CD4 및 IL-17 항체로 면역염색), B17 세포, Th1 세포를 확인하기 위하여 유세포 분석 하였다. 또한 침샘 조직에서의 IL-17+CD4+ Th17 세포의 활성이 감소됨을 확인하였다. 그 결과, 미토콘드리아는 비장 조직 및 침샘 조직에서 Th17 세포, B17세포, Th1 세포 감소시켰음을 확인하였다(도 20B).
3-5-3. 쇼그렌 증후군 동물모델에서 근육 유래 미토콘드리아의 세포 형태 유지효과 및 염증세포의 침윤효과 확인
본 발명자들은 쇼그렌 증후군의 치료를 위한 미토콘드리아의 효과를 확인하기 위하여, 쇼그렌 증후군의 동물 모델인 마우스의 눈물샘(Lacrimal gland) 및 침샘(Salivary gland)에서 세포의 형태를 유지하는지 여부 및 염증세포의 침윤이 되었는지 여부를 당업계에 공지된 H&E 염색법을 통해 확인하는 실험을 수행하였다.
그 결과, 근육 유래 미트콘드리아를 주입한 경우에는 대조군에 비해 눈물샘 및 침샘 조직내에서의 면역 세포 침윤이 감소되었으며, 조직 파괴가 현저히 감소됨을 확인하였다(도 20C).
실시예 4-1. 염증성 장질환 동물 모델에서의 평가
4-1-1. 체중 변화 확인
본 발명의 미토콘드리아 이식의 염증성 장질환에 대한 효과를 확인하기 위하여, 염증성 장질환 동물모델을 제작하였다. 구체적으로, 7주령 수컷 C57BL/6 마우스에 3% dextran sodium sulfate(DDS)를 급수하였다. 급수 5일차에 일반 음용수로 교체하였다. 대조군으로는 아무것도 처리하지 않은 정상군(Normal) 및 생리식염수를 투여한 Vehicle 군으로 분류하였다. 미토콘드리아 주입군은 rat 골격근 유래 세포주인 L6에서 미토콘드리아 분리 키트(ThermoFisher)를 이용해 분리한 미토콘드리아를 10 μg/200μl(saline)의 농도로, 실험 시작 하루전(-1)부터 실험 시작 후 2, 4, 6, 9, 12일 째에 복강으로 투여하였다. DSS투여 시작지점부터 17일까지 각 군의 마우스 체중의 변화를 확인하였다.
그 결과, 대조군인 Normal군과 비교하여, 염증성 장질환이 유도된 Vehicle 군에서는 DSS 투여 후 5일차부터 체중이 감소하는 것을 확인하였으며, 미토콘드리아 주입군은 Vehicle 군과 비교하여, 체중 감소가 유의적으로 억제된 것을 확인하였다(도 21).
4-1-2. 장 길이 변화 확인
상기 실시예 4-1-1의 각 군의 마우스를 DSS투여 후 17일 차에 인도적으로 희생하고, 장(대장)을 적출하여, 각 군별로 장 길이를 측정하였다.
그 결과, 대조군인 Normal군과 비교하여, Vehicle 군의 장 길이가 감소한 것을 확인하였으며, 미토콘드리아 주입군은 Vehicle 군과 비교하여, 장 길이가 증가한 것을 확인하였다(도 22).
실시예 4-2. 조직 병리학적 평가
상기 실시예 4-1-2에서 수득된 장 조직을 파라핀 블록으로 제작한 후 절단하여, 헤마토실린(Hematoxylin) 및 에오신(eosin) 염색을 수행하여, 조직 병리학적 평가를 시행하였다. 구체적으로, 상기 염색으로 조직을 관찰한 후 음와구조(crypt) 손상, 침투(infiltration), 상피(epithelium) 및 배상 세포(goblet cell)의 감소 정도를 조직학적 지수(histological score)로 나타내었다.
그 결과, 대조군인 Normal군과 비교하여, Vehicle 군에서는 장의 조직학적 손상이 관찰되었으며, 조직학적 지수가 증가한 것을 확인하였다. 그러나, 본 발명의 미토콘드리아 주입군에서는 Vehicle 군과 비교하여, 장의 조직학적 손상이 감소하고, 조직학적 지수가 유의적으로 감소한 것을 확인하였다(도 23).
실시예 4-3. 염증성 사이토카인 및 케모카인 억제 확인
상기 실시예 4-1-2에서 수득된 장조직을 파라핀 블록으로 제작한 후 절단하여, 염증성 사이토카인인 IL-6, IL-17 및 케모카인인 MCP-1의 발현을 면역조직화학염색을 통해 확인하였다.그 결과, Vehicle 군에서는 Normal군과 비교하여, 조직 내의 IL-6, IL-17 및 MCP-1의 발현이 증가한 것을 확인하였으며, 미토콘드리아 주입군에서는 증가된 이들 인자의 발현이 유의적으로 감소한 것을 확인하였다(도 24).
실시예 4-4. B 세포 조절 확인
미토콘드리아의 이식에 따른 B 세포의 양상 변화를 확인하기 위하여, 상기 실시예 4-1-2의 마우스 희생시점에서 얻은 장막간 림프절(mesenteric lymph node)에서 조절 B 세포의 빈도를 확인하였다. 구체적으로는 수득된 장막간 림프절을 CD19, CD5, CD1d 및 IL-10 항체를 이용하여 염색 한 후 유세포 분석을 통해 IL-10을 발현하는 조절 B 세포(IL-10-producing B cell)를 분석하였다.
그 결과, 도 25에 나타낸 바와 같이, 염증성 장질환이 유도된 Vehicle 군에서는 Normal군과 비교하여, 조절 B 세포가 감소한 것을 확인하였으며, 미토콘드리아를 이식하면, 감소된 조절 B 세포가 normal 마우스의 빈도 정도로 증가한 것을 확인하였다.
실시예 4-5. 장내 균총 조절 확인
미토콘드리아 이식이 염증성 장질환에서, 유익균 및 유해균 균총을 조절하는지 확인하기 위하여, 상기 실시예 4-1-2에서 희생된 마우스의 맹장으로부터 맹장 내용물(cecal content)을 수득하여 장내 미생물 균총을 분석하였다. 균총 분석 후, Bacteroidetes 및 Firmicutes 문의 균총의 비(abundance ratio)로서, 미토콘드리아 이식에 따른 균총 조절 효과를 확인하였다.
그 결과, 도 26에 나타낸 바와 같이, 염증성 장질환이 유도된 군에서는 Bacteroidetes 문에 속하는 균총이 증가하였으며, 미토콘드리아 주입군에서는 Firmicutes 문의 균총이 증가하여, 미토콘드리아의 이식이 장내 균총을 조절하는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 미토콘드리아 이식은, 염증성 장질환으로 인한 체중 감소 및 장의 손상을 억제하는 것을 확인하였으며, 염증성 사이토카인인 IL-6, IL-17 및 케모카인 MCP-1의 발현을 효과적으로 억제하는 것을 확인하였다. 또한, 조절 B 세포를 증가시키고, 장내 균총을 조절하여, 효과적으로 염증성 장질환을 개선시킬 수 있는 것을 확인하였다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허 청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (23)

  1. 미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는 자가면역질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 미토콘드리아는 세포 또는 세포 배양액으로부터 분리된 것인, 조성물.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 세포 또는 세포 배양액은 체세포, 생식세포 및 줄기세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인, 조성물.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 줄기 세포는 중간엽줄기세포, 성체줄기세포, 역분화줄기세포, 배아줄기세포, 골수줄기세포, 신경줄기세포, 윤부줄기세포, 조직 유래 줄기세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인, 조성물.
  5. 제 2항에 있어서,
    상기 세포 또는 세포 배양액은 근육, 간, 탯줄, 제대혈, 골수, 지방, 상피, 백혈구, 점막, 신경, 피부, 양막, 태반, 활액, 정소, 골막 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것인, 조성물.
  6. 제 2항에 있어서,
    상기 세포는 자가면역질환에 의해 생물학적 활성이 저하된 세포인 것인, 조성물.
  7. 제 1항에 있어서,
    상기 조성물은 아연을 더 포함하는 것인, 조성물.
  8. 제 1항에 있어서,
    상기 미토콘드리아는 STAT3의 발현이 증가하여 미토콘드리아의 양 및 기능이 향상된 것인, 조성물.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 자가면역질환은 염증성 사이토카인 IL-17에 의해 매개된 질환인 것인, 조성물.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 자가면역질환은 이식 거부 반응, 신경계 자가면역질환, 골관절염, 류마티스 관절염(Rheumatoid Arthritis), 천식(Asthma), 피부염(Dermititis), 건선(Psoriasis), 낭섬유증(Cystic Fibrosis), 고형장기 이식 후기 및 만성 거부증(Post transplantation late and chronic solid organ rejection), 다발성 경화증(Multiple Sclerosis), 전신성 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus), 쇼그렌 증후군(Sjogren syndrome), 하시모토 갑상선(Hashimoto thyroiditis), 다발성근염(polymyositis), 경피증(scleroderma), 아디슨병(Addison disease), 백반증(vitiligo), 악성빈혈(pernicious anemia), 사구체신염(glomerulonephritis) 및 폐섬유증(pulmonary fibrosis), 염증성장질환(Inflammatory Bowel Diesese), 크론병(Crohns disease), 자가면역성 당뇨(Autoimmune Diabetes), 당뇨 망막증(Diabetic retinopathy), 비염(Rhinitis), 허혈-재관류 손상(Ischemiareperfusion injury), 혈관성형술후 재협착(Post angioplasty restenosis), 만성 폐색성 심장 질환(Chronic obstructive pulmonary disease; COPD), 그레이브병(Graves disease), 위장관 알러지(Gastrointestinal allergy), 결막염(Conjunctivitis), 죽상경화증(Atherosclerosis), 관상동맥질환(Coronary artery disease),협심증(Angina), 암 전이, 소동맥 질환 및 미토콘드리아 질환(mitochondrial disease)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인, 조성물.
  11. 제 10항에 있어서,
    이식 거부 반응은 세포, 혈액, 조직 및 장기로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 이식 거부 반응인 것인 조성물.
  12. 제 11항에 있어서,
    상기 이식 거부 반응은 골수 이식, 심장 이식, 각막 이식, 장 이식, 간 이식, 폐 이식, 췌장 이식, 신장 이식 및 피부이식의 거부반응으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 거부 반응인 것인 조성물.
  13. 제 12항에 있어서,
    상기 이식 거부 반응은 이식편대숙주병(GVHD,graft-versus-host disease)인 것인, 조성물.
  14. 제 10항에 있어서,
    상기 신경계 자가면역질환은 다발성경화증(multiple sclerosis), 시신경척수염(neuromyelitis optica), 급성 파종성뇌척수염(acute disseminated encephalomyelitis), 상행성 척수염(ascending myelitis), 중심성 척수염(central myelitis), 하행성 척수염(descending myelitis) 횡단성 척수염(transverse myelitis), 중증근무력증(myasthenia gravis), 길랑바레증후군(guillain-barre syndrome), 자가면역성 포도막염(autoimmuneuveitis), 자가면역성뇌증(autoimmune encephalopathy), 뇌척수염(encephalomyelitis) 및 만성 염증성 탈수초성 다발신경병증(chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 조성물.
  15. 제 10항에 있어서,
    상기 염증성 장질환은 크론병, 베체트병에 수반되는 장 병변, 궤양성 대장염, 출혈성 직장 궤양 및 회장 낭염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 염증성 장질환의 예방 또는 치료용 조성물.
  16. 제 1항에 있어서,
    상기 조성물은 Th17의 활성을 저해하여 염증성 사이토카인 IL-17을 억제하고, Treg를 활성화시켜 면역반응을 조절하는 것인, 조성물.
  17. 제 1항에 있어서,
    상기 조성물은 염증성 사이토카인 IL-1β, IL-6와 케모카인 MCP-1을 감소시키고, COX4를 증가시키는 것인, 조성물.
  18. 제 1항에 있어서,
    상기 조성물은 장내 균총을 조절하는 것인, 조성물.
  19. 제 18항에 있어서,
    상기 장내 균총 조절은, 퍼미큐티스 문(Firmicutes phylum) 및 박테로이데테스 문(Bacteroidetes phylum) 균총의 비를 조절하는 것을 특징으로 하는 염증성 장질환의 예방 또는 치료용 조성물.
  20. 약학적으로 유효한 양의 제1항의 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 자가면역질환의 예방 및 치료방법.
  21. 미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는, IL-17이 매개하는 자가면역질환의 예방 또는 치료방법.
  22. 미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는, 자가면역질환의 예방 또는 치료방법에 있어서, 상기 미토콘드리아의 STAT3를 증가시키는 방법.
  23. 미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는, 자가면역질환의 예방 또는 치료방법에 있어서, (1) Th17의 활성을 저해하고, (2) Treg를 활성화시키고, (3)염증성 사이토카인 IL-1β, IL-6와 케모카인 MCP-1을 감소시키며, 및, (4) COX2의 발현을 억제시키는 방법.
PCT/KR2021/016458 2021-04-29 2021-11-11 미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는 자가면역질환 예방 또는 치료용 조성물 WO2022231083A1 (ko)

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