JP2021533820A - 細胞増殖と組織修復の促進方法及び組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
(II)分子量500〜2000ダルトンの中性画分から分子量500〜1200ダルトンの中性画分を分離する。
a)装置及び工具
マイコン全自動インキュベーター(正大(商標)ZF880)、クリーン培養皿、1.0ml注射器(江西洪達(商標))、70%エタノール消毒済みピンセット、ステンレス製ふるい、無菌遠心チューブ(Axygen(登録商標)#SCT-50ML-25-S)、低速冷凍遠心分離機(中佳KDC-2046)。
胚齢7日の卵。
卵を取り、上向きに置いた平らな鈍い端を叩いて殻を破り、殻を剥いて直径約2センチの切り口を形成し、縁はできるだけ平らにするものとする。羊膜を壊さないように、ピンセットにより殻膜と卵黄膜を慎重に引き裂く。胚の発育状況を観察し、発育が良好で、対応する段階の基準に適合する胚のみが羊水の抽出に使用することができる。
胚齢7日の卵の胚を取り、PBSで胚表面を洗浄し、清潔にするまで液体をピペットガンで吸引する。胚胎内臓を取り、残りの組織を肉眼で見えないサイズの顆粒、団塊に切り分ける。1mlの0.25%パンクレアチンを加え、ガンヘッドで組織と均一混合させ、懸濁液を15ml遠心管に注入する。1mlの0.25%パンクレアチンで培養皿を洗浄し、懸濁液を同じ15ml遠心管に注入する。遠心管を37℃の水浴に入れ、5-7分間消化した後、DMEM培地(PBSを含む)を8ml加えてパンクレアチンを中和する。遠心管を遠心分離機に入れ、5-10秒遠心分離する。遠心管を取り出し、上清液を採取する。この上清液を2000rpmで2min遠心する。上清を捨て、DMEM培地を4ml加え、ガンヘッドで細胞を再懸濁させる。それぞれ1mlの細胞懸濁液を10cm細胞培養皿に注入し、更に10mlのDMEM培地を加える。培養皿を十字方向に少なくとも20回ずつ揺らし、細胞を均一に分布させる。37℃、5%CO2条件下で培養する。細胞は、培養皿の下皿の70〜90%を覆ったとき、継代する。
1)DMEM(無血清)
2)DMEM+2.5%EE
3)DMEM+5%EE
4)DMEM+7.5%EE
5)DMEM+10%EE
新生児ラット心室を予冷PBSで洗浄し、その後DMEM/F12で心臓組織を切り分ける。37℃水浴震動、0.04%コラゲナーゼII+0.08%パンクレアチンで消化する。消化した細胞を篩で濾過して遠心分離、1000r/min X 10min。15%FBS細胞培養液を加えてプレートに注入、5%CO2飽和湿度37℃培養器で培養。
初代心筋細胞消化後、96ウェルプレートに注入、6000個/穴、5個重複ウェル/群。5%CO2飽和湿度37℃培養器で24時間培養後、初代培地15%FBSのDMEM/F12を、培地DMEM/F12、10%FBSを含むDMEM/F12、10%FBSと5%EE(実施例1からの羊水、体積比)を含むDMEM/F12にそれぞれ置き換える。48時間培養後、各ウェルに10μlのCCK-8試薬を添加した。2時間孵化後、酵素標識器により450nmにおける吸収値を測定する。
1.1精製サンプル:新鮮な胚齢7日の卵羊水、50ml。
1)GE AKTA purifier
2)ゲルカラムGE Sephacryl S-200
3)陰イオン交換カラムGEHiPrep Q
4)脱塩カラムGEHiPrep 26/10 Desalting
5)ゲルカラムGEHiLoad 16/600 Superdex75pg
6)Superloop 10ml
2.1溶液の調製
リン酸ナトリウム緩衝液A(50mM Na2HPO4+NaH2PO4、pH 8.0)の調製:46.6ml 1mol/l Na2HPO4と3.4 ml 1mol/l NaH2PO4を混合し、ddH2Oを加えて1Lに定容する。
2.2.2サンプル処理:新鮮羊水50ml、適量ヘキサンを加え、2500rpm、4℃で20min遠心分離し水相を得て、0.22μm濾過膜で濾過する。
ステップ1:ゲルカラムGE Sephacryl S-200
ddH2O平衡ゲルカラム:流速2ml/min、280nmまで紫外吸収曲線が穏やかで、ベースラインに回帰する。
サンプル充填:流速1ml/min、サンプル充填量10ml。
溶出:脱ガスddH2Oで粗生成物を溶出、流速2ml/min、画分を等量採取、3ml/管。体積(240ml)のカラム2管溶出。
分離精製を5回繰り返し、各回の同じピーク検出時間の画分を十分に混合する。
リン酸ナトリウム緩衝液A(50 mM Na2HPO4+NaH2PO4、pH 8.0)平衡陰イオン交換カラム:流速2 ml/min、280nmまで紫外吸収曲線が穏やかで、ベースラインに回帰する。
サンプル充填:ステップ1精製後の生物活性を有する画分を取り、ポンプでサンプルを充填、流速1.5ml/min、サンプル充填量250ml、同時に等体積収集陰イオンカラム未結合画分、2ml/管。
脱塩:イオンカラム中の結合と非結合の画分をそれぞれGE HiPrep 26/10 Desaltingで脱気ddH2Oに置換し、脱塩後画分を収集する。
ddH2O平衡ゲルカラム:流速1 ml/min、280nmまで紫外吸収曲線が穏やかで、ベースラインに回帰する。
サンプル充填:流速1ml/min、サンプル充填量10ml。
溶出:脱ガスddH2Oでサンプルを溶出、流速1ml/min、画分を等量採取、2ml/管。体積(240ml)のカラム1.5管溶出。
細胞活性の測定:成長良好なAC16消化後、96ウェルプレート、8000個/ウェル、5個重複ウェル/群。5%CO2飽和湿度37℃培養器で2時間培養、細胞接着。培地DMEMで24時間飢餓培養後、10%FBSのDMEM、DMEMと20%(体積比)画分を添加した培地に交換する。24時間培養後、各ウェルに10μlのCCK-8試薬を添加した。2時間孵化後、酵素標識器により450nmにおける吸収値を測定する。
ゲルカラムGE HiLoad 16/600 Superdex75 pgで分離した未結合画分のクロマトグラムを図10に示す。細胞生存アッセイは生物活性を有する成長因子群を検出した結果を図11に示す。
ステップ1:ゲルカラムGE Sephacryl S-200
ddH2O平衡ゲルカラム:流速2ml/min、280nmまで紫外吸収曲線が穏やかで、ベースラインに回帰する。
サンプル充填:流速1ml/min、サンプル充填量10ml。
溶出:脱ガスddH2Oで粗生成物を溶出し、流速2ml/min、分子量500-2000ダルトン範囲内の画分を採取する。
分離精製を5回繰り返し、各回の同じピーク検出時間の画分を十分に混合する。
リン酸ナトリウム緩衝液A(50 mM Na2HPO4+NaH2PO4、pH 5.8)平衡陽イオン交換カラム:流速2 ml/min、280nmまで紫外吸収曲線が穏やかで、ベースラインに回帰する。
サンプル充填:第1ステップからの分子量500-2000ダルトン範囲内の画分を取り、ポンプでサンプル充填、流速1.5ml/min、サンプル充填量250mlを用いて、陽イオン交換カラムの未結合画分を採取する。
ddH2O平衡ゲルカラム:流速1 ml/min、280nmまで紫外吸収曲線が穏やかで、ベースラインに回帰する。
サンプル充填:第2ステップからの未結合画分を取ってサンプル充填、流速1ml/min、サンプル充填量10ml。
溶出:脱ガスddH2Oでサンプルを溶出し、流速1ml/min、分子量500-1200ダルトン範囲内の画分を採取する。
成長良好なAC16消化後、96ウェルプレート、8000個/ウェル、5個重複ウェル/群。5%CO2飽和湿度37℃培養器で2時間培養、細胞接着。培地DMEMで24時間飢餓培養後、10%FBSのDMEM、DMEMと20%(体積比)画分を添加した培地に交換する。24時間培養後、各ウェルに10μlのCCK-8試薬を添加した。2時間孵化後、酵素標識器により450nmにおける吸収値を測定する。陽イオン交換カラムGE HiPrep SP処理後の非結合領域の細胞活力を図12に示す。
ステップ1:イオン交換カラム、陰イオン交換カラムHiPrep Qを使用して、各溶液のpHはそれぞれ5.8と8.0に調整し、サンプルとイオン交換カラムを充填、流速は2ml/min、280nm紫外吸収曲線が穏やかで、ベースラインに回帰する。
サンプル充填:羊水を取り、ポンプでサンプルを充填、流速1.5ml/min、サンプル充填量50ml、イオンカラム未結合画分を採取する。
ステップ2:ゲルカラムGE Sephacryl S-200
ddH2O平衡ゲルカラム:流速2ml/min、280nmまで紫外吸収曲線が穏やかで、ベースラインに回帰する。
サンプル充填:サンプルはステップ1からの未結合画分、流速1ml/min、サンプル充填量10ml。
溶出:脱ガスddH2Oで粗生成物を溶出し、流速2ml/min、分子量500-2000ダルトン範囲内の画分を採取する。
ddH2O平衡ゲルカラム:流速1 ml/min、280nmまで紫外吸収曲線が穏やかで、ベースラインに回帰する。
サンプル充填:ステップ2からの500-2000ダルトンの范囲内の画分でサンプル充填、流速1ml/min、サンプル充填量10ml。
溶出:脱ガスddH2Oでサンプルを溶出し、流速1ml/min、分子量500-1200ダルトン範囲内の画分を採取する。
成長良好なAC16消化後、96ウェルプレート、8000個/ウェル、5個重複ウェル/群。5%CO2飽和湿度37℃培養器で2時間培養、細胞接着。培地DMEMで24時間飢餓培養後、10%FBSのDMEM、DMEMと20%(体積比)画分を添加した培地に交換する。24時間培養後、各ウェルに10μlのCCK-8試薬を添加した。2時間孵化後、酵素標識器により450nmにおける吸収値を測定する。陰イオン交換カラムGE HiPrep Q処理後の非結合領域の細胞活力を図12に示す。
麻酔薬(5.00%クロラール水和物)、75%エタノール、実施例1からの無菌EE、PBS、マウス(C57BL/6、8週齢)。
(1)清潔なケージを9個用意し、同じ週齢の成体(6〜8週以上)の健康なメスマウス9匹の体重をそれぞれ量り、ケージに入れる。
(2)5.00%濃度のクロラール水和物を調製し、1ml注射器により0.07ml/10gの割合でマウスに腹腔内注入する(麻酔導入時間約5-10分、麻酔維持時間約35分)。
(3)マウスが麻酔状態(正向反射消失後)になると、マウス解剖板で体を固定し、電動シェービングで首筋と背中の毛を剃る、75%エタノールで皮膚を拭いて消毒する。
(4)片手の人差し指、親指でマウス首背部の皮膚を持ち上げて十分な面積のひだを形成し、皮膚ひだを解剖板の上に置く。別の片手は生検針(孔径6mm)を持ち、ひだの中央部に合わせて圧力をかけ、生検部の両側の皮膚が貫通して脱落するまで回転した。
(5)皮膚残留がある場合は、ピンセットと眼科剪で切開した円筒状組織塊の縁を清掃し、皮膚生検針が残った印に沿って全層の皮膚を剪断し、2つの同じ創傷を作る。
(6)実体顕微鏡で創傷を撮影し、創傷面積を測定してデータを記録する。創傷はできるだけ水平線と平行にし、そうしないと測定誤差が大きくなる。
(7)品質検査に合格した100μlのEEとPBS(空白対照群)をそれぞれピペットガンで対応するマウスの創傷に滴下し、創傷を補助材料で覆う。
(8)飼育箱内、木屑の代わりに医療用綿を使用し、マウスが創傷を掻くのを防ぐために単独で飼育する。その後24*n時間ごとに創傷を検査・測定し、写真とデータを記録する。
(9)異なる補助材料が傷口癒合速度に与える影響を算出して比較する。
図13に示すように、それぞれ2日目、4日目にマウスの創傷面積を測定し、両群の創傷面積はいずれも減少し、EE群の癒合速度はより高く、しかも瘢痕も形成しなかった。
常用の普通試薬の例には、中国国薬グループ化学試薬有限公司からの水酸化ナトリウム・塩化ナトリウム・塩化カリウム・水和リン酸水素ナトリウム・リン酸二水素カリウム・炭酸水素ナトリウム・炭酸ナトリウム・塩化マグネシウム・アセトン・濃硫酸・濃塩酸・キシレン・無水エタノール・パラフィンとショ糖など、米国Sigma社からのドデシル硫酸ナトリウムとエチレンジアミン四酸など、北京鼎国公司からのTriton X-100とヘパリン、米国Thermo Fisher社からのTween-20、北京索莱宝科技有限公司からのクロラール水和物、グーグル生物科技有限公司からのパラホルムアルデヒドとMassonマッソントリクローム染色キット、サクラファインテックジャパンからのOCT包埋剤、米国Vector社からの蛍光退色防止封入剤。
(1)免疫蛍光
(a)実験要件に従ってカバーグラス細胞培養又は冷凍切片を処理し、PBS洗浄、5min×3回。
(b)0.5%Triton X -100室温15min透過、PBSで洗浄、5min×3回。
(c)ヤギ血清を37℃で30min密封。
(d)血清を捨て、一次抗体を適当な割合で希釈し、被覆組織を滴加し、4℃湿箱に一晩保存。
(e)湿箱を取り出し、37℃で30min再加温、PBSでグラス又は組織切片を洗浄、5min×3回。
(f)二次抗体を適当な割合で希釈し、被覆組織を滴加し、37℃で30-60minインキュベート。
(g)PBSで洗浄、5min×3回、DAPIで核を10 min染色。
(h)PBSで洗浄、5min×3回、退色防止封入で封入後、蛍光顕微鏡で観察分析。
(a)厚さ4μmの切片、42℃で掬い上げ、60℃で一夜乾燥、常温保存。
(b)パラフィン切片、脱パラフィン、浸水:キシレン三回、毎回20min。降順濃度のエタノール(100%、95%、95%、90%、80%)をそれぞれ2min、2min、2min、1min、1min水化、水道水で5min洗浄。
(c)PBSで洗浄、5min×3回。
(d)ヘマトキシリン染色、5min。
(e)水道水で洗浄、10min。
(f)1%塩酸エタノール分化、2回、水道水で洗浄、5min。
(g)1%アンモニア水で青色に戻し、2min、水道水で洗浄、5min。
(h)エオジン染色、1-5min。
(i)80%、90%、95%、95%、100%のエタノールをそれぞれ1min、2min、2min、2min、2min脱水。
(j)キシレンで透徹、2min×3回。
(k)中性ゴムで封入、検鏡観察。
(a)パラフィン切片、脱パラフィン、浸水。
(b)クロメート処理(重クロム酸カリウム一夜処理)
(c)水道水及び蒸留水で順次洗浄。
(d)ヘマトキシリン(Harris)染色液又はヘマトキシリン(Weigert)染色液で核を染色、1-2min。
(e)十分水洗、過染した場合,塩酸エタノールで分化、2-3s。
(f)アンモニア水で青色に戻し、2min。
(g)Masson麗春紅酸性複紅液を使用、5-10min。
(h)1%リンモリブデン酸水溶液で分化、3-5min。
(i)1%アニリンブルー又はライトグリーン液で染色、5min。
(j)1%氷酢酸水溶液で分化、数秒。
(k)95%エタノール、無水エタノール、キシレン透徹、中性ゴム封入。
8週間C57BL/6J雄性マウスは誘導箱を経ってイソフルランで気麻され、呼吸器頻度は115回/min、呼吸比は1:1、湿気量は1.5mlである。留置針プラスチックチューブ20gを経口気管挿管し、小動物呼吸器に接続し、2.5%イソフルランを含む純酸素で持続麻酔する。皮膚準備、3-4肋間開胸、心臓露出、7-0 prolene線左前下行枝結紮、心尖白化、肋間縫合、皮膚縫合、消毒。麻薬を止め、マウスが覚醒するまで換気を続ける。
8週間C57BL/6J雄マウスは7日に1回ドキソルビシン(5mg/kg)を注射し、全4回注射後マウス心不全を引き起こし、心臓超音波で検証する。
(a)手術後1週間と8週間の治療を行い、マウスに10%水和クロラール(200mg/kg)を腹腔内注射して殺し、心臓を取り出し、1週間の採取には肝腎、OCT包埋またはパラフィン包埋も含む。
(b)凍結切片は免疫蛍光に使用する=パラフィン切片はH&Eとマッソントリクローム染色に使用する。
(c)標本はマッソントリクローム染色後、Image J画像解析ソフトで心筋梗塞サイズを測定する。心筋梗塞面積の計算公式は以下に示す。
すべての実験結果はMean +SEMで示す。両群間の比較はTwo-tailed tailed t検定を使用して、複数群間の比較は一元配置分散分析(one way ANOVA)を使用する。P<0.05は統計的に有意差がある基準である。すべての実験結果はGraphPad Prism 5 (Software, Inc.)とImage Jソフトウェアで作図、分析する。
(I)前記(4)の方法を参照して、マウス心筋梗塞モデルを作製する。作製したマウス心筋梗塞モデルを対照群(NS)と鶏胚羊水(EE)治療群(各群6匹)に分ける。EE治療群は、実施例1で調製したEEを2日ごとに100マイクロリットル尾静脈注射し、第3週の21日までに計10回注射する。対照群は同じ方式で生理食塩水100マイクロリットルを10回注射する。
Claims (10)
- 細胞培養方法であって、非ヒト動物の羊水及び/又はその抽出物を含有する細胞培地を使用して、体外で当該細胞を培養する工程を含むことを特徴とする細胞培養方法。
その中で、前記の羊水の由来は、胚齢5〜12日の卵、好ましくは胚齢6〜11日の卵、より好ましくは胚齢7〜9日の卵、さらに好ましくは胚齢7〜8日の卵、又は前記卵の発育時期に対応する鶏以外の他の鳥類の卵、又は胎齢8〜20日、好ましくは8〜14日の齧歯類の胚、又は胎齢8〜20日、好ましくは8〜14日の齧歯類の発育時期に対応する齧歯類以外の他の非ヒト哺乳動物の胚である。 - 前記方法は、前記抽出物がpH5.8〜8.0間でイオン交換カラムと結合せず、含有成分の分子量が500〜1200ダルトン範囲内であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記方法は、前記細胞の由来は:軟骨組織、半月板組織、靱帯組織、腱組織、椎間板組織、歯周組織、皮膚組織、血管組織、筋肉組織、筋膜組織、骨膜組織、眼組織、心膜組織、肺組織、滑膜組織、神経組織、腎臓組織、骨髄、泌尿生殖組織、腸管組織、肝臓組織、膵臓組織、脾臓組織及び脂肪組織のいずれか1つ又は複数の組織であることを特徴とする請求項1又は請求項2に記載の方法。
- 細胞培地であって、非ヒト動物の羊水及び/又はその抽出物を含有することを特徴とする細胞培地。
その中で、前記の羊水の由来は、胚齢5〜12日の卵、好ましくは胚齢6〜11日の卵、より好ましくは胚齢7〜9日の卵、さらに好ましくは胚齢7〜8日の卵、又は前記卵の発育時期に対応する鶏以外の他の鳥類の卵、又は胎齢8〜20日、好ましくは8〜14日の齧歯類の胚、又は胎齢8〜20日、好ましくは8〜14日の齧歯類の発育時期に対応する齧歯類以外の他の非ヒト哺乳動物の胚である。 - 前記培地は、前記抽出物がpH5.8〜8.0間でイオン交換カラムと結合せず、含有成分の分子量が500〜1200ダルトン範囲内であることを特徴とする請求項4に記載の細胞培地。
- 羊水及び/又はその抽出物の細胞成長及び/又は組織修復を促進する試薬の調製における応用、又は組織損傷に関する病状を治療する薬物の調製における応用。
その中で、前記の羊水の由来は、胚齢5〜12日の卵、好ましくは胚齢6〜11日の卵、より好ましくは胚齢7〜9日の卵、さらに好ましくは胚齢7〜8日の卵、又は前記卵の発育時期に対応する鶏以外の他の鳥類の卵、又は胎齢8〜20日、好ましくは8〜14日の齧歯類の胚、又は胎齢8〜20日、好ましくは8〜14日の齧歯類の発育時期に対応する齧歯類以外の他の非ヒト哺乳動物の胚である。 - 前記応用は、前記抽出物がpH5.8〜8.0間でイオン交換カラムと結合せず、含有成分の分子量が500〜1200ダルトン範囲内であることを特徴とする請求項6に記載の応用。
- 前記応用は、前記組織の由来は:軟骨組織、半月板組織、靱帯組織、腱組織、椎間板組織、歯周組織、皮膚組織、血管組織、筋肉組織、筋膜組織、骨膜組織、眼組織、心膜組織、肺組織、滑膜組織、神経組織、腎臓組織、骨髄、泌尿生殖組織、腸管組織、肝臓組織、膵臓組織、脾臓組織及び脂肪組織のいずれか1つ又は複数であり、前記動物細胞の由来はいずれか1つ又は複数の前記組織であることを特徴とする請求項6又は請求項7に記載の応用。
- 前記応用は、組織損傷に関する病状は:ヘルニア、骨盤底欠損、腱や靱帯の裂傷・断裂、皮膚傷口(瘢痕・外傷性創傷・虚血性傷口・糖尿病傷口・重度熱傷・皮膚潰瘍(褥瘡又は圧力による潰瘍・静脈潰瘍と糖尿病潰瘍など)など)、皮膚癌の切除に伴う手術創、血管病状(末梢動脈疾患、腹部大動脈瘤、頸動脈疾患と静脈疾患、血管欠損症、血管形成不全など)、筋疾患(先天性ミオパチー、重症筋無力症、炎症性・神経性・生筋性筋疾患、及び筋ジストロフィー(デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベーカー筋ジストロフィー、筋強直性筋ジストロフィー、肢帯筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー、先天性筋ジストロフィー、眼咽頭筋ジストロフィー、遠位筋ジストロフィー、エメリー・ドレイフス筋ジストロフィーなど)など)、老人性疾患(老人性認知症や老人性変形性関節症など)などの病気、外傷、または組織発育異常による病状を含むことを特徴とする請求項6〜8のいずれかに記載の応用。
- 羊水及び/又はその抽出物の創傷癒合を促進する薬物の調製における応用。
その中で、前記の羊水の由来は、胚齢5〜12日の卵、好ましくは胚齢6〜11日の卵、より好ましくは胚齢7〜9日の卵、さらに好ましくは胚齢7〜8日の卵、又は前記卵の発育時期に対応する鶏以外の他の鳥類の卵、又は胎齢8〜20日、好ましくは8〜14日の齧歯類の胚、又は胎齢8〜20日、好ましくは8〜14日の齧歯類の発育時期に対応する齧歯類以外の他の非ヒト哺乳動物の胚である。
該抽出物は、pH5.8〜8.0の間でイオン交換カラムと結合せず、含有成分の分子量が500〜1200ダルトン範囲に制御することが好ましい。
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