CN107970435B - 联合诱导内源Lgr5+肝脏干细胞增多的方法及应用 - Google Patents

Abstract

本申请公开了一种联合诱导内源Lgr5+肝脏干细胞增多的方法及应用，利用可溶性蛋白分子HGF和Rspo1联合诱导内源Lgr5⁺肝脏干细胞增多的方法。所述可溶性配体通过静脉注射到达组织干细胞，通过与受体结合达到激活组织干细胞。所述方法采用Lgr5+肝脏干细胞作为靶标。本发明利用各组织器官内源干细胞的自我更新和多功能分化能力，通过可溶性分子直接刺激活化体内组织器官内源干细胞，从而促进组织器官的自我修复/再生，从应用的简便性和成本的节约性以及安全性考虑，更具有可行性。

Description

联合诱导内源Lgr5+肝脏干细胞增多的方法及应用

技术领域

本发明涉及现代分子生物技术领域，特别涉及一种联合诱导内源Lgr5+肝脏干细胞增多的方法及应用。

背景技术

肝脏是非常重要的消化系统生命器官，它负责调控很多重要生理活动，包括储存肝糖、脂代谢、血浆蛋白分泌、异质物解毒、胆汁分泌等。

肝功能如此多样且重要，一旦肝功能丧失，在数日之内就会引起器官衰竭、继发性低血压、糖尿病、脑损伤甚至死亡。肝脏疾病，例如，肝代谢疾病、暴发性肝功能衰竭、肝炎、肝硬化、肝癌等，在世界范围内是致死的重要原因。

目前，肝脏疾病的治疗现状不容乐观，肝脏透析技术可以短时间应对肝功能丧失威胁，尚无有效的治疗措施能够在肝功能丧失情况下长期维护肝功能。肝移植是目前治疗晚期肝脏疾病的唯一有效手段，但健康肝脏的来源十分有限，大部分肝疾病晚期病人不得不在等待中死去。

肝纤维化是肝脏疾病发展的重要病理生理过程，是指由各种致病因子所致肝内结缔组织异常增生。几乎任何肝脏损伤在肝脏修复愈合的过程中都有肝纤维化的过程，短期损伤造成的肝纤维化随着肝脏自我修复可以发生逆转，如果损伤因素长期不能去除，纤维化的过程长期持续就会不可逆转，发展成肝硬化乃至肝癌。

因此针对肝纤维化的治疗方法研究将有助于治疗各种原因引起的肝脏疾病，对救治我国人民免受肝脏疾病威胁意义重大。

随着干细胞研究基础理论的快速发展，目前基于干细胞的细胞替代治疗技术受到全世界的关注，胚胎干细胞技术、诱导多能干细胞技术、成体组织干细胞技术等的发展和应用为人类的健康医疗带来新的希望，有望在较短时间内成为一种治疗缺陷型遗传病、组织器官功能损伤/衰竭的重要医疗手段。预计2020年干细胞与再生医学全球市场份额将超过4000亿美元。

目前已经有多个干细胞治疗多种疾病的临床试验。在眼科领域，日本科学家在美国西雅图视觉与眼科研究协会2016年年会上报告了使用诱导多功能干细胞成功进行了眼部干细胞移植术，帮助患者恢复了视力,日本政府于2017年2月1日批准了异体诱导多能干细胞治疗眼疾临床试验；我国中山大学眼科专家刘奕志团队和张康团队利用内源性干细胞原位再生出透明晶状体，首次实现了人体有生理功能的实体组织器官再生，并用于临床治疗先天性白内障，开辟了干细胞修复组织器官的新方向。

在肝脏领域也有显著的研究成果出现，中科院上海生化细胞所惠利健研究组最近报道了可以从人成纤维细胞诱导产生有功能的肝脏细胞，可以应用在小鼠肝脏急性损伤修复模型，有明显效果，并进一步建立基于人源诱导肝脏细胞（hiHep细胞）的生物人工肝系统应用于救治急性肝衰竭猪模型，显著提升了肝衰竭猪的存活率，证明了hiHep细胞临床应用的可能性。

利用干细胞治疗慢性肝纤维化至今尚无报道。本发明研究发现可以通过诱导内源Lgr5阳性肝脏干细胞促进肝脏损伤修复，对肝纤维化有明显抑制效果，为应用干细胞技术治疗肝纤维化提供了理论依据和实验基础。在当前干细胞技术日益成熟、干细胞制品日益规范、干细胞临床应用范围日益广泛、干细胞应用市场日益扩大的背景下，应用干细胞技术治疗肝纤维化有重大的创新性和临床应用前景。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于，提供了一种联合诱导内源Lgr5+肝脏干细胞增多的方法及应用。在CCL4诱导的慢性肝纤维化中也存在Lgr5阳性表达的干细胞，并且可以通过诱导内源Lgr5阳性肝脏干细胞促进肝脏损伤修复，治疗肝纤维化。相比胚胎干细胞和诱导多功能干细胞体外生成有功能的成熟的器官并将其移植入体内来治疗组织器官损伤，利用各组织器官内源干细胞的自我更新和多功能分化能力，通过可溶性分子直接刺激活化体内组织器官内源干细胞，从而促进组织器官的自我修复/再生，从应用的简便性和成本的节约性以及安全性考虑，在临床应用上更具有可行性。

为解决上述技术问题，本发明提供了一种Lgr5阳性肝脏干细胞诱导方法，通过HGF和/或Rspo1诱导Lgr5阳性肝脏干细胞回复肝功能损伤；所述方法利用各组织器官内源干细胞的自我更新和多功能分化能力，通过可溶性分子直接刺激活化体内组织器官内源干细胞，从而促进组织器官的自我修复/再生。

所述HGF 和/或Rspo1分别可以为可溶性蛋白分子HGF和Rspo1。

所述HGF 和/或Rspo1的给药方式优选为口服 和/或 注射。

为解决上述技术问题，本发明还提供了一种通过诱导内源Lgr5阳性肝脏干细胞促进肝脏损伤修复，治疗肝纤维化的方法。

为解决上述技术问题，本发明又提供了一种肝纤维化细胞的修复方法，通过诱导内源Lgr5阳性肝脏干细胞促进肝脏损伤修复。

为解决上述技术问题，本发明另提供了一种肝纤维化组织的修复方法，通过诱导内源Lgr5阳性肝脏干细胞促进肝脏损伤修复。

为解决上述技术问题，本发明再提供了一种肝纤维化器官的修复方法，通过诱导内源Lgr5阳性肝脏干细胞促进肝脏损伤修复。

为解决上述技术问题，本发明还提供了一种肝纤维化的修复方法，所述修复方法采用Lgr5+肝脏细胞作为靶标。

所述Lgr5+肝脏细胞为优选干细胞。

为解决上述技术问题，本发明还提供了一种Lgr5⁺肝脏干细胞抑制肝纤维化功能在制备治疗肝脏相关疾病药物和/或 制备肝脏纤维化模型 中的应用。

为解决上述技术问题，本发明还提供了一种肝纤维化模型，所述肝纤维化模型的构建方法采用Lgr5+肝脏干细胞作为靶标。

为解决上述技术问题，本发明还提供了一种肝纤维化模型的构建方法，所述肝纤维化模型的构建方法采用Lgr5+肝脏干细胞作为靶标。

所述的方法，优选使用CCl₄诱导肝纤维化模型。

所述的方法，优选具体步骤为：8周龄雄性小鼠腹腔注射CCL₄，1-3毫升/kg体重，CCL4按1：4比例溶于橄榄油，对照小鼠只注射橄榄油，每周两次，持续注射6周；首次注射40天后取肝脏标本。

所述的方法，优选具体步骤为： CCL4处理后第5天，从CCL4处理的Lgr5-GFP小鼠中分离单个Lgr5-GFP +细胞，然后用腺病毒Lgr5 shRNA感染。

为解决上述技术问题，本发明还提供了一种如前述的模型 和/或 方法，在制备治疗肝脏相关疾病药物中的应用。

为解决上述技术问题，本发明还提供了一种如前述的模型 和/或方法，在肝脏相关疾病的检测、治疗 和/或 预后中的应用。

为解决上述技术问题，本发明还提供了一种人、鼠肝脏干细胞体外类器官培养及分化方法，利用Lgr5+肝脏干细胞体外类器官培养及分化为肝脏细胞。

为解决上述技术问题，本发明还提供了一种Rspo1、HGF重组蛋白制备、纯化方法，将rHGF和rRspo1分别以0.1μgmice-1的剂量注射到CCL₄处理的Lgr5-GFP小鼠中，每周三次，持续6周。

所述重组Rspo1和HGF蛋白，优选其人源cDNA被扩增克隆连接6个His标签，可表达融合蛋白，引物序列如下：

Rspo1正向引物: 5’-TTGCGGCCGCATGCGGCTTGGGCTGTG-3’,反向引物: 5’-GGGAATTCGGCAGGCCCTGCAGATGTGAGTGGCC-3’;

HGF正向引物: 5’-TTGCGGCCGCATGTGGGTGACCAAACTCC-3’,

反向引物: 5’-GGGAATTCTGACTGTGGTACCTTATATG-3’。

优选所述酶切位点：NotI/EcoRI，载体：pVL1392。该两个重组蛋白使用sf9昆虫细胞表达系统，用杆状病毒感染昆虫细胞，纯化的蛋白去内毒素后溶于PBS，内毒素含量小于0.1单位每毫克。

为解决上述技术问题，本发明还提供了一种利用可溶性蛋白分子HGF和Rspo1联合诱导内源Lgr5⁺肝脏干细胞增多的方法。

所述利用可溶性蛋白分子HGF和Rspo1联合诱导内源Lgr5⁺肝脏干细胞增多的方法，所述可溶性配体通过静脉注射到达组织干细胞，通过与受体结合达到激活组织干细胞。

所述方法采用Lgr5+肝脏干细胞作为靶标。

为解决上述技术问题，本发明还提供了一种如前任一项所述方法在制备治疗肝脏相关疾病药物和/或肝脏纤维化模型中的应用。

为解决上述技术问题，本发明还提供了一种如前任一项所述方法在肝脏相关疾病的治疗、检测和/或预后中的应用。

为解决上述技术问题，本发明还提供了一种肝脏干细胞分离、培养、传代方法，对小鼠肝脏干细胞分离，肝细胞分离使用三步法；具体步骤如下：200 ml 含 0.5 M EGTA的肝脏灌洗液，成分：30 mMKCl, 1.3 M NaCl, 10 mM NaH2PO4.2H2O，100 mM Glucose and 100mM HEPES，pH7.4，通过肝门静脉灌洗；

然后用不含EGTA的200ml肝脏灌洗液灌洗。然后用含0.02%4型胶原酶和5mMCaCl2的肝脏灌洗液灌洗，直至消化完全；

消化好的肝脏用50mlPBS重悬，100微米的筛孔过滤，50g4度离心5分钟，单细胞悬液用流式细胞分选仪分选Lgr5阳性肝脏干细胞；

Lgr5阳性肝脏干细胞已经GFP绿色荧光蛋白或488绿色染料标记。

为解决上述技术问题，本发明还提供了一种肝脏干细胞分离、培养、传代方法，对人肝脏干细胞分离，具体步骤如下：

新鲜肝脏组织切成小块，用含0.05%胰蛋白酶的DMEM培养液37度消化10分钟；

细胞悬液稀释2倍，在含10%胎牛血清的DMEM培养液里400g离心，然后重悬在含0.02%4型胶原酶的DMEM培养液里37度消化20分钟，细胞悬液经40微米筛孔过滤，稀释4倍在含10%胎牛血清的DMEM培养液里，细胞悬液300g4度离心5分钟；

用抗Lgr5一抗标记Lgr5阳性细胞，用绿色染料标记的二抗标记Lgr5一抗，经流式细胞分选仪分选Lgr5阳性的人肝脏干细胞。

为解决上述技术问题，本发明还提供了一种Lgr5+ 肝脏干细胞及类器官培养方法，包括以下步骤：单个Lgr5-GFP阳性肝脏细胞与基底膜混合，加入细胞培养液，培液两天换一次，培养10-14天，养成的类器官从基底膜里取出，剪碎，传代，传代按1：4到1：8传，每7-10天传一次。

所述细胞培养液优选包括：AdDMEM / F12（Invitrogen）补充1％B27和1％N2（Invitrogen），N-乙酰半胱氨酸，胃泌素，EGF，Rspo1，FGF10，烟酰胺和HGF。

所述细胞培养液可以进一步包括包括： A83.01 (Tocris)和FSK (Tocris)。

本发明有益效果包括：

（1）本发明发现了Lgr5⁺肝脏干细胞抑制肝纤维化。通过本发明的研究证实了Lgr5⁺肝脏干细胞在肝纤维化进程中的作用，本发明的研究将加深了学界对肝脏干细胞参与肝脏损伤修复的理解，为肝纤维化的治疗提供了新的靶标。

（2）本发明利用可溶性蛋白分子HGF与Rspo1联合诱导内源Lgr5⁺肝脏干细胞增多，用于治疗肝纤维化。成体组织干细胞的体内诱导多利用病毒包装转录因子感染细胞来实现，受制于病毒的安全性问题，该方法在临床应用上大受限制。本发明的研究展示可以利用可溶性配体通过静脉注射到达组织干细胞，通过与受体结合达到激活组织干细胞的目的。本发明已经率先找到了HGF与Rspo1蛋白能够激活肝脏干细胞，可以有效治疗肝纤维化。本发明的研究将加深学界对组织内源成体干细胞自我更新、促进组织损伤修复/再生等特性的理解，拓展成体干细胞的应用范围和应用方法，有可能为治疗各种原因引起的组织损伤修复、组织器官再生障碍等疾病所借鉴。

（3）本发明发现Lgr5⁺肝脏干细胞存在于病人样本是本项目的第三大创新。本发明验证了HGF与Rspo1蛋白对人Lgr5⁺肝脏干细胞的诱导作用，这将为HGF与Rspo1蛋白治疗肝纤维化等肝脏疾病的临床应用打下基础。此外，人Lgr5⁺肝脏干细胞的体外培养和分化将直接为肝脏干细胞提供新的来源，可用于体外肝脏疾病模型构建和体内移植，为肝脏疾病的研究和治疗带来了新的手段。

附图说明

图1为本发明实施例所述Lgr5 ⁺肝干细胞移植肝纤维化减少图，其中:

a，实验设置示意图。8周龄野生型C57小鼠腹腔内以1：4溶解在橄榄油中的CCL4（2ml / kg，Sigma-Aldrich）或单独的橄榄油（2ml / kg）每周两次注射6周。将来自Lgr5-GFP小鼠的Lgr5-GFP +肝干细胞或原代肝细胞（PH）通过在第0天通过内联注射移植到肝纤维化小鼠中；

b，通过FACS测定从CCL4处理的Lgr5-GFP小鼠中分离出Lgr5⁺细胞移植（左）。在第40天，用Lgr5+细胞或PH（原代肝细胞）移植（右）的小鼠中使用抗GFP抗体对肝脏Lgr5表达进行染色。n = 10只小鼠，比例尺，200μm；

c，Lgr5 +肝干细胞移植减少CCL4诱导的肝纤维化并恢复肝功能。将Lgr5-GFP +肝干细胞或原代肝细胞（PH）移植描述为图a，收集肝脏并用H＆E和Sirius红染色，用于纤维化分析和通过Image J软件测量的阳性染色区域的定量；对于c，比例尺，200微米，结果显示为平均值±s.d。每只小鼠随机取5个独立部分，每组（n = 10只小鼠）共有50个组织标本，p<0.05，**，p <0.01。

d，e，收集血清用于ALT和AST分析。对于d，e，分析每个条件的一式三份。结果显示为平均值±s.d。的三个独立实验。 *，p <0.05，**，p <0.01。

图2为本发明实施例所述敲除Lgr5表达降低了Lgr5 +细胞的干细胞特性并增加了肝纤维化图， 其中：

a，Lgr5被Ad-Lgr5shRNA敲低。分离Lgr5 +肝干细胞，用Ad-Lgr5shRNA感染，无感染对照shRNA Ad-Ctrl shRNA，western blot和qRT-PCR分析Lgr5蛋白水平（左）和mRNA水平（右）。肌动蛋白作为加载控制；

b，当Lgr5被Ad-Lgr5shRNA下调时，Lgr5 +肝干细胞未能形成组织细胞。分离Lgr5+肝干细胞，用Ad-Lgr5shRNA或Ad-Ctrl shRNA感染，并在基质胶中培养干细胞培养基，在第14天测量肝组织的数量和大小。 b-e，Ad-Lgr5 shRNA增加CCL4诱导的肝纤维化。用Ad-Lgr5shRNA或Ad-Ctrl shRNA感染的Lgr5-GFP小鼠分别以6周施用CCL4（2ml / kg腹膜内）两周/周。 H＆E和Sirius Red的代表性组织学和通过Image J软件；

c，测量的阳性染色区域的量化；

d，e，测量ALT和AST的血清水平。

对于a，d，e，分析每个条件的一式三份。结果显示为平均值±s.d。的三个独立实验。 *，p <0.05。对于b，结果显示为平均值±s.d。的三个独立实验。 **，p <0.01。对于c，比例尺，200微米，结果显示为平均值±s.d。每只小鼠随机取5个独立部分，每组（n = 10只小鼠）共有50个组织标本，*，p <0.05。

图3为本发明实施例所述rHGF / rRspo1在CCL4损伤时诱导Lgr5 +肝干细胞图，其中：

a，b-f的1 X CCL4损伤示意图。 b，c，通过使用Lgr5引物的qRT-PCR分析测量Lgr5表达。如图a所示，8周龄的C57BL / J小鼠注射CCL4和不同的生长因子（0.1μg/小时/次），收集并分析肝脏。 d，e和f，如图a所示，8周龄的Lgr5-GFP小鼠注射CCL4和rHGF或/和rRspo1蛋白（0.1μg/小时/次），Lgr5表达用免疫荧光测定法测定， GFP抗体（d），通过FACS测定（e，f）分析Lgr5 +细胞数。 g，h-j慢性CCL4损伤的示意图。 h，i，8周龄的Lgr5-GFP小鼠注射CCL4和rHGF或/和rRspo1蛋白（0.1μg/小时/次），如图g所示，使用具有抗GFP抗体的免疫荧光测定法测量Lgr5表达在第40天（h），通过FACS测定（i）分析Lgr5 +细胞数。 j，在第40天（rHGF/ rRspo1）上描述为rgGF加rRspo1治疗的肝纤维化模型，从第5天用PBS处理的1XCCl4损伤的肝脏（PBS）中分离出单个Lgr5 +肝脏干细胞，培养生长成有机体。表明组织结构图，分析了有机体数和有机体大小。对于b和c，n = 5只小鼠/组。刻度棒，200 m（d，g）。对于b，c，分析了每个条件的一式三份。结果显示为平均值±s.d。的三个独立实验。 *，p <0.05。对于f，i，j，结果显示为平均值±s.d。的三个独立实验。 **，p <0.01。

图4为本发明实施例所述 rHGF / rRspo1通过Lgr5 +细胞诱导降低肝纤维化图，其中：

a-c， rHGF / rRspo1降低CCL4诱导的肝纤维化并恢复肝功能。 CCL4诱导的肝纤维化和rHGF / rRspo1蛋白处理如图3g所示，收集肝脏并用H＆E和Sirius红染色用于纤维化分析（a）。收集血清用于ALT和AST分析（b，c）；

d-f，rHGF / rRspo1不能降低CCL4诱导的肝纤维化，并且当Lgr5被敲低时恢复肝功能。 CCL4诱导的肝纤维化和Ad-Lgr5-shRNA感染，rHGF / rRspo1蛋白处理被描述为补充图S8a，收获肝脏并用H＆E和Sirius红染色用于纤维化分析（d）。收集血清用于ALT和AST分析（e，f）；

对于a，d，比例尺，200微米，结果显示为平均值±s.d。每只小鼠随机抽取5个独立部分，每组（n = 10只小鼠）总共50个组织标本*，p <0.05。对于b，c，e，f，分析了每个条件的一式三份。结果显示为平均值±s.d。的三个独立实验。 *，p <0.05。

图5为本发明实施例所述 Lgr5 +肝干细胞存在于人纤维化肝脏中之图，其中：

a，使用抗Lgr5抗体的人肝脏样品中的Lgr5染色；

b，人肝脏样本中的Lgr5 mRNA水平；

c，人类Lgr5 +肝细胞的FACS图（左）和实验装置的示意图（右上图）。从诊断为肝纤维化的六个独立供体人肝活检中分离单个Lgr5 +细胞，培养有机物形成，并在体外连续培养至少3代。显示图像（右下方）；

d-f，从诊断为肝纤维化的六个独立供体人肝活检中分离单个Lgr5 +细胞，培养，分析不同浓度的rHGF / rRspo1，分析其组织结构图，有机体数量和有机体大小（d）。使用qPCR测定（e）测量组织中的Lgr5mRNA水平。使用FACS测定（f）测量Lgr5 +细胞数；

对于a，e，分析每个条件的一式三份。结果显示为平均值±s.d。的三个独立实验。*，p <0.05。对于d，f，结果显示为平均值±s.d。的三个独立实验。 *，p <0.05。刻度棒，200m（a），250m（c，d）。

具体实施方式

下面结合实施例详述本发明。为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚、明确，以下参照附图并举实施例对本发明进一步详细说明，但本发明并不局限于这些实施例。

如无特别说明，本发明的实施例中的原料和催化剂均通过商业途径购买。其中，Lgr5(leucine-rich repeat-containing g-protein coupled receptor5)属于G蛋白耦联受体家族,含17个富含亮氨酸重复序列和7次a螺旋跨膜区,其N-和C-末端尾部侧翼富含半胱氨酸序列,可在胃肠道、毛囊等多种组织中表达。

胚胎干细胞(embryonic stem cell, ESC)的研究深入和诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPSC）研究的兴起为肝脏细胞的来源提供了新的方法。运用iPSC方法，小鼠肝脏细胞已经能够从小鼠成纤维细胞成功诱导。然而，iPSC效率不高，并且从体细胞诱导转变为多功能干细胞再分化为肝脏细胞，细胞变化跨度比较大，步骤比较繁复，增加了不稳定性，其产生的细胞的安全性也有待进一步验证。而且体内移植技术瓶颈也有待突破，这导致通过利用胚胎干细胞和诱导多功能干细胞体外生成有功能的成熟的器官并将其移植入体内来治疗某些相应疾病仍然困难重重。

本发明发明人注意到，很多不同组织器官都存在内源组织干细胞，在维持各器官的功能形态发挥着重要作用。肝脏本身拥有很强的再生能力，这使得肝脏在受到损伤或部分切除后会迅速再生修复。肝脏细胞虽然有较强的自我复制能力，但原代肝脏细胞移植效果不理想，容易去分化，很快丧失肝脏细胞功能。利用肝脏干细胞修复肝损伤成为重要研究方向。

本发明的进一步研究发现，在CCL4诱导的慢性肝纤维化中也存在Lgr5阳性表达的干细胞，并且可以通过诱导内源Lgr5阳性肝脏干细胞促进肝脏损伤修复，治疗肝纤维化。相比胚胎干细胞和诱导多功能干细胞体外生成有功能的成熟的器官并将其移植入体内来治疗组织器官损伤，利用各组织器官内源干细胞的自我更新和多功能分化能力，通过可溶性分子直接刺激活化体内组织器官内源干细胞，从而促进组织器官的自我修复/再生，从应用的简便性和成本的节约性以及安全性考虑，在临床应用上更具有可行性。

成体组织干细胞的体内诱导多利用病毒包装转录因子感染细胞来实现，受制于病毒的安全性问题，该方法在临床应用上大受限制。本发明的前期研究展示可以利用可溶性配体通过静脉注射到达组织内源干细胞，通过与干细胞特异受体结合达到激活组织干细胞的目的。本申请发明人已经率先找到了 Rspo1/Slit2 两个配体蛋白可以有效激活肠组织干细胞，促进放化疗导致的肠黏膜损伤修复，并进一步提出并验证了诱导组织干细胞与放化疗联合治疗肿瘤的新的肿瘤治疗手段。该研究于 2013 年发表于国际顶级学术期Nature。该研究发表后，国际干细胞领域顶级学术期刊 Cell Stem Cell 撰文对发明人的论文进行解读，称发明人的研究在减低放化疗严重副作用上有令人振奋的转化应用价值，并可作为再生药物有更广泛的应用。国际一流学术期刊 Nature Reviews Cancer和Cancer Discovery 分别对该文进行了研究亮点推荐。同时该研究发表后受到近百家各大媒体关注、讨论，称发明人的研究为癌症治疗的突破性研究,为癌症的治疗带来了新的希望。包括：美国第一大新闻媒体 FoxNews（《福克斯新闻》）,英国三大媒体之二：Independent(《独立报》)和 The Daily Mail(《每日邮报》)等。其中英国科学媒介中心（Science MediaCentre, UK）邀请两位领域内专家对该文进行了专门点评，普林茅斯大学（PlymouthUniversity）医药学专家 Janusz Jankowski 教授认为发明人的研究是“人们可以通过改变治疗收益和风险的平衡来增加机体修复并最终延长患者生存的明证”。

在本发明一实施例中，在肝纤维化过程中诱导Lgr5 +干细胞。

本发明首先进行了单剂量CCL₄对Lgr5⁺肝干细胞的诱导，观察到在肝脏恢复后，单剂量CCL4诱导的Lgr5表达降低。接下来检测到在CCL4诱导的肝纤维化发展过程中，Lgr5 +肝干细胞是否维持慢性损伤。本发明使用Lgr5增强型绿色荧光蛋白（eGFP）- 内部核糖体进入位点（IRES）-CreERT2（Lgr5-GFP）小鼠检测肝脏中Lgr5-GFP的表达。将8周龄的Lgr5-GFP小鼠腹腔内每周两次注射CCl4（橄榄油中1:4稀释）或单独的橄榄油（2ml / kg体重），持续6周。在油处理对照Lgr5-GFP小鼠中，Lgr5-GFP基本上是不可检测的。在CCl4处理后，从第1天至第40天观察到清除GFP阳性细胞。使用qRT-PCR测定证实Lgr5的表达，其证实了与油处理的小鼠肝脏相比，CCl4处理的小鼠肝脏中Lgr5的诱导约2-3倍。 Lgr5表达在第5天达到峰值，在肝纤维化发展过程中维持该水平。这些Lgr5 +细胞表达Sox9，相对较宽的导管祖细胞标志物，但不表达成熟肝细胞标志物，如Hnf4a。

接下来，我们调查了慢性损伤引起的Lgr5 +细胞是肝干细胞。在连续用CCl4处理的Lgr5-GFP小鼠的第40天分选单个Lgr5-GFP +细胞。在干细胞培养基中培养的分选细胞迅速分裂并形成通过每周传代维持的有机体结构。从肝纤维化模型分类的Lgr5 +细胞形成有机体，其数量和大小与从1X CCL4损伤模型分类的细胞形成的组织相似。此外，当分化肝纤维化模型的Lgr5 +细胞在分化培养基（DM）中培养时，表达成熟肝脏基因，大量白蛋白和AAT分泌到培养基中。分化细胞对于积累的糖原和低密度脂蛋白（LDL）摄取是有效的。这些结果表明，慢性损伤诱导的这些Lgr5 +细胞是肝干细胞。

在本发明另一实施例中，结果移植Lgr5 +细胞减弱肝纤维化。

接下来我们探询Lgr5 +肝干细胞是否支持急性损伤或慢性损伤恢复。使用FACS，我们从用1XCCL4处理的Lgr5-GFP小鼠中分离出Lgr5-GFP +肝干细胞，并将这些细胞注入到具有急性肝损伤（单次CCL4治疗）或慢性肝损伤（肝纤维化模型，2XCCL4）的野生型C57小鼠中治疗/周6周，图1a）。我们使用小鼠原代肝细胞（PH）作为对照。在第40天，在移植有Lgr5-GFP +肝干细胞的小鼠中检测到GFP阳性细胞，但不在移植有PH的小鼠中（图1b），这些Lgr5-GFP +细胞与导管祖细胞标记Sox9共同染色。令我们惊讶的是，在急性肝损伤模型中，Lgr5-GFP +肝干细胞和PH处理的小鼠都表现出正常的血清ALT和AST。在慢性肝损伤模型中，当移植Lgr5-GFP +肝干细胞而不是PH时，小鼠表现出减弱的纤维化表型（图1c-e）。治疗效果为剂量依赖性，105 Lgr5 +肝干细胞移植移植减少了CCL4诱导的小鼠的纤维化面积，并显着降低了血清ALT和AST水平（图1c-e）。然而，由于我们实验室目前不能使用谱系跟踪模型，因此在运行计划后，这些Lgr5 +细胞对哪些单元格类型做出了贡献并不清楚。根据体外分化测定，移植的Lgr5 +肝干细胞可能主要在宿主中产生更多的肝细胞。这些结果一起为Lgr5-GFP +肝干细胞治疗肝损伤，特别是慢性肝纤维化的治疗效果提供了证据。

在本发明再一实施例中，敲除Lgr5加重CCl4导致的肝纤维化。

我们接下来研究了内源性Lgr5 +肝干细胞是否在肝纤维化发展中起关键作用。为了回答这个问题，我们设计了一种删除或禁用Lgr5 +肝干细胞的工具。然后我们调查Lgr5表达是否对于Lgr5 +肝干细胞的干细胞特性是必需的。在肠中，使用条件小鼠模型，de Lauet al。证明，Lgr5缺失不会导致肠道破裂，除非与同源物Lgr4（9）同时删除。然而，虽然肠Lgr5 +细胞表达Lgr5和Lgr4蛋白，但肝Lgr5 +细胞单独表达Lgr5。一致地，对于肠道Lgr5 +细胞，我们不得不击倒Lgr5和Lgr4以抑制其组织形成能力，而对于肝脏Lgr5 +细胞，我们通过单独的Lgr5敲低来消除其组织形成能力。在CCL4处理后第5天，从CCL4处理的Lgr5-GFP小鼠中分离单个Lgr5-GFP +细胞，然后用腺病毒Lgr5 shRNA（Ad-Lgr5shRNA）感染，在腺病毒感染后72小时，Lgr5蛋白表达和Lgr5mRNA表达均降低（图2a）。如前所述培养分选的细胞。我们观察到，Lgr5的敲低抑制了肝组织的体外形成（图2b）。这些结果表明，没有Lgr5表达，Lgr5 +肝干细胞丧失其干细胞特性。此外，结果表明Ad-Lgr5shRNA可用于模拟Lgr5 +肝干细胞失去功能进一步研究。

接下来，我们用Ad-Lgr5shRNA感染小鼠以禁用内源性Lgr5 +肝干细胞，以研究Lgr5 +肝干细胞是否在肝纤维化发展中起关键作用。我们使用CCL4诱导的肝纤维化小鼠模型。将8周龄的C57小鼠每周两次注射CCl4 6周，并将Ad-Lgr5shRNA或无义对照shRNA腺病毒（Ad-Ctrl shRNA）从第0天和每周一次注射到小鼠尾静脉中，直到处死小鼠。我们观察到Ad-Lgr5shRNA感染降低了Lgr5的mRNA水平，当用Ad-Lgr5shRNA处理小鼠时，没有CCl4诱导的Lgr5 +细胞。令人惊讶的是，Ad-Lgr5shRNA处理的小鼠比通过H＆E染色和Sirius染色检测到的Ad-Ctrl shRNA处理的小鼠显示更严重的肝损伤和纤维化（图2c）。此外，与Ad-CtrlshRNA治疗的小鼠中观察到的相比，Ad-Lgr5shRNA处理的小鼠中ALT和AST的血清水平（图2d和2e）显着增加。

为了进一步评估肝脏Lgr5 +干细胞中Lgr5的功能，我们使用CRISPR / Cas9系统生成Lgr5敲除腺病毒。将靶向Lgr5基因第一外显子的Cas9和引导RNA（gRNA）的mRNA包装成腺病毒。在CCL4处理后第5天，从CCL4处理的Lgr5-GFP小鼠中分选单个Lgr5 +细胞，然后用编码Cas9和Lgr5gRNA（Ad-Lgr5gRNA）或对照无义gRNA（Ad-Ctrl gRNA）的腺病毒感染，Lgr5蛋白并在腺病毒感染后72小时mRNA表达降低。如前所述培养分选的细胞。我们观察到Lgr5的敲除抑制了肝组织的体外形成。然后我们用编码Cas9和Lgr5 gRNA的腺病毒感染小鼠，以在体内禁用Lgr5 +肝干细胞。我们使用CCL4诱导的肝纤维化小鼠模型。 8周龄C57小鼠每周两次注射CCl4 6周。将编码Cas9和Lgr5gRNA（Ad-Lgr5gRNA）或对照无义gRNA（Ad-CtrlgRNA）的腺病毒从第0天和每周一次注射到小鼠的尾静脉中，直到小鼠处死。我们观察到编码Cas9和Lgr5 gRNA感染的腺病毒感染降低了肝脏中Lgr5的蛋白质和mRNA水平。令人惊奇的是，用编码Cas9和Lgr5gRNA处理的小鼠的腺病毒处理的小鼠比用H＆E染色和Sirius染色检测的编码Cas9和对照gRNA处理的小鼠的腺病毒处理的小鼠表现出更严重的肝损伤和纤维化。此外，与用编码Cas9和对照gRNA处理的小鼠的腺病毒处理的小鼠相比，用编码Cas9和Lgr5gRNA处理的小鼠的腺病毒处理的小鼠中，ALT和AST的血清水平显着增加。为了确认靶向Lgr5的CRISPR / Cas9的效力，我们检测了用编码Cas9和Lgr5gRNA的腺病毒处理的小鼠肠中Lgr5的表达。我们观察到编码Cas9和Lgr5gRNA的腺病毒感染使肝脏Lgr5和Lgr5 +细胞的数量降低。

这些结果表明Lgr5的敲低加剧了CCL4诱导的肝纤维化。我们的研究结果表明，Lgr5 +肝干细胞可能有助于缓解Lgr5表达依赖性肝纤维化。

在本发明又一实施例中，HGF / Rspo1在CCl4处理后诱导Lgr5 +肝干细胞。

我们接下来探讨了如何在体内诱导更多的内源性Lgr5 +肝干细胞。我们以前的研究表明，体外肠组织培养因子Rspo1和Slit2在体内诱导Lgr5 +肠干细胞。因此，我们测试Lgr5 +肝干细胞培养基中所涉及的生长因子是否在体外诱导Lgr5 +肝干细胞体内。为此，产生重组His标记的EGF，Fgf10，HGF和Rspo1（rEGF，rFgf10，rHGF，rRspo1）。在第0天向8周龄的Lgr5-GFP小鼠注射单剂量的CCL4，将第0天至第4天的生长因子（0.1gmice-1和1天-1）注射到小鼠的尾静脉在第5天收集和分析肝脏（图3a）。我们观察到rgr5 mRNA单独增加rHGF和rRspo1（图3b）。此外，当小鼠肝脏受CCl4损伤时，rHGF与rRspo1组合增加了Lgr5 mRNA水平，然而，它们没有增加油处理的对照小鼠肝脏中的Lgr5 mRNA水平（图3c）。用抗GFP抗体的免疫荧光测定结果表明，在对照油处理的Lgr5-GFP小鼠中，Lgr5-GFP +细胞基本上是不可检测的，不管小鼠是否与rRspo1组合使用或不与重组rHGF一起治疗，然而，在用rHGF与rRspo1组合处理的小鼠中观察到更多数量的Lgr5-GFP +细胞（图3d）。然后我们使用流式细胞术确认了这些结果，并从Lgr5-GFP小鼠中分选了Lgr5-GFP +肝干细胞，我们观察到在CCL4处理的小鼠中与rRspo1和rHGF组合治疗后，Lgr5-GFP +肝脏干细胞数量显着增加但不是在对照油处理的小鼠中（图3e和3f）。在肠中，rHGF与rRspo1组合也增加了10Gy照射损伤时的Lgr5+肠干细胞数，但没有增加正常小鼠中没有照射损伤的Lgr5 +肠干细胞数。

接下来，我们测试了rHGF联合rRspo1的治疗是否增加了慢性损伤时Lgr5 +肝干细胞的数量。此处使用CCL4诱导的肝纤维化模型。将rHGF和rRspo1分别以0.1μgmice-1的剂量注射到CCL4处理的Lgr5-GFP小鼠中，每周三次，持续6周（图3g）。使用抗GFP抗体的免疫荧光测定结果在用rHGF联合rRspo1处理的小鼠中显示出更多的Lgr5-GFP +细胞（图3h）。然后我们使用流式细胞术确认了这些结果，并从Lgr5-GFP小鼠中分选了Lgr5-GFP +肝干细胞，我们观察到rr5-GFP +肝干细胞的数量在用rHGF联合rRspo1处理后显着增加在PBS对照处理的小鼠中观察到（图3i）。

为了证明在肝纤维化期间通过rHGF和rRspo1组合治疗增加的Lgr5 +细胞数是否具有与由1XCCL4诱导的Lgr5 +细胞相似的肝干细胞特性，将单个Lgr5 +细胞从单独用1XCCl4处理的Lgr5-GFP小鼠或12XCCl4（肝纤维化模型）加rHGF和rRspo1。在干细胞培养基条件下培养的分选细胞迅速分裂并形成通过每周传代维持的有机体结构。来自不同条件（单独1XCCL4治疗或肝纤维化模型加rHGF和rRspo1治疗）的Lgr5 +细胞显示出类似的形成组织的能力，其具有相似的形状，数量和大小（图3j）。这些结果表明，重组rHGF联合rRspo1的施用可以在CCL4引起的慢性损伤期间增加体内Lgr5 +肝干细胞的数量。

在本发明再一实施例中，rHGF加rRspo1依赖于Lgr5表达而减弱肝纤维化。

我们接下来测试rHGF / rRspo1是否可以通过增加Lgr5 +肝干细胞的数量来恢复CCl4损伤的肝功能。将rHGF或/和rRspo1以0.1μgmice-1的剂量注射到CCL4处理的C57小鼠中，每周三次，持续6周（图3g）。使用H＆E和Sirius Red染色，我们观察到rHGF加rRspo1显着降低了CCL4诱导的小鼠的纤维化面积，而rHGF或rRspo1alone没有显示出明显的作用（图4a）。与rHGF或rRspo1单独处理的小鼠相比，rHGF加rRspo1治疗小鼠的血清ALT和AST水平也显着降低（图4b和4c）。为了验证rHGF / rRspo1是否通过Lgr5 +肝干细胞诱导恢复肝功能，我们在CCL4诱导的肝纤维化模型中使用Ad-Lgr5shRNA感染敲低Lgr5表达。将Ad-Lgr5shRNA或对照Ad-Ctrl shRNA注射到小鼠尾静脉的尾静脉中，每周一次，持续6周。通过Ad-Lgr5感染，Lgr5 mRNA水平降低。我们观察到，在用Ad-Lgr5shRNA感染的CCL4诱导的小鼠中，rHGF与rRspo1组合不能降低肝纤维化面积以及血清ALT和AST水平（图4d-f），尽管它们显着降低了肝纤维化面积和用Ad-Ctrl shRNA控制感染的CCL4诱导的小鼠中的血清ALT和AST水平。

我们接下来检查rHGF / rRspo1是否可以诱导大量的Lgr5 +肝干细胞，并阻止已建立的纤维化进一步发展。在Dean Sheppard实验室描述的治疗方案之后，我们用CCL4处理Lgr5-GFP小鼠3周，建立纤维化疾病，然后用rHGF / rRspo1或PBS进行CCL4的最后3周。用抗GFP抗体的免疫荧光测定结果显示，用rHGF联合rRspo1处理的小鼠中Lgr5-GFP +细胞的数量显着增加。此外，rHGF / rRspo1甚至在纤维化疾病建立后也显着降低，如胶原（Sirius红）和a-SMA染色和羟脯氨酸含量所测定。 rHGF / rRspo1处理后ALT和AST的血清水平也显着降低。此外，R-spondin1 / HGF处理对于减少肝纤维化的效果比其他人报告的效果更好。

在本发明另一实施例中，在人肝纤维化组织中发现Lgr5 +干细胞。

为进一步研究Lgr5 +肝干细胞是否存在于受伤的人肝脏中，我们从42例肝纤维化临床诊断患者和5例肝纤维化病例正常肝脏样本中获取样本，作为对照。使用针对Lgr5的抗体进行免疫染色，我们观察到Lgr5在正常肝脏中基本上不可检测，而在肝纤维化样品中观察到清楚的Lgr5阳性细胞（图5a）。通过qRT-PCR测定证实Lgr5的增强表达（图5b）。然后我们测试这些人类Lgr5 +肝细胞是否具有干细胞特性。我们从临床诊断为肝纤维化的5名供体获得活检样本。使用FITC标记的抗Lgr5抗体通过FACS分选从这些新鲜肝纤维化样品中分离单个Lgr5 +人肝细胞。与Lgr5阴性细胞相比，FGR分选的Lgr5阳性细胞表达了更多数量的管状样祖细胞的标记基因，包括Lgr5，Axin2，Sox9和CK19，以及较少或没有肝细胞的标记基因，包括Fah， HNF4a和Alb。此外，在干细胞培养基中培养的分选细胞迅速分离并形成组织结构，其连续传代培养（最多4次;每次传代2周）（图5c）。

接下来，我们调查rHGF / rRspo1是否促进人类Lgr5 +肝干细胞。我们在培养基中添加了不同量的rHGF / rRspo1蛋白，观察到单个人类Lgr5 +肝干细胞不能形成没有rHGF/ rRspo1蛋白的有机体，并且高浓度的rHGF / rRspo1蛋白有助于组织生长更快（图5d ），诱导更多的Lgr5 mRNA表达（图5e），并且与低浓度的rHGF / rRspo1蛋白质相比，在组织内产生更多数量的人Lgr5 +肝干细胞（图5f）。这些结果一起表明，Lgr5 +肝干细胞存在于人肝纤维化组织中，使用rHGF联合rRspo1注射诱导更多Lgr5 +肝干细胞的肝纤维化治疗方法也可在人体中起作用。

通过施用可溶性分子诱导内源性成体干细胞为组织损伤修复提供了有利的方法，其可能是移植胚胎或多能干细胞来源的组织用于治疗急性器官衰竭的临床适用和成本有效的替代方案。我们以前发现Slit2与Rspo1协同作用，以减少肠干细胞的损失，减轻肠道对化放疗的反应，导致即使在接受致死剂量的5-FU和全身/腹部照射的动物（16 ）。在这里，我们证明HGF和R-Spondin1可以促进内源性Lgr5 +肝干细胞修复化学诱导纤维化的肝脏。

Huch等人，2013年（8）首先报道了肝脏损伤引起的Lgr5 +肝干细胞的诱导。 Lgr5在健康的成年肝脏中不表达，然而，Lgr5 +细胞在急性损伤时出现在胆管附近，这些Lgr5 +肝干细胞已经被证明通过肝细胞和导管细胞的新生代积极地促进肝再生（8）。在本发明研究中，我们证实Lgr5 +肝干细胞在慢性纤维化肝病中也被诱导和保留。更重要的是，Lgr5 +肝干细胞移植缓解了CCL4诱导的肝纤维化，当Lgr5被敲低时，小鼠发生更严重的纤维化。值得注意的是，尽管报道了Lgr5和Lgr4基因需要同时敲低以消除Lgr5 +肠干细胞的干细胞（9），但我们观察到，在Lgr5 +肝干细胞中，与Lgr5 +肠干细胞不同，没有Lgr4蛋白的表达，单独的Lgr5的敲低对于Lgr5 +肝干细胞来说已经足够了，从而失去了它们的干性。这使我们能够通过敲击Lgr5来剥夺Lgr5 +肝干细胞在体内的功能。此外，我们观察到Rspo1与已知的肝细胞诱导因子HGF的并发给药促进Lgr5 +细胞在体内受损后的诱导。此外，在诊断为肝纤维化的患者中也观察到Lgr5 +肝干细胞，并且rHGF / rRspo1蛋白质可以在体外增加人Lgr5 +肝干细胞的数量。我们的研究结果表明，用HGF / Rspo1治疗可以促进慢性纤维化肝脏的肝脏恢复。考虑到肝纤维化是导致肝功能丧失的全世界疾病，这一假设是非常有趣的，并且在临床环境中具有巨大的潜力。

有趣的是，HGF / Rspo1在不具有Lgr5 +细胞的正常肝脏中不能诱导Lgr5 +细胞，而当肝脏损伤诱导Lgr5 +细胞时，其诱导更多数量的Lgr5 +细胞。 Lgr5表达对于应对HGF/ Rspo1治疗以修复肝损伤至关重要。然而，发生这种情况的机制需要进一步研究。此外，Lgr5 +干细胞的起源尚待解决。这些损伤诱导的Lgr5 +干细胞的潜在来源包括来自非受伤肝脏的Lgr5-祖细胞，从远端位点募集（例如间充质细胞），围绕中心静脉的Axin2 +肝细胞，Sox9 +混合门静脉门静脉和胆管周围的肝细胞，或肝细胞转导入导管细胞，如胆道树（肝内胆管癌）的肿瘤中发生的。需要进一步的研究来探索这些假设。

值得注意的是，最近已经报道了慢性Wnt /-连环蛋白活性异常，包括Rspo1和Lgr5的过度表达，以促进肝肿瘤发生。此外，据报道，Rspo1对体外肝星状细胞（HSC）的活化有促进作用，促进肝纤维化的发生。然而，在我们的研究中，Rspo1注射没有促进体内有或没有CCL4损伤的肝纤维化（图4a-4c，数据未显示）。这些不同的结果可能是由于体外和体内条件之间的差异。此外，我们研究中rRspo1和rHGF的组合的施用预期仅仅短暂地强烈激活Wnt/-连环蛋白信号，这与肿瘤发展或肝纤维化发展所需的Wnt /-连环蛋白活化基本不同，这需要多年。因此，这种短脉冲rRspo1 / rHGF治疗不太可能会增加发生癌症的风险。

此外，我们未发表的数据表明，肝纤维化样本中分离的人Lgr5 +肝干细胞可以在体外培养并分化为功能性成熟肝细胞。我们实验室正在对个体化医学和疾病建模中从人类Lgr5 +肝干细胞衍生的体外成熟肝细胞的潜在用途进行调查。然而，Lgr5 +肝干细胞如何抑制肝纤维化形成的机制尚不清楚。根据我们目前的数据，Lgr5 +肝干细胞诱导不仅抑制肝纤维化的发展，而且减弱了建立的纤维化。来自Lgr5 +肝干细胞的新型健康肝细胞可能有助于肝功能恢复。此外，我们正在进行的研究已经证明，Lgr5 +肝干细胞条件培养基可以将活化的肝星状细胞（HSC）逆转到静止的HSC，这表明Lgr5 +肝干细胞可以通过直接分泌特定因子来减少肝纤维化。需要进一步的研究来探索详细的机制。

在本发明的另一实施例中，具体进行了如下实验：

小鼠实验：

C57BL6/J (wild type; stock no. 005304), and Lgr5-eGFP-IRES-CreERT2(Lgr5–GFP; stock no. 008875)小鼠购买自Jackson Laboratory。

CCL4单次注射：8周龄雄性小鼠腹腔注射CCL4（2毫升/kg体重），CCL4按1：4比例溶于橄榄油，对照小鼠只注射橄榄油，5天后取肝脏标本。

CCL4诱导小鼠肝纤维化模型：8周龄雄性小鼠腹腔注射CCL4（2毫升/kg体重），CCL4按1：4比例溶于橄榄油，对照小鼠只注射橄榄油，每周两次，持续注射6周。首次注射40天后取肝脏标本。

天狼腥红染色：肝脏标本切5微米切片，用天狼猩红染料染色，结果用尼康显微镜40倍视野观察并软件统计分析，每张切片随机取6个视野，每只小鼠随机6张切片，每组10只小鼠，进行统计比较。

免疫荧光染色：

肝脏组织4%多聚甲醛固定，切5微米厚切片，0.05%TritonX100破膜，1%BSA封闭，一抗37度孵育1小时，抗GFP一抗购自Novus Biologicals公司，1：200使用，抗Lgr5一抗购自Abcam公司，1：100使用。洗过一抗后加荧光二抗37度孵育1小时。DAPI染核。莱卡共聚焦显微镜观察拍照。

Lgr5+阳性肝脏干细胞分离、计数：

对小鼠肝脏干细胞分离，肝细胞分离使用标准三步法，200 ml 含 0.5 M EGTA 的肝脏灌洗液 (成分：30 mMKCl, 1.3 M NaCl, 10 mM NaH2PO4.2H2O, 100 mM Glucose and100 mM HEPES, pH7.4)通过肝门静脉灌洗。然后用不含EGTA的200ml肝脏灌洗液灌洗。然后用含0.02%4型胶原酶和5mMCaCl2 的肝脏灌洗液灌洗，直至消化完全。消化好的肝脏用50mlPBS重悬，100微米的筛孔过滤，50g4度离心5分钟，单细胞悬液用流式细胞分选仪分选Lgr5阳性肝脏干细胞。Lgr5阳性肝脏干细胞已经GFP绿色荧光蛋白或488绿色染料标记。

对人肝脏干细胞分离，新鲜肝脏组织切成小块，用含0.05%胰蛋白酶的DMEM培养液37度消化10分钟，细胞悬液稀释2倍，在含10%胎牛血清的DMEM培养液里400g离心，然后重悬在含0.02%4型胶原酶的DMEM培养液里37度消化20分钟，细胞悬液经40微米筛孔过滤，稀释4倍在含10%胎牛血清的DMEM培养液里，细胞悬液300g4度离心5分钟，用购自Abcam公司的抗Lgr5一抗标记Lgr5阳性细胞，用绿色染料标记的二抗标记Lgr5一抗，经流式细胞分选仪分选Lgr5阳性的人肝脏干细胞。

重组蛋白制备：

重组Rspo1和HGF蛋白，其人源cDNA被扩增克隆连接6个His标签，可表达融合蛋白，引物序列如下：

Rspo1正向引物: 5’-TTGCGGCCGCATGCGGCTTGGGCTGTG-3’,反向引物: 5’-GGGAATTCGGCAGGCCCTGCAGATGTGAGTGGCC-3’;

HGF正向引物: 5’-TTGCGGCCGCATGTGGGTGACCAAACTCC-3’,

HGF反向引物: 5’-GGGAATTCTGACTGTGGTACCTTATATG-3’。

酶切位点：NotI/EcoRI，载体：pVL1392。该两个重组蛋白使用sf9昆虫细胞表达系统，用杆状病毒感染昆虫细胞，纯化的蛋白去内毒素后溶于PBS，内毒素含量小于0.1单位每毫克。

定量RT-PCR

使用RNA Miniprep试剂盒（Stratagene）提取小鼠肝/肿瘤或人类患者样品的总RNA，并使用ThermoScript RT-PCR系统（Invitrogen）进行逆转录。 将所得的cDNA用SYBR-Green Master PCR Mix（Applied Biosystem）一式三份进行PCR。全部所有小鼠和humanqRT-PCR引物对购自SABiosciences。 在Mx3000 qPCR系统（Stratagene）上进行PCR和数据采集。 所有定量标准化为内源性-肌动蛋白对照。 每个靶基因与该靶标的校准器相比的相对定量值表示为2-（Ct-Cc）（Ct和Cc是标准化至-肌动蛋白后的平均阈值循环差异）。使用Mx3000 qPCR System (Stratagene)仪器，内参为b-actin ，通过与内参比较得出各组分mRNA水平差异。

Lgr5+ 肝脏干细胞及类器官培养：

小鼠或人的Lgr5阳性肝脏干细胞依前述方法获得，对小鼠细胞，单个Lgr5-GFP阳性肝脏细胞与Matrigel混合，加入细胞培养液（成分：AdDMEM/F12 (Invitrogen)supplemented with 1% B27 and 1% N2 (Invitrogen), N-acetylcysteine (1.25 mM,Sigma-Aldrich), gastrin (10 nM, Sigma), EGF (50 ngml-1, Peprotech), Rspo1 (50ngml-1, R&D), FGF10 (100 ngml-1, Peprotech), nicotinamide (10mM, Sigma-Aldrich) and HGF (50 ng/ml, Peprotech)）。培液两天换一次，对人的Lgr5阳性肝脏干细胞，在小鼠培养液基础上加入5 µM A83.01 (Tocris), and 10 µM FSK (Tocris) ，在前三天，培养液里加入25 ng/ml Noggin (R&D), 25 ng/ml Wnt (R&D), and 10 µM (Y27632,SigmaAldrich)，三天后去掉这三种成分，培养10-14天，养成的类器官从Matrigel里取出，剪碎，传代，传代按1：4到1：8传，每7-10天传一次，可至少培养6个月。

Lgr5shRNA腺病毒尾静脉注射干扰肝脏Lgr5表达：

靶向小鼠Lgr5 shRNA腺病毒由Vector Biolabs (U.S.)公司制备，靶向靶点序列为：5’-TTATTAACAGCAGTCAGGG-3’; 对照control shRNA 靶点序列: 5’-TGAGCAGGCGCATGTGCTG-3’. 1X10⁸ pfu 腺病毒通过尾静脉注射入小鼠体内。对体外培养的Lgr5阳性肝脏干细胞，1X106 pfu 腺病毒被加入细胞培养液，每周加入一次。

肝功能参数测量

肝功能障碍根据标准肝生物化学测定定义。 使用IFCC方法在自动生化分析仪（Au2700，Olympus，Japan）上分析血清天冬氨酸氨基转移酶（AST），丙氨酸氨基转移酶（ALT）。

肝细胞功能检测：

为了测量糖原贮存和LDL摄取，肝干细胞长成的类器官在扩增培养基和分化培养基分别培养14天，收取类器官，应用试剂盒检测对糖原和DiI-Ac-LDL分别进行染色。对于ALB和AAT的检测，类器官分化后，第十四天取培养液上清，用ELLSA试剂盒分别检测ALB和AAT含量，原代肝脏细胞培养液上清作为阳性对照。

Lgr5肝脏干细胞移植：

利用流式细胞分选仪从Lgr5-GFP小鼠肝脏中分选出Lgr5-GFP阳性肝脏干细胞，接受接种小鼠为CCL4诱导肝纤维化模型小鼠，1% pentobarbital sodium 麻醉后，左侧腹部毛发剃光，剪开皮肤，暴露脾脏，1x106 Lgr5阳性肝脏干细胞被注射入脾膜下，100微升抗生素penicillin and streptomycin注射入腹腔内，移植后第40天，小鼠处死，收取血液、肝脏标本。

有机蛋白的Western印迹

将肝组织生长在扩增培养基中10天，并将1×10 ⁸ pfu的Ad-Lgr5 shRNA或Ad-Ctrl shRNA加入到培养基中，3天后收集有机物，与200μl裂解缓冲液（Tris-HCL 50mM ，PH7.4，Nacl 150mM，脱氧胆酸钠0.25％，NP-40 1％，EDTA 1mM，PMSF 1mM，抑肽酶1μgml-1，亮抑酶肽1μgml-1，胃蛋白酶1μgml-1） 在12000rpm下5分钟。 将上清液用5x加载缓冲液煮沸5分钟，然后使用以下抗体进行SDS-PAGE和western印迹：抗-Lgr5（1：2000，ab75850，Abcam），抗-β-肌动蛋白（1：2000，A5441，Sigma）。

患者和免疫组织化学染色

台州医院和南方医院的供体人肝活检（0.5-1 cm3）。 每位患者获得知情同意书，研究方案由温州医科大学和南方医科大学临床研究伦理委员会批准。 组织学检查证实肝纤维化的诊断。

免疫组织化学染色进行如16,331之前，获得5微米厚的组织切片，并与初级抗Lgr5抗体（1：100，ab75850，Abcam）孵育，然后与辣根过氧化物酶抗兔IgG抗体。 然后通过与DAB底物试剂盒（Pierce）显色。 洗涤后，组织切片最后用苏木精复染。

CRISPR/Cas9 系统敲除Lgr5：

腺病毒包装的敲除Lgr5CRISPR/Cas9 系统由上海和元生物公司制备，针对Lgr5第一个外显子设计gRNA，

序列：ACACTGTCACTGTGAGCTGGATGG。1X10⁸ pfu 腺病毒尾静脉注射小鼠，每周一次，连续6周。

统计

通过Student t检验或Mann-Whitney检验对实验数据进行统计学分析。 所有数据以平均值±S.D表示。 P <0.05被认为具有统计学意义。 在所有情况下，使用至少三次独立实验的数据。 所有计算均采用SPSS软件包进行，没有使用随机化，未进行功率计算以预先确定样品量。

本发明延续诱导组织内源干细胞治疗组织损伤疾病的思路，鉴于肝脏疾病对我国及世界人民健康的巨大威胁，发明人在2015年初就瞄准了诱导肝脏干细胞治疗肝损伤疾病的研究方向，进行了全方位探索。

经过大量的前期研究工作，发明人发现，肝纤维化过程中，Lgr5表达阳性的肝脏干细胞被诱导出现，并且该Lgr5阳性的肝脏干细胞有抑制肝纤维化的功能，本发明进一步筛选到了新的蛋白分子HGF与Rspo1联合注射可以诱导内源Lgr5阳性的肝脏干细胞增多，减缓肝纤维化进程。

更重要的是，本发明在临床病人肝纤维化样本中也发现了Lgr5表达阳性的肝脏干细胞。这表明本发明的研究有很强的临床应用可能。目前，与本发明研究相似的成果尚无报道。本发明的研究既具延续性，又具创新性，更具临床应用价值。

综上所述，本发明的研究将利用肝脏组织内源成体干细胞的自我更新和组织损伤修复能力，直接利用可溶性蛋白注射来激活肝脏干细胞活性，以达到修复肝损伤、治疗肝纤维化的目的。本发明方法在应用上操作简便，一旦在动物模型得到验证和优化，将能很快应用到临床上去。本发明的研究将有可能为肝纤维化治疗带来新的有效方法，救治广大遭受肝脏疾病威胁的病人。同时，本发明的研究也将加深人们对成体组织干细胞自我更新、促进组织损伤修复/再生等特性的理解，拓展成体干细胞的应用范围和应用方法，有可能为治疗各种原因引起的组织损伤修复、组织器官再生障碍等疾病所借鉴。

在本发明另一实施例中，主要围绕HGF/Rspo1蛋白诱导内源Lgr5+肝脏干细胞治疗肝纤维化和急性肝损伤的作用和机制开展研究，探讨基于内源干细胞诱导的肝纤维化治疗及急性肝炎治疗的新方法。

1.肝纤维化过程中出现Lgr5表达阳性的肝脏干细胞。

正常肝脏中，未检测到有Lgr5表达阳性干细胞存在，Huch等研究人员报道（Nature，2013），当肝脏受到急性损伤时，会出现Lgr5表达阳性的肝脏干细胞，在慢性肝损伤中是否存在Lgr5+细胞仍然未知。我们首先重复了Huch等研究人员的工作，在CCL4急性处理后，小鼠肝脏Lgr5表达确实上调，并且随着肝脏的自我修复，Lgr5表达水平下调回正常。我们利用Lgr5-GFP小鼠建立了CCL4诱导肝纤维化模型（慢性肝损伤，每周两次2 ml/kgCCL4腹腔注射小鼠，连续六周。），发现，在长期慢性肝损伤引起的肝纤维化中，Lgr5表达阳性的肝脏干细胞一直到第40天造模结束时仍然存在。Lgr5表达水平在CCL4诱导第五天达到顶峰，并在整个肝纤维化过程中维持该表达水平。Lgr5阳性的肝脏干细胞表达祖细胞标志物Sox9，不表达肝实质细胞标志物Hnf4a。

2）肝纤维化模型中分离的Lgr5+肝脏细胞有干细胞能力。运用流式细胞分选技术（FACS），我们成功从第40天的CCL4诱导肝纤维化模型样本中分离到Lgr5表达阳性的细胞，在体外培养中我们发现单个Lgr5+肝脏细胞具有干细胞能力，可以生成类器官，并可传代三次以上仍然维持其干细胞能力。这些肝纤维化模型分离出来的Lgr5肝脏干细胞形成体外类器官的能力与急性肝损伤模型分离出来的Lgr5肝脏干细胞相当。我们用诱导肝脏干细胞分化的培养基对这些Lgr5+细胞进行培养，发现该细胞可向肝脏上皮细胞分化，肝上皮细胞标志物明显上调，并有大量ALB和AAT分泌到上清里。这些分化的细胞能够合成糖原，摄取脂质。

3）Lgr5+肝脏干细胞有抑制肝纤维化功能。我们将通过细胞分选得到的Lgr5+肝脏干细胞移植入肝纤维化模型小鼠脾脏中（图1.a），我们用原代肝脏细胞移植作对照，发现，Lgr5+肝脏干细胞成功经脾脏进入肝脏组织（图1.b），这些Lgr5阳性干细胞表达祖细胞标志物SOX9。对于急性肝损伤，Lgr5阳性肝脏干细胞移植与肝脏原代细胞移植都能有效缓解肝损伤，对于慢性肝纤维化，肝脏原代细胞移植几乎没有任何效果，Lgr5+肝脏干细胞移植则可明显抑制小鼠肝纤维化，天狼猩红胶原纤维染色减少（图1.c）小鼠外周血中ALT、AST表达减少（图1.d，e）。

这些结果证明，Lgr5阳性肝脏干细胞可以用于治疗肝纤维化。

4）Lgr5敲除可以加重CCL4引起的肝纤维化。我们发现，与Lgr5阳性肠干细胞不同，Lgr5阳性肝脏干细胞仅表达Lgr5，不表达Lgr4，这样我们可以通过用腺病毒感染Lgr5shRNA敲低Lgr5表达来使Lgr5阳性肝脏干细胞失去干细胞功能。当我们用携带Lgr5shRNA的腺病毒通过尾静脉注射感染CCL4诱导小鼠肝纤维化模型，发现，携带Lgr5shRNA的腺病毒确实敲低了小鼠肝脏的Lgr5表达。通过天狼星红染色，Lgr5敲低小鼠的肝纤维化程度增强（图2c），肝损伤指标ALT、AST水平升高（图2d，e）。

我们进一步用CRISPR/Cas9 技术敲除CCL4诱导肝纤维化小鼠体内Lgr5表达，发现，Lgr5被敲掉后，小鼠肝脏干细胞体外形成类器官的能力被减弱，体内肝纤维化程度增强，肝损伤指标ALT、AST水平升高。

这些结果表明Lgr5敲除可以加重CCL4引起的肝纤维化，Lgr5阳性干细胞在体内有抑制肝纤维化的作用。

5）HGF/Rspo1蛋白可诱导内源Lgr5+肝脏干细胞增多。我们建立了上调内源Lgr5表达筛选模型（图3.a），筛选到了HGF和Rspo1两个蛋白可以上调内源Lgr5表达（图3.b），二者联用上调Lgr5表达的效果更好（图3.c）。我们进一步通过流式细胞分析（FACS）实验验证了，在CCL4急性刺激情况下，HGF/Rspo1蛋白可诱导内源Lgr5+肝脏干细胞增多（图3.d，e，f）。我们进一步发现，在CCL4慢性肝纤维化模型中，HGF/Rspo1蛋白也可诱导内源Lgr5阳性肝脏干细胞增多（图3.g，h，i）。并且，我们证实了，HGF/Rspo1蛋白诱导出来的Lgr5阳性干细胞的体外形成类器官能力与CCL4诱导出来的Lgr5阳性干细胞能力相当（图3.j）。这些实验表明，在损伤情况下，HGF/Rspo1蛋白可诱导内源Lgr5+肝脏干细胞增多。

6）HGF/Rspo1蛋白降低肝脏纤维化。我们将HGF/Rspo1重组蛋白通过尾静脉注射CCL4诱导肝纤维化模型小鼠（图3.g），发现天狼猩红胶原纤维染色减弱（图4.a），外周血ALT、AST水平降低（图4.b，c）。为了证实HGF/Rspo1通过Lgr5阳性干细胞来回复肝损伤，我们用携带Lgr5shRNA的腺病毒通过尾静脉注射感染CCL4诱导肝纤维化模型的小鼠肝脏，发现，携带Lgr5shRNA的腺病毒可以降低肝脏Lgr5表达，此时，HGF/Rspo1不再能够减缓肝纤维化程度（图4.d-f）。HGF/Rspo1可以减缓携带对照shRNA腺病毒感染小鼠的肝纤维化程度。

我们进一步检测HGF/Rspo1是否能治疗已经发生纤维化的肝脏损伤。在CCL4处理小鼠3周后才开始对小鼠进行HGF/Rspo1蛋白尾静脉注射治疗。我们发现，HGF/Rspo1蛋白尾静脉注射治疗能够诱导出更多的Lgr5细胞，缓解肝脏纤维化程度和损伤程度。更重要的是，我们比较了已报道的能够治疗肝纤维化的试剂，发现，我们提出的HGF/Rspo1蛋白尾静脉注射治疗治疗方法有着更好的治疗效果。

7）人肝纤维化样本中存在Lgr5阳性肝脏干细胞。通过Lgr5抗体免疫组织化学实验，我们发现，在人的肝纤维化样本中也存在Lgr5表达阳性细胞（图5.a），Lgr5 mRNA水平在肝纤维化组织中明显上调（图5.b）。我们进一步通过流式细胞分选（FACS）分离到人Lgr5+肝脏干细胞，并进行了体外培养，发现单个人Lgr5+肝脏干细胞具有干细胞能力，可以成长为类器官，并可保持干细胞能力至少三代以上（图5.c）。我们检测了这些人Lgr5阳性细胞的基因表达，发现，这些细胞表达较高水平的祖细胞标志物如 Lgr5, Axin2, Sox9 and CK19等，低表达或不表达肝实质细胞标志物如Fah, HNF4a, and Alb等。

我们进一步证实，在体外，HGF/Rspo1蛋白可增强人lgr5阳性肝脏干细胞形成类器官的能力（图5.d），并能诱导产生更高的Lgr5表达（图5.e）和更多的Lgr5阳性细胞（图5.f）。

本发明利用各成体组织器官本身内源干细胞的自我更新和多功能分化能力，通过可溶性分子在体内刺激活化组织器官内成体干细胞，从而促进各种原因引起的组织器官功能损伤的自我修复，相比于利用胚胎干细胞或诱导多功能干细胞体外生成组织器官然后移植体内，从技术操作的难易度、应用的简便性和成本的节约性及安全性考虑在临床应用上更具有可行性。发明人之前将Rspo1/Slit2蛋白联用通过保护肠干细胞可以与放化疗联用治疗肿瘤（nature 2013，已申请PCT专利）。通过诱导肝脏内源干细胞治疗肝纤维化尚未见报道，发明人发现肝纤维化过程中，Lgr5表达阳性的肝脏干细胞被诱导出现，并且该Lgr5阳性的肝脏干细胞有抑制肝纤维化的功能，本发明进一步筛选到了新的蛋白分子HGF与Rspo1联合注射可以诱导内源Lgr5阳性的肝脏干细胞增多，减缓肝纤维化进程。

更重要的是，本发明在临床病人肝纤维化样本中也发现了Lgr5表达阳性的肝脏干细胞。本发明将加深学术界对组织内源成体干细胞自我更新、促进组织损伤修复/再生等特性的理解，拓展成体干细胞的应用范围和应用方法，为进一步治疗各种原因引起的组织损伤修复、组织器官再生障碍等疾病所借鉴。此外，人Lgr5⁺肝脏干细胞的体外培养和分化将直接为肝脏干细胞提供新的来源，可进一步用于体外肝脏疾病模型构建和体内移植，为肝脏疾病的诊断、研究和治疗带来了新的技术手段。

以上所述，仅是本发明的几个实施例，并非对本发明做任何形式的限制，虽然本发明以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限制本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于本发明技术方案保护范围内。

Claims (1)

1.试剂在制备治疗肝纤维化药物中的应用，其特征在于：所述试剂可以诱导内源Lgr5⁺肝脏干细胞增多，所述试剂由HGF和Rspo1组成。

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