JP2023159401A - 筋肉量の低下抑制に用いる細胞調製物 - Google Patents

Abstract

【課題】 筋肉量の低下を抑制しうる細胞調製物を提供する。【解決手段】 本発明は、筋肉量の低下抑制に用いる細胞調製物であって、前記細胞調製物は、臍帯由来細胞を含む。【選択図】 図３

Description

本発明は、筋肉量の低下抑制に用いる細胞調製物に関する。

日本国では、急速に高齢化が進んでおり、２０２５年における高齢者数は、総人口の３０％以上と予測されている。高齢者では、加齢に伴い、様々な生活機能の障害が生じる。前記生活機能の障害の原因の１つとして、加齢に伴う筋肉量の減少に伴う疾患（加齢性筋肉減少症）が知られている。また、加齢性筋肉減少症の１つとして、サルコペニアが知られている。サルコペニアの存在は、高齢者では「ふらつき」、「転倒」、さらには「フレイル」に密接に関連し、その先には要介護状態が待ち受けていることが知られており問題となっている（非特許文献１）。これまでのところ、栄養状態を改善し、日常の身体活動量を増やし、軽い運動をすることが推奨されているが、それらの実践は多くの高齢者にとって容易ではなく、新たな治療介入が求められている。

葛谷雅文、「３．サルコペニアの診断・病態・治療」、２０１５年、日本老年医学会雑誌、Vol. 52、No. 4、３４３－３４９頁

加齢性筋肉減少症の治療方法としては、運動または栄養に関する介入療法が実施されている。しかしながら、いずれの方法も、十分な効果があるかは現状不明である。

そこで、本発明は、筋肉量の低下を抑制しうる細胞調製物の提供を目的とする。

前記目的を達成するため、本発明は、筋肉量の低下抑制に用いる細胞調製物であって、
前記細胞調製物は、臍帯由来細胞を含む。

本発明は、加齢性筋肉減少症の治療に用いる細胞調製物であって、
前記本発明の筋肉量の低下抑制に用いる細胞調製物を含む。

本発明によれば、筋肉量の低下を抑制しうる。

図１は、実施例１における体重変化を示すグラフである。 図２は、実施例１における体重あたりの握力の変化を示すグラフである。 図３は、実施例１における持久力を示すグラフである。 図４は、実施例１における筋肉の重量の測定結果を示すグラフである。 図５は、実施例２における筋組織の染色結果を示す写真である。 図６は、実施例３における各マウスの腓腹筋およびヒラメ筋における、ＰＧＣ１－α、ＣＯＸ４、ＧＬＵＴ４の発現量を示すグラフである。 図７は、実施例３におけるウェスタンブロットの結果を示す写真である。 図８は、実施例３におけるミトコンドリアの測定結果を示す写真および図である。 図９は、実施例４におけるアポトーシス解析の結果を示す写真およびグラフである。 図１０は、実施例５における炎症性サイトカインの発現量を示すグラフおよび筋組織の写真である。 図１１は、実施例６におけるＴＧＦ－β１の発現量を示すグラフおよび筋組織の写真である。 図１２は、実施例７におけるＣａｔＫ、Ｓｉｒｔ１およびＭＨＣの発現量を示すグラフまたは写真である。 図１３は、実施例８における電子顕微鏡によるエクソソームの写真である。 図１４は、実施例８におけるウエスタンブロッティングによるエクソソームマーカーの写真である。 図１５は、実施例８におけるエクソソームマーカーの粒子径の分布を示したグラフである。 図１６は、実施例８におけるエクソソームを取り込んだＣ２Ｃ１２細胞を示した写真である。 図１７は、実施例８におけるエクソソームを取り込ませたＣ２Ｃ１２細胞のアポトーシスを示した写真およびグラフである。

＜筋肉量の低下抑制用調製物＞
本発明は、前述のように、筋肉量の低下抑制に用いる細胞調製物（以下、「筋肉量の低下抑制用調製物」ともいう）であって、前記細胞調製物は、臍帯由来細胞を含む。本発明の筋肉量の低下抑制用調製物は、臍帯由来細胞を含むことが特徴であり、その他の構成および条件は、特に制限されない。前記臍帯由来細胞は、後述するように、筋肉、筋組織、または筋細胞（「筋繊維（筋線維）」または「筋肉細胞」ともいう、以下同様。）におけるミトコンドリアの機能性向上、炎症の抑制、アポトーシス抑制、筋細胞の増殖促進、筋肉障害の抑制、筋組織の間質の線維化の抑制および／または筋肉修復の促進機能を有すると推定される。このため、本発明の筋肉量の低下抑制用調製物は、前記臍帯由来細胞を含むことにより、筋肉量の低下を抑制できる。

本発明において、「筋肉量」は、例えば、対象における四肢の筋肉の量を意味し、具体例として、腓腹筋の量があげられる。本発明において、前記「筋肉量」は、例えば、測定対象の筋肉の重量を測定することにより評価してもよいし、二重エネルギーＸ線吸収測定法（ＤＥＸＡ法）、生体電気インピーダンス法、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）または核磁気共鳴画像診断法（ＭＲＩ）を用いて得られた画像等を用いて間接的に体積を算出することにより評価してもよい。前記測定対象がヒト以外の哺乳動物の場合、前記筋肉量は、測定対象の筋肉の重量を測定することにより評価することが好ましい。他方、前記測定対象がヒトの場合、前記筋肉量は、二重エネルギーＸ線吸収測定法（ＤＥＸＡ法）、生体電気インピーダンス法等を用いて間接的に体積を算出することにより評価することが好ましい。

本発明において、前記「筋肉量の低下抑制」は、筋肉量の低下（「減少」、「退縮」、または「低減」ともいう、以下、同様。）が有意に抑制（「阻害」、「阻止」、または「防止」ともいう、以下、同様。）されていることを意味する。具体的には、前記「筋肉量の低下抑制」は、例えば、前記細胞調製物を投与した対象が、前記細胞調製物を投与しない対象と比較として、有意に筋肉量の低下の程度が抑制されていることを意味する。このため、本発明では、前記細胞調製物を投与した対象において、前記細胞調製物の投与開始時と比較して、筋肉量が減少していても、前記細胞調製物を投与しない対象と比較として、有意に筋肉量の低下の程度が抑制されていれば、「筋肉量の低下抑制」が生じているといえる。

本発明の細胞調製物は、後述の実施例で示すように、筋肉量を増加させることにより、筋肉量の低下抑制効果を示すと推定される。このため、本発明の筋肉量の低下抑制に用いる細胞調製物は、例えば、筋肉量の増加（「増大」、「増強」、または「増量」ともいう、以下、同様。）に用いる細胞調製物ということもできる。

本発明の細胞調製物は、後述の実施例で示すように、持続的筋力等の筋力の低下を抑制または前記筋力の増加を促進する。これは、本発明の細胞調製物が、筋肉量の低下抑制機能等を示すことによると推定される。このため、本発明の筋肉量の低下抑制に用いる細胞調製物は、例えば、筋力の抑制または増加（「増大」または「増強」ともいう、以下、同様。）に用いる細胞調製物ということもできる。

本発明において、「臍帯」は、胎児と胎盤を繋ぐ白色の管状組織であり、胎盤および臍帯血を含まない組織を意味する。本発明において、「臍帯」の由来は、特に制限されず、例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、サル、イルカ、アシカ等の哺乳類の臍帯があげられ、好ましくは、霊長類哺乳動物の臍帯であり、より好ましくは、ヒトの臍帯である。

本発明において、前記「臍帯」は、投与、治療、または処置対象（以下、あわせて「投与対象」という）から採取された臍帯であってもよいし、投与対象以外の対象から採取された臍帯であってもよい。調製時に制限を受けないとの観点から、投与対象以外から採取された臍帯を用いることが望ましい。なお、本発明の臍帯由来細胞は、後述する実施例において示されているとおり、投与対象以外から採取された臍帯由来の細胞であってもよい。前記臍帯由来細胞は、例えば、免疫拒絶等により排除されることなく治療効果を奏することが確認されている。

本発明において、前記臍帯は、例えば、経膣分娩または帝王切開にて娩出された胎盤および／または臍帯を含む産褥組織から適宜胎盤を取り除き回収することができる。本発明において、前記臍帯は、回収された臍帯から臍帯血を除去したものでもよく、さらに、無菌または制菌処理を行なったものでもよい。前記臍帯血の除去は、例えば、ヘパリン等の抗凝固剤を含む溶液ですすぐ、または灌流することによって実施できる。前記無菌または制菌処理は、特に制限されず、例えば、ポピドンヨード等の消毒剤の塗布；ペニシリン、ストレプトマイシン、アムホテリシンＢ、ゲンタマイシン、および／またはナイスタチン等の抗生剤、および／または抗真菌剤を添加した培地またはバッファー中に浸漬；等により実施できる。また、前記臍帯は、例えば、必要に応じて、赤血球を選択的に溶解してもよい。前記赤血球を選択的に溶解する方法としては、例えば、塩化アンモニウムによる溶解による高張培地または低張培地中でのインキュベーション等の当技術分野で周知の方法を使用することができる。

本発明において、前記「臍帯由来細胞」とは、臍帯を原材料として、調製された細胞集団を意味する。

本発明の臍帯由来細胞は、例えば、下記（ａ）～（ｃ）のいずれか１つまたは複数の特性を有する細胞集団であってもよく、好ましくは全ての特性を有する細胞集団である。
（ａ）培地存在下の培養において、プラスチックに接着性を示す；
（ｂ）ＣＤ１０５、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ４４、ＨＬＡ－ｃｌａｓｓＩ、ＨＬＡ－Ｇ５およびＰＤ－Ｌ（Programmed cell death 1 ligand）２が陽性であり、ＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１９およびＨＬＡ－ＣｌａｓｓＩＩが陰性である；
（ｃ）炎症の条件下でＩＤＯ（indoleamine 2,3-dioxygenase）、ＰＧＥ_２（Prostaglandin E2）、ＰＤ－Ｌ１の遺伝子および／またはタンパクの発現が誘導される。

本発明において、「陽性」は、抗原抗体反応を利用して検出されるフローサイトメトリー等の解析方法により、前記抗原を発現しない陰性対照細胞または前記抗原と反応しない抗体を用いる陰性対照反応と比較して、高いシグナル等が検出されることを意味する。また、本発明において、「陰性」は、前記抗原を発現しない陰性対照細胞または前記抗原と反応しない抗体を用いる陰性対照反応と比較して、同等またはそれ以下のシグナル等が検出されることを意味する。

本発明において、前記「HLA-class I」とは、ＨＬＡ－Ａ、Ｂ、またはＣを意味する。本発明において、「HLA-Class II」は、ＨＬＡ－ＤＲ、ＤＱ、またはＤＰを意味する。

本発明において、前記「炎症の条件下」は、インターフェロンγ等の炎症性サイトカインと接触させる条件、または添加された条件をいう。

本発明において、前記臍帯由来細胞は、前記臍帯由来細胞の抽出物および／または分泌物であってもよい。前記臍帯由来細胞の抽出物は、例えば、前記臍帯由来細胞に対して、濃縮処理、遠心分離処理、乾燥処理、凍結乾燥処理、溶媒処理、界面活性剤処理、プロテアーゼ、糖鎖分解酵素等を用いた酵素処理、タンパク質抽出処理、超音波処理、および／または磨砕処理により得られる処理物、またはこれらの処理の組合せにより得られる処理物等があげられる。前記臍帯由来細胞の分泌物は、例えば、エクソソーム（細胞外小胞）、臍帯由来細胞の細胞培養上清等があげられる。

本発明において、「細胞外小胞」は、細胞から分泌される膜を有する小胞を意味する。前記細胞外小胞は、一般的に、由来する細胞のエンドソーム内で形成された後、前記細胞の外に放出されると考えられている。このため、前記細胞外小胞は、通常、脂質二重膜と、内腔とを含み、前記内腔は、前記脂質二重膜に囲われた構造を有する。また、前記脂質二重膜は、由来する細胞の細胞膜由来の脂質を含む。そして、前記内腔は、由来する細胞由来の細胞質を含む。前記細胞外小胞は、その大きさおよび／または表面マーカーにより、例えば、エクソソーム（exosome）、マイクロベシクル（micro vesicle：MV）、アポトーシス小体等に分類される。

前記細胞外小胞の平均径（加重平均）は、例えば、１～５００ｎｍ、好ましくは、１０～４００ｎｍ、より好ましくは、３０～４００ｎｍである。前記平均径は、後述の実施例８に準じて測定できる。また、前記細胞外小胞の平均径は、例えば、前記細胞外小胞を含む液体を、所望の孔径を有するフィルタ等を用いてろ過することにより、調整できる。

本発明において、前記細胞調製物は、筋組織における間質線維化の抑制作用を示すことが好ましい。前記間質線維化の抑制作用は、例えば、後述の実施例２に準じて、筋組織の間質における線維化面積を指標に評価でき、具体的には、ＳＡＭＰ１０マウスの筋組織（例えば、腓腹筋またはヒラメ筋）における間質の繊維化面積を指標に評価できる（間質線維化アッセイ）。前記評価では、例えば、前記被検物の投与群における間質の線維化面積が、前記被検物非投与下の群における間質の線維化面積と比較して、１０％以下、１５％以下、２０％以下、２５％以下、３０％以下、３５％以下、４０％以下、４５％以下、５０％以下、５５％以下、６０％以下、６５％以下、７０％以下、７５％以下、８０％以下、８５％以下、９０％以下、９５％以下、９６％以下、９７％以下、９８％以下、または９９％以下である場合、前記被検物は、筋組織における間質線維化の抑制作用があると評価できる。前記細胞調製物は、例えば、前記間質線維化アッセイにおいて、前記細胞調製物を被投与の群と比較して、前記間質線維化を、１０％以下、１５％以下、２０％以下、２５％以下、３０％以下、３５％以下、４０％以下、４５％以下、５０％以下、５５％以下、６０％以下、６５％以下、７０％以下、７５％以下、８０％以下、８５％以下、９０％以下、９５％以下、９６％以下、９７％以下、９８％以下、または９９％以下に低減できる。本発明の筋肉量の低下抑制用調製物は、前記筋組織において、間質の線維化を抑制できることから、例えば、筋組織における間質線維化の抑制に用いる細胞調製物ということもできる。

本発明において、「筋組織」は、筋細胞（筋繊維）から構成される組織を意味し、例えば、収縮能を有する興奮性の組織である。

本発明において、「間質」は、筋繊維の間の空間を意味する。

本発明において、前記細胞調製物は、ミトコンドリアの機能向上作用を示すことが好ましい。前記ミトコンドリアの機能向上作用は、例えば、後述の実施例３に準じて、筋組織におけるＰＧＣ１－α（Peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha）、ＣＯＸ４（cytochrome c oxidase subunit 4）、ＧＬＵＴ４（glucose transporter type 4）等のミトコンドリアの機能向上遺伝子の発現量、または筋組織におけるミトコンドリア数を指標に評価でき、具体的には、ＳＡＭＰ１０マウスの筋組織（例えば、腓腹筋またはヒラメ筋）におけるミトコンドリアにおけるミトコンドリアの機能向上遺伝子の発現量、または筋組織（例えば、腓腹筋またはヒラメ筋）におけるミトコンドリア数を指標に評価できる（ミトコンドリア機能アッセイ）。前記評価では、例えば、前記被検物の投与群におけるミトコンドリアの機能向上遺伝子の発現量が、前記被検物非投与下の群におけるミトコンドリアの機能向上遺伝子の発現量と比較して、１．５倍以上、２倍以上、２．５倍以上、５倍以上、１０倍以上、２５倍以上、５０倍以上、１００倍以上、１２５倍以上、２５０倍以上である場合、前記被検物は、ミトコンドリアの機能向上作用があると評価できる。また、前記評価では、例えば、前記被検物の投与群におけるミトコンドリア数が、前記被検物非投与下の群におけるミトコンドリア数と比較して、１０％以上、１５％以上、２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、または１００％以上である場合、前記被検物は、ミトコンドリアの機能向上作用があると評価できる。前記細胞調製物は、例えば、前記ミトコンドリア機能アッセイにおいて、前記細胞調製物を被投与の群と比較して、前記ミトコンドリアの機能向上遺伝子の発現量を、１．５倍以上、２倍以上、２．５倍以上、５倍以上、１０倍以上、２５倍以上、５０倍以上、１００倍以上、１２５倍以上、２５０倍以上に増加でき、その上限は、例えば、１０００倍以下または５００倍以下である。前記細胞調製物は、例えば、前記ミトコンドリア機能アッセイにおいて、前記細胞調製物を被投与の群と比較して、前記ミトコンドリア数を、１０％以上、１５％以上、２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、または１００％以上に増加でき、その上限は、例えば、１５０％以下または１２５％以下である。本発明の筋肉量の低下抑制用調製物は、前記筋組織において、ミトコンドリアの機能を向上させることから、例えば、筋組織におけるミトコンドリアの機能向上に用いる細胞調製物ということもできる。また、本発明の筋肉量の低下抑制用調製物は、筋組織において、ミトコンドリアの機能性に関連する遺伝子の発現を誘導できることから、例えば、筋組織におけるミトコンドリアの機能向上遺伝子の誘導（発現誘導）に用いる細胞調製物ということもできる。また、本発明の筋肉量の低下抑制用調製物は、筋組織において、ミトコンドリア数を増加できることから、例えば、筋組織におけるミトコンドリア数の増加に用いる細胞調製物ということもできる。

ヒトＰＧＣ１－α、ヒトＣＯＸ４、およびヒトＧＬＵＴ４のｍＲＮＡの塩基配列およびタンパク質のアミノ酸配列は、例えば、以下のGenbankのアクセッション番号で登録されている配列を参照できる。
・ヒトＰＧＣ１－α
ｍＲＮＡのアクセッション番号：NM_001330751
タンパク質のアクセッション番号：NP_001317680
・ヒトＣＯＸ４
ｍＲＮＡのアクセッション番号：NM_001861
タンパク質のアクセッション番号：NP_001852
・ヒトＧＬＵＴ４
ｍＲＮＡのアクセッション番号：NM_001042
タンパク質のアクセッション番号：NP_001033

本発明において、前記細胞調製物は、筋細胞のアポトーシス抑制作用を示すことが好ましい。前記筋細胞のアポトーシスの抑制作用は、例えば、後述の実施例４に準じて、Cleaved-caspase-3および／またはCleaved-caspase-8の発現量、またはＤＮＡの断片化（ゲノムＤＮＡの断片化）を指標に評価でき、具体的には、ＳＡＭＰ１０マウスの筋組織（例えば、腓腹筋またはヒラメ筋）におけるアポトーシス細胞数を指標に評価できる（アポトーシスアッセイ）。前記評価では、例えば、前記被検物の投与群におけるアポトーシス細胞数が、前記被検物非投与下の群におけるアポトーシス細胞数と比較して、１０％以下、１５％以下、２０％以下、２５％以下、３０％以下、３５％以下、４０％以下、４５％以下、５０％以下、５５％以下、６０％以下、６５％以下、７０％以下、７５％以下、８０％以下、８５％以下、９０％以下、９５％以下、９６％以下、９７％以下、９８％以下、または９９％以下である場合、前記被検物は、筋細胞のアポトーシス抑制作用があると評価できる。前記細胞調製物は、例えば、前記アポトーシスアッセイにおいて、前記細胞調製物を被投与の群と比較して、前記アポトーシス細胞数を、１０％以下、１５％以下、２０％以下、２５％以下、３０％以下、３５％以下、４０％以下、４５％以下、５０％以下、５５％以下、６０％以下、６５％以下、７０％以下、７５％以下、８０％以下、８５％以下、９０％以下、９５％以下、９６％以下、９７％以下、９８％以下、または９９％以下に低減できる。本発明の筋肉量の低下抑制用調製物は、筋細胞のアポトーシスの抑制を示すことから、例えば、筋細胞におけるアポトーシス抑制に用いる細胞調製物ということもできる。前記筋細胞は、例えば、骨格筋細胞である。

本発明において、前記細胞調製物は、抗炎症作用を示すことが好ましい。前記抗炎症作用は、例えば、後述の実施例５に準じて、炎症性サイトカイン遺伝子またはケモカイン遺伝子の誘導能を指標に評価でき、具体的には、ＳＡＭＰ１０マウスの筋組織（例えば、腓腹筋またはヒラメ筋）における炎症性サイトカイン遺伝子またはケモカイン遺伝子の発現量を指標に評価できる（炎症アッセイ）。前記評価では、例えば、前記被検物の投与群における炎症性サイトカイン遺伝子またはケモカイン遺伝子の発現量が、前記被検物非投与下の群における炎症性サイトカイン遺伝子またはケモカイン遺伝子の発現量と比較して、１０％以下、１５％以下、２０％以下、２５％以下、３０％以下、３５％以下、４０％以下、４５％以下、５０％以下、５５％以下、６０％以下、６５％以下、７０％以下、７５％以下、８０％以下、８５％以下、９０％以下、９５％以下、９６％以下、９７％以下、９８％以下、または９９％以下である場合、前記被検物は、抗炎症作用があると評価できる。前記細胞調製物は、例えば、前記炎症アッセイにおいて、前記細胞調製物を被投与の群と比較して、前記炎症性サイトカイン遺伝子および／またはケモカイン遺伝子の発現量を、１０％以下、１５％以下、２０％以下、２５％以下、３０％以下、３５％以下、４０％以下、４５％以下、５０％以下、５５％以下、６０％以下、６５％以下、７０％以下、７５％以下、８０％以下、８５％以下、９０％以下、９５％以下、９６％以下、９７％以下、９８％以下、または９９％以下に低減できる。本発明の筋肉量の低下抑制用調製物は、筋組織において、抗炎症性作用を示すことから、例えば、筋組織における炎症抑制に用いる細胞調製物ということもできる。また、本発明の筋肉量の低下抑制用調製物は、筋組織において、ＴＮＦ（Tumor Necrosis Factor）－α等の炎症性サイトカイン遺伝子、および／またはＭＣＰ－１（CCL2、monocyte chemotactic and activating factor）等のケモカイン遺伝子の発現誘導を抑制できることから、例えば、筋組織における炎症性サイトカイン遺伝子および／またはケモカイン遺伝子の発現抑制または発現誘導の抑制に用いる細胞調製物ということもできる。

ヒトＴＮＦ－αおよびヒトＭＣＰ－１のｍＲＮＡの塩基配列およびタンパク質のアミノ酸配列は、例えば、以下のGenbankのアクセッション番号で登録されている配列を参照できる。
・ヒトＴＮＦ－α：
ｍＲＮＡのアクセッション番号：NM_000594
タンパク質のアクセッション番号：NP_000585
・ヒトＭＣＰ－１
ｍＲＮＡのアクセッション番号：NM_002982
タンパク質のアクセッション番号：NP_002973

本発明において、前記細胞調製物は、筋細胞の増殖促進作用を示すことが好ましい。前記増殖促進作用は、例えば、後述の実施例６に準じて、筋細胞の増殖、またはＴＧＦ（Transforming growth factor）－β１等の筋細胞の増殖誘導遺伝子の発現を指標に評価でき、具体的には、ＳＡＭＰ１０マウスの筋組織（例えば、腓腹筋またはヒラメ筋）における筋細胞の増殖または筋細胞の増殖誘導遺伝子の発現量を指標に評価できる（筋増殖アッセイ）。前記評価では、例えば、前記被検物の投与群における筋細胞の数が、前記被検物非投与下の群における筋細胞の数と比較して、１０％以上、１５％以上、２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上である場合、前記被検物は、筋細胞の増殖促進作用があると評価できる。また、前記評価では、例えば、前記被検物の投与群における筋細胞の増殖誘導遺伝子の発現量が、前記被検物非投与下の群における筋細胞の増殖誘導遺伝子の発現量と比較して、１．５倍以上、２倍以上、２．５倍以上、５倍以上、１０倍以上、２５倍以上、５０倍以上、１００倍以上、１２５倍以上、２５０倍以上、または５００倍以上である場合、前記被検物は、筋細胞の増殖促進作用があると評価できる。前記細胞調製物は、例えば、前記筋増殖アッセイにおいて、前記細胞調製物を被投与の群と比較して、前記筋細胞の数を、１０％以上、１５％以上、２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上増加でき、その上限は、例えば、１５０％以下または１００％以下である。前記細胞調製物は、例えば、前記筋増殖アッセイにおいて、前記細胞調製物を被投与の群と比較して、前記筋細胞の増殖誘導遺伝子の発現量を、１．５倍以上、２倍以上、２．５倍以上、５倍以上、１０倍以上、２５倍以上、５０倍以上、１００倍以上、１２５倍以上、２５０倍以上、または５００倍以上に増加でき、その上限は、例えば、１０００倍以下または７５０倍以下である。本発明の筋肉量の低下抑制用調製物は、前記筋細胞の増殖を促進（「加速」、「増加」、または「増強」ともいう、以下同様。）できることから、例えば、筋細胞または筋組織の骨格筋の増殖促進に用いる細胞調製物ということもできる。また、本発明の筋肉量の低下抑制用調製物は、前記筋細胞の増殖誘導遺伝子の発現を誘導できることから、例えば、筋組織の増殖促進遺伝子の誘導（発現誘導）に用いる細胞調製物ということもできる。前記筋細胞は、例えば、骨格筋細胞である。

ヒトＴＧＦ－β１のｍＲＮＡの塩基配列およびタンパク質のアミノ酸配列は、例えば、以下のGenbankのアクセッション番号で登録されている配列を参照できる。
・ヒトＴＧＦ－β１：
ｍＲＮＡのアクセッション番号：NM_000660
タンパク質のアクセッション番号：NP_000651

本発明において、前記細胞調製物は、筋組織、好ましくは、骨格筋の筋線維の修復を促進することが好ましい。前記筋組織の修復能は、例えば、後述の実施例７に準じて、Ｓｉｒｔ１（Sirtuin 1）遺伝子、ミオシン重鎖（Myosin heavy chain：ＭＨＣ）遺伝子等の筋組織の修復促進遺伝子の発現量、または、Ｓｉｒｔ１および／またはミオシン重鎖等の修復促進遺伝子のタンパク質の発現量を指標に評価でき、具体的には、ＳＡＭＰ１０マウスの筋組織（例えば、腓腹筋またはヒラメ筋）における筋組織の修復促進遺伝子の発現量を指標に評価できる（筋修復アッセイ）。前記評価では、例えば、前記被検物の投与群における筋組織の修復促進遺伝子の発現量が、前記被検物非投与下の群における筋組織の修復促進遺伝子の発現量と比較して、１０％以上、１５％以上、２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上である場合、前記被検物は、筋組織の修復作用があると評価できる。前記細胞調製物は、例えば、前記筋修復アッセイにおいて、前記細胞調製物を被投与の群と比較して、前記筋組織の修復促進遺伝子の発現量を、１０％以上、１５％以上、２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上増加でき、その上限は、例えば、１５０％以下または１００％以下である。本発明の筋肉量の低下抑制用調製物は、筋組織または骨格筋の修復能を示すことから、例えば、筋組織または骨格筋の修復に用いる細胞調製物ということもできる。また、本発明の筋肉量の低下抑制用調製物は、筋組織または骨格筋において、修復促進遺伝子の発現、または、修復促進遺伝子のタンパク質の発現を誘導できることから、筋組織の修復促進に用いる細胞調製物または筋組織の修復促進遺伝子の発現誘導に用いる細胞調製物ということもできる。前記筋組織は、例えば、骨格筋の筋組織である。

ヒトＳＩＲＴ１およびＭＨＣのｍＲＮＡの塩基配列およびタンパク質のアミノ酸配列は、例えば、以下のGenbankのアクセッション番号で登録されている配列を参照できる。
・ヒトＳＩＲＴ１：
ｍＲＮＡのアクセッション番号：NM_012238
タンパク質のアクセッション番号：NP_036370
・ヒトＭＨＣ：
ｍＲＮＡのアクセッション番号：NM_005963
タンパク質のアクセッション番号：NP_005954

本発明において、前記細胞調製物は、筋組織、好ましくは、骨格筋の筋組織の障害を抑制することが好ましい。前記筋組織の傷害抑制能は、例えば、後述の実施例７に準じてカテプシンＫ（ＣａｔＫ、Cathepsin K、CTSK）遺伝子等の筋障害の誘導遺伝子の発現量を指標に評価できる。前記ＣａｔＫは、例えば、筋細胞の分解を誘導することにより、筋障害を引き起こす。本発明の筋肉量の低下抑制用調製物は、筋組織または骨格筋の筋組織の傷害抑制能を示すことから、例えば、筋組織または骨格筋の筋組織の障害抑制に用いる細胞調製物ということもできる。また、本発明の筋肉量の低下抑制用調製物は、筋組織または骨格筋において、筋障害の誘導遺伝子の発現を抑制できることから、筋障害の誘導遺伝子の発現抑制に用いる細胞調製物ということもできる。前記筋組織は、例えば、骨格筋の筋組織である。

ヒトＣａｔＫのｍＲＮＡの塩基配列およびタンパク質のアミノ酸配列は、例えば、以下のGenbankのアクセッション番号で登録されている配列を参照できる。
・ヒトＣａｔＫ：
ｍＲＮＡのアクセッション番号：NM_000396
タンパク質のアクセッション番号：NP_000387

本発明において、前記臍帯由来細胞の生産（調製）方法は、例えば、前記臍帯から細胞を単離する工程を含み、任意に、単離された細胞を継代する工程を含んでもよい。具体例として、前記調製方法は、例えば、（１）臍帯を切断する工程、（２）臍帯切片を培養する工程、および（３）継代する工程を含む。また、他の例として、前記調製方法は、例えば、（Ａ）臍帯を切断する工程もしくは酵素処理する工程、またはその双方により組織を解離させる工程、（Ｂ）臍帯組織を培養する工程、および（Ｃ）継代する工程を含む。なお、前記臍帯由来細胞は、一様の細胞による集団であってもよいし、不均一な細胞集団であってよい。

前記（１）～（３）工程を含む方法、または前記（Ａ）～（Ｃ）工程を含む方法により、前記臍帯由来細胞を調製する場合、一例として以下のように実施できる。なお、前記臍帯由来細胞の調製方法は、以下の例に限定されない。

まず、前記（１）～（３）工程を含む方法について説明する。前記（１）臍帯を切断する工程では、例えば、前述の方法で入手した臍帯を、羊膜、血管、血管周囲組織および／またはワルトンジェリーを含む状態にて機械力（細断力または剪断力）によって切断することにより実施できる。切断により得られる臍帯切片の大きさは、特に制限されず、例えば、１～１０ｍｍ^３、１～５ｍｍ^３、１～４ｍｍ^３、１～３ｍｍ^３または１～２ｍｍ^３等があげられる。

つぎに、前記（２）臍帯切片を培養する工程では、例えば、切断された臍帯切片を、シャーレ、ディッシュ、フラスコ等の培養器に播種し、臍帯由来細胞に適した培養液中にて培養する。前記（２）工程では、前記臍帯切片に対して消化酵素処理を行わないことが好ましい。

本発明において、前記「培養器」は、例えば、固体表面を有する培養器であればよい。前記培養器としては、例えば、細胞、組織、および／または臓器の培養に用いられる培養器を使用できる。前記「固体表面」は、例えば、前記臍帯由来細胞との結合を可能とする任意の材料を意味する。具体的には、前記材料は、例えば、その表面への哺乳類細胞の結合を促すように処理（例えば、親水性増加処理）されたプラスチック材料等があげられる。前記固体表面を有する培養容器の種類は、特に制限されず、例えば、シャーレ、ディッシュ、フラスコ等があげられる。

本発明において、前記「臍帯由来細胞に適した培養液」は、例えば、基礎培地に、血清等の添加剤を添加することにより調製できる。前記添加剤は、例えば、血清、および／または、アルブミン、トランスフェリン、脂肪酸、インスリン、亜セレン酸ナトリウム、コレステロール、コラーゲン前駆体、微量元素、２－メルカプトエタノール、３’－チオールグリセロール等の１つ以上の血清代替物があげられる。前記培養液は、例えば、必要に応じて、さらに、脂質、アミノ酸、タンパク質、多糖、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生剤、抗真菌剤、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類などの物質を添加してもよい。前記基礎培地は、特に制限されず、例えば、Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium（DMEM）（高グルコースまたは低グルコース）、改良DMEM、DMEM/MCDB 201、Eagle’s 基本培地、Ham’s F10培地（F10）、Ham’s F-12培地（F12）、イスコーブの改変ダルベッコ（IMDM）培地、Fischer’s培地、間葉幹細胞増殖培地（MSCGM）、DMEM/F12、RPMI 1640、CELL-GRO-FREE、およびこれらの混合培地等があげられる。前記血清は、例えば、ヒト血清、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ウシ血清、仔ウシ血清、ヤギ血清、ウマ血清、ブタ血清、ヒツジ血清、ウサギ血清、ラット血清等の動物由来の血清があげられる。前記基礎培地に対する血清の添加量は、例えば、５ v/v％～１５ v/v％であり、好ましくは、約１０v/v％である。前記脂肪酸は、特に制限されず、例えば、リノール酸、オレイン酸、リノレイン酸、アラキドン酸、ミリスチン酸、パルミトイル酸、パルミチン酸、およびステアリン酸等があげられる。前記脂質は、特に制限されず、例えば、フォスファチジルセリン、フォスファチジルエタノールアミン、フォスファチジルコリン等があげられる。前記アミノ酸は、特に制限されず、例えば、Ｌ－アラニン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－システイン、Ｌ－シスチン、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－グルタミン、Ｌ－グリシン等のアミノ酸のＬ体、これらのＤ体、またはこれらの混合物（ＤＬ体）等があげられる。前記タンパク質は、特に制限されず、例えば、エコチン、還元型グルタチオン、フィブロネクチン、β２－ミクログロブリン等があげられる。前記多糖は、特に制限されず、例えば、ヒアルロン酸、ヘパラン硫酸等のグリコサミノグリカン等があげられる。前記増殖因子は、特に制限されず、例えば、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、インスリン様増殖因子－１（ＩＧＦ－１）、白血球阻害因子（ＬＩＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ－β）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）等があげられる。前記抗生剤および／または抗真菌剤は、特に制限されず、例えば、ペニシリンＧ、ストレプトマイシン硫酸塩、アムホテリシンＢ、ゲンタマイシン、ナイスタチン、およびこれらの混合等があげられる。

前記（２）工程において、播種した臍帯切片が培養液中に浮遊することを防ぐため、培養期間中プレート等を用いて前記臍帯切片を押さえることが好ましい。前記プレートは、例えば、特開２０１５－７０８２４に記載のプレートが例示できる。

前記（２）工程において、培養条件は、特に制限されず、例えば、細胞、組織、臓器等の一般的な培養条件を参照できる。具体例として、前記（２）工程におけるＣＯ_２濃度は、例えば、０～５％である。前記（２）工程におけるＯ_２濃度は、例えば、２～２５％であり、好ましくは、５～２０％である。前記（２）工程における培養温度は、例えば、２５～４０℃であり、好ましくは、約３７℃（３５～３９℃）である。

前記（２）工程において、前記培養期間は、特に制限されず、例えば、前記臍帯切片から細胞が遊走し、細胞が、培養器に対して５０％、６０％、７０％、８０％またはそれ以上のコンフルエントになるまで培養することが好ましい。

そして、前記（２）工程では、例えば、前記培養後、非結合状態の細胞および細胞の破片を除去するために、細胞を洗浄し、ＥＤＴＡ等のキレート剤を含む溶液、トリプシン、コラゲナーゼ、ディスパーゼ等のプロテアーゼ、ヒアルロニダーゼ等の糖鎖分解酵素、またはこれらの混合物を含む剥離剤によって剥離する。そして、前記（２）工程では、例えば、前記細胞および前記臍帯切片を含む剥離溶液を、セルストレーナー等を用いてろ過することで、臍帯由来細胞として細胞のみを入手することができる。得られた臍帯由来細胞は、例えば、前述の培養器へ播種し、前述の培養液を用いて培養できる。

前記（３）工程では、継代培養することで、適宜、必要数まで臍帯由来細胞を増殖することができる。前記（３）工程では、前記継代培養において、前記剥離剤によって剥離し、別途用意した培養器に適切な細胞密度で播種して培養を継続してもよい。前記細胞を播種する際の、細胞密度（播種密度）は、例えば、１×１０^２～１×１０^５細胞／ｃｍ^２、５×１０^２～５×１０^４細胞／ｃｍ^２、１×１０^３～１×１０^４細胞／ｃｍ^２、２×１０^３～１×１０^４細胞／ｃｍ^２等があげられ、好ましくは、２×１０^３～１×１０^４細胞／ｃｍ^２である。前記播種密度は、例えば、適切なコンフルエンシーに達するまでの期間が、３～７日間となるように調整することが好ましい。前記（３）工程の継代培養では、必要に応じて、適宜、培地を交換してもよい。

前記（３）工程の継代回数は、特に制限されず、例えば、細胞分裂の停止する老化まで行われてもよい。前記（３）工程の継代回数は、例えば、治療に用いるとの観点から、好ましくは、３～２５回継代培養され、より好ましくは、４～１２回継代培養される。

つぎに、前記（Ａ）～（Ｃ）工程を含む方法について説明する。前記（Ａ）酵素処理する工程では、前述の方法で入手した臍帯を、羊膜、血管、血管周囲組織および／またはワルトンジェリーを含む状態にて酵素処理にて、組織を解離させる工程により実施できる。前記酵素処理に用いる酵素は、特に制限されず、例えば、コラゲナーゼ、ディスパーゼ等のプロテアーゼ；ヒアルロニダーゼ等の糖鎖分解酵素；等があげられる。

つぎに、前記（Ｂ）臍帯組織を培養する工程、および（Ｃ）継代する工程は、例えば、それぞれ、前記（２）臍帯組織を培養する工程、および前記（３）継代する工程と同様にして実施できる。

これにより、前記（３）または（Ｃ）工程後、前記臍帯由来細胞を取得できる。

前記臍帯由来細胞の調製方法で得られた細胞は、前記臍帯由来細胞であることを確認するために、表面抗原等についてフローサイトメトリー等を用いて従来の方法で解析してもよい。また、前記臍帯由来細胞の調製方法で得られた細胞は、前記細胞より産生される各種タンパク質量を測定することで、前記臍帯由来細胞であるかを評価してもよい。

前記臍帯由来細胞の調製方法で得られた細胞は、そのまま、治療用に調製されてもよいし、凍結保存してもよい。前記凍結保存は、例えば、臍帯由来細胞を保存可能な凍結保存用溶液中に細胞を懸濁させ、－８０℃～－１８０℃で保存することによって行われる。前記凍結保存用溶液は、特に制限されず、例えば、凍害防御剤およびグルコースを含む水溶液があげられる。前記凍害防御剤は、例えば、ジメチルスルホキシド（以下、「ＤＭＳＯ」ともいう）、デキストラン、グリセロール、プロピレングリコール、および１－メチル－２－ピロリドン等があげられ、好ましくは、ＤＭＳＯおよび／またはプロピレングリコールであり、より好ましくは、ＤＭＳＯである。前記凍害防御剤は、例えば、前記凍結保存用溶液中に、１～１５ｗ／ｖ％含まれ、好ましくは、５～１５ｗ／ｖ％含まれ、より好ましくは、５～１２ｗ／ｖ％含まれ、さらに好ましくは、８～１１ｗ／ｖ％含まれる。前記凍害防御剤は、例えば、前記凍結保存用溶液中に、１～１５ｖ／ｖ％含まれ、好ましくは、５～１５ｖ／ｖ％含まれ、より好ましくは、５～１２ｖ／ｖ％含まれ、さらに好ましくは、８～１１ｖ／ｖ％含まれる。

前記凍結保存用溶液に含まれるグルコースは、例えば、前記凍結保存用溶液中に、０．５～１０ｗ／ｖ％含まれ、好ましくは、１～１０ｗ／ｖ％含まれ、より好ましくは、２～８ｗ／ｖ％含まれ、さらに好ましくは、２～５ｗ／ｖ％含まれる。

前記凍結保存用溶液は、さらに、他の成分を含んでいてもよい。他の成分としては、例えば、ｐＨ調整剤、増粘剤等が挙げられる。前記ｐＨ調整剤は、例えば、炭酸水素ナトリウム、ＨＥＰＥＳ、リン酸緩衝液等があげられる。また、basic Stock Solution（ＢＳＳ）にリン酸緩衝液を添加しない場合、前記ｐＨ調整剤としては、例えば、前記臍帯由来細胞に適したｐＨ付近で緩衝能を持たせる働きを有する塩化ナトリウムを添加したものも用いることもできる。前記ｐＨ調整剤としては、リン酸緩衝液を用いることが好ましい。前記ｐＨ調整剤は、前記凍結保存用溶液中のｐＨを、例えば、約６．５～９、好ましくは、７～８．５に調整するように用いられることが好ましい。なお、本発明において、前記「リン酸緩衝液」は、例えば、塩化ナトリウム、リン酸一ナトリウム（無水）、リン酸一カリウム（無水）、リン酸二ナトリウム（無水）、リン酸三ナトリウム（無水）、塩化カリウム、およびリン酸二水素カリウム（無水）等を含む緩衝液のことをいい、特に塩化ナトリウム、リン酸一ナトリウム（無水）、塩化カリウム、またはリン酸二水素カリウム（無水）を含む緩衝液が好ましい。前記ｐＨ調整剤は、例えば、前記凍結保存用溶液中に、０．０１～１ｗ／ｖ％含まれ、好ましくは、０．０５～０．５ｗ／ｖ％含まれる。

前記凍結保存用溶液は、天然の動物由来成分を含んでいてもよいし、含んでいなくてもよい。前記天然の動物由来成分としては、例えば、前述の血清および基礎培地等があげられる。前記凍結保存用溶液は、天然の動物由来成分を含まないことが好ましい。前記天然の動物由来成分を含まない凍結保存用溶液では、天然の動物由来成分のロット間での品質の違いの問題を生じることがなく、血清に含まれる各種サイトカイン、増殖因子およびホルモン等の成分による臍帯組織中の細胞の性質の変化の可能性を抑制でき、さらに、基礎培地に含まれる由来が不明な成分による影響も抑制できる。このため、前記天然の動物由来成分を含まない凍結保存用溶液は、特に臨床使用において非常に有用である。

前記凍結保存用溶液は、さらに、増粘剤を含んでいてもよい。前記増粘剤は、特に制限されず、例えば、前記臍帯組織を十分に保存できる凍結保存用溶液を構成し得るものがあげられる。前記増粘剤は、例えば、カルボキシメチルセルロース（以下、「ＣＭＣ」ともいう）、カルボキシメチルセルロースナトリウム（以下、「ＣＭＣ－Ｎａ」ともいう）、有機酸ポリマー、アルギン酸プロピレングリコール、アルギン酸ナトリウム等があげられる。増粘剤としては、ＣＭＣおよびＣＭＣ－Ｎａが好ましく、ＣＭＣ－Ｎａが特に好ましい。前記有機酸ポリマーは、ポリアクリル酸ナトリウムが好ましい。前記増粘剤は、例えば、前記凍結保存用溶液中に、０．１～１ｗ／ｖ％含まれ、好ましくは、０．１～０．５ｗ／ｖ％含まれ、より好ましくは、０．２～０．４ｗ／ｖ％含まれる。

前記凍結保存用溶液は、水溶液であることが好ましい。前記凍結保存用溶液の浸透圧は、例えば、保存液としての性能を保持するために、好ましくは、１０００ｍＯｓｍ以上であり、より好ましくは、１０００～２７００ｍＯｓｍである。

前記凍結保存用溶液は、好ましくは、増粘剤、凍害防御剤、およびグルコースを含み、かつ天然の動物由来成分を含まない水溶液である。前記凍結保存用溶液は、より好ましくは、ＣＭＣ－Ｎａ、ＤＭＳＯ、およびグルコースを含み、かつ天然の動物由来成分を含まない水溶液である。前記凍結保存用溶液は、さらに好ましいくは、ＣＭＣ－Ｎａを０．１～１ｗ／ｖ％含み、ＤＭＳＯを１．０～１５ｗ／ｖ％含み、グルコースを０．５～１０ｗ／ｖ％含み、かつ天然の動物由来成分を含まない水溶液である。

前記臍帯由来細胞の調製方法で得られた細胞は、例えば、輸液製剤と混合することで、各種用途の細胞調製物として使用してもよい。また、前記臍帯由来細胞を凍結保存する場合、凍結保存された臍帯由来細胞は、前記凍結保存用溶液に懸濁され、解凍後にそのまま各種用途の細胞調製物として使用してもよいし、解凍後に輸液製剤と混合し、得られた混合物を各種用途の細胞調製物として使用してもよい。前記輸液製剤と混合する場合、前記臍帯由来細胞が懸濁された培養液または凍結保存用溶液を輸液製剤等と混合してもよいし、前記培養液または凍結保存用溶液について、遠心分離等により細胞を溶媒と分離した後、細胞のみを輸液製剤と混合してもよい。前記調製方法では、例えば、手技の煩雑さを回避するため、前記凍結した細胞を解凍後、培養する工程を含まないこと、または融解後の細胞が懸濁された凍結保存液を直接輸液製剤と混合することが好ましい。

本発明において、前記「輸液製剤」は、例えば、ヒトの治療の際に用いられる輸液等の溶液があげられ、具体例として、生理食塩水、５％ブドウ糖液、リンゲル液、乳酸リンゲル液、酢酸リンゲル液、１号液、２号液、３号液、４号液等があげられる。

本発明の筋肉量の低下抑制用調製物は、前記臍帯由来細胞に加えて、前記輸液製剤を含むキットであってもよい。

本発明の筋肉量の低下抑制用調製物は、前記輸液製剤に加えて、または代えて、薬学的に許容される担体を含んでもよい。前記担体は、前記細胞調製物を投与するための懸濁剤、溶解補助剤、安定化剤、等張化剤、保存剤、吸着防止剤、界面活性剤、希釈剤、媒体、ｐＨ調整剤、無痛化剤、緩衝剤、含硫還元剤、酸化防止剤等があげられ、本発明の効果を妨げない範囲で適切に添加することができる。

前記懸濁剤は、特に制限されず、例えば、メチルセルロース、ポリソルベート８０、ヒドロキシエチルセルロース、アラビアゴム、トラガント末、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート等があげられる。

前記溶液補助剤は、特に制限されず、例えば、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリソルベート８０、ニコチン酸アミド、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、マクロゴール、ヒマシ油脂肪酸エチルエステル等があげられる。

前記安定化剤は、特に制限されず、例えば、デキストラン４０、メチルセルロース、ゼラチン、亜硫酸ナトリウム、メタ硫酸ナトリウム等があげられる。

前記等張化剤は、特に制限されず、例えば、Ｄ－マンニトール、ソルビトール等があげられる。

前記保存剤は、特に制限されず、例えば、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、ソルビン酸、フェノール、クレゾール、クロロクレゾール等があげられる。

前記吸着防止剤は、特に制限されず、例えば、ヒト血清アルブミン、レシチン、デキストラン、エチレンオキシドプロピレンオキシド共重合体、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、硬化ヒマシ油、ポリエチレングリコール等があげられる。

前記含硫還元剤は、特に制限されず、例えば、Ｎ－アセチルシステイン、Ｎ－アセチルホモシステイン、チオキト酸、チオジグリコール、チオエタノールアミン、チオグリセロール、チオソルビトール、チオグリコール酸およびその塩、チオ硫酸ナトリウム、グルタチオン、炭素原子数１～７のチオアルカン酸等のスルホヒドリル基を有するもの等があげられる。

前記酸化防止剤は、特に制限されず、例えば、エリソルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール、α－トコフェロール、酢酸トコフェロール、Ｌ－アスコルビン酸およびその塩、Ｌ－アスコルビン酸パルミテート、Ｌ－アスコルビン酸ステアレート、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、没食子酸トリアミル、没食子酸プロピルまたはエチレンジアミン４酢酸ナトリウム（ＥＤＴＡ）、ピロリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウム等のキレート剤等があげられる。

本発明の筋肉量の低下抑制用調製物は、さらに、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、炭酸水素ナトリウム等の無機塩；クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、酢酸ナトリウム等の有機塩；グルコース等の糖類；等の一般的に添加される成分を適宜添加していてもよい。また、抗凝固剤および／または前記ｐＨ調整剤として、例えば、ＡＣＤ－Ａ液（クエン酸Ｎａ水和物クエン酸水和物、ブドウ糖等からなる組成）を添加してもよい。

本発明の筋肉量の低下抑制用調製物は、例えば、局所投与のために、バイオポリマー等の有機物；ハイドロキシアパタイト等の無機物；等と混合してもよく、具体例として、コラーゲンマトリックス、ポリ乳酸ポリマーまたはコポリマー、ポリエチレングリコールポリマーまたはコポリマーおよびその化学的誘導体と混合してもよい。

本発明の筋肉量の低下抑制用調製物は、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏで用いてもよいし、ｉｎ ｖｉｖｏで用いてもよい。本発明の筋肉量の低下抑制用調製物は、例えば、研究用試薬として使用することもでき、医薬品として使用することもできる。後者の場合、本発明の筋肉量の低下抑制用調製物は、加齢性筋肉減少症の治療に用いる細胞調製物または医薬用細胞調製物ということもできる。

本発明の筋肉量の低下抑制用調製物の投与対象は、特に制限されない。本発明の筋肉量の低下抑制用調製物をｉｎ ｖｉｖｏで使用する場合、前記投与対象は、例えば、ヒト、またはヒトを除く非ヒト動物があげられる。前記非ヒト動物としては、例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、サル、イルカ、アシカ等の哺乳類；鳥類；魚類；等があげられる。前記本発明の筋肉量の低下抑制用調製物をｉｎ ｖｉｔｒｏで使用する場合、前記投与対象は、例えば、細胞、組織、器官等があげられ、前記細胞は、例えば、生体から採取した細胞、培養細胞等があげられ、前記組織または器官は、例えば、生体から採取した組織（生体組織）または器官等があげられる。前記細胞は、例えば、筋細胞、iPS細胞（induced pluripotent stem cells）、幹細胞等があげられる。

本発明の筋肉量の低下抑制用調製物をｉｎ ｖｉｖｏで使用する場合、前記投与対象は、筋組織において炎症が生じている対象、筋組織において炎症性サイトカイン遺伝子の発現誘導（「増強」、「増加」、「向上」、または「亢進」ともいう、以下同様）および／またはケモカイン遺伝子の発現誘導が生じている対象、筋組織における間質線維化が誘導または生じている対象、筋組織の修復促進遺伝子の発現抑制が生じている対象、筋細胞におけるミトコンドリアの機能低下が生じている対象、筋細胞におけるミトコンドリア数が低下している対象、筋組織において障害が生じている対象、筋組織の障害誘導遺伝子の発現誘導が生じている対象、および／または筋細胞のアポトーシスが向上（亢進）している対象であってもよい。

本発明の筋肉量の低下抑制用調製物をｉｎ ｖｉｖｏで使用する場合、前記投与対象は、筋肉量の低下が生じている対象が好ましい。また、本発明の筋肉量の低下抑制用調製物において、前記投与対象は、後述するように、加齢性筋肉減少症における筋肉量の低下を抑制できることから、加齢に起因する筋肉量の低下が生じている対象が好ましい。また、前記加齢性筋肉減少症は、例えば、中高年に生じる。このため、前記投与対象は、中高年が好ましい。前記中高年は、例えば、４０歳以上、５０歳以上、６０歳以上、７０歳以上、または８０歳以上のヒトがあげられる。

本発明の筋肉量の低下抑制用調製物の使用条件（投与条件）は、特に制限されず、例えば、投与対象の種類等に応じて、投与形態、投与時期、投与量等を適宜設定できる。

本発明の筋肉量の低下抑制用調製物の投与方法は、例えば、脳内投与、髄腔内投与、筋肉内投与、皮下投与、静脈内投与等が例示されるが、例えば、投与者の技術によらず、安全におよび安定的に投与できることから、静脈内投与が好ましい。

本発明の筋肉量の低下抑制用調製物の投与量は、対象に投与した場合に、投与していない対象と比較して疾患に対して筋肉量の低下抑制効果（治療効果）を得ることができる細胞量である。具体的には、前記投与量は、例えば、被験者の年齢、体重、症状等によって適宜決定することができる。具体例として、前記投与量は、例えば、臍帯由来細胞数として、１回の投与当たり１０^４～１０^９個／ｋｇ体重、１０^４～１０^８個／ｋｇ体重、１０^４～１０^７個／ｋｇ体重があげられ、好ましくは、１０^４～１０^８個／ｋｇ体重、１０^４～１０^７個／ｋｇ体重である。前記投与量は、例えば、臍帯由来細胞数として、１回の投与当たり１０^４～１０^９個、１０^６～１０^９個、１０^４～１０^８個、１０^４～１０^７個があげられ、好ましくは、１０^４～１０^８個、１０^４～１０^７個である。前記投与量は、例えば、前記細胞調製物における臍帯由来細胞の数ということもできる。

本発明の筋肉量の低下抑制用調製物の投与回数は、１または複数回である。前記複数回は、例えば、２回、３回、４回、５回またはそれ以上である。前記投与回数は、対象の治療効果を確認しながら、適宜決定されてもよい。前記複数回投与する場合、投与間隔は、対象の治療効果を確認しながら、適宜決定でき、例えば、１日１回、１週１回、２週１回、１ヶ月１回、３ヶ月１回、６か月１回等があげられる。

本発明の筋肉量の低下抑制用調製物は、例えば、他の筋肉量の低下抑制に用いられる薬剤および／または方法と併用してもよい。前記筋肉量の低下抑制に用いられる方法としては、例えば、レジスタンス運動等の運動療法があげられ、具体例として、下記参考文献１～３が参照できる。
参考文献１：若林秀隆、「サルコペニアに対する運動療法の実際」、2013年、日本医事新報、No. 4677、32-36頁
参考文献２：Hidenori Arai et.al., “Special Issue: Clinical Guidelines for Sarcopenia. Guest Editor: Hidenori Arai. This publication has been supported by The Japanese Association on Sarcopenia and Frailty, The Japan Geriatrics Society and National Center for Geriatrics and Gerontology (NCGG) (Japan) Chapter 4 Treatment of sarcopenia”, 2018, Geriatrics & Gerontology International, pages 28-44
参考文献３：Masafumi Kuzuya et.al., “ Special Issue: Clinical Guide for Frailty. Guest Editors: Shosuke Satake and Hidenori Arai. This publication has been supported by The Japanese Association on Sarcopenia and Frailty, The Japan Geriatrics Society and National Center for Geriatrics and Gerontology (NCGG) (Japan) Chapter 3 Frailty prevention”, 2020, Geriatrics & Gerontology International, pages 20-24

本発明の筋肉量の低下抑制用調製物は、筋肉量の低下が生じている対象に好適に使用でき、具体例として、加齢性筋肉減少症の対象に使用できる。前記加齢性筋肉減少症は、例えば、加齢に伴い、骨格筋等の筋肉量が低下する症状または疾患を意味する。前記加齢性筋肉減少症は、例えば、サルコペニア、フレイル等があげられる。

本発明の筋肉量の低下抑制用調製物は、前述のように、対象における筋肉量の低下を抑制できる。このため、本発明は、対象における筋肉量低下の抑制方法を含んでもよい。この場合、本発明は、対象における筋肉量低下の抑制方法であって、対象に、前記本発明の筋肉量の低下抑制に用いる細胞調製物を用いる。本発明の筋肉量低下の抑制方法は、例えば、前記対象に、前記本発明の筋肉量の低下抑制に用いる細胞調製物を投与する工程を含む。前記投与工程における投与条件は、前述の説明を援用できる。

本発明の筋肉量の低下抑制用調製物は、前述のように、対象における筋肉量の低下を抑制できる。このため、本発明は、筋肉量の低下が生じている対象の処置方法であって、対象に、前記本発明の筋肉量の低下抑制に用いる細胞調製物を用いる。本発明の対象の処置方法は、例えば、前記対象に、前記本発明の筋肉量の低下抑制に用いる細胞調製物を投与する工程を含む。前記投与工程における投与条件は、前述の説明を援用できる。

本発明の筋肉量の低下抑制用調製物は、前述のように、対象における筋肉量の低下を抑制できるため、例えば、加齢性筋肉減少症を治療できる。このため、本発明は、加齢性筋肉減少症患者の処置方法であって、前記加齢性筋肉減少症患者に、前記本発明の筋肉量の低下抑制に用いる細胞調製物を投与する。前記投与工程における投与条件は、前述の説明を援用できる。

本発明において、「治療」は、対象疾患の発症の抑制、防止、抑止、予防、または遅延、発症した対象疾患もしくはその症状の進行の停止、抑制、抑止、または遅延、および対象疾患の改善または寛解のいずれの意味で用いてもよい。

＜細胞調製物の用途＞
別の実施形態において、本発明は、筋組織におけるミトコンドリアの機能向上に用いる細胞調製物または筋組織におけるミトコンドリアの機能向上方法を提供する。この場合、本発明は、筋組織におけるミトコンドリアの機能向上に用いる細胞調製物であって、前記細胞調製物は、臍帯由来細胞を含む。また。本発明は、対象の筋組織におけるミトコンドリアの機能向上方法であって、対象に、前記本発明の筋組織におけるミトコンドリアの機能向上に用いる細胞調製物を用いる。本発明は、前記本発明の筋肉量の低下抑制に用いる細胞調製物の説明を援用できる。

また、別の実施形態において、本発明は、筋組織におけるミトコンドリア数の増加に用いる細胞調製物または筋組織におけるミトコンドリア数の増加方法を提供する。この場合、本発明は、筋組織におけるミトコンドリア数の増加に用いる細胞調製物であって、前記細胞調製物は、臍帯由来細胞を含む。また、本発明は、対象の筋組織におけるミトコンドリア数の増加方法であって、対象に、筋組織におけるミトコンドリア数の増加に用いる細胞調製物を用いる。本発明は、前記本発明の筋肉量の低下抑制に用いる細胞調製物の説明を援用できる。

また、別の実施形態において、本発明は、筋組織におけるミトコンドリアの機能向上遺伝子の発現誘導に用いる細胞調製物または筋組織におけるミトコンドリアの機能向上遺伝子の発現誘導方法を提供する。この場合、本発明は、筋組織におけるミトコンドリアの機能向上遺伝子の発現誘導に用いる細胞調製物であって、前記細胞調製物は、臍帯由来細胞を含む。また、本発明は、対象の筋組織におけるミトコンドリアの機能向上遺伝子の発現誘導方法であって、対象に、筋組織におけるミトコンドリアの機能向上遺伝子の発現誘導に用いる細胞調製物を用いる。本発明は、前記本発明の筋肉量の低下抑制に用いる細胞調製物の説明を援用できる。

また、別の実施形態において、本発明は、筋細胞のアポトーシス抑制に用いる細胞調製物または筋細胞のアポトーシスの抑制方法を提供する。この場合、本発明は、筋細胞のアポトーシス抑制に用いる細胞調製物であって、前記細胞調製物は、臍帯由来細胞を含む。また、本発明は、対象の筋細胞におけるアポトーシスの抑制方法であって、対象に、筋細胞のアポトーシス抑制に用いる細胞調製物を用いる。本発明は、前記本発明の筋肉量の低下抑制に用いる細胞調製物の説明を援用できる。

また、別の実施形態において、本発明は、筋組織における炎症抑制に用いる細胞調製物または筋組織における炎症の抑制方法を提供する。この場合、本発明は、筋組織における抗炎症（炎症抑制）に用いる細胞調製物であって、前記細胞調製物は、臍帯由来細胞を含む。本発明は、対象の筋組織における炎症の抑制方法であって、対象に、筋組織における炎症抑制に用いる細胞調製物を用いる。本発明は、前記本発明の筋肉量の低下抑制に用いる細胞調製物の説明を援用できる。

また、別の実施形態において、本発明は、筋組織における炎症性サイトカイン遺伝子および／またはケモカイン遺伝子の発現抑制に用いる細胞調製物、または筋組織における炎症性サイトカイン遺伝子および／またはケモカイン遺伝子の発現抑制方法を提供する。この場合、本発明は、筋組織における炎症性サイトカイン遺伝子および／またはケモカイン遺伝子の発現抑制に用いる細胞調製物であって、前記細胞調製物は、臍帯由来細胞を含む。また、本発明は、対象の筋組織における炎症性サイトカイン遺伝子および／またはケモカイン遺伝子の発現抑制方法であって、対象に、筋組織における炎症性サイトカイン遺伝子および／またはケモカイン遺伝子の発現抑制に用いる細胞調製物を用いる。本発明は、前記本発明の筋肉量の低下抑制に用いる細胞調製物の説明を援用できる。

また、別の実施形態において、本発明は、筋細胞の増殖促進に用いる細胞調製物または筋細胞の増殖促進方法を提供する。この場合、本発明は、筋細胞の増殖促進に用いる細胞調製物であって、前記細胞調製物は、臍帯由来細胞を含む。また、本発明は、対象の筋細胞の増殖促進方法であって、対象に、筋細胞の増殖促進に用いる細胞調製物を用いる。本発明は、前記本発明の筋肉量の低下抑制に用いる細胞調製物の説明を援用できる。

また、別の実施形態において、本発明は、筋細胞の増殖促進遺伝子の発現誘導に用いる細胞調製物または筋細胞の増殖促進遺伝子の発現誘導方法を提供する。この場合、本発明は、筋細胞の増殖促進遺伝子の発現誘導に用いる細胞調製物であって、前記細胞調製物は、臍帯由来細胞を含む。また、本発明は、対象の筋細胞の増殖促進遺伝子の発現誘導方法であって、
対象に、筋細胞の増殖促進遺伝子の発現誘導に用いる細胞調製物を用いる。本発明は、前記本発明の筋肉量の低下抑制に用いる細胞調製物の説明を援用できる。

また、別の実施形態において、本発明は、筋組織の修復に用いる細胞調製物または筋組織の修復方法を提供する。この場合、本発明は、筋組織の修復に用いる細胞調製物であって、前記細胞調製物は、臍帯由来細胞を含む。本発明は、対象の筋組織の修復方法であって、対象に、筋組織の修復に用いる細胞調製物を用いる。本発明は、前記本発明の筋肉量の低下抑制に用いる細胞調製物の説明を援用できる。

また、別の実施形態において、本発明は、筋組織の修復遺伝子の発現誘導に用いる細胞調製物または筋組織の修復遺伝子の発現誘導方法を提供する。この場合、本発明は、筋組織の修復遺伝子の発現誘導に用いる細胞調製物であって、前記細胞調製物は、臍帯由来細胞を含む。また、本発明は、対象の筋組織の修復遺伝子の発現誘導方法であって、対象に、筋組織の修復遺伝子の発現誘導に用いる細胞調製物を用いる。本発明は、前記本発明の筋肉量の低下抑制に用いる細胞調製物の説明を援用できる。

また、別の実施形態において、本発明は、筋組織の障害抑制に用いる細胞調製物または筋組織の障害抑制方法を提供する。この場合、本発明は、筋組織の障害抑制に用いる細胞調製物であって、前記細胞調製物は、臍帯由来細胞を含む。また、本発明は、対象の筋組織の障害抑制方法であって、対象に、筋組織の障害抑制に用いる細胞調製物を用いる。本発明は、前記本発明の筋肉量の低下抑制に用いる細胞調製物の説明を援用できる。

また、別の実施形態において、本発明は、筋組織の障害誘導遺伝子の発現抑制に用いる細胞調製物または筋組織の障害誘導遺伝子の発現抑制方法を提供する。この場合、本発明は、筋組織の障害誘導遺伝子の発現抑制に用いる細胞調製物であって、前記細胞調製物は、臍帯由来細胞を含む。また、本発明は、対象の筋組織の障害誘導遺伝子の発現抑制方法であって、対象に、筋組織の障害誘導遺伝子の発現抑制に用いる細胞調製物を用いる。本発明は、前記本発明の筋肉量の低下抑制に用いる細胞調製物の説明を援用できる。

また、別の実施形態において、本発明は、対象の筋組織の間質の線維化の抑制に用いる細胞調製物または筋組織の間質の線維化の抑制方法を提供する。この場合、本発明は、対象の筋組織の間質の線維化の抑制に用いる細胞調製物であって、前記細胞調製物は、臍帯由来細胞を含む。また、本発明は、対象の筋組織の間質の線維化の抑制方法であって、対象に、対象の筋組織の間質の線維化の抑制に用いる細胞調製物を用いる。本発明は、前記本発明の筋肉量の低下抑制に用いる細胞調製物の説明を援用できる。

＜細胞調製物の使用＞
本発明は、筋肉量の低下抑制、加齢性筋肉減少症の治療、筋組織におけるミトコンドリアの機能向上、筋組織におけるミトコンドリア数の増加、筋組織におけるミトコンドリアの機能向上遺伝子の発現誘導、筋細胞におけるアポトーシスの抑制、筋組織における炎症の抑制、筋組織における炎症性サイトカイン遺伝子および／またはケモカイン遺伝子の発現抑制、筋細胞の増殖促進、筋細胞の増殖促進遺伝子の発現誘導、筋組織の修復、筋組織の修復遺伝子の発現誘導、筋組織の障害抑制、および／または筋組織の障害誘導遺伝子の発現抑制に用いるための、細胞組成物であり、前記細胞調製物は、臍帯由来細胞を含む。本発明は、筋肉量の低下抑制、加齢性筋肉減少症の治療、筋組織におけるミトコンドリアの機能向上、筋組織におけるミトコンドリア数の増加、筋組織におけるミトコンドリアの機能向上遺伝子の発現誘導、筋細胞におけるアポトーシスの抑制、筋組織における炎症の抑制、筋組織における炎症性サイトカイン遺伝子および／またはケモカイン遺伝子の発現抑制、筋細胞の増殖促進、筋細胞の増殖促進遺伝子の発現誘導、筋組織の修復、筋組織の修復遺伝子の発現誘導、筋組織の障害抑制、および／または筋組織の障害誘導遺伝子の発現抑制に用いるための、細胞組成物の製造するための、臍帯由来細胞の使用である。本発明は、前記本発明の筋肉量の低下抑制用調製物の説明を援用できる。

以下、実施例を用いて本発明を詳細に説明するが、本発明は実施例に記載された態様に限定されるものではない。なお、特に示さない限り、市販の試薬およびキット等は、そのプロトコルに従い使用した。

［実施例１］
本発明の細胞調製物により、サルコペニアが治療できることを確認した。

（１）臍帯由来細胞の調製
臍帯由来細胞は、Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ，１８，２２９－２４１，２０１６に記載の方法で採取した。具体的には、東京大学医科学研究所の倫理委員会の承認を得た上で、提供者の同意を得て採取された臍帯の組織要素すべて（羊膜、血管、血管周囲組織およびワルトンジェリーを含む）を１～２ｍｍ^３の断片に細断し、培養皿上へ播種した。そして、セルアミーゴ（株式会社椿本チエイン製）を被せ、１０％ ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ （ＦＢＳ）と抗生物質とを添加したα－ｍｉｎｉｍａｌ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ （αＭＥＭ）中で培養する改良エクスプラント法により、臍帯由来細胞を得た。当該細胞の性状はプラスチック付着性である。

（２）表面抗原の確認
つぎに、得られた臍帯由来細胞について、表面抗原の発現の有無を確認した、前記表面抗原の発現の有無は、それぞれの抗原に対する特異抗体を用いたＦＡＣＳ解析により確認した。臍帯由来細胞の表面抗原としては、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ９０、ＣＤ４４およびＨＬＡ－ｃｌａｓｓＩが陽性、ＨＬＡ－ＣｌａｓｓＩＩ、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１９、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０およびＣＤ１１ｂが陰性を呈した。さらに、ＨＬＡ－Ｇ５およびＰＤ－Ｌ２が陽性を呈した。また、ＨＬＡ－Ｇは弱陽性、ＣＤ４９ｄ（ＩＴＧＡ４）およびＣＤ１８４（ＣＸＣＲ４）は陰性～弱陽性、ＣＤ２９（ＩＴＧＢ１）は陽性を呈した。

なお、前記臍帯由来細胞は、平常状態においてＨＧＦ（Ｈｅｐａｔｉｃ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ）の遺伝子を高発現していること、炎症の条件下（ＩＦＮ－γ １００ｎｇ／ｍｌ）においてＩＤＯ（Ｉｎｄｏｌｅａｍｉｎｅ ２，３－ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ）の遺伝子発現が誘導されることを、Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲによって確認した。特にＨＧＦの発現は、骨髄由来間葉系幹細胞に比べて、臍帯由来細胞でより高いことがわかった。また、臍帯由来細胞を、ＭＬＲ（同種リンパ球混合反応）と共培養することにより、ＰＧＥ２の分泌が誘導されることを、ＥＬＩＳＡにより確認した。

（３）細胞調製物の調製
得られた臍帯由来細胞を、Corning（登録商標） CellBIND（登録商標） 表面１００ｍｍ ディッシュ（コーニング社製、Product Number:#3292）に播種し、Passage 1からPassage 4まで継代し、増殖させた。なお、前記継代培養中の培養液は、ヒト間葉系幹細胞用基礎培養液である、ＣｉＭＳ（商標）－ＢＭ（ニプロ株式会社、製品コード：87-070）に、ヒト間葉系幹細胞用基礎培養液アニマルフリー添加剤であるCiMS（商標）-sAF（ニプロ株式会社、製品コード：87-072）を、添付文書に従った割合で添加したものを用いた。その後、TrypLE（商標） Select Enzyme(1X)， no phenol red（ThermoFisher社、製品番号：12563011）を用いて前記細胞を剥離し、１×１０^６ｃｅｌｌ／１５０μｌとなるように調製し、本発明の細胞調製物とした。

（４）モデル動物
試験に供する動物として、促進老化・短寿命を示すＳＡＭＰ（Senescence-Accelerated Mouse Prone）系統マウスである、ＳＡＭＰ１０（中部科学資材株式会社から購入）を使用した。ＳＡＭＰ１０は、脳萎縮を伴う、学習・記憶障害・情動障害・老化アミロイドーシス等の加齢に伴う障害が早期に発現する形質を示す系統である。ＳＡＭＰ１０は、寿命が１年程度と短く、２４週齢程度から老化現象が確認できるため、サルコペニアのモデル動物として使用した。

（５）マウスの調製
２４週齢のＳＡＭＰ１０マウスをランダムにピックアップし、ＢＤロードーズ（商標）３０Ｇ インスリン皮下投与用針付注射筒（Becton Dickinson社、カタログ番号：326638）を使用して、前記細胞が１×１０^６ｃｅｌｌ／マウスとなるように、マウス尾静脈に投与し、実施例のマウスとした。コントロールは、同容量の生理食塩水、または培養液を投与した２４週齢のＳＡＭＰ１０マウスとした。

また、前記実施例のマウスと、コントロールのマウスとを、それぞれ、トレーニングをさせるグループ（Ex）と、そうでないグループとに分けた。すなわち、細胞を投与し、且つ、トレーニングを行わないグループ（Cell）を、実施例Ａ（ｎ＝８）とし、細胞を投与し、且つ、トレーニングを行うグループ（Cell+Ex）を、実施例Ｂ（ｎ＝８）とした。そして、細胞を投与せず、トレーニングを行わないグループを、コントロール（ｎ＝７）とし、細胞を投与せず、トレーニングを行うグループ（Ex）を、参考例（ｎ＝７）とした。前記トレーニングは、週に３回のトレッドミルトレーニングを行った。前記トレッドミルトレーニングは、ベルトコンベアと、電気刺激を発生させる装置とを備えるトレーニング装置（マウス用ドレッドミル、有限会社メルクエスト社製）を用いて、マウスを強制的に走行させるトレーニングである。また、マウスの週齢によってトレーニング内容を変更した。具体的には、２４週齢～２６週齢のマウスには、装置の傾斜を０°に設定し、まず、７ｍ／ｍｉｎの速度で５分間のウォーミングアップを行った後、１７ｍ／ｍｉｎの速度で３５分間のエクササイズを行い、７ｍ／ｍｉｎの速度で５分間のクールダウンを行った。２７週齢～３６週齢のマウスには、装置の傾斜を５°に設定し、まず、１０ｍ／ｍｉｎの速度で５分間のウォーミングアップを行った後、１８ｍ／ｍｉｎの速度で３５分間のエクササイズを行い、１０ｍ／ｍｉｎの速度で５分間のクールダウンを行った。

（６）結果
各群のマウスについて、２４週齢、２８週齢、３２週齢、および３６週齢時点での体重を測定した。これらの結果を図１に示す。図１は、体重変化を示すグラフである。図１の各グラフにおいて、縦軸は、各群のマウスの平均体重（ｇ）を示し、横軸は、マウスの週齢を示す。図１（Ａ）は、各群のマウスの体重の推移を比較したグラフであり、円（●）のプロットは、コントロール（Control）を示し、四角（□）のプロットは、実施例Ａ（Cell）を示し、三角（▲）のプロットは、参考例（Ex）を示し、三角（▽）のプロットは、実施例Ｂ（Ex+Cell）を示す。また、図１（Ｂ）は、コントロール（Control）のマウスの体重を示すグラフであり、図１（Ｃ）は、実施例Ａ（Cell）のマウスの体重を示すグラフであり、図１（Ｄ）は、参考例（Ex）のマウスの体重を示すグラフであり、図１（Ｅ）は、実施例Ｂ（Ex+Cell）のマウスの体重を示すグラフである。図１に示すように、各群のマウスにおいて、体重に有意差は見られなかった。

また、各群のマウスについて、２４週齢、２８週齢、３２週齢、および２６週齢時点での握力を測定した。握力の測定は、市販の小動物用握力測定装置（マウス用握力メーター、AMETEK Chatillon社製）を用いて、以下のようにして行った。まず、マウスを、前記装置の網部に乗せ、前記網部に四肢でつかまらせた。その状態から、マウスの尾部を持って地面と水平に引っ張り、マウスが網を離すまでに必要な力（加重）を計測し、網を離す直前の力を握力とした。これらの結果を図２に示す。

図２は、体重あたりの握力の変化を示すグラフである。図２の各グラフにおいて、縦軸は、各群のマウスにおける体重当たりの握力（握力（ｇ）／体重（ｇ））の平均値を示し、横軸は、マウスの週齢を示す。図２（Ａ）は、各群のマウスの体重当たりの握力（握力（ｇ）／体重（ｇ））を比較したグラフであり、円（●）のプロットは、コントロール（Control）を示し、四角（□）のプロットは、実施例Ａ（Cell）を示し、三角（▲）のプロットは、参考例（Ex）を示し、三角（▽）のプロットは、実施例Ｂ（Ex＋Cell）を示す。図２（Ｂ）は、コントロール（Control）のマウスの握力を示すグラフであり、図２（Ｃ）は、実施例Ａ（Cell）のマウスの握力を示すグラフであり、図２（Ｄ）は、参考例（Ex）のマウスの握力を示すグラフであり、図２（Ｅ）は、実施例Ｂ（Ex＋Cell）のマウスの握力を示すグラフである。

図２に示すように、実施例Ａのマウスは、コントロールのマウスと比較して、３２週齢および３６週齢時点において、有意に握力が向上していた。また、実施例Ｂのマウスは、参考例（Ex）のマウスおよびコントロールのマウスと比較して、３２週齢および３６週齢時点において、有意に握力が向上していた。このため、本発明の細胞調製物は、握力の向上作用を奏する、すなわち、加齢性筋肉減少症における筋力の低下に対する治療効果を奏することがわかった。

また、各群のマウスについて、２４週齢、２８週齢、３２週齢、および３６週齢時点での持久力を測定した。持久力の測定は、以下の持久力測定方法により実施した。これらの結果を図３に示す。

（持久力測定方法）
速度 傾斜 時間
開始 6m/分 0° 0～ 5分
6m/分 10° 5～ 7分
8m/分 10° 7～ 9分
10m/分 10° 9～11分
12m/分 10° 11～13分
14m/分 10° 13～15分
16m/分 10° 15～17分
18m/分 10° 17～19分
20m/分 10° 19～21分
21m/分 10° 21分～
まず、各マウスについて、速度6m/分、装置の傾斜0°の条件で、5分間で走行させた。5分経過後、傾斜を10°に変更し、6m/分、装置の傾斜10°の条件で2分走行させ、以後2分毎に速度を2m/分ずつ速くした。また、最高速度は21m/分とし、各マウスが走れなくなるまでの時間を測定した。

図３は、持久力を示すグラフである。図３の各グラフにおいて、縦軸は、各群のマウスにおける持久力（min）の平均値を示し、横軸は、マウスの週齢を示す。図３（Ａ）は、各群のマウスの持久力（min）を比較したグラフであり、円（●）のプロットは、コントロール（Control）を示し、四角（□）のプロットは、実施例Ａ（Cell）を示し、三角（▲）のプロットは、参考例（Ex）を示し、三角（▽）のプロットは、実施例Ｂ（Ex＋Cell）を示す。図３（Ｂ）は、コントロール（Control）のマウスの持久力を示すグラフであり、図３（Ｃ）は、実施例Ａ（Cell）のマウスの持久力を示すグラフであり、図３（Ｄ）は、参考例（Ex）のマウスの持久力を示すグラフであり、図３（Ｅ）は、実施例Ｂ（Ex+Cell）のマウスの持久力を示すグラフである。

図３に示すように、実施例Ａのマウスは、コントロールのマウスと比較して、３２週齢時点において、有意に持久力が向上し、３６週齢時点において、さらに持久力が向上していた。また、実施例Ｂのマウスは、参考例（Ex）のマウスおよびコントロールのマウスと比較して、３２週齢時点において、有意に持久力が向上し、３６週齢時点において、さらに持久力が向上していた。このため、本発明の細胞調製物は、持久力の向上効果を奏する、すなわち、加齢性筋肉減少症における筋力の低下に対する治療効果を奏することがわかった。

［実施例２］
本発明の細胞調製物の投与により、筋繊維サイズが向上していることを確認した。

前記実施例１で使用した各マウスを解剖し、腓腹筋（Gastrocnemius muscle）およびヒラメ筋（Soleus muscle）を採取し、重量の測定および形態観察を行った。これらの結果を図４に示す。

図４は、筋肉の重量の測定結果を示すグラフである。図４（Ａ）は、各マウスの腓腹筋の重量を示すグラフであり、図４（Ｂ）は、各マウスのヒラメ筋の重量を示すグラフである。図４において、縦軸は、マウスの体重当たりの筋肉量（筋肉量（ｍｇ）／体重（ｇ））の相対値を示し、横軸は、マウスの種類を示す。図４に示すように、実施例Ａのマウスは、コントロールのマウスと比較して、細胞投与から１２週経過時点において、有意に腓腹筋およびヒラメ筋の重量が増加していた。実施例Ｂのマウスは、コントロールのマウスと比較して、細胞投与から１２週経過時点において、有意に腓腹筋およびヒラメ筋の重量が増加していた。

つぎに、採取した各筋組織について、Hematoxylin-Eosin(HE)染色を行い、形態学的観察を行った。また、採取した各筋組織について、Masson trichome（MT）染色を行い、各筋組織の間質線維化の程度を確認した。これらの結果を図５に示す。

図５は、筋組織の染色結果を示す写真である。図５において、（Ａ）および（Ｂ）は、腓腹筋の結果を示し、（Ａ）がＨＥ染色の結果であり、（Ｂ）が、ＭＴ染色の結果である。図５において、（Ｃ）および（Ｄ）は、ヒラメ筋の結果を示し、（Ｃ）がＨＥ染色の結果であり、（Ｄ）が、ＭＴ染色の結果である。また、図５（Ｂ）および（Ｄ）において、ＭＴ染色により青く染色された部分、すなわち、間質が線維化した領域を破線で囲って示している。図５に示すように、実施例Ａのマウスは、コントロールのマウスと比較して、細胞投与から１２週経過時点において、腓腹筋およびヒラメ筋の筋繊維サイズの拡大がみられた。実施例Ｂのマウスは、コントロールのマウスと比較して、細胞投与から１２週経過時点において、腓腹筋およびヒラメ筋の筋繊維サイズの拡大がみられた。また、実施例ＡおよびＢのマウスは、コントロールのマウスと比較して、腓腹筋およびヒラメ筋のいずれにおいても、間質線維化の減少がみられた。サルコペニア、フレイル等の加齢性筋肉減少症の患者においては、筋断面積（筋繊維サイズ）の減少、間質線維化等が起こることが知られている。本発明の細胞調製物は、筋断面積を向上でき、また、間質線維化を抑制できることから、加齢性筋肉減少症に対する治療効果を奏すると推定される。

以上のことから、本発明の細胞調製物は、筋断面積の向上および間質線維化の抑制を通じて、筋肉量を増加させ、これにより、加齢性筋肉減少症に対する治療効果を奏することがわかった。

［実施例３］
本発明の細胞調製物の投与により、ミトコンドリアの機能向上作用を示すことを確認した。

前記実施例２で採取した各マウスの腓腹筋（Gastrocnemius muscle）およびヒラメ筋（Soleus muscle）について、ｑＰＣＲキット（PowersSYBRR Green CR Master Mix 、ThermoFisher社製、Cat. No.:＃437659）を用いて、各筋組織中のＰＧＣ１－α、ＣＯＸ４、ＧＬＵＴ４をコードするｍＲＮＡの発現量をＲＴ－ＰＣＲ法を用いて確認した。また、前記腓腹筋において、ＰＧＣ１－αの発現量を、ウエスタンブロッティングにより確認した。また、得られたゲルの染色像から、ＰＧＣ１－αの発現量を算出した。なお、ＲＴ－ＰＣＲおよびウエスタンブロッティングの内在性コントロールとしては、グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）を使用した（以下、同様）。これらの結果を、図６および図７に示す。
・ＰＧＣ１－α用プライマーセット
フォワードプライマー：5'-CCGAGAATTCATGGAGCAAT-3'（配列番号１）
リバースプライマー： 5'-TTTCTGTGGGTTTGGTGTGA-3'（配列番号２）
・ＣＯＸ４用プライマーセット
フォワードプライマー：5'-AGCTGAGCCAAGCAGAGAAG-3'（配列番号３）
リバースプライマー： 5'-AATCACCAGAGCCGTGAATC-3'（配列番号４）
・ＧＬＵＴ４用プライマーセット
フォワードプライマー：5'-GACGGACACTCCATCTGTTG-3'（配列番号５）
リバースプライマー： 5'-GCCACGATGGAGACATAGC-3'（配列番号６）
・ＧＡＰＤＨ用プライマーセット
フォワードプライマー：5'-ATGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3'（配列番号７）
リバースプライマー： 5'-ATGCCTGCTTCACCACCTTCT-3'（配列番号８）

図６は、各マウスの腓腹筋における、ＰＧＣ１－α、ＣＯＸ４、ＧＬＵＴ４の発現量を示すグラフである。図６において、上段の３図が、腓腹筋における結果を示すグラフであり、下の３図が、ヒラメ筋における結果を示すグラフである。また、図６の上段および下段のグラフにおいて、左から、ＰＧＣ１－α、ＣＯＸ４、ＧＬＵＴ４の結果を示す。図６の各図において、縦軸は、内在性コントロール（ＧＡＰＤＨ）に対するＰＧＣ１－α、ＣＯＸ４、またはＧＬＵＴ４ ｍＲＮＡの発現量の相対値を示し、横軸は、マウスの種類を示す。

図７は、ウェスタンブロットの結果を示す写真である。図７において、（Ａ）は、腓腹筋におけるＰＧＣ１－αの結果を示すゲル画像であり、図７（Ｂ）は、腓腹筋におけるＰＧＣ１－αの発現量を示すグラフである。図７（Ａ）のゲル画像において、上段は、ＰＧＣ１－αの発現量を示し、下段は、内在性コントロール（ＧＡＰＤＨ）の発現量を示す。また、図７（Ａ）のゲル画像において、左側から３レーンごとに、それぞれ、コントロール（Control）、実施例Ａ（Cell）、参考例（Ex）、実施例Ｂ（Cell+Ex）の結果を示す。

図６に示すように、実施例Ａのマウスは、コントロールのマウスと比較して、細胞投与から１２週経過時点において、腓腹筋およびヒラメ筋におけるＰＧＣ１－α、ＣＯＸ４、およびＧＬＵＴ４ ｍＲＮＡの発現量の増加がみられた。実施例Ｂのマウスは、コントロールのマウスと比較して、細胞投与から１２週経過時点において、腓腹筋およびヒラメ筋におけるＰＧＣ１－α、ＣＯＸ４、およびＧＬＵＴ４ ｍＲＮＡの発現量の増加がみられた。

図７（Ａ）および（Ｂ）に示すように、実施例Ａのマウスは、コントロールのマウスと比較して、細胞投与から１２週経過時点において、腓腹筋およびヒラメ筋におけるＰＧＣ１－αタンパク質の発現量の増加が見られた。また、実施例Ｂのマウスは、コントロールおよび参考例のマウスと比較して、細胞投与から１２週経過時点において、腓腹筋におけるＰＧＣ１－αタンパク質の発現量の増加が見られた。これらの結果から、本発明の細胞調製物は、ミトコンドリアの機能向上という特有の機能を介して、筋肉量の低下を抑制していると推定された。

つぎに、腓腹筋中のミトコンドリアの形態を、電子顕微鏡（JEM-1400Plus、日本電子株式会社製）を用いて観察した。そして、単位面積当たりのミトコンドリアの数を計数した。これらの結果を図８に示す。

図８は、ミトコンドリアの測定結果を示す写真および図である。図８において、（Ａ）は、腓腹筋の電子顕微鏡画像の結果を示し、（Ｂ）は、単位面積当たりのミトコンドリアの数の結果を示す。図８（Ａ）および（Ｂ）に示すように、実施例ＡおよびＢのマウスは、コントロールおよび参考例のマウスと比較して、細胞投与から１２週経過時点において、腓腹筋中におけるミトコンドリアの数の増加がみられた。

サルコペニア、フレイル等の加齢性筋肉減少症では、ミトコンドリアの機能低下が関係していることが示唆されている。このため、本発明の細胞調製物は、ミトコンドリアの機能向上作用を介して、加齢性筋肉減少症に対する治療効果を奏すると推定される。

［実施例４］
本発明の細胞調製物の投与により、筋細胞のアポトーシスが抑制されていることを確認した。

前記実施例２で採取した各マウスの腓腹筋（Gastrocnemius muscle）およびヒラメ筋（Soleus muscle）について、ＴＵＮＥＬ（T-mediated digoxygenin(biotin)-dUTP nick end labeling）法により、各筋組織において、細胞のアポトーシスを示す断片化ＤＮＡの量を確認した。また、内因性アポトーシスのマーカーであるCleaved-caspase-3およびCleaved-caspase-8の発現量を、ウエスタンブロッティング法により確認した。これらの結果を図９に示す。

図９は、アポトーシス解析の結果を示す写真およびグラフである。図９において、（Ａ）は、ＴＵＮＥＬ染色の結果を示す写真であり、左の４図が、腓腹筋の結果を示し、右の４図が、ヒラメ筋の結果を示す。図９（Ａ）の左右の４図において、それぞれ、左上が、コントロール（Control）の結果を示し、右上が、実施例Ａ（Cell）の結果を示し、左下が、参考例（Ex）の結果を示し、右下が、実施例Ｂ（Cell+Ex）の結果を示す。なお、図９（Ａ）において、ＴＵＮＥＬ染色により染色された断片化ＤＮＡの箇所については、白色三角（▽）で示している。図９（Ｂ）は、腓腹筋におけるCleaved-caspase-3の発現量を示すゲル画像およびグラフである。図９（Ｃ）は、腓腹筋におけるCleaved-caspase-8の発現量を示すゲル画像およびグラフである。図９（Ｂ）および（Ｃ）のグラフにおいて、縦軸は、内在性コントロール（ＧＡＰＤＨ）に対するCleaved-caspase-3またはCleaved-caspase-8の発現量の相対値を示し、横軸は、マウスの種類を示す。図９に示すように、実施例ＡおよびＢのマウスは、コントロールのマウスと比較して、細胞投与から１２週経過時点において、各筋組織における細胞のアポトーシスを示す断片化ＤＮＡの減少がみられた。また、実施例ＡおよびＢのマウスは、コントロールおよび参考例のマウスと比較して、細胞投与から１２週経過時点において、各筋組織における内因性アポトーシスのマーカーであるCleaved-caspase-3およびCleaved-caspase-8の発現量の低下がみられた。

サルコペニアの患者は、筋細胞のアポトーシスが亢進していることが知られている。本発明の細胞調製物は、例えば、筋細胞のアポトーシスを抑制できるため、筋肉量の低下を抑制でき、これにより、サルコペニアの治療効果を奏することがわかった。また、フレイル等の加齢性筋肉減少症においても、筋細胞のアポトーシスにより筋肉量が減少することから、本発明の細胞調製物は、他の加齢性筋肉減少症においても、治療効果を奏するといえる。

［実施例５］
本発明の細胞調製物の投与により、抗炎症作用を示すことを確認した。

前記実施例２で採取した各マウスの腓腹筋（Gastrocnemius muscle）およびヒラメ筋（Soleus muscle）について、前記ｑＰＣＲキット（PowersSYBRR Green CR Master Mix、ThermoFisher社製、Cat.No.:＃437659）を用いて、各筋組織における、炎症性サイトカインであるTumor necrosis factor-α（ＴＮＦ－α）およびケモカインであるMonocyte chemotactic protein-1（ＭＣＰ－１）のｍＲＮＡの発現量をＲＴ－ＰＣＲにて確認した。また、採取した各筋組織について、ＣＤ６８染色を行い、マクロファージを検出した。これらの結果を、図１０に示す。
・ＴＮＦ－α用プライマーセット
フォワードプライマー：5'-GACTTTCTCCTGGTATGAGATAG-3'（配列番号９）
リバースプライマー： 5'-AGGCTGCCCCGACTACGT-3'（配列番号１０）
・ＭＣＰ－１用プライマーセット
フォワードプライマー：5'-GCCCCACTCACCTGCTGCTACT-3'（配列番号１１）
リバースプライマー： 5'-CCTGCTGCTGGTGATCCTCTTGT-3'（配列番号１２）

図１０は、炎症性サイトカインの発現量を示すグラフおよび筋組織の写真である。図１０（Ａ）は、各マウスの腓腹筋およびヒラメ筋における、ＴＮＦ－αまたはＭＣＰ－１の発現量を示すグラフである。図１０（Ａ）において、上段の２図が、腓腹筋における結果を示すグラフであり、下の２図が、ヒラメ筋における結果を示すグラフである。また、図１０（Ａ）の上段および下段のグラフにおいて、左から、ＴＮＦ－αおよびＭＣＰ－１の結果を示す。図１０（Ａ）の各図において、縦軸は、内在性コントロール（ＧＡＰＤＨ）に対するＴＮＦ－αまたはＭＣＰ－１ ｍＲＮＡの発現量の相対値を示し、横軸は、マウスの種類を示す。図１０（Ｂ）は、ＣＤ６８染色の結果を示す写真であり、左の４図が、腓腹筋の結果を示し、右の４図が、ヒラメ筋の結果を示す。図１０（Ｂ）の左右の４図において、それぞれ、左上が、コントロール（Control）の結果を示し、右上が、実施例Ａ（Cell）の結果を示し、左下が、参考例（Ex）の結果を示し、右下が、実施例Ｂ（Cell+Ex）の結果を示す。

図１０に示すように、実施例ＡおよびＢのマウスは、コントロールのマウスと比較して、細胞投与から１２週経過時点において、腓腹筋およびヒラメ筋における、ＴＮＦ－αまたはＭＣＰ－１ ｍＲＮＡの発現量が低下していた。また、ＣＤ６８染色の結果から、実施例ＡおよびＢのマウスは、コントロールと比較して、腓腹筋およびヒラメ筋におけるマクロファージの量が低下していることもわかった。

実施例ＡおよびＢのマウスにおいて、筋組織中におけるＴＮＦ－αおよびＭＣＰ－１の発現量が低下すること、および筋組織中におけるマクロファージの量が低下すること等から、本発明の細胞調製物によれば、筋組織の炎症を抑制できることがわかった。老化が進むにつれて、筋組織では微細な炎症が起き、これにより筋肉量が低下しているといわれている。このため、本発明の細胞調製物は、筋組織の炎症を抑制することにより、筋肉量の低下を抑制でき、これにより、サルコペニアの治療効果を奏することがわかった。

［実施例６］
本発明の細胞調製物の投与により、筋細胞の増殖が向上することを確認した。

前記実施例２で採取した各マウスの腓腹筋（Gastrocnemius muscle）およびヒラメ筋（Soleus muscle）について、前記ｑＰＣＲキット（PowersSYBRR Green CR Master Mix、ThermoFisher社製、Cat.No.:＃437659）を用いて、筋組織中のＴＧＦ－β１のｍＲＮＡの発現量をＲＴ－ＰＣＲにて確認した。また、採取した各筋組織について、ＰＣＮＡ（増殖細胞核抗原）の染色を行い、各筋組織における増殖細胞核抗原を検出し、Desmin+/Laminin5+蛍光二重蛍光染色を行い、各筋組織におけるデスミンおよびラミニン５の発現を確認した。これらの結果を図１１に示す。
・ＴＧＦ－β１用プライマーセット
フォワードプライマー：5'-TGGAGCAACATGTGGAACTC-3'（配列番号１３）
リバースプライマー： 5'-GTCAGCAGCCGGTTACCA-3'（配列番号１４）

図１１は、ＴＧＦ－β１の発現量を示すグラフおよび筋組織の写真である。図１１において、（Ａ）は、各マウスの腓腹筋およびヒラメ筋における、ＴＧＦ－β１の発現量を示すグラフであり、（Ｂ）は、ＰＣＮＡ染色の結果を示す写真である。図１１（Ａ）において、左側の図が、腓腹筋における結果を示すグラフであり、右側の図が、ヒラメ筋における結果を示すグラフである。図１１（Ａ）の各図において、縦軸は、内在性コントロール（ＧＡＰＤＨ）に対するＴＧＦ－β１ ｍＲＮＡの発現量の相対値を示し、横軸は、マウスの種類を示す。図１１（Ｂ）において、左の４図が、腓腹筋の結果を示し、右の４図が、ヒラメ筋の結果を示す。図１１（Ｂ）の左右の４図において、それぞれ、左上が、コントロール（Control）の結果を示し、右上が、実施例Ａ（Cell）の結果を示し、左下が、参考例（Ex）の結果を示し、右下が、実施例Ｂ（Cell+Ex）の結果を示す。なお、図１１（Ｂ）において、ＰＣＮＡ染色により染色された増殖細胞核抗原の箇所については、白色三角（▽）で示している。図１１（Ｃ）は、Desmin/Laminin5の蛍光二重蛍光染色の結果を示す写真であり、左の４図が、腓腹筋の結果を示し、右の４図が、ヒラメ筋の結果を示す。図１１（Ｃ）の左右の４図において、それぞれ、左上が、コントロール（Control）の結果を示し、右上が、実施例Ａ（Cell）の結果を示し、左下が、参考例（Ex）の結果を示し、右下が、実施例Ｂ（Cell+Ex）の結果を示す。なお、図１１（Ｃ）において、Desmin/Laminin5の蛍光二重蛍光染色により染色されたDesmin⁺/Laminin5⁺（double positive）の箇所については、白色アスタリスク（＊）で示している。

図１１に示すように、実施例ＡおよびＢのマウスは、コントロールのマウスと比較して、細胞投与から１２週経過時点において、腓腹筋およびヒラメ筋における、ＴＧＦ－β１ ｍＲＮＡの発現量が増加していた。また、ＰＣＮＡ染色の結果から、コントロールのマウスと比較して、細胞投与から１２週経過時点において、腓腹筋およびヒラメ筋における増殖細胞核抗原の数が増加している、すなわち、骨格筋細胞の増殖が亢進していることがわかった。さらに、Desmin+/Laminin5+蛍光二重蛍光染色の結果から、実施例ＡおよびＢのマウスは、コントロールのマウスおよび参考例のマウスと比較して、細胞投与から１２週経過時点において、腓腹筋およびヒラメ筋における、DesminおよびLaminin5の発現量が増加していること、すなわち、骨格筋の修復が誘導されていることがわかった。

これらの結果から、本発明の細胞調製物は、骨格筋細胞の増殖を誘導し、これにより骨格筋の修復を促進することがわかった。また、ＴＧＦ－β１は、骨格筋細胞の増殖を誘導することから、本発明の細胞調製物は、ＴＧＦ－β１の発現誘導を介して、上記経路を誘導していると推定された。サルコペニア、フレイル等の加齢性筋肉減少症の患者においては、骨格筋細胞の数が減少することが知られている。このため、本発明の細胞調製物は、骨格筋の細胞増殖を誘導することにより、筋肉量の低下を植生し、これにより、加齢性筋肉減少症の治療効果を奏することがわかった。

［実施例７］
本発明の細胞調製物の投与により、骨格筋の修復が亢進されていることを確認した。

前記実施例２で採取した各マウスの腓腹筋（Gastrocnemius muscle）およびヒラメ筋（Soleus muscle）について、前記ｑＰＣＲキット（PowersSYBRR Green CR Master Mix、ThermoFisher社製、Cat.No.:＃437659）を用いて、カテプシンＫ（ＣａｔＫ）およびＧＡＰＤＨをコードするｍＲＮＡの発現量をＲＴ－ＰＣＲ法を用いて確認した。また、Ｓｉｒｔ１およびミオシン重鎖（Myosin heavy chain：ＭＨＣ）の発現量と、ＧＡＰＤＨの発現量とを、ウエスタンブロッティング法により確認した。これらの結果を、図１２に示す。
・ＣａｔＫ用プライマーセット
フォワードプライマー：5'-AGCAGGCTGGAGGACTAAGGT-3'（配列番号１５）
リバースプライマー： 5'-TTTGTGCATCTCAGTGGAAGACT-3'（配列番号１６）

図１２は、ＣａｔＫ、Ｓｉｒｔ１およびＭＨＣの発現量を示すグラフまたは写真である。図１２において、（Ａ）は、各マウスの腓腹筋およびヒラメ筋における、ＣａｔＫの発現量を示すグラフであり、（Ｂ）は、腓腹筋におけるＳｉｒｔ１の発現量を示すゲル画像およびグラフであり、（Ｃ）は、腓腹筋におけるＭＨＣの発現量を示すゲル画像およびグラフである。図１２（Ａ）において、左図が、腓腹筋における結果を示すグラフであり、右図が、ヒラメ筋における結果を示すグラフである。図１２（Ａ）の各図において、縦軸は、内在性コントロール（ＧＡＰＤＨ）に対するＣａｔＫの発現量の相対値を示し、横軸は、マウスの種類を示す。図１２（Ｂ）および（Ｃ）のゲル画像において、上段は、Ｓｉｒｔ１またはＭＨＣの発現量を示し、下段は、内在性コントロール（ＧＡＰＤＨ）の発現量を示す。また、各ゲル画像において、左側から三レーンごとに、それぞれ、コントロール（Control）、実施例Ａ（Cell）、参考例（Ex）、実施例Ｂ（Cell+Ex）の結果を示す。図１２（Ｂ）および（Ｃ）のグラフにおいて、縦軸は、内在性コントロール（ＧＡＰＤＨ）に対するＳｉｒｔ１またはＭＨＣの発現量の相対値を示し、横軸は、マウスの種類を示す。

図１２（Ａ）に示すように、実施例ＡおよびＢのマウスは、コントロールのマウスと比較して、細胞投与から１２週経過時点において、有意に各筋組織におけるＣａｔＫの発現量の減少がみられた。また、実施例ＡおよびＢのマウスは、コントロールおよび参考例のマウスと比較して、細胞投与から１２週経過時点において、有意にＳｉｒｔ１およびＭＨＣの発現量の上昇がみられた。

ＣａｔＫは、筋肉の障害後に高発現し、炎症を惹起することにより筋肉の障害を増強し、再生を遅延させることが知られている。また、Ｓｉｒｔ１等のサーチュイン遺伝子は、抗老化作用に関連する遺伝子であることが知られている。ＭＨＣは、筋肉量の修復および増大に関連する遺伝子であり、筋繊維の量を維持する機能があることが知られている。このため、本発明の細胞調製物は、骨格筋におけるＣａｔＫの発現量を抑制でき、Ｓｉｒｔ１およびＭＨＣの発現量を上昇させることができるため、例えば、骨格筋の修復を亢進し、これを維持できると推定された。このため、本発明の細胞調製物は、筋肉の障害を増強する遺伝子の発現を抑制し、他方、筋肉を再生させる遺伝子の発現を誘導することにより、筋肉量の低下を抑制し、これにより、サルコペニアの治療効果を奏することがわかった。

［実施例８］
本発明の細胞調製物のエクソソームが、筋細胞のアポトーシスを抑制できることを確認した。

（１）細胞調製物培養上清からのエクソソームの精製
本発明の細胞調製物のエクソソームが、アポトーシスを抑制することを確認するために、まず、細胞調製物培養上清からエクソソームの精製を行った。具体的には、実施例１（１）～（３）と同様にして調製した細胞調製物を、Corning（登録商標） CellBIND（登録商標）表面１００ｍｍディッシュ（コーニング社製、Product Number:#3292）に、細胞数１×１０^５ｃｅｌｌ／１ｍｌになるように播種し、４８時間培養した。前記培養の培養液は、ＣｉＭＳ（商標）－ＢＭ（ニプロ株式会社、製品コード：87-070）に、ヒト間葉系幹細胞用基礎培養液アニマルフリー添加剤であるＣｉＭＳ（商標）－ｓＡＦ（ニプロ株式会社、製品コード：87-072）を、添付文書に従った割合で添加したものを用いた。前記培養後、３００×ｇ、１０分の条件下で、第１の遠心を行い、細胞を除去し、第１の上清を得た。前記上清を、２０００×ｇ、１０分の条件下で、第２の遠心を行い、細胞断片等を除去し、第２の上清を得た。その後、前記第２の上清を、０．２２μｍのフィルタを用いて濾過し、サンプルを得た。前記サンプルを超遠心用ＵＣチューブに入れ、ローター（ＳＷ３２Ｔｉ－１２Ｕ、ベックマン・コールター社製）に設置し、超遠心機（Ｏｐｔｉｍａ Ｌ－１００、ベックマン・コールター社製）を用いて第３の遠心を行った。前記第３の遠心は、３５０００ｒｐｍ、７０分の条件下で行った。前記第３の遠心後、上清を除去し、沈殿物を得た。前記沈殿物に１ｍｌのフィルタ濾過したＰＢＳを添加し、ボルテックスを行った。前記ボルテックス後、ＰＢＳで３５ｍｌにメスアップし、前記第３の遠心と同様の条件で、第４の遠心を行った。前記第４の遠心後、上清を除去し、少量のＰＢＳを添加し、ボルテックスを行い、エクソソーム溶液を得た。その後、前記エクソソーム溶液は、１．５ｍｌの低吸着チューブに保存した。

（２）エクソソームの電子顕微鏡撮影
つぎに、前記エクソソーム溶液にエクソソームが含まれているか確認するために、前記エクソソーム溶液の電子顕微鏡による観察を行った。具体的には、１０μｌの前記エクソソーム溶液を、グリッドに載せ、１０分間の条件下で、自然乾燥を行った。前記自然乾燥後、酢酸ウラニルを添加し、ネガティブ染色を行った。前記ネガティブ染色後、透過電子顕微鏡（ＪＥＭ－１４００ＰＬＵＳ、日本電子社製）を用いて、観察を行った。これらの結果を図１３に示す。

図１３は、電子顕微鏡によるエクソソームの写真である。図１３において、スケールバーは、２００ｎｍを示す。図１３に示すように、直径約５０ｍｍから約２００ｍｍの丸い小胞が、多数観察された。以上のことから、本発明の細胞調製物の培養上清から、エクソソームが精製できることが示唆された。

（３）エクソソームのマーカーの確認
前記電子顕微鏡で観察された丸い小胞がエクソソームか確認するため、ウエスタンブロッティング法を用いて、前記小胞が、エクソソームマーカーを発現しているか確認した。具体的には、前記実施例８（１）で得たエクソソーム溶液５０μｌに、５０μｌの２×サンプルバッファーを添加し、９５℃で５分間加熱し、サンプルを調製した。前記調製後、１０～２０％スーパーセップTMエース（富士フイルム和光純薬社製）アクリルアミドゲルのウェルに前記サンプルをアプライし、電気泳動を行った。前記電気泳動後、ウエスタンブロッティングを行った。前記ウエスタンブロッティングにおけるエクソソームの検出は、一晩の条件下で、１次抗体を反応させた後、室温（約２５℃）、１時間の条件下で、２次抗体で染色した。前記１次抗体には、エクソソームのマーカーである、抗ＣＤ９モノクローナル抗体（clone:1K、１０００倍希釈、Cat.No:041-27763、富士フイルム和光純薬社製）、抗ＣＤ６３モノクローナル抗体（clone:3-13、１０００倍希釈、Cat.No:012-27063、富士フイルム和光純薬社製）、および抗ＣＤ８１モノクローナル抗体（clone:17B1、１０００倍希釈、Cat.No:011-27773、富士フイルム和光純薬社製）を用いた。前記２次抗体には、Anti-Mouse IgG, HRP-Linked F（ab’）₂ Fragment Sheep（５０００倍希釈、Cat.No:NA9310V、cytiva社製）を用いた。同様に、独立に追加で調製した３つのエクソソーム溶液について、エクソソームのマーカーの検出を行なった。これらの結果を図１４に示す。

図１４は、ウエスタンブロッティングによるエクソソームマーカーの検出結果を示す写真である。図１４において、写真の左側は、エクソソームのマーカーを示し、写真の上部は、エクソソーム溶液のサンプルを示し、レーン１～４は、それぞれ、独立して調製したエクソソーム溶液の結果を示す。図１４に示すように、エクソソーム溶液のいずれのサンプルにおいても、エクソソームマーカーが検出され、臍帯由来間葉系幹細胞がエクソソームを分泌していることを再現よく確認できた。以上のことから、本発明の細胞調製物の培養上清から、エクソソームが精製できることがわかった。

（４）エクソソームの粒子径分布の評価
本発明の細胞調製物の培養上清から得られたエクソソームの、粒子径分布について評価を行った。具体的には、実施例８（１）で得たエクソソーム溶液を、ＰＢＳを用いて５０倍に希釈した。前記希釈後、粒径測定器（Nano particle tracking analysis（NanoSight）、Malvern Panalytical社製）を用いて、デフォルトのパラメータでエクソソームの粒子径を測定した。これらの結果を図１５に示す。

図１５は、エクソソームマーカーの粒子径の分布を示したグラフである。図１５において、縦軸は、エクソソームの濃度（小胞数／ｍｌ）を示し、横軸は、エクソソームの大きさ（ｎｍ）を示す。図１５に示すように、前記臍帯由来間葉系細胞のエクソソームは、４０～４００ｎｍに分布し、１１６ｎｍの大きさのエクソソームが一番多く、４０ｎｍの大きさのエクソソームが一番小さく、６２１ｎｍの大きさのエクソソームが一番大きかった。また、約１００ｎｍから約３００ｎｍの大きさのエクソソームが多く見られた。以上のことから、本発明の細胞調製物の培養上清から得たエクソソームは、約１００ｎｍから約３００ｎｍの大きさのエクソソームであることがわかった。

（５）エクソソームの培養筋細胞への取り込みの評価
本発明の細胞調製物の培養上清から得られたエクソソームが、培養筋細胞に取り込まれるかについて評価を行った。具体的には、実施例８（１）で得たエクソソーム溶液（タンパク質量として１０μｇ）を、ExoSparkler Exosome Membrane Labeling Kit-Green（Cat.No:EX01、同仁化学研究所社製）を用いて標識した。前記標識後、ディッシュに１．２５×１０^４細胞を播種したＣ２Ｃ１２細胞（マウス横紋筋細胞）に、添加した。前記添加後、２４時間インキュベートを行った。前記インキュベート後、４％パラホルムアルデヒド含有リン酸緩衝液（Cat.No:161-20141、富士フイルム和光純薬社製)を用いて、室温、２０分の条件下で、前記細胞を固定した。前記固定後、室温、５分の条件下で、ＰＢＳを用いて洗浄を行い、さらに、前記洗浄を計３回行った。その後、蛍光顕微鏡（Super-resolution/confocal Microscopy（LSM880-ELYRA PS. 1、Carl Zeiss社製）を用いて、前記細胞の観察を行った。これらの結果を図１６に示す。

図１６は、エクソソームを取り込んだＣ２Ｃ１２細胞を示した写真である。図１６に示すように、Ｃ２Ｃ１２細胞が、標識されたエクソソームを取り込んでいることがわかった。以上のことから、本発明の細胞調製物の培養上清から得たエクソソームは、筋細胞に取り込まれることがわかった。

（６）エクソソームによる、アポトーシス抑制の評価
本発明の細胞調製物の培養上清から得られたエクソソームが、前記エクソソームを取り込んだ培養筋細胞のアポトーシスを抑制するかを検討した。具体的には、カバーグラスが入ってた１２ウェル培養プレートに、Ｃ２Ｃ１２細胞（マウス横紋筋細胞）を２×１０^４細胞となるように播種した後、３００μｍｏｌ／ｌのＨ_２Ｏ_２を添加した。前記添加後、１２時間インキュベートを行った。前記インキュベート後、前記実施例８（１）で得たエクソソーム溶液（タンパク質量として１μｇ）を添加したＤＭＥＭ培地内で培養を行った。ネガティブコントロールには、前記エクソソーム溶液の代わりに、等容量のＰＢＳを添加したＤＭＥＭ培地を用いて培養を行った。前記培養は、１２時間行った。前記培養後、ＴＵＮＥＬ染色を行い、蛍光顕微鏡を用いて細胞を観察した。また、核の染色には、ProLong^TM Galss Antifade Mountan with NucBlue^TM（Cat.No:P36985、ThermoFisher社製）を用いた。核陽性細胞におけるＴＵＮＥＬ陽性細胞の割合を算出した。これらの結果を図１７に示す。有意差の検定には、t tests (and nonparametric tests)を用いた。

図１７は、エクソソームを取り込ませたＣ２Ｃ１２細胞のアポトーシスを示した写真およびグラフである。図１７において、（Ａ）は、エクソソーム添加の有無によるＴＵＮＥＬ染色を示した写真であり、（Ｂ）は、エクソソーム添加の有無によるＴＵＮＥＬ陽性細胞の割合を示したグラフである。図１７（Ａ）において、写真の左側は、エクソソーム添加の有無を示し、写真の上部は、マーカーの種類を示す。図１７（Ｂ）において、縦軸は、ＴＵＮＥＬ陽性細胞の割合（％）を示し、横軸は、エクソソーム添加の有無を示す。図１７（Ａ）に示すように、エクソソームを添加したＣ２Ｃ１２細胞（Exosome）では、エクソソームを添加していないネガティブコントロール（Control）と比較して、ＴＵＮＥＬ陽性細胞は少なく観察された。また、図１７（Ｂ）に示すように、エクソソームを添加したＣ２Ｃ１２細胞では、エクソソームを添加していないネガティブコントロールと比較して、有意にＴＵＮＥＬ陽性細胞の割合が減少した。以上のことから、本発明の細胞調製物の培養上清から得たエクソソームは、前記エクソソームを取り込んだ筋細胞において、Ｈ_２Ｏ_２によって引き起こされるアポトーシスを、抑制できることがわかった。なお、臍帯由来細胞がエクソソームを分泌することは、本発明者らが初めて示したことである。

以上、実施形態および実施例を参照して本発明を説明したが、本発明は、上記実施形態および実施例に限定されるものではない。本発明の構成や詳細には、本発明のスコープ内で当業者が理解し得る様々な変更をすることができる。

この出願は、２０２０年１１月１６日に出願された日本出願特願２０２０－１９０５５１を基礎とする優先権を主張し、その開示の全てをここに取り込む。

＜付記＞
上記の実施形態および実施例の一部または全部は、以下の付記のように記載されうるが、以下には限られない。
（付記１）
筋肉量の低下抑制に用いる細胞調製物であって、
前記細胞調製物は、臍帯由来細胞を含む、細胞調製物。
（付記２）
前記臍帯由来細胞は、臍帯由来間葉系細胞である、付記１に記載の細胞調製物。
（付記３）
前記臍帯由来細胞は、
（ｉ）ＣＤ１０５、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ４４、ＨＬＡ－ｃｌａｓｓＩ、ＨＬＡ－Ｇ５およびＰＤ－Ｌ２が陽性であり、かつ
（ｉｉ）ＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１９およびＨＬＡ－ＣｌａｓｓＩＩが陰性である、付記１または２に記載の細胞調製物。
（付記４）
前記臍帯由来細胞は、
（ｉｉｉ）炎症条件下でＩＤＯ、ＰＧＥ２、ＰＤ－Ｌ１のいずれか１つの遺伝子および／またはタンパクの発現が誘導される、付記１から３のいずれかに記載の細胞調製物。
（付記５）
前記臍帯由来細胞が、羊膜、血管、血管周囲組織および／またはワルトンジェリーを含む臍帯組織から調製された細胞である、付記１から４のいずれかに記載の細胞調製物。
（付記６）
前記細胞調製物は、１×１０^６～１×１０^９個の臍帯由来細胞を含む、付記１から５のいずれかに記載の細胞調製物。
（付記７）
前記細胞調製物は、前記臍帯由来細胞の抽出物および／または分泌物を含む、付記１から６のいずれかに記載の細胞調製物。
（付記８）
前記細胞調製物は、筋組織におけるミトコンドリアの機能向上作用を示す、付記１から７のいずれかに記載の細胞調製物。
（付記９）
前記細胞調製物は、筋組織におけるミトコンドリア数の増加作用を示す、付記１から８のいずれかに記載の細胞調製物。
（付記１０）
前記細胞調製物は、筋組織におけるミトコンドリアの機能向上遺伝子の発現誘導作用を示す、付記１から９のいずれかに記載の細胞調製物。
（付記１１）
前記ミトコンドリアの機能向上遺伝子は、ＰＧＣ１－α遺伝子、ＣＯＸ４遺伝子、および／またはＧＬＵＴ４遺伝子である、付記１０記載の細胞調製物。
（付記１２）
前記細胞調製物は、筋細胞のアポトーシス抑制作用を示す、付記１から１１のいずれかに記載の細胞調製物。
（付記１３）
前記細胞調製物は、筋組織において、抗炎症作用を示す、付記１から１２のいずれかに記載の細胞調製物。
（付記１４）
前記細胞調製物は、筋組織における炎症性サイトカイン遺伝子および／またはケモカイン遺伝子の発現抑制作用を示す、付記１から１３のいずれかに記載の細胞調製物。
（付記１５）
前記炎症性サイトカイン遺伝子は、ＴＮＦ－α遺伝子である、付記１４に記載の細胞調製物。
（付記１６）
前記ケモカイン遺伝子は、ＭＣＰ－１遺伝子である、付記１４に記載の細胞調製物。
（付記１７）
前記細胞調製物は、筋細胞の増殖促進作用を示す、付記１から１６のいずれかに記載の細胞調製物。
（付記１８）
前記細胞調製物は、筋細胞の増殖促進遺伝子の発現誘導作用を示す、付記１から１７のいずれかに記載の細胞調製物。
（付記１９）
前記筋細胞の増殖促進遺伝子は、ＴＧＦ－β１遺伝子である、付記１８に記載の細胞調製物。
（付記２０）
前記細胞調製物は、筋組織の修復作用を示す、付記１から１９のいずれかに記載の細胞調製物。
（付記２１）
前記細胞調製物は、筋組織の修復遺伝子の発現誘導作用を示す、付記１から２０のいずれかに記載の細胞調製物。
（付記２２）
前記筋組織の修復遺伝子は、ＳＩＲＴ１遺伝子および／またはＭＨＣ遺伝子である、付記２１に記載の細胞調製物。
（付記２３）
前記細胞調製物は、筋組織の障害抑制作用を示す、付記１から２２のいずれかに記載の細胞調製物。
（付記２４）
前記細胞調製物は、筋組織の障害誘導遺伝子の発現抑制作用を示す、付記１から２３のいずれかに記載の細胞調製物。
（付記２５）
前記筋組織の障害誘導遺伝子は、カテプシンＫ遺伝子である、付記２４に記載の細胞調製物。
（付記２６）
運動療法と併せて用いる、付記１から２５のいずれかに記載の細胞調製物。
（付記２７）
筋組織において炎症が生じている対象に用いる、付記１から２６のいずれかに記載の細胞調製物。
（付記２８）
静脈内投与用である、付記１から２７のいずれかに記載の細胞調製物。
（付記２９）
筋肉量の低下が、加齢に起因するものである、付記１から２８のいずれかに記載の細胞調製物。
（付記３０）
中高年に投与するための、付記１から２９のいずれかに記載の細胞調製物。
（付記３１）
加齢性筋肉減少症の治療に用いる細胞調製物であって、
付記１から３０のいずれかに記載の筋肉量の低下抑制に用いる細胞調製物を含む、細胞調製物。
（付記３２）
前記加齢性筋肉減少症は、サルコペニアまたはフレイルである、付記３１に記載の細胞調製物。
（付記３３）
筋組織におけるミトコンドリアの機能向上に用いる細胞調製物であって、
前記細胞調製物は、臍帯由来細胞を含む、細胞調製物。
（付記３４）
筋組織におけるミトコンドリア数の増加に用いる細胞調製物であって、
前記細胞調製物は、臍帯由来細胞を含む、細胞調製物。
（付記３５）
筋組織におけるミトコンドリアの機能向上遺伝子の発現誘導に用いる細胞調製物であって、
前記細胞調製物は、臍帯由来細胞を含む、細胞調製物。
（付記３６）
前記ミトコンドリアの機能向上遺伝子は、ＰＧＣ１－α遺伝子、ＣＯＸ４遺伝子、および／またはＧＬＵＴ４遺伝子である、付記３５に記載の細胞調製物。
（付記３７）
筋細胞のアポトーシス抑制に用いる細胞調製物であって、
前記細胞調製物は、臍帯由来細胞を含む、細胞調製物。
（付記３８）
筋組織における抗炎症（炎症抑制）に用いる細胞調製物であって、
前記細胞調製物は、臍帯由来細胞を含む、細胞調製物。
（付記３９）
筋組織における炎症性サイトカイン遺伝子および／またはケモカイン遺伝子の発現抑制に用いる細胞調製物であって、
前記細胞調製物は、臍帯由来細胞を含む、細胞調製物。
（付記４０）
前記炎症性サイトカイン遺伝子は、ＴＮＦ－α遺伝子である、付記３９に記載の細胞調製物。
（付記４１）
前記ケモカイン遺伝子は、ＭＣＰ－１遺伝子である、付記３９に記載の細胞調製物。
（付記４２）
筋細胞の増殖促進に用いる細胞調製物であって、
前記細胞調製物は、臍帯由来細胞を含む、細胞調製物。
（付記４３）
筋細胞の増殖促進遺伝子の発現誘導に用いる細胞調製物であって、
前記細胞調製物は、臍帯由来細胞を含む、細胞調製物。
（付記４４）
前記筋細胞の増殖促進遺伝子は、ＴＧＦ－β１遺伝子である、付記４３に記載の細胞調製物。
（付記４５）
筋組織の修復に用いる細胞調製物であって、
前記細胞調製物は、臍帯由来細胞を含む、細胞調製物。
（付記４６）
筋組織の修復遺伝子の発現誘導に用いる細胞調製物であって、
前記細胞調製物は、臍帯由来細胞を含む、細胞調製物。
（付記４７）
前記筋組織の修復遺伝子は、ＳＩＲＴ１遺伝子および／またはＭＨＣ遺伝子である、付記４６に記載の細胞調製物。
（付記４８）
筋組織の障害抑制に用いる細胞調製物であって、
前記細胞調製物は、臍帯由来細胞を含む、細胞調製物。
（付記４９）
筋組織の障害誘導遺伝子の発現抑制に用いる細胞調製物であって、
前記細胞調製物は、臍帯由来細胞を含む、細胞調製物。
（付記５０）
前記筋組織の障害誘導遺伝子は、カテプシンＫ遺伝子である、付記４９に記載の細胞調製物。
（付記５１）
対象の筋組織における間質の線維化の抑制に用いる細胞調製物であって、
前記細胞調製物は、臍帯由来細胞を含む、細胞調製物。
（付記５２）
対象における筋肉量低下の抑制方法であって、
対象に、付記１から３０のいずれかに記載の筋肉量の低下抑制に用いる細胞調製物を用いる、方法。
（付記５３）
対象に、付記１から３０のいずれかに記載の筋肉量の低下抑制に用いる細胞調製物を投与する、付記５２に記載の方法。
（付記５４）
筋肉量の低下が生じている対象の処置方法であって、
対象に、付記１から３０のいずれかに記載の筋肉量の低下抑制に用いる細胞調製物を用いる、方法。
（付記５５）
対象に、付記１から３０のいずれかに記載の筋肉量の低下抑制に用いる細胞調製物を投与する、付記５４に記載の方法。
（付記５６）
対象の筋組織におけるミトコンドリアの機能向上方法であって、
対象に、付記３３に記載の筋組織におけるミトコンドリアの機能向上に用いる細胞調製物を用いる、方法。
（付記５７）
対象に、付記３３に記載の細胞調製物を投与する、付記５６に記載の方法。
（付記５８）
対象の筋組織におけるミトコンドリア数の増加方法であって、
対象に、付記３４に記載の筋組織におけるミトコンドリア数の増加に用いる細胞調製物を用いる、方法。
（付記５９）
対象に、付記３４に記載の細胞調製物を投与する、付記５８に記載の方法。
（付記６０）
対象の筋組織におけるミトコンドリアの機能向上遺伝子の発現誘導方法であって、
対象に、付記３５または３６に記載の筋組織におけるミトコンドリアの機能向上遺伝子の発現誘導に用いる細胞調製物を用いる、方法。
（付記６１）
対象に、付記３５または３６に記載の細胞調製物を投与する、付記６０に記載の方法。
（付記６２）
対象の筋細胞におけるアポトーシスの抑制方法であって、
対象に、付記３７に記載の筋細胞のアポトーシス抑制に用いる細胞調製物を用いる、方法。
（付記６３）
対象に、付記３７に記載の細胞調製物を投与する、付記６２に記載の方法。
（付記６４）
対象の筋組織における炎症の抑制方法であって、
対象に、付記３８に記載の筋組織における抗炎症（炎症抑制）に用いる細胞調製物を用いる、方法。
（付記６５）
対象に、付記３８に記載の細胞調製物を投与する、付記６４記載の方法。
（付記６６）
対象の筋組織における炎症性サイトカイン遺伝子および／またはケモカイン遺伝子の発現抑制方法であって、
対象に、付記３９に記載の筋組織における炎症性サイトカイン遺伝子および／またはケモカイン遺伝子の発現抑制に用いる細胞調製物を用いる、方法。
（付記６７）
対象に、付記３９に記載の細胞調製物を投与する、付記６６に記載の方法。
（付記６８）
対象の筋細胞の増殖促進方法であって、
対象に、付記４２に記載の筋細胞の増殖促進に用いる細胞調製物を用いる、方法。
（付記６９）
対象に、付記４２に記載の細胞調製物を投与する、付記６８に記載の方法。
（付記７０）
対象の筋細胞の増殖促進遺伝子の発現誘導方法であって、
対象に、付記４３または４４に記載の筋細胞の増殖促進遺伝子の発現誘導に用いる細胞調製物を用いる、方法。
（付記７１）
対象に、付記４３または４４に記載の細胞調製物を投与する、付記７０に記載の方法。
（付記７２）
対象の筋組織の修復方法であって、
対象に、付記４５に記載の筋組織の修復に用いる細胞調製物を用いる、方法。
（付記７３）
対象に、付記４５に記載の細胞調製物を投与する、付記７２に記載の方法。
（付記７４）
対象の筋組織の修復遺伝子の発現誘導方法であって、
対象に、付記４６または４７に記載の筋組織の修復遺伝子の発現誘導に用いる細胞調製物を用いる、方法。
（付記７５）
対象に、付記４６または４７に記載の細胞調製物を投与する、付記７４に記載の方法。
（付記７６）
対象の筋組織の障害抑制方法であって、
対象に、付記４８に記載の筋組織の障害抑制に用いる細胞調製物を用いる、方法。
（付記７７）
対象に、付記４８に記載の細胞調製物を投与する、付記７６に記載の方法。
（付記７８）
対象の筋組織の障害誘導遺伝子の発現抑制方法であって、
対象に、付記４９または５０に記載の筋組織の障害誘導遺伝子の発現抑制に用いる細胞調製物を用いる、方法。
（付記７９）
対象に、付記４９または５０に記載の細胞調製物を投与する、付記７８に記載の方法。
（付記８０）
加齢性筋肉減少症患者の処置方法であって、
前記加齢性筋肉減少症患者に、付記１から３０のいずれかに記載の細胞調製物を投与する、処置方法。
（付記８１）
対象の筋組織の間質の線維化の抑制方法であって、
対象に、付記５１に記載の対象の筋組織における間質の線維化の抑制に用いる細胞調製物を用いる、方法。
（付記８２）
対象に、付記５１に記載の細胞調製物を投与する、付記８１に記載の方法。
（付記８３）
筋肉量の低下抑制に用いるための、細胞組成物であり、
前記細胞調製物は、臍帯由来細胞を含む、細胞調製物。
（付記８４）
加齢性筋肉減少症の治療に用いるための、細胞調製物であり、
前記細胞調製物は、臍帯由来細胞を含む、細胞調製物。
（付記８５）
筋組織におけるミトコンドリアの機能向上に用いるための、細胞調製物であり、
前記細胞調製物は、臍帯由来細胞を含む、細胞調製物。
（付記８６）
筋組織におけるミトコンドリア数の増加に用いるための、細胞調製物であり、
前記細胞調製物は、臍帯由来細胞を含む、細胞調製物。
（付記８７）
筋組織におけるミトコンドリアの機能向上遺伝子の発現誘導に用いるための、細胞調製物であり、
前記細胞調製物は、臍帯由来細胞を含む、細胞調製物。
（付記８８）
筋細胞におけるアポトーシスの抑制に用いるための、細胞調製物であり、
前記細胞調製物は、臍帯由来細胞を含む、細胞調製物。
（付記８９）
筋組織における炎症の抑制に用いるための、細胞調製物であり、
前記細胞調製物は、臍帯由来細胞を含む、細胞調製物。
（付記９０）
筋組織における炎症性サイトカイン遺伝子および／またはケモカイン遺伝子の発現抑制に用いるための、細胞調製物であり、
前記細胞調製物は、臍帯由来細胞を含む、細胞調製物。
（付記９１）
筋細胞の増殖促進に用いるための、細胞調製物であり、
前記細胞調製物は、臍帯由来細胞を含む、細胞調製物。
（付記９２）
筋細胞の増殖促進遺伝子の発現誘導に用いるための、細胞調製物であり、
前記細胞調製物は、臍帯由来細胞を含む、細胞調製物。
（付記９３）
筋組織の修復に用いるための、細胞調製物であり、
前記細胞調製物は、臍帯由来細胞を含む、細胞調製物。
（付記９４）
筋組織の修復遺伝子の発現誘導に用いるための、細胞調製物であり、
前記細胞調製物は、臍帯由来細胞を含む、細胞調製物。
（付記９５）
筋組織の障害抑制に用いるための、細胞調製物であり、
前記細胞調製物は、臍帯由来細胞を含む、細胞調製物。
（付記９６）
筋組織の障害誘導遺伝子の発現抑制に用いるための、細胞調製物であり、
前記細胞調製物は、臍帯由来細胞を含む、細胞調製物。
（付記９７）
筋組織の間質の線維化の抑制に用いるための、細胞調製物であり、
前記細胞調製物は、臍帯由来細胞を含む、細胞調製物。
（付記９８）
臍帯由来細胞に由来するエクソソームと、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
（付記９９）
前記エクソソームの平均径は、１～５００ｎｍである、付記９８に記載の医薬組成物。
（付記１００）
前記エクソソームは、脂質膜および内腔を含み、
前記脂質膜は、前記臍帯由来細胞に由来し、
前記内腔は、前記臍帯由来細胞の細胞質を含む、付記９８または９９に記載の医薬組成物。
（付記１０１）
筋肉量の低下抑制に用いるための、付記９８から１００のいずれかに記載の医薬組成物。
（付記１０２）
筋組織におけるミトコンドリアの機能向上に用いるための、付記９８から１０１のいずれかに記載の医薬組成物。
（付記１０３）
筋組織におけるミトコンドリア数の増加に用いるための、付記９８から１０２のいずれかに記載の医薬組成物。
（付記１０４）
筋組織におけるミトコンドリアの機能向上遺伝子の発現誘導に用いるための、付記９８から１０３のいずれかに記載の医薬組成物。
（付記１０５）
筋細胞のアポトーシス抑制に用いるための、付記９８から１０４のいずれかに記載の医薬組成物。
（付記１０６）
筋組織における抗炎症（炎症抑制）に用いるための、付記９８から１０５のいずれかに記載の医薬組成物。
（付記１０７）
筋組織における炎症性サイトカイン遺伝子および／またはケモカイン遺伝子の発現抑制に用いるための、付記９８から１０６のいずれかに記載の医薬組成物。
（付記１０８）
筋細胞の増殖促進に用いるための、付記９８から１０７のいずれかに記載の医薬組成物。
（付記１０９）
筋細胞の増殖促進遺伝子の発現誘導に用いるための、付記９８から１０８のいずれかに記載の医薬組成物。
（付記１１０）
筋組織の修復に用いるための、付記９８から１０９のいずれかに記載の医薬組成物。
（付記１１１）
筋組織の修復遺伝子の発現誘導に用いるための、付記９８から１１０のいずれかに記載の医薬組成物。
（付記１１２）
筋組織の障害抑制に用いるための、付記９８から１１１のいずれかに記載の医薬組成物。
（付記１１３）
加齢性筋肉減少症に用いるための、付記９８から１１２のいずれかに記載の医薬組成物。

以上のように、本発明によれば、筋肉量の低下を抑制できる。このため、本発明によれば、筋肉量の減少により生じる疾患を治療できる。このため、本発明は、例えば、医薬分野等において極めて有用である。

Claims (32)

1. 筋肉量の低下抑制に用いる細胞調製物であって、
   前記細胞調製物は、臍帯由来細胞を含む、細胞調製物。
2. 前記臍帯由来細胞は、臍帯由来間葉系細胞である、請求項１に記載の細胞調製物。
3. 前記臍帯由来細胞は、
   （ｉ）ＣＤ１０５、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ４４、ＨＬＡ－ｃｌａｓｓＩ、ＨＬＡ－Ｇ５およびＰＤ－Ｌ２が陽性であり、かつ
   （ｉｉ）ＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１９およびＨＬＡ－ＣｌａｓｓＩＩが陰性である、請求項１または２に記載の細胞調製物。
4. 前記臍帯由来細胞は、
   （ｉｉｉ）炎症条件下でＩＤＯ、ＰＧＥ２、ＰＤ－Ｌ１のいずれか１つの遺伝子および／またはタンパクの発現が誘導される、請求項１から３のいずれか一項に記載の細胞調製物。
5. 前記臍帯由来細胞が、羊膜、血管、血管周囲組織および／またはワルトンジェリーを含む臍帯組織から調製された細胞である、請求項１から４のいずれか一項に記載の細胞調製物。
6. 前記細胞調製物は、１×１０^６～１×１０^９個の臍帯由来細胞を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の細胞調製物。
7. 前記細胞調製物は、前記臍帯由来細胞の抽出物および／または分泌物を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の細胞調製物。
8. 前記細胞調製物は、筋組織におけるミトコンドリアの機能向上作用を示す、請求項１から７のいずれか一項に記載の細胞調製物。
9. 前記細胞調製物は、筋組織におけるミトコンドリア数の増加作用を示す、請求項１から８のいずれか一項に記載の細胞調製物。
10. 前記細胞調製物は、筋組織におけるミトコンドリアの機能向上遺伝子の発現誘導作用を示す、請求項１から９のいずれか一項に記載の細胞調製物。
11. 前記ミトコンドリアの機能向上遺伝子は、ＰＧＣ１－α遺伝子、ＣＯＸ４遺伝子、および／またはＧＬＵＴ４遺伝子である、請求項１０に記載の細胞調製物。
12. 前記細胞調製物は、筋細胞のアポトーシス抑制作用を示す、請求項１から１１のいずれか一項に記載の細胞調製物。
13. 前記細胞調製物は、筋組織において、抗炎症作用を示す、請求項１から１２のいずれか一項に記載の細胞調製物。
14. 前記細胞調製物は、筋組織における炎症性サイトカイン遺伝子および／またはケモカイン遺伝子の発現抑制作用を示す、請求項１から１３のいずれか一項に記載の細胞調製物。
15. 前記炎症性サイトカイン遺伝子は、ＴＮＦ－α遺伝子である、請求項１４に記載の細胞調製物。
16. 前記ケモカイン遺伝子は、ＭＣＰ－１遺伝子である、請求項１４に記載の細胞調製物。
17. 前記細胞調製物は、筋細胞の増殖促進作用を示す、請求項１から１６のいずれか一項に記載の細胞調製物。
18. 前記細胞調製物は、筋細胞の増殖促進遺伝子の発現誘導作用を示す、請求項１から１７のいずれか一項に記載の細胞調製物。
19. 前記筋細胞の増殖促進遺伝子は、ＴＧＦ－β１遺伝子である、請求項１８に記載の細胞調製物。
20. 前記細胞調製物は、筋組織の修復作用を示す、請求項１から１９のいずれか一項に記載の細胞調製物。
21. 前記細胞調製物は、筋組織の修復遺伝子の発現誘導作用を示す、請求項１から２０のいずれか一項に記載の細胞調製物。
22. 前記筋組織の修復遺伝子は、ＳＩＲＴ１遺伝子および／またはＭＨＣ遺伝子である、請求項２１に記載の細胞調製物。
23. 前記細胞調製物は、筋組織の障害抑制作用を示す、請求項１から２２のいずれか一項に記載の細胞調製物。
24. 前記細胞調製物は、筋組織の障害誘導遺伝子の発現抑制作用を示す、請求項１から２３のいずれか一項に記載の細胞調製物。
25. 前記筋組織の障害誘導遺伝子は、カテプシンＫ遺伝子である、請求項２４に記載の細胞調製物。
26. 運動療法と併せて用いる、請求項１から２５のいずれか一項に記載の細胞調製物。
27. 筋組織において炎症が生じている対象に用いる、請求項１から２６のいずれか一項に記載の細胞調製物。
28. 静脈内投与用である、請求項１から２７のいずれか一項に記載の細胞調製物。
29. 筋肉量の低下が、加齢に起因するものである、請求項１から２８のいずれか一項に記載の細胞調製物。
30. 中高年に投与するための、請求項１から２９のいずれか一項に記載の細胞調製物。
31. 加齢性筋肉減少症の治療に用いる細胞調製物であって、請求項１から３０のいずれか一項に記載の筋肉量の低下抑制に用いる細胞調製物を含む、細胞調製物。
32. 前記加齢性筋肉減少症は、サルコペニアまたはフレイルである、請求項３１に記載の細胞調製物。
    
    

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