ES2903411T3 - AMD3100 para el tratamiento y/o la prevención de caquexia, y composición farmacéutica del mismo - Google Patents
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Abstract
Compuesto 1,1'-[1,4-fenileno-bis(metileno)]-di-1,4,8,11-tetraazaciclotetradecano o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para uso en un método para aliviar y/o mejorar la pérdida de grasas provocada por caquexia.
Description
DESCRIPCIÓN
AMD3100 para el tratamiento y/o la prevención de caquexia, y composición farmacéutica del mismo
Campo técnico
La descripción se refiere al campo de las medicinas y, particularmente, a la aplicación de AMD3100 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para el tratamiento y/o la prevención de caquexia y una composición farmacéutica del mismo para el tratamiento y/o para tratar caquexia.
Antecedentes
La caquexia de tumores es un síntoma concomitante habitual en pacientes de cáncer y se manifiesta principalmente como una pérdida de peso involuntaria y anorexia. Al menos un 30% de los pacientes de cáncer mueren de caquexia y al menos un 50% de los pacientes de cáncer mueren con caquexia. La definición de la caquexia tumoral, establecida por el profesor Fearon de la entidad School of Clinical Science and Community Health, Universidad de Edimburgo, Reino Unido, ha conseguido básicamente un consenso en la actualidad: la caquexia es un síndrome multifactorial, que se manifiesta de hecho en que un paciente está perdiendo la masa de los músculos esqueléticos (con o sin pérdida de masa de grasa), al mismo tiempo que el aporte nutritivo habitual no puede invertirla completamente y provoca entonces un deterioro continuo deL daño funcional. La caquexia tumoral no solamente reduce la calidad de vida de los pacientes, sino que conduce también a la tolerancia del tratamiento tumoral y debilita el efecto del tratamiento tumoral. Por tanto, el tratamiento de la caquexia tumoral desempeña una función importante en el tratamiento del tumor y la mejora de la calidad de vida de los pacientes.
Con el desarrollo de una gran cantidad de investigaciones, ha sido posible una comprensión adicional en profundidad del desarrollo de la patogénesis de la caquexia tumoral. La característica patológica de la caquexia tumoral es que la proteína y la energía están en un equilibrio negativo que está provocado por una absorción en sangre recudida y factores integrados de un metabolismo anormal. Aunque se ha conseguido un progreso considerable con muchos estudios preclínicos en el modelo de animales que tienen caquexia tumoral en la actualidad, no hay todavía fármacos que se hayan sido aprobados para la prevención y el tratamiento de caquexia tumoral en el sector clínico. Clínicamente, la aparición de la caquexia tumoral es retrasada principalmente a través del aporte nutritivo y el ejercicio físico.
Por tanto, es urgente conocer a fondo la patogénesis de la caquexia tumoral. Se lleva a cabo una intervención dirigida a diana en la fase temprana de la caquexia tumoral con el fin de conseguir un mejor efecto terapéutico.
La célula madre mesenquimatosa (MSC) es una célula madre no hematopoyética (Friedenstein, A.J., et al, 1974) que se encuentra en la médula ósea de forma muy temprana, que participa en la formación del microentorno hematopoyético de la médula ósea y tiene un efecto de apoyo evidente sobre la proliferación y diferenciación de células madre hematopoyéticas. La MSC está ampliamente distribuida en diversos tejidos y órganos en todo el cuerpo. Además de la médula ósea, existen también en las encías, músculos esqueléticos, grasas y otros tejidos para participar en la reparación del deterioro y el mantenimiento de la homeostasis de los tejidos. La MSC carece de marcadores específicos, que expresan principalmente marcadores mesenquimatosas, marcadores mesenquimatosos como CD29, CD44, CD73, CD90, CD105 y CD166, en lugar de los marcadores relacionados con la hematopoyesis como CD11b, CD14, CD19, CD34 y CD45.
La Nestina es una proteína de seda intermedia. En la fase del desarrollo embrionario, la Nestina es expresada en primer lugar en células madre epiteliales neuronales que tienen capacidad potencial de diferenciación multidireccional. Sin embargo, en tejidos adultos, la proteína de seda intermedia Nestina solo es expresada en la población de células madre/progenitoras adultas que no está completamente diferenciada y mantiene una cierta capacidad proliferativa. Por lo tanto, esta célula Nestina+ es un componente importante de una colección de células madre adultas y desempeña una función importante en el mantenimiento de la homeostasis de células madre de un cuerpo. Recientemente, Mendez Ferrer et al. confirmaron en primer lugar que un grupo de células Nestina+ están presentes en la médula ósea usando ratones transgénicos de Nestina-GPF y pueden ser clonados y desarrollados in vitro y tener las características de una diferenciación osteogénica, lipogénica y condrogénica, sugiriendo que la proteína de seda intermedia Nestina es un marcador importante de la célula madre mesenquimatosa (MSC) de la médula ósea. En la fase temprana de la presente aplicación, la investigación del inventor usando los ratones transgénicos de Nestina-GFP muestra que las células positivas AGFP aisladas a partir de testículos, riñón, corazón y otros tejidos, tienen la capacidad potencial de autorrenovación y diferenciación multidireccional y tienen la capacidad de rearar los tejidos deteriorados. Estos resultados indican que las MSC de Nestina+ desempeñan una función importante en el mantenimiento de la homeostasis de tejidos.
En resumen, las células madre adultas tienen las funciones de autorrenovación, restitución o reparación de tejidos deteriorados que acompañan a las vidas de los diferentes órganos. Como un miembro de las células madre adultas, las MSC son un componente importante para el mantenimiento de la homeostasis de los interiores de los tejidos corporales. En el procedimiento del desarrollo tumoral, el tumor tiene la capacidad de reclutar Nestina+ de MSC para
entrar en el microentorno tumoral. Después de que es reclutada la Nestina+ de MSC por los tumores, se destruye la homeostasis, que provoca la disfunción de los tejidos de los órganos y se convierte en un factor importante para inducir la caquexia tumoral.
Las MSC expresan múltiples receptores de moléculas de quimocinas y de adhesión. En presencia de ligandos, las MSC pueden mediar para desplazarse hacia las partes de las heridas o inflamaciones. Está descrito muchas veces que las MSC son reclutadas para entrar en el microentorno tumoral en el transcurso del desarrollo del tumor. En 2011, Michael Quante y sus colaboradores encontraron que en el modelo de ratón con cáncer gástrico crónico inducido por Helicobacter pylori, el tejido enfermado reclutaba células Nestina+ de la médula ósea; en 2014, Diana Klein y sus colaboradores encontraron que los tumores B16F10 y LLC reclutaban células Nestina+ de tejidos, excepto de médula ósea, para participar en la formación de vasos sanguíneos. Estos resultados sugieren que los tumores tienen la capacidad de reclutar MSC del cuerpo con Nestina como marcador. Sin embargo, el mecanismo de reclutar MSC por los tumores no ha sido estudiado de forma completa y clara.
El AMD3100 tiene el nombre químico 1,1’-[1,4-fenileno-bis(metileno)]-di-1,4,8,11-tetraazaciclotetradecano. Su fórmula estructural es como sigue:
El AMD3100 fue sintetizado por primera vez en 1994 y su capacidad potencial terapéutica se conoce que incluye la infección por HIV, enfermedades inflamatorias, movilización de células madre, leucemia y tumores sólidos. Hasta ahora, no ha habido informes sobre el AMD3100 en la prevención y el tratamiento de caquexia.
D. UCHIDA ET AL: Molecular Cancer Research, Vol.5(7), 2007, páginas 685-694, describen que el tratamiento con AMD3100 mejoraba significativamente la pérdida de peso corporal de ratones que portan tumores.
Sumario
A través de una investigación a largo plazo del inventor de la descripción, el compuesto 1,1'-[1,4-fenilenobis(metileno)]-di-1,4,8,11-tetraazaciclotetradecano, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, puede tratar y/o prevenir eficazmente la caquexia, especialmente proporciona un nuevo planteamiento para el tratamiento de la caquexia tumoral, que es beneficioso para posponer o aliviar los síntomas de caquexia de pacientes de tumores, mejorando el efecto del tratamiento de tumores y mejorando la calidad de vida y prolongando las expectativas de supervivencia.
La invención proporciona el compuesto 1,1’-[1,4-fenileno-bis(metileno)]-di-1,4,8,11-tetraazaciclotetradecano o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para ser usado en un método para aliviar y/o mejorar la pérdida de grasa debida a caquexia.
Otro aspecto de la invención proporciona una composición farmacéutica para ser usada en un método para aliviar y/o mejorar la pérdida de grasa provocada por caquexia, comprendiendo la composición farmacéutica el compuesto 1,1’-[1,4-fenileno-bis(metileno)]-di-1,4,8,11-tetraazaciclotetradecano o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Preferentemente, la composición farmacéutica contiene también al menos uno de otros fármacos. El fármaco o composición farmacéutica de la descripción pueden ser usados en el tratamiento y/o la prevención de caquexia en animales (por ejemplo, seres humanos, ratones, ratas, conejos, perros, gatos, vacas, caballos, cerdos y monos). El objeto de la descripción se puede referir a cualesquiera animales, incluidos, pero sin limitación, seres humanos, ratones, ratas, conejos, perros, gatos, vacas, caballos, cerdos y monos y otros mamíferos. El método de la descripción es análogamente aplicable a una combinación con una cierta dosificación eficaz de otros fármacos o composiciones farmacéuticas, para actuar de forma sinérgica en el tratamiento y/o la prevención de caquexia.
El fármaco o composición farmacéutica de la descripción pueden ser aplicados a través de cualesquiera vías fisiológicamente aceptables, como una administración oral o una inyección. En las realizaciones proporcionadas por
la descripción, la dosificación de AMD3100 es una inyección.
Cuando se usa en el tratamiento y la prevención que anteceden o en otros tratamientos y/o prevenciones, la cantidad diaria total del compuesto y la composición de la descripción debe ser decidida por el facultativo encargado, dentro de una gama de criterios médicos fiables. Para cualesquiera pacientes específicos, el nivel de dosis eficaz terapéutica específica debe ser determinado dependiendo de múltiples factores, que incluyen el obstáculo tratado y la gravedad del obstáculo; la actividad del compuesto específico usado; la composición específica usada; la edad, peso, estado general de salud, sexo y dieta del paciente; el tiempo de administración, la vía de administración y el ritmo de excreción del compuesto específico usado; la duración del tratamiento; los fármacos usados en combinación o de forma simultánea con los compuestos específicos usados y factores similares, conocidos en el campo médico. Por ejemplo, la práctica de la técnica es que la dosificación del compuesto comienza desde un valor inferior al nivel requerido para obtener el efecto terapéutico necesario y la dosificación se aumenta gradualmente hasta que se obtiene el efecto necesario.
El fármaco o composición farmacéutica de la descripción pueden ser preparados como formas de dosificación farmacéuticamente aceptables, en general, los ingredientes eficaces del fármaco suponen un 1-95% del peso total del fármaco terapéutico administrado. La forma de dosificación del fármaco es necesario que sea aplicables a diferentes vías de administración como preparaciones orales (como comprimidos, cápsulas, soluciones o suspensiones); preparaciones inyectables (como soluciones o suspensiones inyectable, o polvo seco inyectable u otros medios inyectables esterilizados antes de ser usados). Estas preparaciones pueden ser obtenidas adoptando el procedimiento habitual.
El fármaco o composición farmacéutica de la descripción puede contener también excipientes o vehículos farmacéuticamente permisibles. Los excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables pueden ser seleccionados en la medida necesaria. Estos excipientes o vehículos son bien conocidos, incluyendo: adhesivos usados para preparaciones orales (como almidón, gelatina, metilcelulosa, carboximetilcelulosa de sodio y/o polivinilpirrolidona) diluyentes (como lactosa, dextrosa, sacarosa, manitol, sorbitol, celulosa y/o glicerina), lubricantes (como sílice, talco, ácido esteárico o sus sales, habitualmente estearato de magnesio o estearato de calcio y/o polietilenglicol) y si es necesario, contiene también agentes disgregantes como almidón, agar, ácido algínico o sus sales, habitualmente alginato de sodio y/o una mezcla efervescente, codisolventes, estabilizadores, agentes suspensores, pigmentos incoloros y agentes para dar sabor, conservantes, disolventes, estabilizadores y similares, usados para preparaciones inyectables; matrices, diluyentes, lubricantes, conservantes y similares, usados para preparaciones locales.
“Farmacéuticamente permisible” significa que el adyuvante o vehículo es compatible con los ingredientes activos, de forma óptima, puede estabilizar los ingredientes activos y es inocuo para el individuo tratado.
La caquexia de la descripción incluye enfermedades crónicas como tumores malignos, tuberculosis, diabetes, enfermedades sanguíneas, enfermedades endocrinas, enfermedades infecciosas, síndrome de inmunodeficiencia adquirido y similares y síndromes sistémicos con pérdida de peso significativa, anorexia y similares como síntomas principales. Por ejemplo, caquexia de cáncer, caquexia de tuberculosis, caquexia de diabetes, caquexia de enfermedad sanguínea, caquexia de enfermedad endocrina, caquexia infecciosa y caquexia provocada por síndrome de inmunodeficiencia adquirida.
Preferentemente, la caquexia es una caquexia de tumor (a saber, caquexia provocada por tumores).
Preferentemente, el tratamiento y/o la prevención de la caquexia comprende aliviar o mejorar los síntomas de la caquexia de tumor.
Según la invención, el tratamiento y/o la prevención de la caquexia comprende el alivio o mejora de los síntomas de caquexia o pérdida de grasa.
El tratamiento y/o la prevención de la caquexia usada en la presente invención comprende el alivio o la mejora del síntoma de caquexia de un paciente, a saber, pérdida de grasa.
La expresión “sal farmacéuticamente aceptable” usada en la presente memoria descriptiva se refiere a algunas sales que pueden mantener su actividad biológica original y son adecuadas para un uso médico. El compuesto 1,1'-[1,4-fenileno-bis(metileno)]-di-1,4,8,11-tetraazaciclotetradecano puede producir muchas sales diferentes con ácidos inorgánicos y orgánicos diferentes. Los ácidos para preparar las sales puede ser ácidos para generar sales por adición de ácidos no tóxicas incluyen, pero sin limitación, citrato, maleato, hidrocloruro, hidrobromato, hidroyodato, nitrato, sulfato, bisulfato, fosfato, acetato, lactato, salicilato, citrato, succinato, maleato, gentianato, fumarato, formiato, benzoato, metanosulfonato, etanosulfonato y bencenosulfonato. Preferentemente, la sal se selecciona entre hidrobromato e hidrocloruro.
El término “tratamiento”, usado en la presente memoria descriptiva, se refiere al alivio o la mejora de enfermedades, a saber, retrasar o inhibir el desarrollo de las enfermedades o, al menos, un síntoma clínico. El término “prevención”
usado en la presente memoria descriptiva, se refiere a la administración del compuesto de la descripción a un sujeto antes de la aparición de los síntomas de la enfermedad.
Como se usan en la presente memoria descriptiva, los objetos “necesitan” este tratamiento si se benefician del tratamiento por vía biológica, médica o cualitativa.
El inventor de la presente solicitud propone que la deficiencia de células madre mesenquimatosas del cuerpo es la razón por la que se produce la caquexia de tumores. Después de una investigación a largo plazo se encontró que el compuesto 1,1'-[1,4-fenileno-bis(metileno)]-di-1,4,8,11-tetraazaciclotetradecano o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo puede tratar y/o prevenir eficazmente la caquexia y proporciona un nuevo planteamiento para el tratamiento de la caquexia. Bloquean principalmente el reclutamiento de tumores en células madre mesenquimatosas de múltiples tejidos sistémicos, conduciendo así al mantenimiento de la homeosatasis del cuerpo, retrasando la aparición de caquexia y reduciendo o aliviando los síntomas de la caquexia, mejorando el efecto terapéutico y mejorando la calidad de vida y prolongando las expectativas de supervivencia de los pacientes.
Breve descripción de los dibujos
Las Figs. A-D en la Fig. 1 son, respectivamente, ratones en el grupo de caquexia C57 BL/6 después de un trasplante subcutáneo de células tumorales LLC y el grupo testigo: (A) detección de alimentación de los ratones; (B) comprobación del peso de los ratones; (C) y (D) detección del peso de los tejidos de grasa y tejidos de músculos, respectivamente.
Las Figs. A-D en la Fig. 2 son un grupo testigo y un grupo de caquexia de ratones transgénicos de Nestina-GFP, respectivamente: (A) y (B) son una tinción por inmunofluorescencia de secciones de tejidos de grasa de ratones y estadísticas de células Nestina-GFP+ en las secciones; (C) es la detección PCR cuantitativa de fluorescencia sobre la expresión Nestina en tejidos de grasa; (D) y (E) son la tinción por inmunofluorescencia de secciones de tejidos de músculos de ratones y estadísticas de células Nestina-GFP+ en las secciones, respectivamente; (F) es la detección PCR cuantitativa de la fluorescencia sobre la expresión de Nestina en tejidos de músculos.
La Fig. 3 muestra que después del trasplante subcutáneo de células tumorales LLC en ratones transgénicos de Nestina-GFP: (A) es la tinción por inmunofluorescencia de secciones de tejidos tumorales de ratones y estadísticas de células Nestina-GFP+ en las secciones; (B) es la detección PCR cuantitativa de fluorescencia de expresión de GFP en tejidos tumorales; (C) y (D) son la detección por citometría de flujo de células Nestina-GFP+ en sangre periférica.
La Fig. 4 muestra el resultado de detección PCR cuantitativa de la expresión quimocinas tumorales.
La Fig. 5 muestra los resultados de la detección del receptor de quimocina de expresión de células positivas Nestina en tejidos de músculos y grasa de ratones.
La Fig. 6 muestra resultados experimentales del favorecimiento del desplazamiento de células Nestina+ de ratón por Cxcl 12.
La Fig. 7 muestra los resultados experimentales de la inhibición in vivo del desplazamiento de células Nestina+ por ADM3100.
La Fig. 8 muestra la comprobación de los resultados de síntomas de discrasia tumoral después de que se use ADM3100 in vivo.
La FIG. 9 muestra los resultados experimentales del tiempo de vida de ratones que portan tumores después de que se use ADM3100 in vivo.
Descripción de las realizaciones
La solución técnica de la descripción se describirá adicionalmente en combinación con los dibujos que se acompañan con posterioridad.
El AMD3100 fue adquirido de la entidad American American Apex Bio Company, y su número de artículo es A2025. Salvo que se indique otra cosa, todos los reactivos usados en los ejemplos son reactivos convencionales existentes en la técnica y pueden ser adquiridos en el comercio. Todas las operaciones experimentales que no están especialmente ilustradas en los ejemplos son operaciones convencionales en la técnica o pueden ser comprendidas o conocidas por los expertos en la técnica, según las técnicas existentes concebidas o los conocimientos bien sabidos.
Ejemplo 1. Cultivo de LLC de cáncer pulmonar de Lewis y cultivo de células Nestina+ de ratón
1.1 Cultivo de células LLC: Se cultivaron células LLC (ATCC #CRL-1642) usando un medio de cultivo básico DMEM (que contenía 10% de suero bovino fetal) para un uso posterior.
1.2 Aislamiento de células Nestina+ de músculo de ratón
Se tomaron los ratones machos transgénicos de Nestina-GFP adultos (del Dr. Masahiro Yamaguchi, también disponibles en el comercio) y se cortaron completamente los músculos gastrocnemios en ambos lados bajo condiciones esterilizadas y se colocaron rápidamente en un plato de cultivo que contenía PBS. Los bloques de músculo se aclararon tres veces con PBS y seguidamente se cortaron en forma de tejidos de músculos pequeños y los vasos sanguíneos, nervios y tejidos conectivos se retiraron tanto como fue posible. Las células de los músculos se digirieron y se aislaron usando colagenasa de tipo I: los tejidos de los músculos fueron transferidos a un tubo de centrifugadora, se les añadió colagenasa de tipo I y se digirieron durante 30 min en un recinto de baño de agua de oscilación a temperatura constante de 37° C. Se añadió suero para detener la digestión, la solución de la digestión se centrifugó a 1100 rpm durante 4 minutos, la materia sobrenadante se succionó y el precipitado se volvió a poner en suspensión en PBS y se filtró a través de un tamiz de filtración de malla 200. El filtrado se recogió y se centrifugó durante 4 min, la materia sobrenadante se retiró y el precipitado se volvió a poner en suspensión en PBS. Se clasificaron las células Nestina+ mediante citometría de flujo.
1.3 Aislamiento de células Nestina de grasa de ratón
Se seleccionaron ratones transgénicos de Nestina-GFP de aproximadamente 6 semanas de edad. Los tejidos de grasa en las ingles de los ratones se aislaron bajo condiciones esterilizadas. Después de lavar con PBS (Al menos 6 veces), los tejidos de grasa se cortaron suficientemente en trozos con tijeras. Se añadieron 10 ml de 0,1% de colagenasa IV 0,05% de pancreatina 0,1% de Dispasa II y se agitó durante 60 min a 37° C. Seguidamente se añadió el medio de cultivo a-MEM que contenía 10% de FBS para terminar la digestión. La solución digerida se filtró con tamices de maya 100 y maya 200, se centrifugó durante 5 min a 800 g, la materia sobrenadante se desechó, se añadió el medio de cultivo y se preparó la suspensión celular batiendo suavemente y mezclando de forma uniforme; las células Nestina+ se clasificaron mediante citometría de flujo.
1.4 Cultivo de células de músculo de ratón y Nestina+ derivadas de grasa
Las células Nestina+ obtenidas de tejidos de músculos y grasa en los apartados 1.2 y 1.3 fueron sometidos a un cultivo adherente en medio de cultivo de DMEM/ bajo en azúcares (10% de suero bovino fetal).
Ejemplo 2. Alimentación de ratones y construcción de modelo de caquexia tumoral
2.1 Método de alimentación de los ratones: los ratones fueron alimentados con pienso para ratones convencional (el contenido de proteínas era de 20~25% p, el contenido de grasa era de 5% ~ 10% p y el contenido de fibras en bruto era de 3-5% p).
2.2 Construcción de caquexia de tumor de ratón. Se tomaron ratones C57 BL/6 machos de 8 semanas de edad (adquiridos de la entidad Nanjing University Institute of Model Animals) o ratones transgénicos de Nestina-GFP que tenían no más de 2 g de peso y se dividieron al azar en un grupo testigo y un grupo de caquexia. Se inyectaron por vía subcutánea aproximadamente 4 x 106 células LLC de cáncer de pulmón de Lewis en la ingle de cada ratón en el grupo de caquexia. El procedimiento experimental se llevó a cabo en una plataforma ultralimpia. Se prestó atención a la operación aséptica. El día de inoculación fue el día 0 y el día siguiente el día 1, día 2, etc., de forma secuencial. En el día 7 de la inoculación del tumor se detectó que el peso de los ratones que portaban tumores comenzó a disminuir y había comenzado a producirse la caquexia tumoral; en el día 21 los pesos de los ratones estaban significativamente disminuidos y los indicios de caquexia eran evidentes.
Ejemplo 3: Evaluación de caquexia de tumor en ratones
En el ejemplo 2, después de que los ratones en el grupo de caquexia fueron inoculados con tumor, se observaron el color del cabello, la actividad, peso ingesta de alimentos y tamaño de tumores de los ratones a la misma hora cada día y se compararon con los del grupo testigo. Después de la inoculación de tumor, los ratones fueron sacrificados usando una anestesia excesiva cada 2 días hasta el día 21, o en el día 7, día 14 y día 21. Se retiraron los tejidos tumorales y se pesaron los pesos de todos los animales sin tumores. Se aislaron y se pesaron, respectivamente, cuádriceps femorales (QUAD), gastrocnemios (GAST), tibialis anterior (TA), tejido de grasa de epidídimos (eWAT), tejido de grasa inguinal (iWAT), tejidos de grasa marrón entre dorsal y escapular (iBAT).
En la Fig. 1, la Fig. A muestra los resultados de ensayos de comidas diarias de ratones C57 BL/6 en el grupo testigo y el grupo de caquexia, la Fig. B muestra los resultados de comprobación del peso del grupo testigo y el grupo de caquexia y la Fig. C y la Fig. D muestran la detección de pesos de tejidos grasos y tejidos de músculos, respectivamente. Se puede observar a partir de la Fig. 1 que, después del trasplante subcutáneo de células de tumor LLC en ratones C57 BL/6 se produjo una discrasia tumoral.
Ejemplo 4: Detección de células Nestina-GFP+ en músculos esqueléticos, tejidos de grasa y tumores de ratones 4.1 Tinción por inmunofluorescencia
Se aislaron, respectivamente, cuádriceps femorales (QQAD), gastrocnemios (GAST) y músculo anterior tibial (A) a partir de ratones transgénicos de Nestina-GFP en el grupo testigo y en el grupo de caquexia, se inmovilizaron durante 8 h con 4% de PFA, se deshidrataron durante 48 h con sacarosa al 30% (peso) y se congelaron y se cortaron en rodajas. Después de que la membrana de sustrato fue etiquetada con anticuerpo de laminina, se incubó el segundo anticuerpo fluorescente, el núcleo de la célula se volvió a teñir durante 5 min con 1 mg/ ml de DAPI al 0,2% y los tejidos se lavaron dos veces con PBS 0,01 M y se observaron bajo el microscopio.
Los tejidos de grasa de epidídimos (eWAT), tejidos de grasa inguinal (iWAT) y tejidos de grasa marrón interescapular (iBAT) se aislaron, respectivamente a partir de ratones C57 BL/6 en el grupo testigo y el grupo de caquexia se inmovilizaron durante 8 h con 4% de PFA, experimentaron una deshidratación gradiente con alcohol y se cortaron en rodajas con parafina sucesivamente. Después de un desparafinado gradiente con xileno y alcohol, los tejidos cortados en rodajas con anterioridad fueron sometidos a una tinción con anticuerpos con Nestina mediante la referencia al anterior método de tinción de músculos esqueléticos y se observaron bajo en microscopio.
El tratamiento de tejidos tumorales de ratones transgénicos de Nestina-GFP en grupo de caquexia fue igual al de los tejidos de músculos. Después de ser congeladas y cortadas en rodajas, los núcleos de las células fueron nuevamente teñidos con 1 g/ml de DAPI al 0,2% durante 5 min y los tejidos tumorales se lavaron con dos veces con PBS 0,01 M y se observaron bajo el microscopio.
La Fig. A en la Fig. 2 muestra los resultados de observación de la tinción por inmunofluorescencia de secciones de tejidos de músculo de ratones del grupo de discrasia de ratones transgénicos de Nestina-GFP en el día 7, día 14 y día 21 después del trasplante subcutáneo de células tumorales LLC y grupo testigo. La Fig. B en la Fig. 2 muestra los resultados estadísticos de células Nestina-GFP+ en secciones de tejidos de ratones del grupo de caquexia de ratones transgénicos de Nestina-GFP en el día 7, día 14 y día 21, después de un trasplante subcutáneo de células tumorales LLC y el grupo testigo.
La Fig. D en la Fig. 2 muestra los resultados de la observación de la tinción por inmunofluorescencia de secciones de músculos de ratones del grupo de caquexia de ratones transgénicos de Nestina GFP en el día 7, día 14 y día 21 después del trasplante subcutáneo de células tumorales LLC y el grupo testigo cultivado durante 21 días.; la Fig. E en la Fig. 2 muestra los resultados estadísticos de células Nestina-GFP en secciones de tejidos de músculos de ratones del grupo de caquexia de ratones transgénicos de Nestina GFP en el día 7, día 14 y día 21 después del trasplante subcutáneo de células tumorales LLC y el grupo testigo cultivado durante 21 días.
La Fig. A en la Fig. 3 muestra los resultados de observación de tinción por inmunofluorescencia de secciones de tejidos tumorales del grupo de caquexia de ratones transgénicos de Nestina-GFP en el día 7, día 14 y día 21 después del trasplante subcutáneo de células tumorales LLC; la Fig. C y la Fig. D en la Fig. 3 son gráficos de resultados de células Nestina-GFP+ en sangre periférica de ratón en el grupo testigo y el grupo de caquexia detectados mediante citometría de flujo.
4.2 PCR cuantitativa de fluorescencia
Las etapas específicas de analizar la expresión génica de Nestina usando PCR cuantitativa son como sigue: Se tomaron los músculos QQAD, GAST, tA y las grasas, (de modelo de caquexia tumoral eWAT, iWAT, iBAT) de ratones de cada grupo experimental en el ejemplo 2 y los tejidos tumorales de ratones del grupo de caquexia. Después de que los tejidos fueran triturados en nitrógeno líquido, se extrajo el RNA total mediante el método de Trizol. Se llevó a cabo una transcripción inversa sobre RNA para obtener cDNA de cadena única y se llevó a cabo una PCR cuantitativa de fluorescencia, usando el sistema de LC480 de la empresa Roche, para detectar la expresión génica de Nestina o GFP. Los cebadores de Nestina usados fueron 5'-GGCTACATACAGGATTCTGCTGG-3' (F) y 5'-CAGGAAAGCCAAGAGAAGCCT-3' (R), y los cebadores de GFP usados fueron 5'-GGA GCT GCA CAC AAC CCA TTGCC-3' (F) y 5'-GAT CAC TCT CGG CAT GGA CGAGC-3 '(F). Los resultados de detección aparecen en las Figs. C y F de la Fig. 2. En las mismas, la Fig. C en la Fig. 2 muestra la expresión de Nestina en tejidos de grasa en los tejidos de grasa detectados mediante PCR cuantitativa de fluorescencia, después del trasplante subcutáneo de células tumorales LLC en los ratones transgénicos de Nestina-GFP; la Fig. F en la Fig. 2 es la expresión de Nestina en tejidos de músculos detectados mediante PCR cuantitativa de fluorescencia después de que se llevara a cabo el trasplante subcutáneo de células tumorales LLC en ratones transgénicos de Nestina-GFP.
La Fig. B en la Fig. 3 es la expresión de GFP en tejidos tumorales en tejidos detectados mediante PCR cuantitativa de fluorescencia después del trasplante subcutáneo de células tumorales después de que se llevara a cabo el trasplante subcutáneo de células tumorales LLC en ratones transgénicos de Nestina-GFP.
Se puede observar a partir de los resultados de detección del ejemplo 4, que después de que se llevara a cabo el
trasplante subcutáneo de células tumorales LLC en ratones transgénicos de Nestina-GFP, las células Nestina-GFP en los músculos esqueléticos y los tejidos de grasa resultaron continuamente disminuidos y las células Nestina-GFP+ en el tumor resultaron continuamente aumentadas.
Ejemplo 5. Detección de la expresión de quimiocina tumoral y detección de la expresión de receptores de quimiocina MSC de ratón.
5.1 Detección de la expresión de quimiocinas tumorales mediante PCR cuantitativa de fluorescencia
El cDNA de cadena única pudo ser obtenido mediante el método de tratamiento de tejidos tumorales mencionado en el apartado 4.2 y seguidamente se llevó a cabo una PCR cuantitativa de fluorescencia para la expresión de cada gen de quimiocina usando el sistema LC480 de Roche.
Los diversos cebadores usados en las PCR cuantitativas de fluorescencia son como sigue:
(1) cebadores de Ccl2 de ratón:
5'-TGTCATGCTTCTGGGCCTGCT-3' (F) y 5'-TTCACTGTCACACTGGTCACT-3' (R);
(2) cebadores de Ccl3 de ratón:
5'-GGTCTCCACACTGCCCTT-3' (F) y 5'-TCAGGCATTCAGTTCCAGGTC-3' (R);
(3) cebadores de Ccl5:
5'-ATATGGCTCGGACACCACTC-3' (F) y 5'-TCCTTCGAGTGACAAACACG-3' (R);
(4) cebadores de Ccl7:
5'-GTGTCCCTGGGAAGCTGTTA-3' (F) y 5'-CTTTGGAGTTGGGGTTTTCA-3' (R);
(5) cebadores de Ccl8:
5'-CGCAGTGCTTCTTTGCCTG-3' (F) y 5'-TCTGGCCCAGTCAGCTTCTC-3' (R);
(6) cebadores de Cxcl1:
5'-GCTGGGATTCACCTCAAGAA-3' (F) y 5'-AAGGGAGCTTCAGGGTCAAG-3' (R);
(7) cebadores de Cxcl2:
5'-GCCAAGGGTTGACTTCAAGA-3' (F) y 5'-TTCAGGGTCAAGGCAAACTT-3' (R);
(8) cebadores de Cxcl3:
5'-TTCTAAATCAGAGAAAAGCGAT-3' (F) y 5'-TAGATGCAATTATACCCGTAG-3' (R);
(9) cebadores de Cxcl11:
5'-TGTAATTTACCCGAGTAACGGC-3' (F) y 5'-CACCTTTGTCGTTTATGAGCCTT-3' (R);
(10) cebadores de Cxcl12:
5'-TGCATCAGTGACGGTAAACCA-3' (F) y 5'-TTCTTCAGCCGTGCAACAATC-3' (R);
(11) cebadores de HGF:
5'-TCTTGCCAGAAAGATATCCC-3' (F) y 5'-TTTTAATTGCACAATACTCCC-3' (R).
Los resultados de las PCR cuantitativas de fluorescencia se muestran en la Fig. 4. Se puede observar a partir de la Fig. 4 que la quimiocina Cxcl12 es altamente expresada en el tumor de ratón.
5.2 Detección de la expresión de receptor Cxcr4 de quimiocina MSC de ratón
Las células derivadas de grasa y músculo de ratón se inmovilizaron durante 15 min con 4% de PFA, seguidamente se penetraron durante 15 min con 0,2% de tritón y seguidamente se sellaron durante 30 min con 1% de BSA. El
anticuerpo de Nestina (fuente de ratón diluido a 1:100 y el anticuerpo Cxcr4 (fuente de conejo) diluido a 1:100 se incubaron a 4° C durante 14 h. Los anticuerpos se lavaron durante 10 min con PBS tres veces y seguidamente el segundo anticuerpo fluorescente de ratón verde (1:500) y el segundo anticuerpo fluorescente de ratón rojo (1:500) se incubaron a 37° C durante 30 min. Los anticuerpos se lavaron 10 min con PBS tres veces, los núcleos se volvieron a teñir con 1 mg/ml de DAPI al 0,2% durante 5 min y los anticuerpos se lavaron dos veces con PBS 0,01 M y se observaron bajo el microscopio. Se pudo observar que las células Nestina+, aisladas a partir de tejidos de músculo y grasa de los ratones, expresan Cxcr4.
Ejemplo 6: Experimento para favorecer el desplazamiento de células Nestina+ de ratón por Cxcl12
Se colocó la cámara Corning Transwell (tamaño de poros de 8 pm) en una placa de 24 pocillos y se inocularon células Nestina+ derivadas de músculo y de grasa (véase el ejemplo 1) cultivadas in vitro en la cámara Transwell con 2 x 104 células/pocillo y se cultivaron en un incubador de 5% de CO2 y a 37° C. A cada pocillo se añadieron 500 pl de azúcar de DMEM/bajo en azúcar bajo la cámara Transwel. El grupo experimental contenía 1 pmol/ml de factores Cxcl12, mientras que los factores Cxcl12 no fueron añadidos al grupo testigo. Después de 24 horas, se extrajo la cámara, las células en el interior de la cámara se limpiaron con un paño de algodón y la cámara se lavó suavemente y se inmovilizó y se aclaró dos veces con alcohol anhidro; las cámaras en los diversos grupos se marcaron y se dispusieron sobre la placa de pocillos abandonada y se añadió sobre solución de colorante violeta cristal a cada pocillo para incubar a temperatura ambiente durante 15 min; el exceso de solución de tinción se retiró por lavado. La cantidad de células desplazadas en cada grupo se midió bajo un microscopio invertido. Se seleccionaron al azar cinco campos (400 veces) para calcular la cantidad de células desplazadas en cada grupo bajo el microscopio con 3 pocillos repetidos en cada grupo. Se calculó el valor medio de los resultados. Los resultados se muestran en la Fig. 6. Se puede observar a partir de la Fig. 6 que el Cxcl12 puede desfavorecer el desplazamiento de células Nestina+ de ratón.
Ejemplo 7. Experimento para la inhibición in vivo del desplazamiento de células Nestina+ por medio de AMD3100 Se tomaron ratones machos C57 BL/6 de 8 semanas de edad de no más de 2 g de peso y se dividieron en un grupo testigo, un grupo de caquexia (LLC) y un grupo de AMD3100 (LLC AMD3100). Grupo testigo: sin tratamiento. Grupo de caquexia: se trasplantaron 4 x 106 LLC por vía subcutánea en la ingle de los ratones. Después de siete días los ratones fueron anestesiados con 100 pl de hidrato cloran al 10% y se implantaron bombas de liberación lenta Alzet (modelo 1004) por vía subcutánea en el dorso de los ratones. La solución salina normal estaba contenida en la bomba.
Grupo de AMD3100: se trasplantaron 4 x 106 LLC por vía subcutánea en la ingle de los ratones. Después de 7 días, los ratones fueron anestesiados con 100 pl de hidrato cloral al 10% y se implantó una bomba de liberación lenta Alzet (modelo: 1004) por vía subcutánea en el dorso y el AMD3100 estaba contenido en la bomba. La cantidad usada de AMD3100 en los ratones fue de 0,15 mg/kg de peso/día. Después de 14 días de instalación de la bomba de liberación lenta, los ratones fueron sacrificados y se tomaron secciones de tejidos de musculo y grasa para una tinción por inmunofluorescencia o transcripción inversa de RNA para llevar a cabo una PCR cuantitativa de fluorescencia extrayendo RNA de transcripción inversa para detectar la expresión de Nestina.
Los resultados de tinción por inmunofluorescencia se pueden observar en la Fig. A y B de la Fig. 7. La Fig. A en la Fig. 7 muestra los resultados de observación de tinción por inmunofluorescencia de secciones de tejidos de grasa de ratón para el grupo de caquexia de ratones transgénicos de Nestina-GFP y el grupo de AMD3100, 21 días después del trasplante subcutáneo de células tumorales LLC y el grupo testigo cultivados durante 21 días; la Fig. B en la Fig. 7 muestra los resultados estadísticos de células Nestina de GFP+ en secciones de tejidos de grasa de ratones del grupo de caquexia de ratones transgénicos de Nestina-GFP y el grupo de AMD3100 después del trasplante subcutáneo de células tumorales LLC y el grupo testigo, cultivados durante 21 días. Fig. C y Fig. D en la Fig. 7. La Fig. C en la Fig. 7 muestra los resultados de observación de tinción por inmunofluorescencia sobre secciones de tejidos de grasa de ratón del grupo de caquexia de ratones transgénicos de Nestina-GFP y el grupo de AMD310021 días después de la administración subcutánea de células tumorales LLC y el grupo testigo cultivado durante 21 días; la Fig. D en la Fig. 7 muestra los resultados estadísticos de células Nestina-GFP+ en secciones de tejidos de grasa de ratones del grupo de caquexia de ratones transgénicos de Nestina-GFP y el grupo de AMD310021 días después del trasplante subcutáneo de células tumorales de LLC y el grupo testigo cultivado durante 21 días.
Se puede observar a partir de los resultados experimentales que las células Nestina-GFP+ en los tejidos de músculos esqueletales y de grasa de ratones que portan tumores aumentó después de que se usó in vivo AMD3100. Ejemplo 8. Ejemplo de prolongación del tiempo de vida de ratones que portan tumores por medio de AMD3100 Se tomaron ratones C57BL/6 de 8 semanas de edad de no más g de peso y se dividieron en un grupo testigo, un grupo de caquexia (LLC) y un grupo de AMD3100 (LLC+ AMD3100).
Grupo testigo: sin tratamiento.
El grupo de caquexia: 4x106 LLC fue trasplantado por vía subcutánea en la ingle de los ratones. Después de 7 días, los ratones fueron anestesiados con 100 pl de hidrato cloral al 10% y se implantaron por vía subcutánea bombas de liberación lenta Alzet (modelo: 1004) en los dorsos de los ratones. La solución salina normal estaba contenida en la bomba.
Grupo de AMD3100: se trasplantaron 4 x 106 por vía subcutánea en la ingle de los ratones. Después de 7 días, los ratones fueron anestesiados con 100 pl de hidrato cloral al 10% y la bomba de liberación lenta Alzet (modelo: 1004) se implantó por vía subcutánea en su dorso y el AMD3100 estaba contenido en la bomba. La cantidad usada de AMD3100 fue de 0,15 mg/kg de peso/día. El estado de los ratones se observó continuamente hasta 35 días después de que se inocularon las células tumorales.
Resultados de los experimentos que se observan en la Fig. 8 y la Fig. 9
En los cuales, la Fig. A en la Fig. 8 muestra los pesos de ratones en los pesos de los ratones diversos grupos experimentales y la Fig. B en la Fig. 8 muestra la atrofia de tejidos de grasa y músculos en diversos grupos experimentales. La Fig. C en la Fig. 8 muestra los pesos de grasas y músculos de ratones en diversos grupos experimentales. A partir de los resultados experimentales en la Fig. 8 se puede observar que, después del uso de AMD3100 in vivo, se aliviaron los síntomas de caquexia tumoral en ratones.
La Fig. 9 es un gráfico de comparación de los tiempos de vida de los ratones en cada grupo experimental. Se puede observar que el uso de AMD3100 in vivo puede prolongar los tiempos de vida de ratones que portan tumores.
A través de los experimentos que anteceden, se confirma que la aparición de caquexia tumoral está relacionada con las células madre mesenquimatosas y se evalúa el contenido de células madre mesenquimatosas de Nestina+ en los tejidos de músculos y grasa de los ratones con caquexia tumoral. Llevando a cabo un corte en rodajas y una tinción por inmunofluorescencia en los músculos y grasas de los ratones y haciendo un recuento de la cantidad de células Nestina+, se encontró que los ratones con caquexia tumoral tienen menos células Nestina+ que los ratones normales. Al mismo tiempo, la PCR cuantitativa de fluorescencia indica también que la expresión de Nestina en los músculos y grasas de los ratones con caquexia tumoral resultó disminuida.
Los resultados anteriores sugieren que la aparición de caquexia tumoral está acompañada por una disminución de células madre mesenquimatosas en los tejidos de músculos y grasas.
Después de trasladar el tumor a ratones usando ratones transgénicos de Nestina-GFP, el inventor de la presente solicitud encontró células Nestina-GFP+ en secciones tumorales. Además, con la aparición de la caquexia tumoral, disminuyó gradualmente la cantidad de células Nestina-GFP+. Los resultados anteriores sugieren que la disminución de células Nestina+ es debida al desplazamiento hacia el tumor, con la condición de que la disminución de células madre mesenquimatosas del organismo sea debida al desplazamiento hacia el tumor.
El inventor de la presente solicitud detectó, en primer lugar, la expresión elevada de Cxcl12 en el tumor mediante PCR cuantitativa de fluorescencia y encontró que las células Nestina+ aislada a partir de los tejidos de músculos y grasas de los ratones expresa Cxcr4 por medio de tinción por inmunofluorescencia. In vitro, usando Cxcl12, el inventor encontró que se podía favorecer el desplazamiento Transwel de células Nestina+ derivadas de músculos y grasas. En los ratones, se proporcionó AMD3100 a 0,15 mg/kg de peso corporal/día a ratones que portan tumores por medio de una bomba de liberación lenta Alzet, con el fin de inhibir satisfactoriamente el desplazamiento de células Nestina+ desde los músculos y grasas hacia el tumor, de forma que las células Nestina+ en los músculos y grasas se recuperan significativamente en comparación con el grupo de AMD3100. Los resultados anteriores confirman que el eje de quimiotaxis de Cxcl12-Cxcr4 media en el desplazamiento de células Nestina+ derivadas de músculos y grasas de ratón.
Calculando el valor de los pesos, de los músculos y grasas de los ratones, el inventor de la presente solicitud encontró que el síntoma de caquexia en ratones con AMD3100 es más bajo que para los ratones sin AMD3100 en los mismos días de cortar el tumor. Además, la observación del tiempo de vida de los ratones que portan tumores reveló que los ratones con AMD3100 tenían un tiempo de vida más prolongado que los ratones sin AMD3100.
Los resultados experimentales anteriores muestran que el AMD3100 tiene un efecto significativo sobre la prevención y el tratamiento de caquexia tumoral. El uso de AMD3100 para pacientes de tumores puede bloquear el reclutamiento de tumores en células madre mesenquimatosas de múltiples tejidos sistémicos como en músculos, grasas y medulas óseas, es beneficioso para mantener la homeostasis del tejido del organismo y retrasar la aparición de caquexia tumoral y conduce a una reducción de los síntomas de caquexia en pacientes de tumores, mejorando el efecto del tratamiento del tumor, mejorando la calidad de vida y prolongando las expectativas de supervivencia.
Claims (4)
1. Compuesto 1,1'-[1,4-fenileno-bis(metileno)]-di-1,4,8,11-tetraazaciclotetradecano o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para uso en un método para aliviar y/o mejorar la pérdida de grasas provocada por caquexia.
2. El compuesto para uso según la reivindicación 1, en el que la caquexia es caquexia tumoral.
3. Una composición farmacéutica para uso en un método para aliviar y/o mejorar la pérdida de grasas provocada por caquexia, comprendiendo la composición farmacéutica el compuesto 1,1'-[1,4-fenileno-bis(metileno)]-di-1,4,8,11-tetraazaciclotetradecano o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
4. La composición farmacéutica para uso en un método según la reivindicación 3, en la que la caquexia es caquexia tumoral.
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