BR112013004700B1 - uso de células precursoras de células-tronco mesenquimais (msc) cd271+ - Google Patents

Abstract

USO DE CÉLULAS PRECURSORAS DE CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS (MSC) CD271 Os métodos de isolamento de populações de células-tronco CD271 são importantes na prevenção ou tratamento de doenças cardiovasculares e reparação do tecido cardíaco. Os métodos são aplicáveis a células-tronco de diferentes fontes e podem ser usados para tratar ou prevenir doenças ou reparação de tecidos em outras partes do organismo.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA PARA PEDIDOS RELACIONADOS

[0001] Este pedido reivindica prioridade para o Pedido Provisória dos EUA No. 61/377,661, depositado em 27 de agosto de 2010, e todo o seu conteúdo está incorporado aqui por referência.

CAMPO DA INVENÇÃO

[0002] Configurações da invenção foram direcionadas para os métodos de tratamento de doenças cardiovasculares usando células precursoras mesenquimais derivadas da medula óssea.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0003] Insuficiência cardíaca é responsável por US$ 33,2 bilhões em custos diretos e indiretos para o sistema de saúde dos EUA (1, 2), e a maioria dos pacientes com esse diagnóstico fica com uma cicatriz no miocárdio quando sofre um infarto. A função ventricular esquerda é o determinante mais importante de sobrevivência e qualidade de vida em pacientes que sofreram um infarto do miocárdio (MI) (1, 3). O miocárdio tem um potencial regenerativo muito limitado após o infarto; uma importante busca da medicina hoje em dia é quanto à regeneração tecidual baseada em célula. Essa busca promete transformar o tratamento de diversas doenças crônicas. Na área da cardiomiopatia isquêmica crônica (uma disfunção que afeta mais de 4 milhões de norte-americanos), uma terapia baseada em células bem-sucedida terá um impacto enorme na morbidade e mortalidade do paciente, além de reduzir os encargos sociais dessa disfunção. Para progredir neste campo, houve tentativas significantes de atingir uma terapia celular bem-sucedida na última meia década, e estratégias implementando células derivadas da medula óssea foram testadas nos primeiros ensaios clínicos (4, 5). Esses ensaios fizeram muito para avançar o entendimento sobre métodos de liberação de células e para estabelecer perfis de segurança; no entanto, uma fonte celular ideal ainda precisa ser totalmente estabelecida.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0004] Este Sumário é fornecido para apresentar um sumário da invenção, indicando brevemente a natureza e substância da invenção. Ele é enviado com o entendimento de que não será usado para interpretar ou limitar o escopo ou significado dos requerimentos.

[0005] Configurações da invenção relacionam-se a composições, que compreendem precursoras derivadas da medula óssea de adultos de células-tronco mesenquimais. Essas células são administradas in vivo, como, por exemplo, o coração e a regeneração do miocárdio.

[0006] Em uma configuração preferida, um método para prevenir ou tratar doenças ou disfunções cardiovasculares, que compreende isolar células-tronco mesenquimais precursoras (MSCs) CD271+ da medula óssea de um sujeito; administrar para um paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz de células- tronco mesenquimais (MSC) precursoras CD271+ isoladas.

[0007] Em uma configuração, as MSCs CD271+ são isoladas das células da medula óssea, possuindo um receptor de crescimento dos nervos de baixa afinidade (NGFR; CD271). As células-tronco CD271+ são isoladas dos doadores (ou fontes), que compreendem: autólogo, isogênico, alogênico ou xenogênico. As células precursoras MSC diferenciam-se em pelo menos uma linhagem, que compreende: linhagens do miocárdio, vascular ou endotelial.

[0008] Em outra configuração, as células-tronco mesenquimais precursoras isoladas são cultivadas ex vivo e expandidas antes para administração para um paciente. Em uma configuração, as células-tronco não aderentes são expandidas e administradas para um paciente. Em outra configuração, as células-tronco mesenquimais precursoras são opcionalmente administradas para um paciente em concentrações variadas durante um período de tempo. Em uma configuração, as células- tronco mesenquimais precursoras são opcionalmente condicionadas com meio condicionado por células estromais derivadas do coração.

[0009] Em outra configuração, um ou mais agentes são administrados opcionalmente para o paciente, sendo que os agentes compreendem pelo menos um de: citocinas, fatores quimiotáticos, fatores de crescimento ou fatores de diferenciação.

[0010] Em uma configuração preferencial, uma célula-tronco de adulto compreende uma célula derivada precursora de células-tronco mesenquimais (MSC) da medula óssea tendo um fenótipo CD271+. Outros aspectos são descritos infra.

[0011] Outros aspectos são descritos infra.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0012] A Figura 1 mostra a morfologia das células CD271+. Citospinas foram preparadas e coradas com a solução Wright Giemsa.

[0013] A Figura 2A -2C mostra a formação MSC de células CD271+ (Figura 2A; 170.000 células por frasco T75 cm2); células BM MNC (Figura 2B; 15 milhões de células por frasco T75 cm2) e células C) CD271- (Figura 2C; 17 milhões de células por frasco T75 cm2).

[0014] A Figura 3 mostra uma colônia CFU-F típica no dia 10 da cultura.

[0015] A Figura 4 mostra a cultura de células CD271+ em sacos de Teflon para os dias 7, 14 e 21.

[0016] A Figura 5 mostra a análise de fluxo de células- tronco mesenquimais não aderentes (NA-MSC). A descoloração de controle de isótopos é mostrada na linha verde e CD105-FITC na área sombreada.

[0017] As Figuras 6A e 6B mostram a diferenciação osteogênica e de adipócitos de células CD271+ da medula óssea humana. A diferenciação osteogênica e de adipócitos foi executada conforme descrito nos métodos. A presença de diferenciação osteogênica foi mostrada pela expressão de fosfato de alcalina (AP) corada por FAST BCIP/NBT (Figure 6A; x/100) no dia 14. A diferenciação para adipócito foi mostrada pela descoloração de Oil Red O (Figura 6B; x/100) no dia 11. Um exemplo representativo dos três experimentos é mostrado.

[0018] A Figura 7 mostra a expressão de marcadores cardíacos em células CD 271+ cultivadas.

[0019] A Figura 8 mostra a comparação ecocardiográfica de grupos de tratamento.

[0020] As Figuras 9A-9D mostram a imunoistoquímica de seções do coração de ratos NOD/SCID injetados com células CD271+. As seções do coração foram coradas com sequência Alu e também com marcadores cardíacos (áSA, troponina I (TnI), Connexin 43 (Cx)(40X). Figura 9A: mostra uma parte da zona fronteiriça com células positivas incorporadas na parede vascular e também entre os miócitos do transplantado. Figura 9B: mostra uma zona remota voltada para a base do coração e também as células humanas injetadas. Figura 9C: mostra um vaso sanguíneo grande com células alu positivas em área remota. Figura 9D: mostra a zona fronteiriça de outro coração com diversas células positivas.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0021] As células-tronco demonstram potencial para muitas áreas diferentes da saúde e pesquisa médica. Algumas das condições médicas mais graves, como câncer e defeitos de nascimento, são causadas por problemas que ocorrem em algum ponto do processo de diferenciação ou manutenção de células- tronco. De modo geral, existem dois tipos diferentes de células-tronco: células-tronco embrionárias e células-tronco adultas. Células-tronco embrionárias são encontradas em blastocistos e são capazes de se diferenciar em todos os tecidos embrionários especializados. Células-tronco adultas são células indiferenciadas encontradas em todo o corpo após o desenvolvimento embrionário. As células-tronco adultas são capazes de dividir e preencher células mortas e regenerar tecidos danificados. Além disso, elas podem manter a rotatividade normal dos órgãos regenerativos, como o tecido sanguíneo, da pele e intestinal. As células-tronco adultas têm a capacidade de se dividir e de se auto-renovar indefinidamente e são capazes de gerar todos os tipos de células do órgão do qual se originam. As células-tronco podem ser classificadas como totipotentes, pluripotentes, multipotentes ou unipotentes, com base em seu potencial de se diferenciar em diferentes tipos de celulares. Células-tronco totipotentes são produzidas pela fusão de gametas e pelas primeiras divisões do ovo fertilizado. Essas células podem se diferenciar em tipos de células embrionárias e extra- embrionárias. As células-tronco pluripotentes podem se diferenciar em células de qualquer uma das três camadas germinais. Chamadas multipotentes podem produzir apenas células de uma família estreitamente relacionados. Células unipotentes podem produzir apenas um tipo de célula, mas têm a propriedade de auto-renovação que as diferencia de células não-tronco. A maioria das células-tronco adultas são células- tronco multipotentes de linhagem restrita e são referenciadas pelo seu tecido de origem. Células-tronco adultas pluripotentes são raras e geralmente escassas, mas podem ser encontradas em vários tecidos, incluindo o sangue do cordão umbilical (Ratajczak M. Z., et al., Leukemia 21(5): 860-867 (2007)). Existem vários tipos diferentes de células-tronco adultas, incluindo, mas não se limitando a, células-tronco derivadas adiposas (Zuk, P. A., et al., Tissue Engineering 7:211-216) (2001)), células-tronco epiteliais, células-tronco hematopoiéticas, células-tronco mamárias (Shackleton, M., et al., Breast Cancer R E. 7:86-95 (2005)), células-tronco mesenquimais, células-tronco endoteliais, células-tronco neurais (Alvarez-Bullta, A., et al., Brain Res. Bull. 57:751758 (2002)), células-tronco olfativas (Murrel, W., et al., Dev. Dyn. 233:496-515 (2005)), células-tronco testiculares, células-tronco derivadas de polpa dentária e células progenitoras hematopoéticas do sangue do cordão umbilical.

[0022] Ao se dividir, uma célula-tronco adulta cria uma célula como ela e outra célula mais diferenciada. Esse processo de divisão celular assimétrica dá origem a uma célula-filha idêntica e uma célula transiente amplificadora inicial (TA precoce), que possui capacidade proliferativa elevada. Por meio de uma série de divisões celulares, a célula TA inicial origina uma última célula TA, seguida por uma célula progenitora específica ao tecido e, finalmente, para o volume de células diferenciadas que formam o órgão ou tecido (Ribacka, C., et al. Ann. Med., publicação eletrônica antes da impressão: 1-10 (2008)).

[0023] Vários aspectos da invenção são descritos a seguir com referência a exemplos de aplicações para ilustração. Deve ser entendido que vários detalhes, relacionamentos e métodos específicos são estabelecidos para proporcionar um entendimento total da invenção. No entanto, um perito na área reconhecerá facilmente que a invenção pode ser praticada sem um ou mais dos detalhes específicos ou com outros métodos. A invenção atual não é limitada pela ordenação ilustrada de atos ou eventos, pois alguns atos podem ocorrer em ordens diferentes e/ou simultaneamente com outros atos ou eventos. Além disso, nem todos os atos ou eventos ilustrados são necessários para implementar uma metodologia de acordo com a invenção atual.

[0024] Configurações da invenção podem ser praticadas sem os aspectos teóricos apresentados. Além disso, os aspectos teóricos são apresentados com o entendimento de que os

Definições

[0025] A terminologia utilizada aqui é para descrever apenas configurações específicas e não para restringir a invenção. Como utilizado aqui, as formas singulares “um(a)” e “o/a” são para incluir as formas plurais também, a menos que o contexto indique claramente o contrário. Além disso, se os termos “incluindo”, “inclui”, “tendo”, “tem”, “com” ou suas variantes forem utilizados na descrição detalhada e/ou nos requerimentos, eles devem ser tão inclusivos quanto o termo “compreendendo”.

[0026] O termo “cerca” ou “aproximadamente” significa dentro de um intervalo de erro aceitável para o valor específico, conforme determinado por um perito da área, o que dependerá em parte de como o valor é medido ou determinado, ou seja, das limitações do sistema de medição. Por exemplo, “cerca” pode significar dentro de 1 ou mais desvio padrão, de acordo com a perícia. Como alternativa, “cerca” pode significar um intervalo de até 20%, de preferência até 10%, mais preferencialmente de até 5% e mais preferencialmente ainda de até 1% de um dado valor. Como alternativa, especialmente no que diz respeito aos sistemas ou processos biológicos, o termo pode significar dentro de uma ordem de magnitude, de preferência dentro de 5 vezes, e mais preferencialmente dentro de 2 vezes, de um valor. Quando valores específicos forem descritos no pedido e requerimentos, a menos que indicado de outra forma, o termo “cerca” significando dentro de um intervalo de erro aceitável para o valor particular deve ser assumido.

[0027] Uma “célula-tronco”, conforme utilizada aqui, é uma célula não diferenciada que é capaz de propagação essencialmente ilimitada, seja in vivo ou ex vivo, e capaz de diferenciação de outros tipos de célula. Isso pode acontecer em determinados tipos de célula diferenciada, comprometida, imatura, progenitora ou madura presentes no tecido do qual foram isolados ou tipos de célula significantemente diferenciadas, como, por exemplo, os eritrócitos e os linfócitos, que derivam de uma célula precursora comum, ou até mesmo nos tipos de célula em qualquer estágio de um tecido completamente diferente do tecido do qual a célula-tronco é obtida. Por exemplo, as células-tronco do sangue podem se tornar células do cérebro ou células do fígado, e as células- tronco neurais podem se tornar células do sangue, de forma que as células-tronco sejam pluripotenciais, e, dados os sinais apropriados do seu meio ambiente, elas possam se diferenciar em qualquer tecido do corpo.

[0028] “Propagação” pode ser determinada, por exemplo, pela capacidade de uma célula-tronco isolada de ser propagada através de pelo menos 50, de preferência de 100, e até mesmo de 200 ou mais divisões celulares em um sistema de cultura de células. As células-tronco podem ser “totipotentes”, o que significa que podem dar origem a todas as células de um organismo, como, por exemplo, as células germinativas. As células-tronco podem ser também “pluripotentes”, o que significa que podem dar origem a muitos tipos diferentes de células, mas não a todas as células de um organismo. Quando uma célula-tronco se diferencia, geralmente dá origem a um tipo de célula mais adulto, que pode ser uma célula parcialmente diferenciada, como uma célula progenitora, uma célula diferenciada ou uma célula terminalmente diferenciada. As células-tronco podem ser extremamente móveis.

[0029] “Isolar” uma célula-tronco refere-se ao processo de remoção de células-tronco de uma amostra de tecido e separação de outras células que não são células-tronco do tecido. Uma célula-tronco isolada geralmente está livre de contaminação por outros tipos de célula, ou seja, “homogeneidade” ou “pureza” e geralmente tem a capacidade de propagação e diferenciação para produzir células maduras do tecido do qual foi isolada. Uma célula-tronco isolada pode existir na presença de uma pequena fração de outros tipos de célula que não interferem na utilização da célula-tronco para análise ou produção de outros tipos de células diferenciada. As células- tronco isoladas, em geral, serão pelo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 99,9% puras. De preferência, as células-tronco isoladas, de acordo com a invenção, serão pelo menos 98% ou pelo menos 99% puras.

[0030] Conforme utilizado aqui, “cultura” refere-se à propagação ou nutrição de uma célula, coleta de células, tecidos ou órgãos, por incubação durante um período de tempo em um ambiente e em condições que suportam a viabilidade ou propagação celular. O cultivo pode incluir uma ou mais das etapas de expansão e proliferação de uma célula, a coleta de células, tecido ou órgão, de acordo com a invenção.

[0031] “Célula progenitora derivada de medula óssea” (BMDC) ou “célula-tronco derivada de medula óssea” refere-se a uma célula-tronco primitiva com o mecanismo de auto-renovação constitutivamente ativo. Nesta definição, estão incluídas as células-tronco, que são totipotentes, pluripotentes e precursoras. Uma “célula precursora” pode ser qualquer célula em uma via de diferenciação celular que seja capaz de se diferenciar em uma célula mais madura. Assim, o termo “população de células precursoras” refere-se a um grupo de células capazes de se desenvolver em uma célula mais madura. Uma população de células precursoras pode compreender células que são totipotentes, células que são pluripotentes e células que são da linhagem restrita de células-tronco (ou seja, células capazes de se desenvolver não em todas as linhagens hematopoiéticas ou em, por exemplo, apenas células de linhagem eritróide).

[0032] Conforme utilizado aqui, o termo “autólogo” refere- se a qualquer material derivado do mesmo indivíduo em quem depois deve ser introduzido novamente.

[0033] O termo “célula xenogénica” refere-se a uma célula que se deriva de uma espécie animal diferente da espécie do animal receptor em um procedimento de transplante ou vacinação.

[0034] O termo “célula alogénica” refere-se a uma célula que é da mesma espécie animal, mas geneticamente diferente em um ou mais loci genéticos do animal que é o “receptor do transplante”. Isso geralmente se aplica às células transplantadas de um animal para outro animal não-idêntico da mesma espécie.

[0035] O termo “célula singeneica” refere-se a uma célula que é da mesma espécie animal e tem a mesma composição genética da maioria dos marcadores genotípicos e fenotípicos do animal receptor dessa linha celular em um procedimento de transplante ou vacinação. Isso se aplica geralmente a células transplantadas de gêmeos idênticos ou pode ser aplicado a células transplantadas entre animais altamente congênitos.

[0036] Conforme utilizada aqui, a expressão “quantidade segura e eficaz” ou “quantidade terapêutica” refere-se à quantidade de um componente que é suficiente para obter uma resposta terapêutica desejada sem efeitos colaterais adversos indevidos (como toxicidade, irritação ou resposta alérgica) comensuráveis com uma relação benefício/risco razoável quando utilizada na forma desta invenção. Por “quantidade terapeuticamente eficaz” entende-se uma quantidade de um composto da invenção atual, efetiva para provocar a resposta terapêutica desejada. A quantidade segura e eficaz específica ou a quantidade terapeuticamente eficaz variará de acordo com fatores como a condição específica sendo tratada, a condição física do paciente, o tipo de mamífero ou animal sendo tratado, a duração do tratamento, a natureza da terapia simultânea (se for o caso) e as formulações específicas utilizadas e a estrutura dos compostos ou seus derivados.

[0037] “Paciente” ou “sujeito” refere-se a mamíferos e inclui sujeitos humanos e veterinários.

[0038] Conforme utilizado aqui, o termo “diagnóstico” refere-se à classificação de uma doença ou de um sintoma, à determinação da gravidade da doença, à monitoração da a progressão da doença, à previsão de um resultado de uma doença e/ou perspectivas de recuperação. Opcionalmente, o termo “detecção” também pode abranger qualquer um dos citados acima. Deve-se notar que uma “amostra biológica obtida do sujeito” opcionalmente também pode abranger uma amostra que não foi fisicamente removida do sujeito, conforme descrito com mais detalhes abaixo.

[0039] “Tratamento” é uma intervenção realizada com a intenção de prevenir o desenvolvimento ou alterar a patologia ou sintomas de uma disfunção. Deste modo, “tratamento” refere- se tanto a tratamento terapêutico como a medidas profiláticas ou preventivas. Aqueles que necessitam de tratamento incluem aqueles que já têm a disfunção, bem como aqueles nos quais a disfunção deve ser prevenida. Conforme usado aqui, “recuperado” ou “tratamento” refere-se a um sintoma que se aproxima de um valor normalizado (por exemplo, um valor obtido em um paciente ou indivíduo saudável), por exemplo, é menos que 50% diferente de um valor normalizado, de preferência é menos que cerca de 25% diferente de um valor normalizado, mais preferencialmente, é menos que 10% diferente de um valor normalizado e, ainda mais preferencialmente, não é significantemente diferente de um valor normalizado, conforme determinado utilizando testes estatísticos de rotina.

[0040] Conforme definido aqui, “uma quantidade terapeuticamente eficaz” de um agente ou composto, células, etc., (ou seja, uma dosagem eficaz) significa uma quantidade suficiente para provocar um resultado terapeuticamente (por exemplo, clinicamente) desejável. As composições podem ser administradas de uma ou mais vezes por dia até uma ou mais vezes por semana, incluindo uma vez a cada dois dias. O especialista avaliará se determinados fatores podem influenciar a dosagem e o tempo necessário para tratar um sujeito com eficácia, incluindo, mas não se limitando a, a gravidade da doença ou disfunção, os tratamentos anteriores, a doença geral e/ou a idade do sujeito e outras doenças presentes. Além disso, o tratamento de um sujeito com uma quantidade terapeuticamente eficaz dos compostos da invenção pode incluir um único tratamento ou uma série de tratamentos. Uma “quantidade profilaticamente eficaz” pode se referir à quantidade de células-tronco mesenquimais precursoras suficientes para prevenir a recorrência de doenças ou disfunções do coração, por exemplo, isquemia ou a ocorrência dela em um paciente, incluindo, mas não limitado a, pessoas com predisposição a doenças cardíacas, por exemplo, pessoas com predisposição genética a doenças cardíacas, derrame, etc. Uma quantidade profilaticamente eficaz também pode se referir à quantidade do agente profilático que proporciona um benefício profilático na prevenção da doença.

[0041] O termo “amostra” deve ser interpretado em seu sentido mais amplo. Uma “amostra” refere-se a uma amostra biológica, como, por exemplo, uma ou mais células, tecidos ou fluidos (incluindo, sem limitação, plasma, soro, sangue total, fluido cerebrospinal, linfa, lágrimas, urina, saliva, leite, pus e exsudados e secreções do tecido) isolada de um indivíduo ou de constituintes da cultura celular, assim como as amostras obtidas de, por exemplo, um procedimento de laboratório. Uma amostra biológica pode compreender cromossomos isolados de células (por exemplo, uma disseminação de cromossomos em metafase), organelos ou membranas isoladas de células, células ou tecidos inteiros, ácido nucleico, como o ADN genômico, em solução ou ligado a um suporte sólido, como para análise do sul, RNA em solução ou ligado a um suporte sólido, como por análise do norte, DNA complementar em solução ou ligado a um suporte sólido, oligonucleótidos em solução ou ligados a um suporte sólido, polipéptidos ou péptidos em solução ou ligados a um suporte sólido, um tecido, uma impressão de tecido e afins.

[0042] Diversos métodos bem conhecidos de coleta de tecido ou de fluido podem ser utilizados para coletar a amostra biológica do sujeito, para determinar o nível do DNA, do RNA e/ou o polipéptido da variante de interesse no sujeito. Os exemplos incluem, mas não estão limitados a, biópsia por agulha fina, biópsia por agulha, biópsia por agulha grossa, biópsia cirúrgica (por exemplo, biópsia do cérebro) e lavagem. Independentemente do procedimento utilizado, quando uma biópsia/amostra é obtida, o nível da variante pode ser determinado e, então, um diagnóstico pode ser feito.

[0043] Conforme utilizado aqui, “doenças ou disfunções do coração” ou “doenças ou distúrbios cardiovasculares” refere-se a qualquer tipo de doença ou disfunção do coração, incluindo cardiomiopatia, cardiomiopatia hipertrófica, cardiomiopatia dilatada, aterosclerose, doença arterial coronária, doença cardíaca isquêmica, miocardite, infeção viral, feridas, doença cardíaca hipertensiva, doença valvular, doença cardíaca congênita, infarto do miocárdio, insuficiência cardíaca congestiva, arritmias, doenças resultantes na remodelagem do coração, insuficiência cardíaca, isquemia, infarto do miocárdio, transplante, hipertensão, restenose, angina de peito, doença reumática do coração ou disfunções cardiovasculares congênitas. Doenças ou disfunções do coração podem ocorrer por qualquer razão, como, por exemplo, danos ao tecido cardíaco, como perda de contratilidade (por exemplo, conforme demonstrado por uma diminuição da fração de ejeção).

[0044] Danos ou disfunções cardíacos caracterizados por função cardíaca insuficiente incluem qualquer deficiência ou ausência de uma função cardíaca normal ou presença de uma função cardíaca anormal. Função cardíaca anormal pode ser o resultado de doença, ferimento e/ou idade. Conforme utilizado aqui, função cardíaca anormal inclui anormalidade morfológica e/ou funcional de um cardiomiócito, uma população de cardiomiócitos ou do coração em si. Exemplos não-restritivos de anormalidades morfológicas e funcionais incluem deterioração física e/ou morte de cardiomiócitos, padrões de crescimento anormal de cardiomiócitos, anormalidades na ligação física entre os cardiomiócitos, falta ou excesso de produção de uma substância ou de substâncias pelos cardiomiócitos, insuficiência de cardiomiócitos para produzir uma substância ou substâncias que produzem normalmente e transmissão de impulsos elétricos em padrões anormais ou em tempos anormais. Anormalidades em um nível mais grave incluem discinesia, fração de ejeção reduzida, mudanças observadas por ecocardiografia (por exemplo, dilatação), mudanças no ECG, mudanças na tolerância a exercícios, perfusão capilar reduzida e mudanças observadas por angiografia. A função cardíaca anormal é vista com muitas disfunções, incluindo, por exemplo, doença cardíaca isquêmica, por exemplo, angina de peito, infarto do miocárdio, doença cardíaca isquêmica crônica, doença cardíaca hipertensiva, doença cardíaca pulmonar (cor pulmonale), doença cardíaca valvular, por exemplo, febre reumática, prolapso de válvula mitral, calcificação do anel mitral, doença cardíaca carcinoide, endocardite infecciosa, doença cardíaca congênita, doença do miocárdio, por exemplo, miocardite, cardiomiopatia dilatada, cardiomiopatia hipertensiva, disfunções cardíacas que resultam em insuficiência cardíaca congestiva e tumores do coração, por exemplo, sarcomas primários e tumores secundários. Dano cardíaco também inclui feridas, como, por exemplo, ferida por corte; biológicos (por exemplo, doenças virais; autoimunes) ou químicos (por exemplo, quimioterapia, drogas), cirurgia, transplante e afins.

[0045] “Isquemia do miocárdio” refere-se a uma falta do fluxo de oxigênio no coração que resulta em danos isquêmicos do miocárdio. Conforme utilizada aqui, a frase lesão isquêmica do miocárdio inclui danos causados pela redução do fluxo sanguíneo para o miocárdio. Exemplos não-restritivos de causas de isquemia do miocárdio e danos isquêmicos do miocárdio incluem: diminuição da pressão aórtica diastólica, aumento da pressão intraventricular e da contração do miocárdio, estenose da artéria coronária (por exemplo, ligação coronária, estenose coronária fixa, mudança aguda de placas (por exemplo, ruptura, hemorragia), trombose da artéria coronária, vasoconstrição), estenose e regurgitação da válvula aórtica e aumento da pressão atrial direita. Non-limiting examples of adverse effects of myocardial ischemia and myocardial ischemic damage include: danos no miócito (por exemplo, perda de células do miócito, hipertrofia dos miócitos, hiperplasia celular do miócito), angina (por exemplo, angina estável, angina variante, angina instável, morte cardíaca súbita), infarto do miocárdio e insuficiência cardíaca congestiva. As lesões provocadas pela isquemia do miocárdio podem ser agudas ou crônicas, e as consequências podem incluir a formação de cicatrizes, remodelagem cardíaca, hipertrofia cardíaca, afinamento das paredes, dilatação e mudanças funcionais associadas. A existência e a etiologia de danos no miocárdio agudos ou crônicos e/ou isquemia do miocárdico podem ser diagnosticadas usando qualquer um de diversos métodos e técnicas bem conhecidos na área, incluindo, por exemplo, imagens não-invasivas (por exemplo, MRI, ecocardiografia), angiografia, testes de estresse, ensaios para proteínas cardíacas específicas, como troponina cardíaca, e sintomas clínicos. Esses métodos e técnicas, assim como outras técnicas apropriadas, podem ser usados para determinar quais sujeitos são candidatos adequados para os métodos de tratamento descritos aqui. Células CD271+ derivadas da medula óssea

[0046] A cardiomiopatia isquêmica é a principal causa de insuficiência cardíaca em países desenvolvidos. Existem alguns tratamentos para melhorar a função cardíaca após uma remodelagem provocada por infarto, e faltam tratamentos que realmente revertam a remodelagem nociva do coração após um infarto do miocárdio (MI). A administração de células progenitoras derivadas da medula óssea adulta no coração promete regenerar o miocárdio. Os inventores demonstraram em modelos pré-clínicos (e, pela primeira vez, em seres humanos em dados preliminares) a capacidade de que células-tronco mesenquimais (MSCs) derivadas da medula óssea (BM) fossem liberadas para o coração por meio de sistemas de liberação cirúrgicos e por cateter para enxertar, suportar a remodelagem reversa, melhorar a função cardíaca e reduzir o tamanho da cicatriz. Embora as MSCs tenham despertado uma grande promessa, essas células necessitam de 4 a 5 semanas de cultura para obter quantidades suficientes a serem injetadas. Um precursor de MSCs pode ser isolado da medula óssea com base na expressão da do receptor do fator de crescimento dos nervos de baixa afinidade (NGFR; CD271), e as células CD271+ são uma fonte de células prontamente disponível para uso terapêutico. É importante notar que as células CD271+ derivadas da medula óssea podem ser obtidas com uma inalação da medula óssea e isoladas em quantidades suficientes de 4 a 5 horas, oferecendo uma vantagem logística para uso imediato. Além disso, essas células são significantemente mais eficazes para MSCs cultivados. O objetivo dos estudos é realizar ensaios pré- clínicos testando células BM-CD271+ em um roedor e modelo suíno de infarto do miocárdio e traduzir esse trabalho em um ensaio clínico de injeções cirúrgicas diretas de células CD-271+ após cirurgias de bypasses na artéria coronária. Sem se pretender ficar limitado pela teoria, a hipótese de que as BM-CD271 + células entregues por injecção cirúrgica irá enxertar, melhorar a função cardíaca, e reduzir o tamanho da cicatriz.

[0047] A terapia celular para cardiomiopatia isquêmica crônica permite prevenir mais danos ao tecido, que poderiam levar à insuficiência cardíaca. Os inventores demonstraram que as células CD271+ humanas são de fato precursoras da MSC e têm podem reparar o tecido isquêmico em um modelo com rato de infarto do miocárdio (IM). As células CD271+ são mais potentes e têm maior capacidade de diferenciação em cardiomiócitos do que MSCs cultivadas. Números consideravelmente adequados de células CD271+ podem ser isolados da BM, em quatro a cinco horas, oferecendo um importante avanço logístico no tratamento de pacientes imediatamente com terapia derivada da medula óssea autóloga.

[0048] Numa configuração preferida, células-tronco CD271+ mesenquimais precursoras derivadas da medula óssea (BM) são utilizadas no tratamento do tecido isquêmico em pacientes com insuficiência cardíaca.

[0049] Em outra configuração preferida, um método para prevenir ou tratar doenças ou disfunções cardiovasculares compreende a administração para um paciente de uma quantidade eficaz de células-tronco CD271+. Preferencialmente, as células CD271+ são isoladas das células da medula óssea, possuindo um receptor de crescimento dos nervos de baixa afinidade (NGFR; CD271).

[0050] Em outra configuração preferencial, as células- tronco CD271+ são autólogas, singênicas, alogênicas, xenogênicas ou uma combinação dessas. As células-tronco administradas preenchem e reparam o tecido danificado, por exemplo, o tecido cardíaco. Essas células se diferenciam nas diversas linhagens, resultando na regeneração e reparo do tecido danificado.

[0051] Em outra configuração preferida, um ou mais agentes são administrados opcionalmente para o paciente, sendo que os agentes compreendem pelo menos um de: citocinas, fatores quimiotáticos, fatores de crescimento ou fatores de diferenciação.

[0052] Em um aspecto, aqui são fornecidos os métodos para tratar um paciente com uma doença cardíaca ou um ferimento compreendendo a administração de uma composição celular terapêutica para um paciente com uma doença ou ferimento do sistema cardíaco ou circulatório e avaliação do paciente para melhorias na função cardíaca, em que a referida composição celular compreende CD271+ conforme descrito aqui. Numa configuração, a doença cardíaca é uma cardiomiopatia. Em configurações específicas, a cardiomiopatia é idiopática ou uma cardiomiopatia com uma causa conhecida. Noutras configurações, a cardiomiopatia é de natureza isquêmica ou não isquêmica. Em outras configurações, a doença do sistema cardíaco ou circulatório compreende um ou mais das seguintes: angioplastia, aneurisma, angina (angina de peito), estenose aórtica, aortite, arritmias, arteriosclerose, arterite, hipertrofia septal assimétrica (ASH), aterosclerose, fibrilação e vibração atrial, endocardite bacteriana, Síndrome de Barlow (prolapso da válvula mitral), bradicardia, Doença de Buerger (tromboangeíte obliterante), cardiomegalia, cardiomiopatia, cardite, doença das artérias carótidas, coarctação da aorta, doenças cardíacas congênitas (disfunções cardíacas congênitas), insuficiência cardíaca congestiva (insuficiência cardíaca), doença arterial coronariana, síndrome de Eisenmenger, embolia, endocardite, eritromelalgia, fibrilação, displasia fibromuscular, bloqueio cardíaco, sopro no coração, hipertensão, hipotensão, calcificação infantil idiopática, doença de Kawasaki (mucocutânea síndrome do nó de linfa, doença do nódulo linfático mucocutâneo, poliarterite infantil), síndrome metabólica, angina microvascular, infarto do miocárdio (ataques cardíacos), miocardite, taquicardia atrial paroxística (PAT), periartrite nodosa (poliarterite, poliarterite nodosa), pericardite, doença vascular periférica, isquemia crítica, vasculopatia diabética, flebite, estenose da válvula pulmonar (estenose pulmonar), doença de Raynaud, estenose da artéria renal, hipertensão renovascular, doença reumática do coração, disfunções septais, isquemia silenciosa, síndrome X, taquicardia, Arterite de Takayasu, tetralogia de Fallot, transposição dos grandes vasos, atresia tricúspide, truncus arterial, doença valvular cardíaca, úlceras varicosas, varizes, vasculites, defeitos do septo ventricular, Wolff- Parkinson-White ou comunicação atrioventricular.

[0053] Em outras configurações, a doença do sistema cardíaco ou circulatório é composto por uma ou mais das seguintes: febre reumática aguda, pericardite reumática aguda, endocardite reumática aguda, miocardite reumática aguda, doenças cardíacas reumáticas agudas, doenças da válvula mitral, estenose mitral, insuficiência mitral reumática, doenças da válvula aórtica, doenças de outras estruturas do endocárdio, doença isquêmica cardíaca (aguda e subaguda), angina de peito, doenças da circulação pulmonar (doença cardio-pulmonar aguda, embolia pulmonar, doença cardio- pulmonar crônica), doença cardíaca por cifose e escoliose, miocardite, endocardite, endomiocardiofibrose, fibroelastose endocárdica, bloqueio atrioventricular, arritmias cardíacas, degeneração do miocárdio, doenças do sistema circulatório, incluindo acidente vascular cerebral, oclusão e estenose das artérias pré-cerebrais, oclusão das artérias cerebrais, doenças das artérias, arteríolas e vasos capilares (aterosclerose, aneurisma) ou doenças das veias e vasos linfáticos.

[0054] Numa configuração, o tratamento compreende um paciente apresentando uma cardiomiopatia com uma composição celular terapêutica composta por células CD271+, com ou sem outro tipo de célula. Em outras configurações preferidas, o paciente experimenta os benefícios da terapia, por exemplo, da capacidade das células de suportar o crescimento de outras células, incluindo células-tronco ou progenitoras presentes no coração, do crescimento interno de tecido ou vascularização do tecido e da presença de fatores celulares benéficos, quimiocinas, citocinas e afins.

[0055] Melhorias em um indivíduo com uma doença ou disfunção do sistema circulatório, em que o indivíduo é administrado com células CD271+ ou com as composições terapêuticas fornecidas aqui, podem ser avaliadas ou demonstradas por melhorias detectáveis em um ou mais sintomas da doença ou disfunção do sistema circulatório. Em outra configuração, melhorias em um indivíduo com uma doença ou disfunção do sistema circulatório, em que o indivíduo é administrado com as células CD271+ ou as composições terapêuticas fornecidas aqui, podem ser avaliadas ou demonstradas por melhorias detectáveis em um ou mais indícios de função cardíaca, por exemplo, demonstração de melhorias detectáveis em uma ou mais saída cardíaca do tórax (CO), índice cardíaco (CI), pressões triangulares da artéria pulmonar (PAWP), e índice cardíaco (CI), redução fracional % (% FS), fração de ejeção (EF), fração de ejeção do ventrículo esquerdo (LVEF), diâmetro diastólico final do ventrículo esquerdo (LVEDD), finais do ventrículo esquerdo sistólico (LVESD), contratilidade (por exemplo, dP/dt), loops de volume de pressão, medições do funcionamento cardíaco, aumento no funcionamento atrial ou ventricular, aumento na eficiência de bombagem, diminuição na taxa de perda de eficiência de bombagem, diminuição na perda de funcionamento hemodinâmico e diminuição nas complicações associadas à cardiomiopatia, em comparação com o indivíduo antes da administração de células CD271+.

[0056] Melhorias em um indivíduo recebendo as composições terapêuticas fornecidas aqui também podem ser avaliadas por métricas subjetivas, por exemplo, a autoavaliação do indivíduo sobre seu estado de saúde após a administração.

[0057] Em certas configurações, os métodos de tratamento fornecidos aqui compreendem induzir as células CD271+ terapêuticas para diferenciação na linhagem mesenquimal, por exemplo, para um fenótipo cardiomiogênico, angiogênico ou vasculogênico ou em células como miócitos, cardiomiócitos, células endoteliais, células do miocárdio, células do epicárdio, células endoteliais vasculares, células do músculo liso (por exemplo, células vasculares do músculo liso).

[0058] A administração de células CD271+ ou composições terapêuticas compreendendo tais células, a um indivíduo que precisa delas pode ser realizada, por exemplo, através de transplante, implante (por exemplo, das células em si ou das células como parte de uma combinação de células matriz), injeção (por exemplo, diretamente no local da doença ou condição, por exemplo, diretamente em um local isquêmico no coração de um indivíduo que sofreu um infarte do miocárdio), infusão, liberação via cateter ou qualquer outro meio conhecido na área para oferecer terapia celular.

[0059] Numa configuração, as composições celulares terapêuticas são fornecidas a um indivíduo que precise das mesmas, por exemplo, por injeção em uma ou mais partes do indivíduo. Numa configuração específica, as composições celulares terapêuticas são fornecidas por injeção intracardíaca, por exemplo, em uma área isquêmica do coração. Em outras configurações específicas, as células são injetadas na superfície do coração, em uma área adjacente ou mesmo em uma área mais remota. Em configurações preferidas, as células podem voltar para a área doente ou ferido.

[0060] É possível administrar células CD271+ em um indivíduo com uma doença ou condição nos sistemas coronário ou vascular a qualquer momento; as células seriam terapeuticamente benéficas. Em certas configurações, por exemplo, as células ou composições terapêuticas da invenção são administrados dentro de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 ou 24 horas ou de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 dias após o infarto do miocárdio. A administração próxima no tempo a um infarto do miocárdio, por exemplo, dentro de 1 a 3 ou 1 a 7 dias é preferível em relação à administração distante no tempo, por exemplo, após 3 ou 7 dias após um infarto do miocárdio. Em outras configurações, as células ou composições terapêuticas da invenção são administrados dentro de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 ou 24 horas, ou de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 dias após o diagnóstico inicial da doença ou condição.

[0061] Também são fornecidos aqui kits para utilização no tratamento de infarto do miocárdio. Os kits oferecem a composição celular terapêutica, que pode ser preparada de forma farmaceuticamente aceitável, por exemplo, misturando com um portador farmaceuticamente aceitável e um aplicador e seguindo as instruções de uso. Idealmente, o kit pode ser utilizado no campo, por exemplo, em consultório médico, ou por um provedor de cuidados de emergência a ser aplicado em um paciente diagnosticado como tendo sofrido um infarto do miocárdio ou evento cardíaco similar.

[0062] Em alguns aspectos dos métodos de tratamento fornecidos aqui, as células CD271+ são administradas com células-tronco que não são células CD271+, mioblastos, miócitos, cardiomioblastos, cardiomiócitos ou progenitoras de mioblastos, miócitos, cardiomioblastos e/ou cardiomiócitos.

[0063] Numa configuração específica, os métodos de tratamento fornecidos aqui compreendem a administração de células CD271+, por exemplo, uma composição terapêutica que compreende as células, para um paciente com uma doença no sistema cardíaco ou circulatório e avaliando o paciente para melhorias da função cardíaca, em que a composição celular terapêutica é administrada como um complexo de células matriz. Em certas configurações, a matriz é um andaime, de preferência bioabsorvível, que compreende pelo menos as células.

[0064] Em algumas configurações, as populações de células CD271+ são incubadas ou administradas em um paciente na presença de um ou mais fatores que estimulam a diferenciação de células-tronco ou progenitoras em uma via cardiogênica, angiogênica, hemangiogênica ou vasculogênica. Tais fatores são conhecidos na área, a determinação de condições adequadas para a diferenciação pode ser feita com experimentação de rotina. Tais fatores incluem, mas não se limitam a fatores de crescimento, quimiocinas, citocinas, produtos celulares, agentes demetilantes e outros estímulos que são conhecidos agora ou mais tarde, vias vias ou linhagens cardiogênicos, angiogênicos, hemangiogênicos ou vasculogênicos. Por exemplo, células CD271+ podem ser diferenciadas em vias ou linhagens cardiogênicos, angiogênicos, hemangiogênicos ou vasculogênicos pela cultura das células na presença de fatores que compreendem pelo menos um de um agente de desmetilação, uma proteína fator BMP, FGF, Hedgehog, e/ou anti-Wnt.

[0065] A inclusão de agentes de desmetilação geralmente permite que as células se diferenciem em linhas mesenquimais, para uma via cardiomiogênica. A diferenciação pode ser determinada, por exemplo, pela expressão de pelo menos um entre cardiomiosina, miosina esquelética ou GATA4, ou pela aquisição de um ritmo de batimento, espontâneo ou induzido, ou pela capacidade de se integrar, pelo menos, parcialmente no músculo cardíaco de um paciente, sem induzir a arritmias. Agentes de desmetilação que podem ser usados para iniciar tal diferenciação incluem, mas não estão limitados a, 5- azacitidina, 5-aza-2'-desoxicitidina, dimetilsulfóxido, cloreto de queleritrina, ácido retinóico ou seus sais, ácido 2-amino-4-(etiltio) butírico, procainamida e procaína.

[0066] Em certas configurações aqui, as células tornam-se células cardiomiogênicas, angiogênicas, hemangiogênicas ou vasculogênicas, ou progenitoras. De preferência, as células integram-se no sistema cardiovascular do receptor, incluindo, mas não limitado a, o músculo do coração, estruturas vasculares e outras estruturas do coração, vasos sanguíneos cardíacos ou periféricos, e afins. Em determinadas outras configurações, as células CD271+ dividem-se em células que adquirem dois ou mais dos indícios células cardiomiogênicas ou suas progenitoras e conseguem se integrar no coração ou vasculatura do receptor. Em configurações específicas, as células, que são administradas a um indivíduo, não resultam em aumento de arritmias, problemas cardíacos, defeitos nos vasos sanguíneos ou outras anomalias do sistema circulatório ou saúde do indivíduo. Em certas configurações, as células CD271+agem para promover a diferenciação de células-tronco presentes naturalmente no músculo cardíaco do paciente, vasos sanguíneos, sangue e afins, para se dividir em, por exemplo, cardiomiócitos, ou pelo menos em linhas cardiomiogênicas, angiogênicas, hemangiogênicas ou vasculogênicas.

[0067] As células CD271+, e as populações de tais células, podem ser fornecidas terapeuticamente ou profilaticamente a um indivíduo, por exemplo, com uma doença, disfunção ou condição que afeta o sistema cardíaco ou circulatório. Tais doenças, disfunções ou condições podem incluir insuficiência cardíaca congestiva causada por aterosclerose, cardiomiopatia ou lesão cardíaca, por exemplo, uma lesão isquêmica, como infarto do miocárdio ou ferida (aguda ou crônica).

[0068] As células CD271+ podem ser administradas a um indivíduo na forma de uma composição terapêutica que compreende as células e outro agente terapêutico, como o fator de crescimento parecido à insulina (IGF), fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), fator de crescimento epidérmico (EGF), fator de crescimento de fibroblastos (FGF), fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), fator de crescimento de hepatócitos (HGF), IL-8, agente antitrombogênico (por exemplo, heparina, derivados de heparina, uroquinase e Ppack (dextrofenilalanina, prolina, arginina, clorometilcetona); compostos de antitrombina, antagonistas de receptores de plaquetas, anticorpos de anti-trombina, anticorpos de receptor anti-plaquetários, aspirina, dipiridamol, protamina, hirudina, inibidores de prostaglandina, e/ou inibidores de plaquetas), agente anti-apoptótico (por exemplo, EPO, derivados e análogos de EPO e seus sais, TPO, IGF-I, IGF-II, fator de crescimento de hepatócitos (HGF) ou inibidores de caspases), agente anti- inflamatório (por exemplo, inibidores de quinase p38 MAP, estatinas, inibidores IL-6 e IL-1, Pemirolast, tranilaste, Remicade, Sirolimus, anti-inflamatórios não compostos, por exemplo, ácido acetilsalicílico, ibuprofeno, tepoxalina, Tolmetina ou Suprofen), agente imunossupressor ou imunomodulador (por exemplo, inibidores de calcineurina, por exemplo, ciclosporina, tacrolimus, inibidores mTOR, como sirolimus ou everolimus, anti-proliferativos como azatioprina e micofenolato mofetil; corticosteróides, por exemplo, prednisolona ou hidrocortisona, anticorpos, como anticorpos do receptor anti-IL-2Ra monoclonais, basiliximab, Daclizuma, anticorpos anti-células T policlonais, como anticorpos anti- globulina de timócitos (ATG), globulina anti-linfócito (ALG), anticorpo monoclonal anti-célula T OKT3 e/ou um antioxidante (por exemplo, probucol, vitaminas A, C e E, coenzima Q-10, glutationa, L-cisteína, N-acetilcisteína ou antioxidante derivado, análogos ou sais dos anteriores). Em certas configurações, composições terapêuticas que compreendem as células CD271+ compreendem também um ou mais tipos de células adicionais, por exemplo, células adultas (por exemplo, fibroblastos ou células endodérmicas), células-tronco ou progenitoras. Tais agentes terapêuticos e/ou uma ou mais células adicionais podem ser administrados a um indivíduo que necessite, individualmente ou em combinações de dois ou mais compostos ou agentes.

[0069] Em certas configurações, o indivíduo a ser tratado é um mamífero. Numa configuração específica, o indivíduo a ser tratado é um ser humano. Em configurações específicas, o indivíduo é um animal de criação ou um animal doméstico. Em outras configurações específicas, o indivíduo a ser tratado é um cavalo, ovelha, vaca ou boi, porco, cachorro ou gato.

[0070] Em outra configuração preferida, a população de células-tronco é de pelo menos cerca de 80% puroas, em comparação com uma amostra de controle de células isoladas em um tecido do coração, de preferência, a população de células- tronco é de cerca de 90% puras, em comparação com uma amostra de controle de células, de preferência, a população de células-tronco é de cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,9% puras, em comparação com uma amostra de controle de células.

[0071] Em outra configuração preferida, as populações de células-tronco CD271+ isoladas podem ser usadas em qualquer ensaio desejado pelo usuário final, como, por exemplo, expressando uma molécula não-nativa ou estrangeira, uma molécula nativa que pode ou não estar ativada nas células. Exemplos de tais moléculas podem ser fatores de crescimento, receptores, ligadores, agentes terapêuticos, etc. As moléculas podem ser selecionadas pelo usuário final, para expressão pelas células-tronco isoladas, dependendo da necessidade do usuário final. As moléculas compreendem, por exemplo, um polipéptido, um péptido, um oligonucleótido, um polinucleótido, uma molécula orgânica ou inorgânica.

[0072] Em outra configuração preferida, as células-tronco podem ser células-tronco embrionárias, células-tronco adultas, células-tronco do sangue do cordão umbilical, células-tronco somáticas ou células-tronco cancerígenas. Em configurações preferidas, as células-tronco são células-tronco adultas, de preferência células-tronco cardíacas.

[0073] Além disso, as células-tronco da invenção atual podem ser células-tronco hematopoiéticas ou células-tronco mesenquimais. As células-tronco da invenção atual podem ser totipotentes, pluripotentes, multipotentes ou unipotentes. As células-tronco de acordo com a invenção atual podem ser selecionadas pela presença de um ou mais marcadores de células-tronco, incluindo, mas não se limitando a: CD133, CD34, CD38, CD117/c-kit, OCT3/4, Nanog, RUNX2, SOX9, Integrin, SPARC, osteocalcina, endoglina e STRO-1.

[0074] As células-tronco da invenção atual podem ser primárias ou derivadas de uma linha de células-tronco estabelecida, linha de células-tronco pré-malignas, linha de céulas cancerígenas ou de qualquer linha celular que manifeste qualquer marcador de células-tronco. Células-tronco primárias podem ser derivadas de um paciente com câncer ou um de paciente saudável.

[0075] Administração: O isolamento de populações de células-tronco CD271+ é útil para muitos tipos de aplicações, por exemplo, transplante no coração ou outros órgãos para o tratamento de doenças ou disfunções cardíacas, como danos no miocárdio. Conforme utilizadoa aqui “danos no miocárdio” refere-se a células do miocárdio que foram expostas a condições isquêmicas. Essas condições isquêmicas podem ser causadas por um infarto do miocárdio ou outra doença cardiovascular ou queixa relacionada. A falta de oxigênio provoca a morte das células na área ao redor, deixando um infarto, que eventualmente irá cicatrizar. Conforme utilizado aqui, “cardiomiopatia relacionada à idade” refere-se à deterioração do miocárdio como resultado de mecanismos intrínsecos que ocorrem com o envelhecimento do organismo.

[0076] Numa configuração preferida, as células-tronco são usadas em métodos de reparação e/ou regeneração de danos no miocárdio ou cardiomiopatia relacionada à idade em um sujeito com essa necessidade, administrando células-tronco isoladas em áreas de danos no miocárdio, em que as células-tronco administradas se dividem em um ou mais dos miócitos, células endoteliais ou células do músculo liso. As células diferenciadas podem proliferar e formar várias estruturas cardíacas, incluindo artérias coronárias, arteríolas, capilares e miocárdio, que são todas estruturas essenciais para o bom funcionamento do coração. A capacidade de restaurar a integridade funcional e estrutural é ainda outro aspecto desta invenção. Numa configuração preferida, as células-tronco são as células-tronco cardíacas adultas. Numa outra configuração, as células-tronco cardíacas adultas são isoladas do tecido cardíaco coletado do indivíduo que precisa de tratamento terapêutico para uma das condições cardíacas ou da vasculatura e implantadas de volta no sujeito.

[0077] Em outra configuração preferida, as células-tronco CD271+ isoladas são cultivadas e expandidas ex vivo antes da administração das células-tronco a um paciente. As células podem ser, por exemplo, autólogas, singênicas, alogênicas ou xenogênicas ou qualquer combinação dessas. A mesma fonte de células-tronco não precisa ser utilizada se administrações sucessivas forem necessários.

[0078] Assim, em configurações preferidas, a invenção envolve a administração de uma dose ou uma quantidade terapeuticamente eficaz de células-tronco para o coração. Uma dose eficaz é uma quantidade suficiente para produzir r um resultado clínico benéfico ou desejado. A dose pode ser administrada em uma ou mais administrações. A determinação precisa do que seria considerada uma dose eficaz pode ser baseada em fatores individuais para cada paciente, incluindo seu tamanho, idade, área da lesão no miocárdio e tempo decorrido desde a lesão. Um perito na área, especificamente um médico ou cardiologista, seria capaz de determinar o número de células-tronco que constituem uma dose eficaz, sem experimentação indevida.

[0079] Em algumas configurações da invenção, as células- tronco isoladas são ativadas antes da administração a um sujeito. A ativação das células-tronco pode ser realizada expondo as células-tronco isoladas a uma ou mais citocinas, como fator de crescimento de hepatócitos (HGF), fator de crescimento parecido à insulina (IGF-1) ou uma variante desses. O HGF influencia positivamente a migração de células- tronco e a hospedagem pela ativação do receptor c-Met (Kollet et al. (2003) J. Clin. Invest. 112: 160-169; Linke et al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 8966-8971; Rosu-Myles et al. (2005) J. Cell. Sci. 118: 4343-4352; Urbanek et al. (2005) Circ. Res. 97: 663-673). Da mesma forma, o IGF-1 e seu receptor correspondente (IGF-1R) induzem à divisão de células- tronco cardíacas, regulam a atividade da telomerase, impedem a senescência replicativa e preservam o conjunto de células- tronco cardíacas funcionalmente competentes no coração (Kajstura et al. (2001) Diabetes 50: 1414-1424; Torella et al. (2004) Circ. Res. 94: 514-524; Davis et al. (2006) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103: 8155-8160). Numa configuração preferida, as células-tronco isoladas são contatadas com o fator de crescimento de hepatócitos (HGF) e/ou fator de crescimento parecido à insulina-1 (IGF-1).

[0080] Alguns outros exemplos não limitativos de citocinas adequados para a ativação das células-tronco isoladas incluem activina A, proteína morfogénica do osso 2, proteína morfogenética óssea 4, proteína morfogenética óssea 6, Cardiotrofina-1, fator de crescimento de fibroblastos 1, fator de crescimento 4, Ligador Flt3, fator neurotrófico derivado glial, heparina, fator de crescimento parecido à insulina-II, proteína de ligação do fator de crescimento parecido à insulina-3, proteína de ligação do fator de crescimento parecido à insulina-5, interleucina-3, interleucina-6, interleucina-8, fator inibidor de leucemia, Midkine, fator de crescimento derivado de paletas AA, fator de crescimento derivado de paletas BB, progesterona, putrescina, fator de células-tronco, fator derivado estromal-1, trombopoietina, fator de crescimento transformante-á, fator de crescimento transformante-â1, fator de crescimento transformante-P2, fator de crescimento transformante-â3, fator de crescimento endotelial vascular, Wnt1, Wnt3a e Wnt5a, como descrito em Kanemura et al. (2005) Cell Transplant. 14:673-682; Kaplan et al. (2005) Nature 438:750-751; Xu et al. (2005) Methods Mol. Med. 121:189-202; Quinn et al. (2005) Methods Mol. Med. 121:125-148; Almeida et al. (2005) J Biol. Chem. 280:41342-41351; Bamabe-Heider et al (2005) Neuron 48:253-265; Madlambayan et al. (2005) Exp Hematol 33: 1229-1239; Kamanga- Sollo et al. (2005) Exp Cell Res 311:167-176; Heese et al. (2005) Neuro-oncol. 7:476-484; He et al. (2005) Am J. Physiol. 289:H968-H972; Beattie et al. (2005) Stem Cells 23:489-495; Sekiya et al. (2005) Cell Tissue Res 320:269-276; Weidt (2004) Stem Cells 22:890-896; Encabo et al (2004) Stem Cells 22:725- 740; e Buytaeri-Hoefen et al. (2004) Stem Cells 22:669-674, o texto completo foi incorporado aqui por referência.

[0081] Variantes funcionais das citocinas mencionadas acima também podem ser empregadas na invenção. Variantes de citocina funcionais continuariam com capacidade de ligar e ativar seus receptores correspondentes. Variantes podem incluir substituições, inserções, exclusões, variantes de fatias alternativas de aminoácidos ou fragmentos da proteína nativa. Por exemplo, NK1 e NK2 são variantes de fatias naturais do HGF, que são capazes de se ligar ao receptor c-MET. Esses tipos de variantes de fatias que ocorrem naturalmente, bem como variantes produzidas das proteínas de citocina que retêm a função, são contemplados pela invenção.

[0082] Em algumas configurações, a administração de células-tronco a um sujeito que precisa do mesmo é acompanhada pela administração de uma ou mais citocinas para o coração. As citocinas podem ser selecionadas do grupo que consiste em fator de células-tronco (SCF), fator de estimulação de colônias de granulócitos (G-CSF), fator estimulador de colônias de granulócitos-macrófagos (GM-CSF), fator derivado de células estromais-1, fator de aço, fator de crescimento endotelial vascular, fator de estimulação de colônias de macrófagos, fator de estimulação de granulócitos e macrófagos, fator de crescimento de hepatócitos (HGF), fator de crescimento parecido à insulina-1 (IGF-1), Interleucina-3 ou qualquer citocina capaz de estimular e/ou mobilizar células-tronco. Numa configuração preferida, as citocinas são selecionadas a partir do HGF, IGF-1, variantes funcionais de HGF ou IGF-1 ou combinações desses. As citocinas podem ser liberadas simultaneamente com a população CD271+ de células- tronco. Alternativamente, a administração das citocinas pode preceder ou seguir a administração das células-tronco por um período de tempo especificado. O período de tempo pode ser cerca de 15 minutos, de 30 minutos, de 1 hora, de 3 horas, de 6 horas, de 12 horas, de 24 horas, de 36 horas, de 1 semana, de 2 semanas, de 1 mês ou de 6 meses.

[0083] As citocinas podem ser liberadas no coração por uma ou mais administrações. Numa configuração, as citocinas são liberadas por uma única administração. Noutra configuração, várias administrações da mesma dosagem de citocinas são liberadas para o coração. Uma configuração preferida da invenção inclui a administração de doses múltiplas das citocinas para o coração, de modo que um gradiente quimiotático seja formado. Um gradiente quimiotático se estendendo desde o átrio e/ou ápice do coração até a região central do ventrículo esquerdo pode ser estabelecido pela administração de doses múltiplas de concentração de citocina crescente. Como alternativa, o gradiente quimiotático pode ser formado no local de implante das células-tronco na região central do ventrículo esquerdo ou na região fronteiriça do miocárdio infartado.

[0084] Numa configuração, pelo menos duas citocinas são utilizadas na formação do gradiente quimiotático. Numa outra configuração, a concentração da primeira citocina permanece constante enquanto a concentração da segunda citocina é variável, formando, assim, o gradiente quimiotático.

[0085] Numa configuração preferida, o gradiente quimiotático é formado por administrações múltiplas do IGF-1 e HGF, em que a concentração de IGF-1 permanece constante e a concentração do HGF é variável. Em algumas configurações, as concentrações variáveis do HGF podem variar de cerca de 0,1 até cerca de 400 ng/ml. Noutras configurações, a concentração de IGF-1 pode ser de cerca de 0,1 a cerca de 500 ng/ml.

[0086] A população CD271+ isolada de células- tronco e citocinas pode ser administrada até o coração, por injeção. A injeção é de preferência intramiocárdica. Como sabe um perito na área, esse é o método preferencial de entrega de células-tronco e/ou citocinas, pois o coração é um músculo em funcionamento. A injeção por esta via garante que o material injetado não seja perdido devido aos movimentos de contração do coração.

[0087] Em um aspecto adicional da invenção, as células-tronco e/ou citocinas são administradas por injeção transendocardíaca ou transepicárdica. Esta configuração preferencial permite que as citocinas penetrem na membrana protectora envolvente, necessária pela configuração em que as citocinas são injetadas no intramiocárdio. Outra configuração preferencial da invenção inclui a utilização de uma abordagem baseada em cateter para proporcionar a injeção transendocárdica. O uso de um cateter impede métodos de entrega mais invasivos, em que a abertura da cavidade torácica seria necessária. Como sabe um perito na área, o tempo de recuperação ideal seria permitido pelo procedimento mais minimamente invasivo. Uma abordagem do cateter envolve a utilização de técnicas, como o cateter NOGA ou sistemas semelhantes. O sistema de cateter NOGA facilita a administração guiada, fornecendo mapeamento eletromecânico da área de interesse, assim como uma agulha retrátil que pode ser usada para fornecer injeções direcionadas ou para lavar uma área-alvo com um agente terapêutico. Qualquer uma das configurações da invenção atual podem ser administradas pelo uso de tal sistema para fornecer injeções ou fornecer um agente terapêutico. Um perito na área reconhecerá sistemas alternativos que também permitem fornecer tratamento direcionado pela integração de imagens e um sistema de liberação de cateter que pode ser usado com a invenção atual. As informações sobre a utilização do NOGA e sistemas semelhantes podem ser encontradas, por exemplo, em Sherman (2003) Basic Appl. Myol. 13: 11-14; Patel et al (2005) The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery 130:1631-38; e Perrin et al. (2003) Circulation 107: 2294-2302; cujo texto completo foi incorporado aqui. Numa outra configuração, as células-tronco cardíacas isoladas são administradas por uma via de administração intracoronária. Um perito na área irá reconhecer outros métodos úteis de liberação ou de implante que podem ser utilizados com a invenção atual, incluindo os descritos em Dawn et al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102, 3766-3771, cujo conteúdo completo foi incorporado aqui.

[0088] Os métodos da invenção atual são úteis para o tratamento de doença cardiovascular, incluindo, mas não se limitando a, aterosclerose, hipertensão, isquemia, restenose, angina de peito, doença reumática do coração, disfunções cardiovasculares congênitas, cardiomiopatia relacionada à idade e inflamação arterial e outras doenças das artérias, arteríolas e vasos capilares. Especificamente, os métodos da invenção atual permitem a reparação e/ou regeneração do miocárdio lesionado, resultante de uma das doenças listadas acima ou da diminuição geral de células do miocárdio com a idade.

[0089] A invenção atual também abrange métodos para a prevenção ou tratamento de insuficiência cardíaca num sujeito, compreendendo a administração de uma população CD271+ isolada de células-tronco cardíacas adultas no coração do sujeito e a administração de um antagonista do receptor da angiotensina II. Numa configuração, as células-tronco cardíacas adultas da população CD271+ são ativadas antes da administração pela exposição a uma ou mais citocinas, conforme descrito aqui. Numa outra configuração, uma ou mais citocinas são administradas para o coração, para formar um gradiente quimiotático fazendo com que as células-tronco cardíacas adultas administradas migrem para áreas da lesão do miocárdio. Numa outra configuração, uma ou mais citocinas são HGF, IGF-1 ou suas variantes. O sistema de renina-angiotensina (RAS) é um sistema hormonal que facilita a regulação da pressão sanguínea e do volume extracelular no corpo. Quando a perfusão renal cai, as células do rim liberam a enzima renina. A renina divide a angiotensinogena, um peptídeo precursor inativo expelido pelo fígado, em angiotensina I. A angiotensina I depois é convertida em angiotensina II (Ang II) pela enzima de conversão da angiotensina (ACE), que é predominantemente encontrada nos pulmões. A Ang II produz vários efeitos, incluindo vasoconstrição e secreção de aldosterona e vasopressina, pela ativação do receptor AT1. A Ang II tem sido implicada no acumúlo dependente da idade dos danos oxidativos no coração (Fiordaliso et al. (2001) Diabetes 50: 2363-2375; Kajstura et al. (2001) Diabetes 50: 1414-1424) e tem sido reportada como indutora da senescência e diminuição do número e função das células progenitoras endoteliais (Kobayashi et al. (2006) Hypertens. Res. 29: 449-455). Além disso, a Ang II dispara a apoptose em miócitos (Leri et al. (1998) J. Clin. Invest. 101: 1326-1342) e pode contribuir para a progressão da insuficiência cardíaca (McMurray et al. (2003) Lancet 362: 767-771). Na verdade, a inibição dos receptores AT1 comprovou melhorar o resultado clínico de pacientes com insuficiência cardíaca crônica e prolongar a vida em seres humanos (McMurray et al. (2003) Lancet 362: 767-771).

[0090] A invenção oferece métodos para prevenir a insuficiência cardíaca e/ou tratar insuficiência cardíaca crônica num indivíduo pela administração de um antagonista do receptor Ang II, em combinação com a administração de células- tronco cardíacas adultas no coração do sujeito. Preferencialmente, o antagonista do receptor Ang II é um antagonista do receptor AT1. Alguns exemplos não restritivos de antagonistas do receptor Ang II, que seriam englobados pela invenção atual, incluem Valsartan, Telmisartan, Losartan, Irbesartan, Olmesartan, Candesartan e Eprosartan.

[0091] Além disso, os inibidores da enzima de conversão da angiotensina (ACE) podem ser administrados em complemento ou no lugar do antagonista do receptor Ang II. Como descrito acima, a ACE converte a angiotensina I em angiotensina II. A inibição dessa enzima levaria à diminuição dos níveis da Ang II, reduzindo, assim, os efeitos deletérios da Ang II em células-tronco cardíacas. Inibidores ACE que podem ser utilizados nos métodos da invenção de prevenção incluem, mas não estão limitados a, Benazepril, Enalapril, Lisinopril, Captopril, Fosinopril, Ramipril, Perindopril, Quinapril, Moexipril e Trandolapril.

[0092] Os antagonistas de receptores Ang II ou inibidores ACE podem ser administrados no sujeito em doses múltiplas subsequentes à administração das células-tronco cardíacas adultas. Os antagonistas ou inibidores podem ser tomados diariamente por um período de tempo definido. Por exemplo, os inibidores podem ser tomados uma vez por dia durante cerca de 1 mês, cerca de 2 meses, cerca de 3 meses, cerca de 6 meses, cerca de 12 meses ou cerca de 24 meses após a administração das células-tronco cardíacas adultas. Outras dosagens podem ser aplicadas. Um perito na área, em particular um médico ou cardiologista, poderia determinar a dose apropriada e a programação para a administração dos inibidores ACE ou antagonistas do receptor Ang II. De preferência, um ou mais sintomas de insuficiência cardíaca são reduzidos ou aliviados após a administração das células-tronco cardíacas e do antagonista receptor da angiotensina II e/ou do inibidor ACE. Os sintomas de insuficiência cardíaca incluem, mas não estão limitados a, fadiga, fraqueza, batimentos cardíacos rápidos ou irregulares, dispnéia, tosse persistente ou chiado, edema nas pernas e pés e inchaço do abdômen.

[0093] A invenção também abrange métodos para a preparação de composições, como composições farmacêuticas, incluindo células-tronco adultas e/ou pelo menos uma citocina, por exemplo, para utilização em métodos inventivos para tratamento de doenças cardiovasculares, insuficiência cardíaca ou outros problemas cardíacos. Numa configuração, a composição farmacêutica compreende células-tronco cardíacas humanas isoladas e um transportador farmaceuticamente aceitável. Em um aspecto preferencial, os métodos e/ou composições, incluindo composições farmacêuticas, compreendem quantidades eficazes de células-tronco cardíacas adultas ou duas ou mais citocinas, em combinação com um agente farmacêutico apropriado útil no tratamento de condições cardíacas e/ou vasculares.

[0094] Em um aspecto adicionalmente preferencial, as composições farmacêuticas da invenção atual são aplicadas por injeção. Essas vias de administração (liberação) incluem, mas não estão limitadas a, subcutânea ou parenteral, incluindo administração intravenosa, intraarterial (por exemplo, intracoronária), intramuscular, intraperitoneal, intramiocárdica, transendocárdica, administração intranasal transepicárdica, assim como técnicas intratecais e de infusão. Por conseguinte, a composição farmacêutica é de preferência de forma adequada para injeção. Durante a administração de um agente terapêutico da invenção atual por via parenteral, ela será geralmente formulada em forma injetável de dosagem unitária (solução, suspensão, emulsão). As formulações farmacêuticas adequadas para injeção incluem soluções ou dispersões aquosas estéreis e pós estéreis para reconstituição em soluções ou dispersões injetáveis estéreis. O transportador pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, glicol propileno, glicol polietileno líquido e afins), suas misturas adequadas e óleos vegetais.

[0095] A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, pela utilização de um revestimento como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula necessário no caso de dispersão e pelo uso de tensioativos. Veículos não aquosos, como óleo de semente de algodão, óleo de sésamo, óleo de oliva, óleo de soja, óleo de milho, óleo de girassol ou óleo de amendoim e ésteres, como miristato de isopropilo, também podem ser utilizados como sistemas dissolventes para composições do composto. Além disso, vários aditivos que aumentam a estabilidade, esterilidade e isotonicidade das composições, incluindo conservantes antimicrobianos, antioxidantes, quelantes e protetores, podem ser adicionados. A prevenção da ação de microorganismos pode ser assegurada por vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico e afins. Em muitos casos, será desejável incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, cloreto de sódio e afins. A absorção prolongada da forma farmacêutica injetável pode ser provocada pelo uso de agentes que retardam a absorção, por exemplo, de monoestearato de alumínio e gelatina. No entanto, de acordo com a invenção atual, qualquer veículo, diluente ou aditivo utilizado deveria ser compatível com os compostos. Soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas por incorporação dos compostos utilizados na prática da invenção atual na quantidade necessária do solvente apropriado com várias quantidades de outros ingredientes, como desejado.

[0096] As composições farmacêuticas da invenção atual, por exemplo, compreendendo uma dose terapêutica de células-tronco CD271+ podem ser administradas ao sujeito em uma formulação injetável contendo qualquer transportador compatível, como vários veículos, adjuvantes, aditivos e diluentes, ou os compostos utilizados na invenção atual podem ser administrados por via parenteral para o sujeito sob a forma de implantes subcutâneos de liberação lenta ou sistemas de liberação específicos, como anticorpos monoclonais, iontoforéticos, matrizes de polímero, lipossomas e microesferas. As composições farmacêuticas utilizadas na invenção atual podem ser administradas oralmente ao sujeito. Métodos convencionais, como a administração dos compostos em comprimidos, suspensões, soluções, emulsões, cápsulas, pós, xaropes e afins, são utilizáveis. Técnicas conhecidas que administram o composto por via oral ou por via intravenosa e mantêm a atividade biológica são preferidas.

[0097] Numa configuração, uma composição da invenção atual pode ser administrada inicialmente e depois mantida por administração adicional. Por exemplo, uma composição da invenção pode ser administrada em um tipo de composição e depois administrada em um tipo de composição igual ou diferente. Por exemplo, uma composição da invenção pode ser administrada por injeção intravenosa para reduzir os níveis sanguíneos a um nível adequado. Os níveis do sujeito, então, são mantidos por uma forma de dosagem oral, embora outras formas de administração, dependendo da condição do sujeito, podem ser utilizadas. A quantidade da composição farmacêutica a ser administrada irá variar a cada sujeito sendo tratado. Numa configuração preferencial, 2 x 104 a cerca de 1 x 105 células-tronco cardíacas adultas e, opcionalmente, 50-500 μg/kg por dia de uma citocina ou variante da referida citocina são administrados ao sujeito. However, the precise determination of what would be considered an effective dose may be based on factors individual to each subject, including their size, age, area of damaged myocardium, and amount of time since damage. Assim, um especialista na área pode determinar prontamente as dosagens e a quantidade de compostos e aditivos, veículos e/ou transportadores opcionais em composições a serem administradas nos métodos da invenção. Geralmente, aditivos (além da(s) célula(s)-tronco ativa(s) e/ou citocina(s)) estão presentes numa quantidade de solução de 0,001 a 50% de peso em salina protegida com fosfato e o ingrediente ativo está presente na forma de microgramas a miligramas, como cerca de 0,0001 a cerca de 5% de peso, de preferência cerca de 0,0001% a cerca de 1 de peso, mais preferencialmente cerca de 0,0001% a cerca de 0,05 de peso ou cerca de 0,001 a cerca de 20% de peso, de preferência cerca de 0,01% a cerca de 10 de peso, e mais preferencialmente cerca de 0,05 a cerca de 5% de peso. É claro que, para qualquer composição a ser administrada a um animal ou humano, e para um determinado método de administração, prefere-se, portanto, determinar: a toxicidade, como pela determinação da dose letal (LD) e LD50 num modelo animal adequado, por exemplo, roedor, como rato, e a dosagem da(s) composição(ões), concentração dos componentes no seu interior e tempo de administração da(s) composição(s), que provocam uma resposta adequada. Tais determinações não requerem experimentação indevida do conhecimento de um especialista na área, desta divulgação e dos documentos aqui citados. O tempo para que administrações sequenciais possam ser atestadas sem experimentação indevida. Exemplos de composições que compreendem um agente terapêutico da invenção incluem preparações líquidas para orifícios, por exemplo, oral, nasal, anal, vaginal, peroral, intragástrico, mucosal (por exemplo, perlingual, alveolar, gengival, olfativo ou na mucosa respiratória), etc., administração como suspensões, xaropes ou elixires; e preparações para administração parenteral, subcutânea, intradérmica, intramuscular ou intravenosa (por exemplo, administração injetável), como suspensões ou emulsões estéreis. Tais composições podem estar misturadas com um transportador, diluente ou excipiente adequado, como água estéril, soro fisiológico, glicose ou afins. As composições também podem ser liofilizadas. As composições podem conter substâncias auxiliares, como agentes molhantes ou emulsionantes, agentes de proteção do pH, aditivos de aumento da gelificação ou viscosidade, conservantes, agentes aromatizantes, cores, e afins, dependendo da via de administração e da preparação desejada. Textos padrão, como “CIÊNCIA FARMACÊUTICA DE REMINGTON”, 17a edição, 1985, incorporado aqui por referência, podem ser consultados para oferecer preparações adequadas, sem experimentação indevida.

[0098] As composições farmacêuticas da invenção são fornecidos convenientemente como preparações líquidas, por exemplo, soluções aquosas isotônicas, suspensões, emulsões ou composições viscosas que podem ser protegidas com um pH selecionado.

[0099] Obviamente, a escolha de transportadores adequados e outros aditivos dependerá da via exata de administração e da natureza da forma de dosagem particular, por exemplo, forma de dosagem líquida (por exemplo, se a composição deve ser formulada numa solução, uma suspensão, gel ou outra forma líquida) ou forma de dosagem sólida (por exemplo, se a composição deve ser formulada em comprimido, tablete, cápsula, pílula, forma de liberação por tempo ou forma de líquido preenchido). Soluções, suspensões e géis normalmente contêm uma quantidade importante de água (preferencialmente água purificada), além do composto ativo. Quantidades menores de outros ingredientes, como ajustadores de pH (por exemplo, uma base como NaOH), emulsificadores ou agentes de dispersão, agentes de proteção, conservantes, agentes de umectação, agentes gelificantes, (por exemplo, metilcelulose), cores e/ou sabores, também podem estar presentes. As composições podem ser isotônicas, ou seja, podem ter a mesma pressão osmótica que o sangue e fluido lacrimal. A isotonicidade desejada das composições desta invenção pode ser realizada utilizando cloreto de sódio ou outros agentes farmaceuticamente aceitáveis «, como dextrose, ácido bórico, tartarato de sódio, propilenoglicol ou outros solutos inorgânicos ou orgânicos. O cloreto de sódio é preferido especialmente para proteções contendo íons de sódio.

[0100] A viscosidade das composições pode ser mantida no nível selecionado, usando um agente espessante farmaceuticamente aceitável. A metilcelulose é preferida, porque é pronta e economicamente disponível e fácil de se trabalhar. Outros agentes espessantes adequados incluem, por exemplo, goma de xantano, celulose carboximetil, celulose hidroxipropil, carbómero e afins. Um conservante farmaceuticamente aceitável pode ser utilizado para aumentar a vida útil das composições. Álcool benzílico pode ser adequado, embora diversos conservantes, incluindo, por exemplo, parabenos, timerosal, clorobutanol ou cloreto de benzalcônio, também possam ser utilizados. Uma concentração adequada do conservante será de 0,02% a 2% com base no peso total, embora possa haver variação significativa dependendo do agente selecionado. Peritos na área irão reconhecer que os componentes das composições devem ser selecionados para serem quimicamente inertes em relação ao composto ativo. Isso não será nenhum problema para os especialistas em princípios químicos e farmacêuticos, ou problemas podem ser facilmente evitados consultando textos padrão ou por experimentos simples (não envolvendo experimentação indevida), a partir desta divulgação e dos documentos aqui citados.

[0101] As composições podem ser administradas em dosagens e por técnicas bem conhecidas dos peritos nas artes médicas e veterinárias, tendo em consideração fatores tais como a idade, sexo, peso e condição do sujeito em particular, e da forma de composição utilizada para a administração (por exemplo, sólida vs líquida). As dosagens para seres humanos ou outros mamíferos pode ser determinada sem experimentação indevida por um especialista na matéria, a partir desta divulgação, os documentos aqui citados, e do conhecimento na arte. Os regimes adequados para administração inicial e doses adicionais ou para a administração sequencial também são variáveis, podem incluir uma administração inicial seguida por administrações subsequentes, mas, no entanto, pode ser determinada pelo perito na arte, a partir desta divulgação, os documentos aqui citados, e o conhecimento no estado da técnica.

[0102] As composições farmacêuticas da presente invenção são usadas para tratar insuficiência cardíaca e doenças cardiovasculares, incluindo, mas não se limitam a, aterosclerose, isquemia inflamação, hipertensão, restenose, angina de peito, doença reumática do coração, defeitos congênitos cardiovasculares e arteriais e outras doenças das artérias, arteríolas, capilares ou queixas relacionadas. Assim, a invenção envolve a administração de células-tronco adultas, conforme discutido aqui, sozinhas ou em combinação com uma ou mais citocinas ou variantes de tais citocinas, como aqui discutido, para o tratamento ou prevenção de qualquer uma ou mais destas condições ou outras condições envolvendo doenças ou disfunções cardíacas. Vias de administração vantajosas envolve aquelas mais adequadas para o tratamento dessas condições, como por injeção, incluindo, mas não se limitando a, administração subcutânea ou parenteral, incluindo intravenosa, intra-arterial, intramuscular, intraperitoneal, intramiocárdica, transendocárdica, transepicárdica, intranasal, além de técnicas intratecais e de infusão.

[0103] Embora várias configurações da invenção atual tenham sido descritas acima, deve ser entendido que foram apresentadas apenas como exemplos, e não como limitação. Diversas alterações nas configurações descritas podem ser feitas de acordo com a esta divulgação, sem alterar o espírito ou âmbito da invenção. Assim, a amplitude e âmbito da invenção atual não devem ser limitadas por nenhuma das configurações descritas acima.

[0104] Todos os documentos mencionados aqui são incorporados por referência. Todas as publicações e documentos de patente citados neste pedido são aqui incorporados por referência para todos os fins na mesma medida, como se cada publicação individual ou documento de patente fosse indicado individualmente. Pela citação de várias referências neste documento, os candidatos não admitem qualquer referência particular de “arte prévia” à invenção. Configurações das composições e métodos de invenção estão ilustradas nos exemplos a seguir.

EXEMPLOS

[0105] Os seguintes exemplos não-restritivos servem para ilustrar configurações selecionadas da invenção. Será apreciado que variações nas proporções e alternativas nos elementos dos componentes mostrados fiquem evidentes aos peritos na área e estejam dentro do âmbito das configurações da invenção atual.

Materiais e métodos

[0106] Abreviaturas e acrônimos não padrão: Medula óssea (BM); Fibroblasto de unidade de formação de colônias (CFU-F); Colocação de bypass da artéria coronária (CABG); Fração de ejeção (EF); Volume diastólico final (EDV); Volume sistólico final (ESV); Célula-tronco mesenquimal (MSC); Célula Mononuclear (MNC); Meio condicionado de células estromais do coração de ratos (MsHrtStr CM); Infarto do miocárdio (MI); MSC não aderente (NA-MSC); Fator de crescimento do fibroblasto humano básico recombinante (rhbFGF).

[0107] Ratos: células humanas foram transplantadas em ratos NOD / SCID sujeito a ligadura da artéria coronária esquerda e indução de infarto do miocárdio (MI). Apenas ratos machos com 2 meses de idade foram estudados. Os grupos foram os seguintes: 1) 10 ratos injetados com MSC humana; 2) 10 ratos injetados com células BM-CD271+ humanas.

[0108] Método de ligação da artéria coronária esquerda: Os ratos foram anestesiados com 5% de isoflurano para indução e depois com 20 mg / kg ip. de etomidato Intubação endotraqueal foi realizada, e o rato foi colocado em um monitor cardíaco e ventilado mecanicamente. A pele sobre o local da toracotomia lateral esquerda foi preparada e envolta de forma estéril usando solução de 10% de iodo de providona. Uma almofada de aquecimento foi usada para manter os ratos aquecidos durante os procedimentos, para evitar perda de calor. Pomada oftálmica cirurgicamente estéril não medicada foi aplicada nos olhos no pré-operatório, para evitar secura da córnea.

[0109] Quando a sedação adequada foi alcançada, o tórax foi aberto através de toracotomia lateral esquerda. A artéria coronária esquerda foi exposta e ligada para produzir um MI anterior. 10 minutos após a oclusão, a eritropoietina (2-6 mg / kg) foi infundida com um cateter jugular interno. O tórax foi fechado em camadas com 0 e 3,0 (para o músculo) de sutura absorvível, e buprenorfina (0,05-0,1 mg/kg s.c.) foi dada no pós-operatório para a dor. Os ratos foram atados com faixas e mantidos em compartimento isolado estéril padrão para se recuperar durante 3 ou 4 dias após a cirurgia. A dor pôde ser controlada com 6 doses de 0,05-0,1 mg / kg sc q12 h de buprenorfina. Os animais foram monitorados de perto (4 vezes ao dia) para ver se havia dor e infecção no pós-operatório, procurando sinais como anorexia, falta de pelo, agressividade e dificuldade para respirar. Animais que apresentaram paralisia, feridas abertas, respiração difícil ou relutância em se movimentar foram retirados do estudo e sacrificados.

[0110] Ratos submetidos à cirurgia de controle, que passam por tudo, menos a colocação da ligadura da artéria coronária, servem como controles. A mortalidade perioperatória foi baixa no grupo placebo (<15%) e ligeiramente maior para os grupos infartados. Dos ratos restantes, cerca de 75% sobreviveram pelo menos dois meses após o MI. Os ratos geralmente eram estudados por quatro semanas após a cirurgia.

[0111] As células-tronco foram administradas por injeção intra-miocárdica direta usando uma agulha de calibre 30. No dia do infarto, enquanto o peito foi aberto para indução do MI, as células foram injetadas diretamente no miocárdio. Três injeções de 100 μL foram aplicadas.

[0112] Método para medições hemodinâmicas: a análise hemodinâmica de coração intacto foi realizada utilizando micromanometria de condutância miniaturizada. Os animais foram anestesiados conforme a seguir: gás de isoflurano seguido por 12 mg/kg i.p. de etomidato, 600 mg/kg i.p. de uretano e 1 mg/kg i.p. de morfina. Intubação endotraqueal foi realizada, e o rato foi colocado em um monitor cardíaco e ventilado mecanicamente. A veia jugular interna esquerda foi exposta e picada com uma agulha de calibre 30, para a administração de substâncias. Um cateter de volume de pressão de 4 eletrodos (SPR-839, Millar Instruments Inc) foi inserido na artéria carótida direita e avançado para o ventrículo esquerdo. Medições de loops de volume de pressão foram feitas na linha de base e após a infusão de isoproterenol (1 a 100 ng/min). Por último, a pré-carga foi diminuída, apertando a veia cava inferior através de uma incisão torácica. A profundidade da anestesia foi monitorada, observando o movimento da parede torácica, a frequência cardíaca, a pressão arterial, o tônus muscular e a percepção de estímulos. No final dos experimentos, os animais (sob anestesia profunda conforme acima) foram sacrificados, e o coração foi colhido para estudos de biologia molecular futuros e imunoistoquímica.

[0113] Modelo de cardiomiopatia isquêmica crônica: Porquinhos gottingen miniswine (de 25 a 30kg, fêmeas, de 10 a 12 meses de idade) foram utilizados e submetidos a um modelo animal de grande porte de insuficiência cardíaca isquêmica. Para criar o modelo pré-clínico de cardiomiopatia isquêmica crônica, o miniporco recebeu quetamina para indução da anestesia, intubação endotraqueal foi realizada e também recebeu isoflurano para manutenção da anestesia geral. Os porcos receberam monitoramento contínuo da BP não invasiva, frequência cardíaca, temperatura, oximetria de pulso e capnografia. Uma incisão longitudinal na metade do pescoço foi feita, e a artéria carótida comum direita e a veia jugular interna foram expostas. O controle proximal e distal com loops dos vasos foi obtido, e uma bainha de acesso vascular de 7 Fr foi, então, colocada tanto na artéria carótida comum direita quanto na veia jugular interna direita. Loops de volume de pressão com oclusão IVC foram obtidos antes e após o MI. Angiografias coronárias esquerda e direita foram realizadas com um cateter 4 JR. Então, os porquinhos passaram por um experimento antes do infarto, por oclusão do balão da artéria coronária (LAD) descendente anterior esquerda, distante do primeiro ramo diagonal por 2,5 horas. O porco foi monitorado quanto a arritmias e suporte à vida útil cardíaco avançado, se necessário. Na conclusão da angioplastia por balão, a artéria carótida é reparada com suturas de prolene 6-0 e a veia jugular interna é ligada. A incisão no pescoço é fechada em 3 camadas, a fáscia, o tecido subcutâneo e a pele são reaproximados com poliéster 3-0. O porquinho foi, então, recuperado e a cicatriz, geralmente um infarto transmural, aproximadamente 20% do ventrículo esquerdo e localizado na parede ântero-septal, pôde se curar durante 3 meses enquanto o coração passava por remodelagem.

[0114] Liberação de células BM-MSCs ou BM-CD271+ humanas: Em três meses após o MI, o porquinho recebeu quetamina para indução da anestesia, foi colocado deitado de costas na mesa de operação, recebeu isoflurano através de uma máscara, intubação traqueal foi realizada e ele continuou recebendo isoflurano para manutenção da anestesia geral. O acesso vascular da artéria carótida comum esquerda e da veia jugular interna foi obtidao como descrito acima, para realizar a avaliação hemodinâmica com loops de volume de pressão. Uma incisão de toracotomia lateral anterior esquerda foi realizada no espaço 5-6o intercostal com um bisturi número 10; os tecidos suaves foram dissecados com electrocauterização para controlar a hemorragia, a pleura parietal foi identificada; foi aberta utilizando tesouras Metzenbaum para acessar a cavidade pleural esquerda com cuidado, sem ferir o parênquima pulmonar; um afastador de costela foi usado para separar as costelas. O pericárdio foi identificado e uma incisão de longitude foi feita com tesouras Metzenbaum com cuidado para permanecer anterior ao nervo frênico e não ferir o miocárdio. O coração foi exposto, e 10 injeções na área da cicatriz e zona fronteiriça foram dadas com uma seringa cheia com 0,5cc de células MSC ou CD271+. O volume injetado total foi de 5 cc. Todas as áreas de hemorragia foram controladas com compressas. A incisão toracotomia foi fechada em três camadas com suturas de poliéster 2-0 com um tubo no peito de 18Fr na sucção subaquática colocada no aspecto lateral da incisão. O porco foi, então, retirado do ventilador e recuperado. O tubo torácico foi retirado no dia seguinte. Os grupos foram os seguintes: 1) injeção de 200 milhões de MSCs em 3 meses após o MI (n = 6), 2) Injeção de 2 milhões de células CD271em 3 meses após o MI (n=6).

[0115] Avaliação da função cardíaca: Os efeitos das células CD271+ e MSCs transplantadas foram avaliados com loops de volume de pressão do ventrículo esquerdo e MR cardíaco serial. A hemodinâmica do ventrículo esquerdo (LV) foi avaliada com um cateter transdutor de volume de pressão Millar colocado no LV durante o cateterismo cardíaco antes e após o MI agudo, no momento da injeção e no sacrifício. Dados da função cardíaca não invasiva simultânea foram adquiridos com o uso de um scanner Siemens 1.5T MRI. A MR cardíaca surgiu como uma modalidade de imagens abrangente e de alta precisão para avaliar a função global, a função regional, o tamanho da cicatriz e os parâmetros de perfusão. Muitos consideram a MR cardíaca como completa para obtenção de imagens do coração, pois diversos parâmetros cardíacos são avaliados com um estudo. O protocolo de MR cardíaca inclui imagens de cine em ECG, imagens de perfusão do gadolínio de primeira passagem, imagens MR com etiqueta e imagens de hiper-realce tardio. Uma varredura de MR típica obtém aproximadamente 1.200 imagens do coração, que requer análise de pós-processamento extenso. Todas as imagens foram mantidas no sistema WebPax da Universidade de Miami e cada estudo foi baixado em uma estação de trabalho Dell Precision 690. Dois programas de software aprovados pela FDA foram utilizados para a análise: Segment (Medviso AB e Lund University, Lund, Suécia) e Diagnosoft (Cary, NC). As imagens de cine e de melhoria atrasada foram analisadas usando o software Segment. As imagens marcadas e as imagens de perfusão de primeira passagem foram analisadas com o programa Diagnosoft para obter a estirpe circunferencial euleriana de pico, a curva ascendente do miocárdio e a área abaixo da curva, respectivamente.

[0116] Sacrifício e histologia: Em 3 meses após a injeção de células, cada animal foi sacrificado sob anestesia profunda, conforme discutido acima. O coração foi preso por infusão central de 40mEq de cloreto de potássio, que prende o coração em diástole. O coração do porco foi retirado e conservado em formol. Cada coração foi secionado no eixo curto e biópsias do infarto, zona fronteiriça e zona remota foram analisadas com microscópio confocal para enxerto e diferenciação. Além disso, a necrópsia de todo o corpo dos porcos foi realizada para avaliar a formação de tecido ectópico. Ratos: ratos NOD SCID foram usados, pois são imunodeficientes e um recipiente adequado de células-tronco humanas. A função cardíaca dos ratos que foram submetidos a um MI era inferior ao funcionamento de ratos submetidos à cirurgia de controle dentro de quatro semanas após a cirurgia. Com base em cálculos, 8 ratos precisaram ser incluídos em cada grupo para obter uma potência de 0,90 e á = 0,05. No entanto, a mortalidade após o infarto do miocárdio em ratos selvagens foi cerca de 25% nas primeiras seis semanas de pós-operatório. Assim, para realizar os estudos de MI, pelo menos 10 ratos foram usados em cada grupo.

[0117] Suínos: porquinhos gottingen foram utilizados em estudos pré-clínicos, devido à anatomia coronária semelhante a um ser humano; de 12 a 15 meses de idade, eles têm uma curva de crescimento estável que permite que sejam seguidos em estudos a longo prazo de sobrevivência com crescimento de confusão mínima do coração. Cálculos mostraram que 6 porquinhos precisavam ser incluídos em cada coorte para atingir uma potência de 0,90 e α = 0,05.

[0118] Cirurgias em ratos: cirurgias em ratos foram realizadas voltadas para a prevenção da dor e desconforto. Conforme indicado acima, agentes apropriados foram usados durante os procedimentos cirúrgicos, para fornecer anestesia e analgesia. Para a ligação da artéria coronária, os ratos foram anestesiados com 5% de isoflurano durante a indução e, em seguida, etomidato 20 mg / kg i.p. O controle da dor foi conseguido com 0.05-0.1 mg/kg s.c. q12 h. de buprenorfina. Além disso, a temperatura corporal dos ratos foi mantida usando cobertores ou lâmpadas de aquecimento. Embora alguns ratos desenvolveram hipertrofia cardíaca e insuficiência cardíaca devido aos diferentes procedimentos cirúrgicos, os ratos que tiveram uma perda de peso excessiva, dificuldade de respiração, cianose e falta de reação foram avaliados, e, se apropriado, sacrificados no início.

[0119] Cirurgias em suínos: todos os procedimentos com os porcos foram realizados voltados para a prevenção da dor e sofrimento. Como discutido acima, todos os procedimentos são realizados sob anestesia geral. A dor pós-operatória foi controlada com uma injeção pós-operatória de 0,05-0,1mg/kg de buprenofina subcutânea e um adesivo de 25mcg de fentanil foi colocado sobre o dorso do porco por 72 horas. Se, a qualquer momento durante o decorrer do estudo, um porco tiver demonstrado sofrimento, isso foi avaliado pelo veterinário e equipe de investigação. Muitos casos de sofrimento são devido a uma infecção da ferida ou pulmões, que pode ser controlada com antibióticos por via oral ou intramuscular.

[0120] Eutanásia: esses métodos são consistentes com as recomendações das Diretrizes da Associação Médica Veterinária dos Esatados Unidos, de 2007, sobre a eutanásia. Todos os porcos e ratos foram sacrificados por uma de duas indicações: 1) apresentaram dor pós-operatória ou sofrimento significante, que não foi aliviada por analgésicos, antibióticos e outras medidas; 2) concluíram o período de tempo designado para o estudo da fisiologia. Os ratos foram sacrificados com uma overdose de cetamina (150mg/kg) e xilazina (10mg/kg) e, em seguida, por deslocamento cervical. Os porcos foram colocados sob anestesia profunda, conforme discutido anteriormente, e o coração foi preso com 40meq de cloreto de potássio. Exemplo 1: Comparação de células BM-MSCs e BM-CD271+ humanas em um modelo de rato (NOD/SCID) de infarto do miocárdio.Para testar isso, um modelo de rato estabelecido de infarto do miocárdio foi usado por ligadura temporária de peito aberto da artéria coronária descendente anterior esquerda (LAD) em ratos NOD/SCID. Após 1 hora de isquemia, a ligadura por sutura foi removida da LAD para permitir reperfusão completa. Os ratos, então, foram, randomizados de forma 1:1 para células BM-MSCs ou BM-271+ humanas. Grupos adicionais de animais foram usados para estabelecer controles e comparações adequados. Esses incluem células derivadas da medula óssea CD34+ e CD133+, que contêm células-tronco/progenitoras hematopoiéticas e precursoras endoteliais. Após a reperfusão, as células foram injetadas sob visão direta na área da cicatriz e na zona fronteiriça para um volume de injeção total de 10 μL. Os ratos, então, foram seguidos por 8 semanas por ecocardiografia serial, para avaliar a eficácia da terapia celular. Em 8 semanas após a injeção, os ratos passam por uma avaliação hemodinâmica detalhada, são sacrificados e seus corações são retirados para análise imunoistoquímica, para determinar o enxerto e diferenciação das células injetadas.Histopatologia: após medições hemodinâmicas no final do estudo, o coração do rato foi perfurado com cloreto de potássio e fixadores para estudos imunoistoquímicos. Os pesos totais da carcaça, coração, pulmão e fígado e o comprimento tibial foram medidos para detectar hipertrofia do tecido ventricular não infartado. As seções do coração foram coradas com hematoxilina e eosina para inspeção geral. A fração da circunferência do ventrículo esquerdo, em cortes transversais corados pelo azul de Masson, fornece uma medida do tamanho do infarto.

[0121] células-tronco diferenciadas foram rastreadas por imunocoloração. células humanas foram detectadas dentro dos corações dos ratos usando coloração alu. Coloração para troponina I, á-actina sarcomérica, miócito cardíaco, desmina, á-actinina cardíaca, connexin-43, GATA-4, NKX-2.5 e miócitos indicados MEF2. A coloração CD31 e vimentina foi utilizada para identificar as células endoteliais, enquanto a á-actina de músculo liso e o SMA22 foram utilizados para identificar as células de músculo liso. Assim, todas as células resultantes da injeção de CD271 ou MSC humano e o potencial dessas células de regenerar linhagens diferentes podem ser identificados.

[0122] Uma descrição completa de regeneração cardíaca também incluiu medição total de números e tamanhos de células de miócitos. O número de miócitos por ventrículo esquerdo foi estimado contando os núcleos, com o método de Bruel e Nyengaard. Para medir a área de seção transversal dos miócitos, as laterais foram coradas com aglutinina de gérmen de trigo de fluoresceína conjugada (Invitrogen) e Hoechst 33258. O volume de miócitos foi calculado utilizando uma combinação dos princípios Cavalieri e dissetores. Como alternativa, miócitos individuais podem ser medidos por microscopia confocal após dissociação aguda usando software morfométrico. Para detectar a fibrose associada à remodelagem patológica, as seções foram coradas com Sirius Red (colágeno) e verde rápido (células). Os resultados foram corroborados pelo tricrômico de Masson. Para detectar eventuais miócitos apoptóticos que possam estar associadas à remodelagem contínua, seções mergulhadas em parafina foram coradas utilizando o Apoptag Red In Situ Apoptosis Detection Kit (Millipore) com base no método TUNEL indireto. Outros ensaios incluem imunoistoquímica com um anticorpo específico para a caspase-3 fendida, detecção por transferência de clivagem PKCa dependente da caspase e escalonamento de DNA.Estudos em ratos: células BM-CD271 humanas injetadas no coração de ratos NOD/SCID após o MI experimental melhora a fração de ejeção (FE), e a redução fracional foi comparada com células-tronco placebo e mesenquimais. É importante notar que as células CD271 foram muito potentes na melhoria do EF, e essa melhoria aumenta no tamanho da câmara do coração a um grau maior que um número muito maior de MSCs cultivadas. injeções de células CD271 também causaram melhoria na contratilidade do miocárdio em comparação com placebo, conforme evidenciado pelo aumento da inclinação e do desvio da curva esquerda da curva de volume de pressão sistólica final. Quando avaliadas histologicamente, as células CD271 exibiram um alto grau de enxertamento e evidência de diferenciação dos miócitos, sustentando a ideia de que a recuperação cardíaca é devido ao enxerto de células do miocárdio lesionado. Esses estudos definitivamente testam a hipótese de que as precursoras MSC CD271 são capazes de diferenciação dos miócitos e vascular e de reparação do coração lesionado em um grau maior do que as MSCs cultivadas.Exemplo 2: Comparação de células BM-MSCs e BM-CD271+ humanas em um modelo de porco de infarto do miocárdio.

[0123] Um modelo de animal de grande porte de cardiomiopatia isquêmica crônica foi usado e está bem estabelecido neste laboratório (7, 8) para testar se as células CD271 são enxertadas e diferenciadas em miócitos, células endoteliais e células vasculares do músculo liso. A MRI cardíaca também foi usada para testar os efeitos de células CD271+ na função cardíaca, no tamanho da cicatriz e na perfusão do miocárdio. Os inventores possuem uma vasta experiência na criação de modelos de cardiomiopatia isquêmica em várias raças de suínos (8, 9). Para este estudo, 10 adultos porquinhos gottingen foram submetidos a angioplastia com balão experimental da artéria coronária descendente anterior esquerda durante 2,5 horas, resultando num infarto transmural da parede anterior-septal que engloba cerca de 20% do miocárdio ventricular esquerdo, seguido por reperfusão completa após esvaziamento do balão. Os animais, então, são recuperados e acompanhados com MR cardíaca serial à medida que o coração passa por ampla remodelagem. Três meses após o MI, os porcos foram randomizados de forma 1:1 para células BM-MSCs ou BM-CD271+ humanas. Os animais, então, possuem uma minitoracotomia esquerda em que a medula óssea humana derivada de células CD271+ ou MSCs foi injetada sob visão direta com uma agulha de calibre 22. Todas as áreas de hemorragia foram suturadas. O tórax foi fechado e os animais foram acompanhados em série com MR cardíaca. Todos os porquinhos foram imunosuprimidos com ciclosporina oral A (CsA) para prevenir rejeição imunológica do transplante de células humanas no coração dos porcos (10, 11).

[0124] A eficácia de células CD271+ foi avaliada com imagens de ressonância magnética cardíaca em série (MRI). Essa modalidade de imagens permitiu a análise fenotípica detalhada da função cardíaca global, da função cardíaca regional empregando HARP, do tamanho da cicatriz, usando imagens de hiper-realce tardio e curva ascendente da perfusão miocárdica e da área abaixo da curva pela perfusão de primeira passagem de gadolínio. Aos 3 meses após a injeção, os animais foram sacrificados e os corações foram retirados para análise imunoistoquímica, a fim de determinar o enxerto e diferenciação de CD271+. Foi realizada necrópsia no corpo todo, em cada animal, para avaliar a formação de tecido ectópico.Uma avaliação detalhada de segurança e eficácia foi realizada nesses estudos com animais, conforme descrito (7-9). O objetivo geral era estabelecer segurança de longo prazo, que inclui liberdade da neoplasia ou formação de tecido ectópico e adicionar ao banco de dados de crescimento que a liberação cirúrgica aguda das células no coração com problemas era segura. Além disso, em estudos mecanísticos detalhados em paralelo, foram empregadas imagens, a avaliação hemodinâmica e imunoistoquímica para testar a hipótese de que a injeção de células CD271+ foi altamente eficaz na criação de remodelagem reversa na cardiomiopatia isquêmica crônica e que o mecanismo desse efeito foi, pelo menos em parte, devido ao enxerto e diferenciação celular.

[0125] Células-tronco mesenquimais autólogas produzem remodelagem reversa na cardiomiopatia isquêmica crônica: O trabalho neste laboratório em modelos animais de grande porte com cicatrizes completamente curadas após um infarto do miocárdio mostrou que a administração de MSCs pode melhorar significativamente a estrutura ventricular esquerda e os índices funcionais, indicando reparação significativa.. Pela exploração dessa experiência com técnicas de imagens, melhorias fenotípicas desencadeadas pela implantação de MSCs foram rastreadas no modelo suíno de cardiomiopatia isquêmica crônica, e essas mudanças foram quantificadas morfometricamente. O MI foi produzido em porcos; após 12 semanas, o segmento do infarto havia diminuído, deixando uma cicatriz transmural. MSCs autólogas foram expandidas a partir de cada animal, e essas células ou placebo foram liberadas no infarto e na zona fronteiriça ao redor neste momento. Durante um período de acompanhamento de mais 12 semanas, a MRI cardíaca revelou que injeções intramiocárdicas de MSCs não somente reduziram a carga de cicatrizes (massa de VE) de 21,8 +3,9% (p <0,05 versus placebo e semana 12 versus semana 24), mas também melhorou significativamente a contratilidade regional, a global função do VE, a fração de ejeção e o fluxo sanguíneo do miocárdio. É importante notar que a terapia produziu remodelagem reversa e reduziu a extensão circunferencial da cicatriz do infarto. Essa infinidade de efeitos evidencia a reparação altamente eficaz na cardiomiopatia isquêmica.

[0126] Células-tronco mesenquimais alogênicas restauram a função cardíaca na cardiomiopatia isquêmica crônica via capacidade diferenciada de três linhagens: A hipótese testou se a reparação cardíaca baseada em MSC regenera o coração por mecanismos que compreendem enxerto de longo prazo e por diferenciação tanto em elementos do miocárdio quanto vasculares. MSCs alogênicas foram geradas a partir de um dador suíno masculino e células sexuais incompatíveis administradas por injeção transendocárdica em fêmeas suínas 12 semanas após o MI. Os animais foram acompanhados com MRI em série, e, após 12 semanas, seus corações foram retirados para avaliação imunoistológica. O destino das células do doador macho foi determinado pela co-localização de células de cromossono Y (Ypos) com marcadores de linhagens cardíacas, vasculares e endoteliais. MSCs enxertadas nas zonas do infarto e zonas fronteiriças e diferenciadas em cardiomiócitos conforme atestado pela co-localização com GATA-4, Nkx2.5 e marcadores de á-actina do sarcômero. Além disso, MSCs Ypos exibiram o músculo liso vascular e diferenciação de células endoteliais, contribuindo para a formação de vasos grandes e pequenos. O número de células com enxerto corresponde às mudanças funcionais ocorridas. Sobrevivência, enxerto e diferenciação de MSCs de longo prazo em linhagens do miocárdio, vascular e endotelial foram demonstrados após o transplante em miocárdio cronicamente cicatrizado. A capacidade dessas células para cardiomiogênese e vasculogênese provavelmente contribuíram para sua capacidade de reparar cronicamente o miocárdio cicatrizado.Exemplo 3: Teste de células CD271+ em um estudo clínico de pacientes com um MI sendo submetido a cirurgia de bypass e um ensaio clínico de células CD271+ em pacientes submetidos a cirurgia de bypass.Para ser realizado, é um ensaio clínico fase I/II [chamado de “Estudo Prospectivo Randomizado de Terapia Celular CD271+ em pacientes submetidos a cirurgia cardíaca” (PROMETHEUS-II)]. É um ensaio duplo-cego, randomizado e controlado por placebo, que comparando as células CD271+ com placebo em 15 pacientes submetidos a cirurgia de bypass. Os pontos finais desta avaliação são segurança e eficácia. O ponto final de eficácia utiliza imagens de ressonância magnética cardíaca (MRI) para avaliar o tamanho do infarto do miocárdio, função ventricular (LV) esquerda regional e global, função e perfusão do miocárdio. Um biorepositório da medula óssea do paciente e amostras de sangue em circulação também são coletados para determinar biomarcadores que podem prever sucesso na resposta terapêutica. Os produtos de células CD271+ utilizados neste estudo estão isolados nas instalações Programa de Fabricação de Células, da Universidade de Miami. A célula CD271+ a ser utilizada neste ensaio é uma célula-tronco adulta derivada da medula óssea, que é uma precursora à MSC.

[0127] Dados preliminares do ensaio clínico: células autólogas transendocárdicas na avaliação de insufiência randomizado de fase I/II que foi aprovado pelo Food and Drug Administration para inscrição em 2009. Esse estudo irá inscrever 60 pacientes com disfunção ventricular esquerda isquêmica crônica (EF entre 20-50%) secundário em um infarto do miocárdio. O cateter de infusão Helix (BioCardia, San Jose, CA) é usado para liberar através de injeções transendocárdicas de: MSCs, toda medula óssea ou placebo durante o cateterismo cardíaco.

[0128] A avaliação TAC-HFT foi projetada para inscrever 8 pacientes como uma execução aberta em fase para estabelecer os dados de segurança preliminares antes da fase randomizada de duplo-cego com 60 pacientes. Esses 8 primeiros pacientes receberam medula óssea inteira (n = 4) ou células-tronco mesenquim derivadas da medula óssea (n = 4), de forma não cega. Todos os oito pacientes toleraram as injeções de células-tronco sem efeitos adversos maiores, permitindo que a fase de duplo cego inscreva subsequentemente os pacientes. Como todos os oito primeiros pacientes receberam injeções de células, suas imagens de MR cardíaco foram analisadas. Imagens de cine e imagens de realce tardio foram analisadas usando o software Segment (Medviso AB e Lund University, Lund, Suécia) e imagens cardíacas marcadas foram analisadas usando o software HARP (Diagnosoft, Inc.). Os dados preliminares desses pacientes revelam que em 6 meses após a injeção de células- tronco, as melhorias na função global demonstraram uma queda no volume diastólico final de 11,2 ± 3,4% (p <0,05), uma redução de 13,5 ± 4,2% (p <0,01) no volume sistólico final e um aumento na fração de ejeção média de 4,9 ± 6,7%. Nas imagens de realce tardio, o tamanho da cicatriz como um percentual da massa ventricular esquerda reduziu em média 13,3 ± 7,2% (p = 0,06). As imagens do MR marcadas mostraram melhoria regional de contratilidade, na zona do infarto e na zona fronteiriça, conforme demonstrado por Eulerian Circumferential Strain. Esses dados mostram que as MSCs são seguras, melhoram a função cardíaca, suportam a remodelagem reversa e reduzem o tamanho da cicatriz.

[0129] Esses dados são antes da configuração, pois nenhuma outra estratégia terapêutica atinge esse grau de remodelagem reversa, acompanhada por redução real da cicatriz do miocárdio. Essas descobertas interessantes são altamente favoráveis ao imperativo para acelerar a investigação clínica nesta área.Um estudo randomizado, e duplo-cego, controlado por placebo, de escalonamento de dose de células-tronco mesenquimais humanas adultas intravenosas (Prochymal) após infarto agudo do aiocárdio: Os dados de segurança e eficácia do estudo de fase I de 53 pacientes inscritos foram publicados recentemente no Jornal da Faculdade Americana de Cardiologia (18) e forneceram dados de segurança essenciais para MSCs alogênicas. Neste estudo, os pacientes com infarto agudo do miocárdio reperfundidos foram randomizados para uma única infusão intravenosa de placebo ou CTMs humanas isoladas de aspirados da medula óssea, obtidos de um único doador não relacionado que não era de antígeno leucocitário humano compatível para os destinatários. As taxas de eventos adversos foram semelhantes em tratados com hMSC (5,3 por paciente) e tratados com placebo (7,0 por paciente). As gravações de ECG ambulatoriais demonstraram uma redução no número de episódios de taquicardia ventricular em pacientes tratados com hMSC em comparação com o placebo. A ecocardiografia em pacientes MI anteriores demonstrou fração de ejeção melhorada em pacientes tratados com hMSC. É importante notar que este ensaio forneceu dados de segurança fundamentais para a utilização de MSCs alogênicas em doença cardíaca isquêmica.Dados de segurança e de eficácia pré-clínicos do laboratório do inventor (7, 8, 15) foram obtidos de diversas raças de modelos de suínos com MI agudo e crônico. A injeção de MSCs via cateter no tecido infartado reduz o tamanho do infarto do miocárdio, melhora a função do LV global e regional, normaliza as funções cardíacas e restaura a perfusão do tecido (7, 8, 16).

[0130] Isolamento de células CD271+ do BM humano normal: Aspirações da medula óssea foram obtidas da crista ilíaca do paciente sob sedação consciente e analgesia local por um hematologista/oncologista experiente. As células mononucleares da BM foram isoladas utilizando centrifugação de gradiente de densidade e, em seguida, as células foram marcadas com microesferas ligadas a um anticorpo para as células CD271 e CD271+ isoladas no dispositivo clínico CliniMACS (Miltenyi Biotech, Colônia, Alemanha). As células, então, foram lavadas e preparadas para infusão. Este processo demora aproximadamente de 4 a 5 horas. Todas as células CD271+ (1-5 M) foram utilizadas para a injeção no paciente. O trabalho anterior deste laboratório demonstrou a viabilidade de isolar as células CD271+. Células CD271+ foram isoladas das células normais da medula óssea do doador utilizando uma marcação indireta de células com anticorpos CD271-APC e APC Microbeads. O número médio de células da MNC da BM inicial era 1,4 x 108 células nucleadas (intervalo de 2,9 x 107 a 3,3 x 108, N=7), resultando em uma média de 4,2 x 105 células CD271+ após a seleção (intervalo de 3,9 x 104 a 9,4 x 105). Isto representa uma frequência de 0,3% de células CD271+ no produto MNC BM. As células CD271+ isoladas demonstraram uma morfologia primitiva com uma baixa relação citoplasma para nuclear. Quando colocadas em cultura líquida, as células CD271+ formaram MSCs em 7 dias, enquanto as MNCs da BM formaram menos MSCs. A geração de MSCs a partir de células CD271+ foi comparada com células CD271; enquanto 170.000 células CD271+ geraram MSCs significativas após 7 dias de cultura em um frasco T162 cm2, cem vezes mais que as células CD271 (1,7 x 107 células num frasco T162 cm2) para gerar MSCs significativas no sétimo dia. Houve algumas células aderentes na cultura de células CD271-; no entanto, essas parecem ser células endoteliais, não MSCs. As células CD271+ foram enriquecida para CFU-F, com 1 em 222 células CD271+ formando CFU-F, em comparação com 1 em 12.500 de MNCs BM. Além disso, a fração negativa de CD271 continha muito pouco CFU-F, com menos de 1 em 100.000 células. Distribuição celular: Na conclusão da cirurgia de bypass da artéria coronária, as células BM-CD271+ autólogas placebo foram injetadas pelo cirurgião cardíaco sob visão direta através do epicárdio na área da cicatriz e zona fronteiriça. Todas as áreas de hemorragia foram controladas com compressas.

[0131] MRI cardíaco: Este grupo tem uma vasta experiência na determinação da estrutura e função cardíacas, explorando técnicas de imagens não-invasivas de ponta (17, 19, 20). O MR cardíaco foi usado para avaliar a eficácia da terapia celular. A função miocárdica, a perfusão dos tecidos e a determinação não-invasiva do tamanho do infarto foram determinadas pela Marcação de Tecido de Fase Harmônica (HARP), cinética de captação de gadolínio e protocolos de MRI de realce de contraste tardio, respectivamente. Os pacientes deitam de costas na mesa de operação, e todas as imagens são obtidas durante uma apneia de batimentos cardíacos 12-15 no fim da expiração, uma média de 10 a 15 segundos com períodos de descanso adequados entre as prisões de respiração (10-15 seg.). O protocolo de imagens primeiro incluiu imagens do escanograma sagitais, axiais e oblíquas para localizar o coração. Estima-se que cada sessão de MRI dure entre 45 e 60 min. Para determinar a função do miocárdio, os protocolos de marcação de tecido foram realizados conforme descrito anteriormente. O protocolo foi baseado numa sequência de pulsos de eco de gradiente rápido disparada pelo ECG, que resultou na separação marcada de 6 mm do miocárdio. Este método produziu parâmetros de movimento e quantitativos numa base regional, que podem ser utilizados para comparação entre sujeitos em diferentes momentos após a intervenção, proporcionando, assim, um método rápido e reproduzível para avaliar a função do LV de série e quantitativa. Em seguida, os pacientes receberam uma injeção intravenosa em bolus de 0,2 mmol/kg de gadolínio-DTPA. Imagens de realce tardio de alta resolução foram obtidas de oito a dez seções transversais de eixo curto do VE (garantindo cobertura cardíaca inteira), usando uma sequência de eco de gradiente rápido fechada preparada. As regiões hiper-realçadas adquiridas com este método mostraram estar dentro de 10% do tamanho do infarto medido post-mortem por coloração de cloreto de trifenil- tetrazólio (TTC), significando, assim, que este método é uma maneira muito precisa para determinar o tamanho do infarto (19).

Exemplo 4: Potencial cardíaco de células precursoras Métodos

[0132] Isolamento de células CD271+: Aspirações da medula óssea (25 a 50 ml) foram obtidas da AllCells LLC (Emeryville, Canadá) com o consentimento informado apropriado e aprovação do IRB. As células da medula óssea (BM) foram diluídas 1:1 com PBS + 1% FCS e dispostas sobre Ficol para isolar a fracção de células mononucleares de baixa densidade (MNC). A MNC, então, foi marcada com microesferas CD271 (Miltenyi Biotech, Colônia, Alemanha) e com as células CD271+ isoladas usando um dispositivo de seleção de célula Miltenyi MACS (VarioMACS), de acordo com os procedimentos recomendados pelos fabricantes. As células CD271+ foram contadas e as citospinas foram preparadas para análise morfológica.

[0133] Isolamento e expansão de células-tronco mesenquimais (MSCs): MNCs da BM foram isoladas conforme descrito acima e as células foram cultivadas em frascos de cultura T162 cm2 em 1 a 3 milhões de MNCs por ml de MEM alfa contendo 20% de FBS mais 1% de penicilina glutamina e estreptomicina. O meio foi trocado a cada 3 a 4 dias, com descarte das células não aderentes. As MSCs cresceram como células aderentes à superfície dos frascos, e as culturas foram passadas quando confluentes, utilizando tratamento com tripsina. As MSCs foram coletadas na passagem 4 ou 5 e congeladas em nitrogênio líquido. Antes da injeção, as células foram descongeladas e lavadas.

[0134] Ensaio CFU-F: O potencial clonegênico de MNCs BM, células CD271+ e CD271- foi avaliado utilizando o ensio de fibroblasto de unidade formadora de colônias (CFU-F). As células foram plaqueadas em placas de 35 mm de Mídia de estimulção de células-em 2 ml de células-tronco mesenquimais e suplementos (tecnologias de células-tronco, Vancouver, Canadá). As células foram plaqueadas em diferentes densidades celulares, desde 10.000 células por placa até 1 milhão de células por placa. Os cultivos foram incubados a 37°C em 5% de CO2 durante 10 dias e, em seguida, corados com Giemsa e pontuados com um microscópio de dissecação. Geralmente, colônias CFU-F têm entre 1 e 8 mm de diâmetro e podem ser pontuadas macroscopicamente.

[0135] Indução e avaliação do potencial de diferencaição adipocítico e osteogênico: células CD271+ foram cultivadas em condições não aderentes, em sacos de teflon e as células foram coletadas e plaqueadas em placas de cultura celular (Nunc, Roskilde, Dinamarca), para os ensaios de diferenciação. A diferenciação adipocítica foi induzida pelo cultivo dessas células em meio NH AdipoDiff (Miltenyi Biotec Inc., Auburn, CA, EUA) a uma concentração de 5 x 104 células/ml, durante 2 semanas. Em seguida, as células foram utilizadas para a coloração com gotas de lipídos Oil Red O (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). A diferenciação osteogênica foi induzida pelo cultivo dessas células em meio NH OsteoDiff (Miltenyi Biotec Inc.) a uma concentração de 3 x 104 células/ml durante 3 semanas. Em seguida, as células foram coradas com SIGMA FAST BCIP/NBT Buffered Substrate Tablet (Sigma) para detectar sua expressão de fosfatase de alcalina (AP), uma enzima envolvida na mineralização da matriz óssea. As células que foram cultivadas em alfa-MEM durante este período foram utilizadas como controles.

[0136] Modelo animal, infarto do miocárdio e transplante de células. Todos os experimentos em animais vivos foram realizados de acordo com o protocolo aprovado pelo programa de cuidado e uso de animais da Universidade de Miami. Os animais foram anestesiados com inalação de soflurano pela intubação endotraqueal (1-2%), enquanto o nível de anestesia foi controlado pela temperatura corporal e frequência cardíaca. A buprenorfina (0,3 mg/kg, injeção de SQ) foi usada antes e após a cirurgia (horas Q6) para controlar a dor. Usando uma toracotomia anterior esquerda, o coração de ratos fêmeas (NOD/SCID; Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) em 8 a 10 semanas de idade foi exposto e a artéria LAD foi ligads permanentemente à sutura de proleno 7-0. O infarto foi confirmado por um vazio visual distante da ligadura e elevação do segmento ST no eletrocardiograma (ECG). O primeiro ECG de acompanhamento foi utilizado em 48 horas após a cirurgia como um critério de inscrição do estudo, portanto todos os animais tiveram MI de tamanho igual. Quatro grupos experimentais foram estabelecidos, consistindo em animais que receberam salina protegida com fosfato (PBS), injecções como controle; células CD271+ (células 1,2x105), MSCs da BM humana em duas doses diferentes de 1,2x105 células (dose baixa) ou 1x106 células (dose alta). Imediatamente após o infarto, cada animal recebeu três injeções (10μL/injeção) de PBS ou células nas fronteiras e no centro da região infartada usando uma agulha de calibre 30. A mortalidade cirúrgica foi de 11,5% e a mortalidade nas primeiras 48 horas após a injeção de células foi de 5% (mortalidade total para o tempo peri-cirúrgico é de 16,5%). Oito semanas após o transplante, os animais foram sacrificados e os corações são preparados para análise imunoistológica.

[0137] Ecocardiografia: A função cardíaca foi monitorada pelo sistema de imagens Vevo 770 (VisualSonic Inc., Toronto, Canadá) na linha de base antes da cirurgia, 48 horas, 1, 2, 4 e 8 semanas após o infarto e injeção de células. As imagens foram registradas sob anestesia com inalação de isoflurano (12%) em frequências cardíacas superiores a 400bpm e temperaturas do corpo de (37±10C). Os parâmetros ultrassonográficos da estrutura e anatomia cardíacas, incluindo volume diastólico final (VDF), volume sistólico final (VSF) e fração de ejeção (EF), foram calculados utilizando imagens bidimensionais.

[0138] Análise do loop do volume de pressão: Oito semanas após a injeção de células, e usando a abordagem carótida correta, um catéter de manometria de condutância Millar (SPR 839) (Millar Instruments, TX) progrediu para o ventrículo esquerdo. Durante o procedimento, uma solução de 6,25% de albumina diluída foi infundida na veia jugular, a uma taxa de 5 uL/min e a anestesia foi aplicada com inalação de 1-2% de isoflurano através de intubação endotraqueal. Os dados de volume de pressão foram obtidos utilizando o sistema MPVS Ultra (Millar Instruments, TX) na linha de base e após a oclusão da veia cava inferior (IVC). A calibragem do volume foi feita usando o método de cubeta e infusão de solução salina hipertônica.

[0139] Preparação e histopatologia do tecido: Depois de terminar a gravação de loop PV, os corações foram retirados e perfundidos durante 10 minutos em uma solução de 20μM de cloreto de potássio e 10% de formalina a 1mL/min através de canulação da aorta para corrigir os corações com diástole. Os corações foram cortados e os cortes histológicos foram corados com Mason Trichrome (TM) e H&E ou utilizados para imunoistoquímica.

[0140] Sondas de DNA específicas aos seres humanos foram usadas (Human Alu Probe, BioGenex, CA) e o método hibridação in situ fluorescente (FISH) para rastrear as células humanas injetadas nos tecidos dos ratos (AntiFluorescein-HRP Conjugate, Perkin Elmer, Boston, MA). As amostras de coração fetal humano e ratos injetados com PBS foram utilizadas como controles positivos e negativos, respectivamente. Os slides corados Alu foram digitalizados com um scanner a laser fluorescente Zeiss e as imagens foram analisadas usando o software de visualização Mirax em ampliação 20 X. As imagens foram tomadas separadamente e mescladas usando o CS3 Adobe Photoshop e células positivas contadas em duas áreas separadas do mesmo corte.

[0141] Imunoistoquímica: As amostras foram coradas com anticorpos específicos ao coração, alfa actina sarcomérica (á- SA) (Sigma, St. Louis, MO), Troponina I (TnI) (Abcam, Cambridge, MA) e Connexin 43 (Cx43) (Santa Cruz, CA). A coloração de laminina (Abcam) foi utilizada para delinear células. As amostras coradas foram estudadas primeiro por microscopia imunofluorescente e, em seguida, pelo microscópio confocal Zeiss LSM710 para preparar imagens.

[0142] Análise estatística: Os dados foram analisados usando o software Graph Pad Prism e os valores são expressos como média ± erro padrão da média (SEM). A análise de variação foi utilizada com medições repetidas (ANOVA bilateral com teste post hoc Bonferoni para analisar os dados de eco e um ANOVA unidirecional para comparar os dados hemodinâmicos terminais com o teste post hoc Newman-Keuls Multiple Comparison.

Resultados

[0143] Isolamento de células CD271+ do BM humano normal: Células CD271+ foram isoladas das células normais da BM do doador utilizando uma marcação indireta de células com anticorpos CD271-APC e APC Microbeads. O número médio de células da MNC da BM inicial era 1,4 x 108 células nucleadas (intervalo de 2,9 x 107 a 3,3 x 108, N=7), resultando em uma média de 4,2 x 105 células CD271+ após a seleção (intervalo de 3,9 x 104 a 9,4 x 105). Isto representa uma frequência de 0,3% de células CD271+ no produto MNC BM. As células CD271+ isoladas demonstraram uma morfologia primitiva com uma baixa relação citoplasma para nuclear (Figura 1).

[0144] Quando colocadas em cultura líquida, as células CD271+ formaram MSCs em 7 dias (Figura 2A), enquanto as MNCs da BM formaram menos MSCs (Figura 2B). A geração de MSCs a partir de células CD271+ foi comparada com células CD271; enquanto 170.000 células CD271+ geraram MSCs significativas após 7 dias de cultura em um frasco T162 cm2, cem vezes mais que as células CD271 (1,7 x 107 células num frasco T162 cm2) para gerar MSCs significativas no sétimo dia (Figura 2C). Conforme mosrado na Figura 2C, houve algumas células aderentes na cultura de células CD271-; no entanto, essas parecem ser células endoteliais, não MSCs.

[0145] As células CD271+ foram enriquecida para CFU-F (Figura 3), com 1 em 250 células CD271+ formando CFU-F, em comparação com 1 em 12.500 de MNCs BM. Além disso, a fração negativa de CD271 continha muito pouco CFU-F, com menos de 1 em 100.000 células.

[0146] Cultivo in vitro de células CD271+ em condições não aderentes: As células CD271+ foram cultivadas em condições não aderentes em sacos de Teflon durante 1 a 3 meses e os estágios iniciais de crescimento são apresentados na Figura 4. Os meios para essas culturas consistiram em alfa-MEM + 20% de FCS com o fator de crescimento do fibroblasto humano básico recombinante de 20ng/mL (rhbFGF). Na primeira semana, aglomerados de células podiam ser vistos com algumas células que se formam na superfície do saco de Teflon, de morfologia semelhante à MSC aderente de plástico. Os sacos foram massageados para retirar células aderentes e meios que mudam semanalmente. Os aglomerados de células continuaram proliferando e formando esferas, como mostrado na Figura 4, com esferas grandes em desenvolvimento pelo dia 21. Essas células foram analisadas após 4 semanas em cultivo por citometria de fluxo; a Figura 5 mostra que a maioria expressou CD105, um marcador MSC típico.

[0147] O potencial de diferenciação adipocítico e osteoblástico das células CD271+ em condições não aderentes também foi avaliado. As células foram colhidas dos sacos de cultivo e plaqueadas em placas de cultivo de células (Nunc, Roskilde, Dinamarca), para os ensaios de diferenciação. Como mostrado na Figura 6, as células CD271+ cultivadas se diferenciaram em adipócitos e osteoblastos.

[0148] As células também foram cultivadas em condições típicas de cultivo de MSCs, ou seja, cultura em frascos de cultivo de tecidos com meio alfa MEM mais 20% de FCS. As esferas mostradas na Figura 4 anexada à superfície plástica dos frascos e MSCs típicas cresceram das esferas e formaram culturas confluentes, após 1 a 2 semanas.

[0149] Esses resultados demonstram que as células CD271+ cultivadas em condições não aderentes formam esferas de células que são CD105+, possuem potencial de adipócitos e osteoblastos e formam MSCs aderentes plásticos, como células consistentes com as propriedades do MSC.

[0150] Usando o meio condicionado por células de rato estromais derivadas de tecido cardíaco (CM MsHtStr) o potencial cardíaco de células cultivadas CD271+ em condições não aderentes por 2 semanas foi avaliado. O MSC não aderente (NA-MSC) expressava alfa sarcomérica actinina, Nkx2.5 e Connexin-43, GAT-4 e N-Caderina (Figura 7). Esses resultados demonstram que as células CD271+ conseguem se diferenciar em células cardíacas, bem como os adipócitos e os osteoblastos e mostram que as células CD271+ têm maior potencial de diferenciação em comparação com MSCs gerados como células plásticas aderentes . Como o CD271 é um receptor neuronal, foi proposto que essas células também podem apresentar potencial de diferenciação neuronal e atualmente realizar experimentos para avaliar essa questão.

[0151] Potencial in vivo de células CD271+ BM: Para avaliar o potencial cardíaco in vivo de células CD271+ da BM, células CD271+ humanas recém-isoladas foram injetadas em corações infartados de ratos NOD/SCID. A lesão MI produziu uma dilatação ventricular e uma disfunção dependentes do tempo (Figura 8). O impacto inicial do infarte entre todos os grupos foi igual. A comparação do volume ventricular na diástole final (EDV) (Figura 8) mostrou remodelagem reversa marcada nos ratos tratados com células CD271+ (112,8 ± 13,6μL) quando comparado com o controle (128,1 ± 15,7μL) (P = 0,02). O grupo tratado CD 271 também foi marcadamente melhor que os animais tratados com uma dose igual de MSC (dose baixa; 145,5 ± 14.9μL) (p = 0,0001), mas semelhantes aos animais tratados com a dose elevada de MSC (116,5 ± 14,5μL). A resposta à dose foi demonstrada em animais tratados com MSC com uma diferença significativa entre os animais tratados com dose baixa de MSCs em comparação com a dose alta (p = 0,0001). As mesmas tendências resultaram em volume sistólico final (VSF) - os animais tratados com CD 271 tiveram uma ESV significativamente menor (81,5 ± 12.4μL) em comparação com animais de controle (119,7 ± 17,8μL, p <0, 0001) e de animais tratados de com MSC de baixa dose (117,1 ± 13,4μL, p <0,0001), mas não os animais tratados por MSC de dose alta (91,2 ± 12,6μL). Os animais tratados com CD 271 demonstraram uma fracção de ejeção maior (EF) no final de 8 semanas (32,3 ± 3,7%) em comparação com animais tratados com controle (17,6 ± 4,1%, p<0,0001) e de animais tratados com baixa dose de MSC (19,7 ± 3,1 %, p=0,0005), mas não os animais tratados com MSC de dose alta (24,7 ± 2,9%).

[0152] Análise do loop do volume de pressão: Avaliação hemodinâmica de corações tratados e de controle foram realizadas em 8 semanas após a injeção. Manometria condutância foi usada por via transcarótida. A elastância arterial (Ea) foi calculada e os ratos tratados com CD271 tiverem um Ea menor (3,0 ± 0,2 mmHg/μL) em comparação com animais de controlw (4,7 ± 0,2 mmHg/μL, p <0,05), mas não significativamente diferente dos ratos tratados com doses altas ou baixas de MSN (4,3 ± 0,6 e 3,5 ± 0,4 mmHg/μL, respectivamente). A constante de relaxamento isovolumétrico (Tau_ Weiss) mostrou melhores propriedades diastólicas de corações CD271 (12,3 ± 0,8 mseg) do que os controles (15,2 ± 1,0 mseg, p <0,05).

[0153] Imunoistoquímica: As seções de tecido de corações de animais tratados com células CD271+, MSCs e placebo foram coradas com sondas 8 Alu específicas a seres humanos 8 semanas após a injeção. Como mostrado nas Figuras 9A-9D, os animais injetados com células CD271+ demonstraram a presença de células humanas tanto nas zonas remotas quanto fronteiriças dos corações. Um grande número de células humanas foi detectado mergulhadas na parede vascular ou entre as células do receptor. Além disso, alguns cardiomiócitos foram positivos para células Alu e Alu positivas, expressaram troponina I (Figura 9B) e alfa actinina lisa (Figura 9D). Isso evidencia certo potencial de diferenciação cardíaca de células CD271+. Células humanas também foram detectadas nos corações de animais injetados com a dose elevada de MSCs, e novamente essas células estavam embutidas na parede vascular ou entre cardiomiócitos do receptor. Não houve detecção de cardiomiócitos de coloração Alu ou expressão de marcadores cardíacos em células Alu positivas nos corações de animais injetados com altas doses de MSCs.

Discussão

[0154] As células CD271+ estavam presentes em baixa frequência nas células da BM, que consistem em cerca de 0,3% da população de MNCs da BM. Utilizando reagentes e dispositivos de seleção Miltenyi MACS, uma população altamente purificada de células CD271+ foram isoladas, com pureza acima de 90% e uma recuperação média de 4,2 x 105 células de uma aspiração da BM de 25 cc. A morfologia das células CD271+ demonstrou um fenótipo primitivo de células blásticas uniformes constituído por uma baixa relação entre citoplasma nuclear. Os dados confirmaram o enriquecimento de células formadoras de MSCs na população CD271+ com um nível 60 vezes maior de CFU-F em células CD271+ em comparação com MNCs da BM. Além disso, a frequência de CFU-F na população negativa CD271 foi bastante reduzida em 1 em 100.000 células em comparação com 1 em 12.500 na população MNC da BM e 500 vezes mais baixa do que a população CD271+. As MSCs geradas de células CD271+, por aderência a frascos plásticos, apresentaram-se idênticas nas propriedades in vitro como MSCs gerados a partir de MNCs da BM com expressão de CD105+ e capazes de formar adipócitos e osteoblastos in vitro. Estudos anteriores demonstraram que o potencial de MSC reside na população de células CD271+CD45-. Além disso, a análise fenotípica demonstrou que as células CD271+ eram negativas para marcadores de MSC típicos. incluindo CD105 e CD90, no entanto, após o cultivo, as células expressavam marcadores MSC clássicos: CD105, CD90 e CD73. A expressão CD271 adicional inibe mais a diferenciação de MSCs para linhagens osteogênicas, adipogênicas e miogênicas. Os dados aqui, são consistentes com a literatura e apoiar a proposta de que as células CD271 + são uma população de células estaminais que é um precursor de MSCs e que a diferenciação de células CD271 + para plásticos resultados aderentes MSCs em compromisso com a adipogénicos, linhagens condrogênicos e osteogénico.

[0155] Experimentos adicionais foram realizados in vitro para avaliar as metodologias para a geração de MSCs em condições de cultivo não aderentes. Dado o foco deste laboratório na reparação cardíaca se a hipótese de que o MSC gerado como plástico células aderentes pode não ser ideal para a regeneração cardíaca. Na BM, MSCs têm a superfície óssea para actuar como um substrato para o crescimento de células aderentes, no entanto, não existe equivalente de substrato no tecido do coração. Portanto condições de cultura foram desenvolvidos para a expansão das MSCs em condições não aderentes (NA-MSCs). Células CD271+ foram cultivadas em sacos de teflon, o que minimiza a adesão de células e regulares de massagem dos sacos mantidas as células em suspensão. Como mostrado na secção de resultados, as MSCs proliferaram nos sacos que formam esferas de células com propriedades de MSC, formando MSC aderente clássico como células quando colocadas em frascos plásticos padrão e expressando CD105. O NA-MSCs também diferenciadas em adipócitos e condrócitos, sob condições de cultura adequadas. A capacidade osteogênica do NA-MSCs está atualmente sendo avaliado. A capacidade osteogênica das NA-MSCs está atualmente sendo atualmente sendo avaliado. Meios condicionados por células estromais derivadas de tecido do coração humano fetal também estimula a expressão de genes cardíacos. Estes dados evidenciam que as células CD271 + pode ter uma maior capacidade de diferenciação em comparação com plástico aderente MSCs gerada que não conseguiu expressar genes cardíacos quando cultivadas em condições idênticas. O potencial em humanos in vivo de células CD271+ foram avaliados imuno-comprometidos NOD / SCID após a indução de um enfarte do miocárdio.

[0156] O potencial em humanos in vivo de células CD271+ foram avaliados imuno-comprometidos NOD / SCID após a indução de um enfarte do miocárdio. Para comparação humano MSCs isoladas e expandidas utilizando a aderência a frascos de plástico padrão foram injetados e um grupo de controle de animais que receberam a injecção de . A injecção de 120 mil células CD271+ resultou na melhoria da função cardíaca em comparação com ratinhos injetados com o número equivalente de MSCs e os animais de controlo com o aumento da fracção de ejecção. Resultados equivalentes foram obtidos para os animais injetados com uma dose mais elevada de MSCs. Estes dados evidenciam que o potencial das células CD271 + é maior do que as MSCs em doses equivalentes de células. Além disso, a expressão de marcadores cardíacos foram detectados em células humanas em animais injetados com células CD271 +, mas não animais injetados com MSCs, consistente com os dados in vitro que demonstram um potencial cardíaca das células CD271 +, mas não as MSCs.

[0157] Diversos grupos que avaliam o potencial de medula óssea várias populações derivadas incluindo células mononucleares, células CD34+, CD133+ e MSCs. Neste estudo, o potencial da BM MSCs derivada foi avaliada em estudos pré- clínicos com animais grandes e demonstrou-se que as MSCs podem enxertar na e adjacente à cicatriz infarto crónicas e estimular a recuperação do miocárdio significativos, incluindo reduções substanciais no tamanho do enfarte, inverter a remodelação do coração lesado, e aumentos tanto a contratilidade miocárdica e perfusão tecidual. Estes estudos pré-clínicos levaram a ensaios clínicos em curso de MSCs na Universidade de Miami. Um desses estudos foi realizado em pacientes com disfunção ventricular esquerda isquêmica crônica secundária a enfarte do miocárdio que são submetidos à cirurgia cardíaca para revascularização do miocárdio (CABG). Inscrição para este ensaio tem sido limitado devido à urgência de pacientes submetidos a cirurgia de bypass e apenas um pequeno número de pacientes é capaz de esperar as 5-6 semanas necessárias para gerar MSCs autólogas. Estes BM derivados CD271+ células representam uma fonte ideal de células autólogas para estes pacientes. As células CD271 + pode ser isolado a partir de um aspirado de BM dentro de 4 a 5 horas proporcionando uma população de células disponíveis para o tratamento de pacientes operados que necessitam de cirurgia de urgência. Estes estudos proporcionam evidência de que a BM derivados células CD271+ oferecem uma população celular única para o estudo da reparação cardíaca. Comparado com MSCs isoladas por aderência ao plástico, as células CD271+ tem um potencial de diferenciação in vitro maior cardíaca e no tratamento de ratinhos após um resultado de MI em grande melhora na função cardíaca. As células CD271 + pode ser isolado rapidamente usando a seleção magnética de células, portanto, poderia ser uma fonte de células potencial para pacientes que necessitam de cirurgia de bypass.

[0158] Embora a invenção tenha sido ilustrada e descrita em relação a uma ou mais das implementações, alterações e modificações equivalentes ocorrerão a outros peritos na área após a leitura e compreensão desta especificação e dos desenhos anexos. Além disso, embora uma característica específica da invenção possa ter sido divulgada com relação a apenas uma das várias implementações, tal característica pode ser combinada com uma ou mais outras características das outras implementações, pois pode ser desejável e vantajoso para uma dada aplicação ou alguma em particular.

[0159] O resumo da divulgação permitirá que o leitor ateste rapidamente a natureza da divulgação técnica. Ele é enviado com o entendimento de que não será usado para interpretar ou limitar o escopo ou significado dos requerimentos a seguir. Lista de Referências (1) Lloyd-Jones D, Adams R, Carnethon M, De SG, Ferguson TB, Flegal K, Ford E, Furie K, Go A, Greenlund K, Haase N, Hailpern S, Ho M, Howard V, Kissela B, Kittner S, Lackland D, Lisabeth L, Marelli A, McDermott M, Meigs J, Mozaffarian D, Nichol G, O'Donnell C, Roger V, Rosamond W, Sacco R, Sorlie P, Stafford R, Steinberger J, Thom T, Wasserthiel-Smoller S, Wong N, Wylie-Rosett J, Hong Y. Heart disease and stroke statistics--2009 update: a report from the American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee. Circulation 2009;119(3):480-486. PMID: 19171871 (2) Fang J, Mensah GA, Croft JB, Keenan NL. Heart failure- related hospitalization in the U.S., 1979 to 2004. J Am Coll Cardiol 2008;52(6):428-434. PMID: 18672162 (3) Verma A, Meris A, Skali H, Ghali JK, Arnold JM, Bourgoun M, Velazquez EJ, McMurray JJ, Kober L, Pfeffer MA, Califf RM, Solomon SD. Prognostic implications of left ventricular mass and geometry following myocardial infarction: the VALIANT (VALsartan In Acute myocardial iNfarcTion) Echocardiographic Study. JACC Cardiovasc Imaging 2008;1(5):582-591. PMID: 19356485 (4) Krause K, Jaquet K, Schneider C, Haupt S, Lioznov MV, Otte KM, Kuck KH. Percutaneous intramyocardial stem cell injection in patients with acute myocardial infarction: first- in-man study. Heart 2009;95(14):1145-1152. PMID: 19336430 (5) Hirsch A, Nijveldt R, van d, V, Tio RA, van der Giessen WJ, Marques KM, Doevendans PA, Waltenberger J, Ten Berg JM, Aengevaeren WR, Biemond BJ, Tijssen JG, van Rossum AC, Piek JJ, Zijlstra F. Intracoronary infusion of autologous mononuclear bone marrow cells in patients with acute myocardial infarction treated with primary PCI: Pilot study of the multicenter HEBE trial. Catheter Cardiovasc Interv 2008;71(3):273-281. PMID: 18288734 (6) Hare JM. Translational development of mesenchymal stem cell therapy for cardiovascular diseases. Tex Heart Inst J 2009;36(2):145-147. PMID: 19436809 (7) Quevedo HC, Hatzistergos KE, Oskouei BN, Feigenbaum GS, Rodriguez JE, Valdes D, Pattany PM, Zambrano JP, Hu Q, McNiece I, Heldman AW, Hare JM. Allogeneic mesenchymal stem cells restore cardiac function in chronic ischemic cardiomyopathy via trilineage differentiating capacity. Proc Natl Acad Sci U S A 2009;106(33):14022-14027. PMID: 19666564 (8) Schuleri KH, Feigenbaum GS, Centola M, Weiss ES, Zimmet JM, Turney J, Kellner J, Zviman MM, Hatzistergos KE, Detrick B, Conte JV, McNiece I, Steenbergen C, Lardo AC, Hare JM. Autologous mesenchymal stem cells produce reverse remodelling in chronic ischaemic cardiomyopathy. Eur Heart J 2009;30(22):2722-2732. PMID: 19586959 (9) Schuleri KH, Boyle AJ, Centola M, Amado LC, Evers R, Zimmet JM, Evers KS, Ostbye KM, Scorpio DG, Hare JM, Lardo AC. The adult Gottingen minipig as a model for chronic heart failure after myocardial infarction: focus on cardiovascular imaging and regenerative therapies. Comp Med 2008;58(6):568- 579. PMID: 19149414 (10) Avison DL, DeFaria W, Tryphonopoulos P, Tekin A, Attia GR, Takahashi H, Jin Y, Palaios E, Pararas N, Carreno MR, Santiago S, Bazer F, Ruiz P, Tzakis A. Heterotopic uterus transplantation in a swine model. Transplantation 2009;88(4):465-469. PMID: 19696628 (11) Ishikawa Y, Hirakata A, Griesemer AD, Etter J, Moran S, Weiner J, Shimizu A, Yamada K. Tolerance and Long-Lasting Peripheral Chimerism After Allogeneic Intestinal Transplantation in MGH Miniature Swine. Transplantation 2010;89(4):417-426. PMID: 20177343 (12) Pijnappels DA, Schalij MJ, Ramkisoensing AA, van TJ, de Vries AA, van der LA, Ypey DL, Atsma DE. Forced alignment of mesenchymal stem cells undergoing cardiomyogenic differentiation affects functional integration with cardiomyocyte cultures. Circ Res 2008;103(2):167-176. PMID: 18556577 (13) Kruglyakov PV, Sokolova IB, Zin'kova NN, Viide SK, Aleksandrov GV, Petrov NS, Polyntsev DG. In vitro and in vivo differentiation of mesenchymal stem cells in the cardiomyocyte direction. Bull Exp Biol Med 2006;142(4):503-506. PMID: 17415448 (14) Silva GV, Litovsky S, Assad JA, Sousa AL, Martin BJ, Vela D, Coulter SC, Lin J, Ober J, Vaughn WK, Branco RV, Oliveira EM, He R, Geng YJ, Willerson JT, Perin EC. Mesenchymal stem cells differentiate into an endothelial phenotype, enhance vascular density, and improve heart function in a canine chronic ischemia model. Circulation 2005;111(2):150-156. PMID: 15642764 (15) Amado LC, Saliaris AP, Schuleri KH, St JM, Xie JS, Cattaneo S, Durand DJ, Fitton T, Kuang JQ, Stewart G, Lehrke S, Baumgartner WW, Martin BJ, Heldman AW, Hare JM. Cardiac repair with intramyocardial injection of allogeneic mesenchymal stem cells after myocardial infarction. Proc Natl Acad Sci U S A 2005;102(32):11474-11479. PMID: 16061805 (16) Amado LC, Schuleri KH, Saliaris AP, Boyle AJ, Helm R, Oskouei B, Centola M, Eneboe V, Young R, Lima JA, Lardo AC, Heldman AW, Hare JM. Multimodality noninvasive imaging demonstrates in vivo cardiac regeneration after mesenchymal stem cell therapy. J Am Coll Cardiol 2006;48(10):2116-2124. PMID: 17113001 (17) Schuleri KH, Amado LC, Boyle AJ, Centola M, Saliaris AP, Gutman MR, Hatzistergos KE, Oskouei BN, Zimmet JM, Young RG, Heldman AW, Lardo AC, Hare JM. Early improvement in cardiac tissue perfusion due to mesenchymal stem cells. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2008;294(5):H2002-H2011. PMID: 18310523 (18) Hare JM, Traverse JH, Henry TD, Dib N, Strumpf RK, Schulman SP, Gerstenblith G, DeMaria AN, Denktas AE, Gammon RS, Hermiller JB, Jr., Reisman MA, Schaer GL, Sherman W. A randomized, double-blind, placebo-controlled, dose-escalation study of intravenous adult human mesenchymal stem cells (prochymal) after acute myocardial infarction. J Am Coll Cardiol 2009;54(24):2277-2286. PMID: 19958962 (19) Amado LC, Gerber BL, Gupta SN, Rettmann DW, Szarf G, Schock R, Nasir K, Kraitchman DL, Lima JA. Accurate and objective infarct sizing by contrast-enhanced magnetic resonance imaging in a canine myocardial infarction model. J Am Coll Cardiol 2004;44(12):2383-2389. PMID: 15607402 (20) Schuleri KH, Centola M, George RT, Amado LC, Evers KS, Kitagawa K, Vavere AL, Evers R, Hare JM, Cox C, McVeigh ER, Lima JA, Lardo AC. Characterization of peri-infarct zone heterogeneity by contrast-enhanced multidetector computed tomography: a comparison with magnetic resonance imaging. J Am Coll Cardiol 2009;53(18):1699-1707. PMID: 19406346

Claims (11)

1. Uso de uma quantidade terapeuticamente eficaz de células precursoras de células-tronco mesenquimais (MSC) CD271+ isoladas da medula óssea de um indivíduo e cultivadas sob condições não aderentes caracterizado por ser na fabricação de um medicamento para o tratamento terapêutico ou prevenção de uma doença ou distúrbio cardiovascular, em que as células precursoras MSC CD271+ cultivadas são capazes de enxertar em um coração in vivo em zonas do infarto e zonas fronteiriças.

2. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as células precursoras MSC CD271+ são isoladas das células da medula óssea, possuindo um receptor de crescimento dos nervos de baixa afinidade (NGFR; CD271).

3. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as células precursoras MSC CD271+ são isoladas dos doadores, compreendendo: autólogo, isogênico, alogênico ou xenogênico.

4. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as células precursoras MSC CD271+ se diferenciam em pelo menos uma linhagem, compreendendo: linhagens do miocárdio, vascular ou endotelial.

5. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as células precursoras MSC CD271+ se diferenciam em linhagens, compreendendo: linhagens do miocárdio, vascular ou endotelial.

6. Uso de acordo com a reivindicação 4 ou 5, caracterizado pelo fato de que as células do miocárdio são identificadas por marcadores, compreendendo: GATA-4, Nkx2.5 ou X-actina ou α-actina sarcomérica.

7. Uso de acordo com a reivindicação 4 ou 5, caracterizado pelo fato de que as células vasculares são identificadas por marcadores, compreendendo: α-actina de músculo liso ou SMA22.

8. Uso de acordo com a reivindicação 4 ou 5, caracterizado pelo fato de que as células endoteliais são identificadas por marcadores, compreendendo: CD31 ou vimentina.

9. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o medicamento compreende um ou mais agentes compreendendo pelo menos um dos seguintes: citocinas, fatores quimiotáticos, fatores de crescimento ou fatores de diferenciação.

10. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a doença ou distúrbio cardiovascular compreende: insuficiência cardíaca, aterosclerose, isquemia, infarto do miocárdio, transplante, hipertensão, restenose, angina de peito, doença cardíaca reumática ou disfunção cardiovascular congênita.

11. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as células precursoras MSC CD271+ são condicionadas com meio condicionado por células estromais derivadas do coração.

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