JP6777840B2 - 脳梗塞の治療用医薬 - Google Patents

Description

本発明は、間葉系幹細胞を含む虚血性血管障害の治療薬に関する。より詳しくは、本発明は、血栓溶解療法等の閉塞血管の再開通療法に伴う脳出血のリスクを低減し、その投与可能時間を延長することが可能な虚血性血管障害の治療薬に関する。

脳梗塞は、脳動脈の閉塞または狭窄のために脳虚血を来たし、脳組織が壊死またはこれに近い状態になる病態を言う。脳梗塞（とくに急性期又は超急性期の脳梗塞）や心筋梗塞では、虚血による壊死を防止するため、血栓溶解あるいは血栓の物理的除去が治療の第一選択となる。しかしながら、閉塞血管の再開通はしばしば脳出血のリスクを伴うという問題がある。

ｔ−ＰＡ静注療法は、ウロキナーゼ等の他の血栓溶解剤に比べて血栓溶解活性が高く、出血のリスクも低いため、超急性期又は急性期脳梗塞の再開通治療において、標準治療となっている。しかし、ｔ−ＰＡによる治療効果は時間とともに低下し、出血のリスクが高まるため、その治療は通常発症から４．５時間以内に開始しなければならない。そこで、出血のリスクを減らし、ｔ−ＰＡによる治療可能時間を延長するために、内皮障害を抑制する新たな治療が求められている。

一方、間葉系幹細胞（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ：ＭＳＣ）には脳（実質及び血管）の保護作用があることが知られている。脳梗塞後のＭＳＣ投与は、梗塞体積を減らし、行動機能を改善することが、実験的梗塞モデルを用いて確認されている（非特許文献１〜３、特許文献１）。また、ＭＳＣの静脈投与による脳梗塞患者の治療も多数実施され、運動機能や損傷部位の改善が報告されている（非特許文献４、特許文献２）。

ＷＯ２００２／０００８４９号 ＷＯ２００９／００２５０３号

Iihoshi S. et al., Brain Res. 2004;1007:1-9. Nomura T. et al., Neuroscience. 2005;136:161-169. Honma T. et al., Exp. Neurol. 2006;199:56-66. Honmou O. et al., Brain. 2011;134:1790-1807.

本発明の課題は、閉塞血管の再開通療法に伴う脳出血の新たな治療方法を提供することにある。とくに、血栓溶解療法に伴う脳出血のリスクを低減し、虚血性血管障害に伴う運動機能及び高次機能の障害を治療するための手段を提供することにある。

発明者らは、動脈に塞栓糸を挿入することで誘導した一過性中大脳動脈閉塞モデルに対し、ＭＳＣの静脈投与をｒｔ−ＰＡによる血栓溶解療法と併用することで、出血性梗塞が顕著に抑制され、経時的な運動機能も良好な改善を示すことを確認した。

すなわち、本発明は以下の（１）〜（１８）に関する
（１）閉塞血管の再開通療法と併用されることを特徴とする、間葉系幹細胞を含む虚血性血管障害の治療用医薬；
（２）閉塞血管の再開通療法に伴う脳出血のリスクを低減することを特徴とする、上記（１）記載の医薬；
（３）閉塞血管の再開通療法が、血栓溶解剤、血小板凝集阻害薬、及び血液凝固阻害薬の投与、ならびに血栓の物理的除去から選ばれるいずれか１又は２以上を含む、上記（１）又は（２）に記載の医薬；
（４）閉塞血管の再開通療法が血栓溶解剤の投与を含む、上記（１）〜（３）のいずれか１に記載の医薬；
（５）血栓溶解剤がプラスミノーゲンアクチベーターである、上記（４）に記載の医薬；
（６）血栓溶解剤の投与可能な時間を延長することを特徴とする、上記（３）〜（５）のいずれか１に記載の医薬；
（７）虚血性血管障害が虚血性脳血管障害又は心筋梗塞である、上記（１）〜（６）のいずれか１に記載の医薬；
（８）虚血性血管障害が超急性期又は急性期の虚血性脳血管障害又は急性心筋梗塞である、上記（１）〜（６）のいずれか１に記載の医薬；
（９）間葉系幹細胞が骨髄由来の間葉系幹細胞である、上記（１）〜（８）のいずれか１に記載の医薬；
（１０）間葉系幹細胞を含む、閉塞血管の再開通療法に伴う脳出血を予防するための医薬。
（１１）閉塞血管の再開通療法が、血栓溶解剤、血小板凝集阻害薬、及び血液凝固阻害薬の投与、ならびに血栓の物理的除去から選ばれるいずれか１又は２以上を含む、上記（１０）に記載の医薬；
（１２）閉塞血管の再開通療法が血栓溶解剤の投与を含む、上記（１０）又は（１１）に記載の医薬；
（１３）血栓溶解剤がプラスミノーゲンアクチベーターである、上記（１２）に記載の医薬；
（１４）血栓溶解剤の投与可能な時間を延長することを特徴とする、上記（１１）〜（１３）のいずれか１に記載の医薬；
（１５）虚血性血管障害の患者に使用される、上記（１０）〜（１４）のいずれか１に記載の医薬；
（１６）虚血性血管障害が虚血性脳血管障害又は心筋梗塞である、上記（１５）に記載の医薬；
（１７）虚血性血管障害が超急性期又は急性期の虚血性脳血管障害又は心筋梗塞である、上記（１５）又は（１６）に記載の医薬；
（１８）間葉系幹細胞が骨髄由来の間葉系幹細胞である、上記（１０）〜（１７）のいずれか１に記載の医薬。

本発明によれば、ｔ−ＰＡ療法等の閉塞血管の再開通療法に伴う脳出血のリスクが低減されるとともに、ＭＳＣの治療効果（運動機能の改善、梗塞病変の減少）が向上するという相乗効果が達成される。また、脳出血のリスクが低減されることにより、通常発症４．５時間とされるｔ−ＰＡ療法等、血栓溶解療法の適用可能時間が延長可能となる。

図１は実験プロトコルの概要を示す。中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）の６０分後にＤＷＩを取得し、無作為に４群に分けた後、閉塞を再開通させてｒｔ−ＰＡか生理食塩水を投与し（閉塞後９０分）、さらに３０分後に培地かＭＳＣを投与する。 図２はｒｔ−ＰＡ療法とＭＳＣ投与の併用後における急性出血の発症を示す。Ａ：各グループ（生理食塩水＋培地、ｒｔ−ＰＡ＋培地、生理食塩水＋ＭＳＣ、ｒｔ−ＰＡ＋ＭＳＣ）の画像、Ｂ：１日目における脳出血の発症率、Ｃ：１日目におけるＴ２ＷＩ−ＭＲＩで評価した出血体積（＊＊Ｐ＜０．０１，＊Ｐ＜０．０５，Ｔｕｋｅｙ’ｓ ｐｏｓｔ−ｈｏｃ ｔｅｓｔ）。 図３はゼラチンザイモグラフィーの結果を示す。Ａ：ＭＭＰ−９の発現量（左から、マーカー、シャム、対側：生理食塩水＋培地、ｒｔ−ＰＡ＋培地、生理食塩水＋ＭＳＣ、ｒｔ−ＰＡ＋ＭＳＣ、同側：生理食塩水＋培地、ｒｔ−ＰＡ＋培地、生理食塩水＋ＭＳＣ、ｒｔ−ＰＡ＋ＭＳＣ）。Ｂ：デンシトメトリー測定によるＭＭＰ−９活性（＊＊Ｐ＜０．０１，Ｔｕｋｅｙ’ｓ ｐｏｓｔ−ｈｏｃ ｔｅｓｔ）。 図４は、ＭＲＩ解析による虚血病変部位の特性を示す。Ａ：各グループにおける閉塞前のＤＷＩ（カラム１）、再開通後４日目（カラム２）、７日目（カラム３）、１４日目（カラム４）、２８日目（カラム５）のＴ２ＷＩ。Ｂ：ＤＷＩ（閉塞前）及び再開通後１、４、７、１４、２１、２８日目のＴ２ＷＩで評価した各グループの病変体積。Ｃ：ＰＷＩで評価したｒＣＢＦ（＊＊Ｐ＜０．０１，＊Ｐ＜０．０５，Ｔｕｋｅｙ’ｓ ｐｏｓｔ−ｈｏｃ ｔｅｓｔ）。 図５は、トレッドミル負荷試験の結果を示す。各グループにつき、再開通後１日目、４日目、７日目、１４日目、２１日目、２８日目において、ラットがトレッドミル上を走行できた最大速度（＊＊Ｐ＜０．０１，＊Ｐ＜０．０５，Ｔｕｋｅｙ’ｓ ｐｏｓｔ−ｈｏｃ ｔｅｓｔ）。

１．虚血性血管障害治療薬
本発明は、閉塞血管の再開通療法（例えば、血栓溶解剤、血小板凝集阻害薬、血液凝固阻害薬を含む医薬の投与や血栓の物理的除去）と併用されることを特徴とする、間葉系幹細胞を含む虚血性血管障害の治療用医薬に関する。

［間葉系幹細胞］
本発明で使用される間葉系幹細胞とは、間葉系組織の間質細胞の中に微量に存在する多分化能および自己複製能を有する幹細胞であり、骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞などの結合組織細胞に分化するだけでなく、神経細胞や心筋細胞への分化能を有することが知られている。

間葉系幹細胞のソースとしては、骨髄、末梢血、臍帯血、胎児胚、脳などが挙げられるが、骨髄由来の間葉系幹細胞（骨髄間葉系幹細胞）、とくにヒト骨髄間葉系幹細胞が好ましい。骨髄由来の間葉系幹細胞は、１）顕著な効果が期待できる、２）副作用の危険性が低い、３）充分なドナー細胞の供給が期待できる、４）非侵襲的な治療であり自家移植が可能であるので、５）感染症のリスクが低い、６）免疫拒絶反応の心配がない、７）倫理的問題がない、８）社会的に受け入れられやすい、９）一般的な医療として広く定着しやすいなどの利点がある。さらに、骨髄移植療法は既に臨床の現場で用いられている治療であり、安全性も確認されている。また、骨髄由来の幹細胞は遊走性が高く、局所への移植ばかりか、静脈内投与によっても目的の損傷組織へ到達し、治療効果が期待できる。

細胞はＥＳ細胞や誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞等）から分化誘導した細胞であっても、株化された細胞であっても、生体から単離・増殖させた細胞であってもよい。細胞は、他家細胞由来でも自家細胞由来であってもよいが、自家細胞由来（患者自身の細胞に由来する）間葉系幹細胞が好ましい。

本発明で使用される間葉系幹細胞は未分化な状態であることが好ましい。未分化な状態の細胞は増殖率および生体内導入後の生存率が高いからである。発明者らは、そのような細胞の取得方法も開発しており、その詳細はＷＯ２００９／００２５０３号に記載されている。

発明者らが開発した前記方法では、骨髄液等から抗凝固剤（ヘパリン等）と実質的に接触しない条件で分離した細胞を、ヒト血清（好ましくは、自家血清）を含み、かつ、抗凝固剤（ヘパリン等）を含まないかあるいは極めて低濃度で含む培地を用いて増殖させる。

培地における細胞の密度は、細胞の性質および分化の方向性に影響を与える。間葉系幹細胞の場合、培地中の細胞密度が８，５００個／ｃｍ²を超えると、細胞の性質が変化してしまうため、最大でも８，５００個／ｃｍ²以下で継代培養させることが好ましく、より好ましくは、５，５００個／ｃｍ²以上になった時点で継代培養させる。

発明者らが開発した前記方法ではヒト血清含有培地を使用するため、血清ドナーの負担を考慮して、培地交換はなるべく少ない回数であることが望ましく、例えば、少なくとも週１回、より好ましくは週１〜２回の培地交換を行う。

培養は、細胞の総数が１０⁸個以上になるまで継代培養を繰り返し行う。必要とされる細胞数は、使用目的に応じて変化し得るが、例えば、脳梗塞などの虚血性脳疾患の治療のための移植に必要とされる間葉系幹細胞の数は、１０⁷個以上と考えられている。発明者らが開発した方法によれば、１２日間程度で１０⁷個の間葉系幹細胞を得ることができる。

増殖したＭＳＣは、必要に応じて、使用されるまで凍結保存などの手法で（例えば、−１５２℃のディープフリーザーにて）保存してもよい。凍結保存には、血清（好ましくはヒト血清、より好ましくは自家血清）、デキストラン、ＤＭＳＯを含む培地（ＲＰＭＩ等の哺乳動物細胞用の培地）を凍結保存液として使用する。例えば、通常の濾過滅菌したＲＰＭＩ２０．５ｍＬと、患者から採取した自己血清２０．５ｍＬ、デキストラン５ｍＬ、ＤＭＳＯ ５ｍＬを含む凍結保存液に細胞を懸濁して−１５０℃で凍結保存することができる。例えば、ＤＭＳＯとしては、ニプロ株式会社製のクライオザーブ、デキストランは大塚製薬製の低分子デキストランＬ注を使用できるが、これらに限定されない。

本発明の医薬に含まれるＭＳＣの細胞数は多い程好ましいが、対象への投与時期や、培養に要する時間を勘案すると、効果を示す最小量であることが実用的である。したがって、本発明の医薬の好ましい態様において、間葉系幹細胞の細胞数は、１０⁷個以上、好ましくは５×１０⁷個以上、より好ましくは１０⁸個以上、さらに好ましくは５×１０⁸個以上である。

本発明の医薬は、好ましくは非経口投与製剤、より好ましくは非経口全身投与製剤、特に静脈内投与製剤である。非経口投与に適した剤形としては、溶液性注射剤、懸濁性注射剤、乳濁性注射剤、用時調製型注射剤等の注射剤や移植片などが挙げられる。非経口投与用製剤は、水性または非水性の等張性無菌溶液または懸濁液の形態であり、例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、培地（とくに、ＲＰＭＩ等の哺乳動物細胞の培養に用いられる培地）、ＰＢＳなどの生理緩衝液、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、賦形剤、ビヒクル、防腐剤、結合剤等とを適宜組み合わせて、適切な単位投与形態に製剤化される。

注射用の水溶液としては、例えば、生理食塩水、培地、ＰＢＳなどの生理緩衝液、ブドウ糖やその他の補助剤を含む等張液、例えばＤ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウム等が挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールや非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０等と併用してもよい。

［虚血性血管障害］
本発明の医薬は虚血性血管障害を治療するために使用される。虚血性血管障害とは、動脈血流の減少により、局所的な血管障害（例えば、変性、閉塞）を呈する状態を言い、例えば、虚血性脳血管障害や虚血性心疾患を挙げることができる。

［虚血性脳血管障害］
本発明の医薬は虚血性脳血管障害を治療するために使用される。前述のとおり、ＭＳＣには脳（実質及び血管）の保護作用があることが知られており、既に静脈投与による脳梗塞等の虚血性脳血管障害の治療にも使用されている。

虚血性脳血管障害としては、例えば、脳梗塞（例えば、アテローム血栓性脳梗塞、脳血栓、脳塞栓、ラクナ梗塞、ＢＡＤ（Ｂｒａｎｃｈ Ａｔｈｅｒｏｍａｔｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ）、Ｔｒｏｕｓｓｅａｕ症候群、血液凝固異常、動脈解離、静脈梗塞、血管炎、抗リン脂質抗体症候群）、及び一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）等が挙げられる。

［虚血性心疾患］
本発明の医薬は心筋梗塞等の虚血性心疾患を治療するためにも使用される。心筋梗塞は心臓に酸素や栄養を供給する冠動脈血管に閉塞や狭窄が起きて血液の流量が下がり、心筋が虚血状態になり壊死する状態を言う。

本発明の医薬は、閉塞血管の再開通療法、とくに血栓溶解療法が適用される超急性期（８時間以内）又は急性期（８時間〜２４時間）の虚血性脳血管障害や急性心筋梗塞（発症から３日以内）に適しているが、適用時期は患者の症状に応じて適宜判断する。

［血栓溶解剤］
虚血性血管障害（とくに急性期又は超急性期の虚血性脳血管障害や心筋梗塞）では、虚血による壊死を防止するため、血栓溶解あるいは血栓の物理的除去等による閉塞血管の再開通が治療の第一選択となる。

血栓溶解剤は、ウロキナーゼ、プロウロキナーゼ、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔｉｓｓｕｅ−Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ:ｔ−ＰＡ）、ナサルプラーゼ、ストレプトキナーゼ等が挙げられる。

現在使用されているｔ−ＰＡはいずれも組換え型ｔ−ＰＡ（ｒｔ−ＰＡ）である。ｒｔ−ＰＡには、天然型ｔ−ＰＡと同じアミノ酸配列を有するアルテプラーゼ（ａｌｔｅｐｌａｓｅ）、チソキナーゼ（ｔｉｓｏｋｉｎａｓｅ）のほか、半減期延長のためにアミノ酸改変を加えたパミテプラーゼ（ｐａｍｉｔｅｐｌａｓｅ）等がある。現在、国内で販売されているｔ−ＰＡを含む医薬としては、アクチバシン（ＡＣＴＩＶＡＣＩＮ）（登録商標）注、グルトパ（ＧＲＴＰＡ）（登録商標）注、クリアクター（Ｃｌｅａｃｔｏｒ）（登録商標）注が市販されており、前二者は虚血性脳血管障害及び急性心筋梗塞への適用が承認されている。また、後一者は、急性心筋梗塞と急性肺塞栓症への適用が承認されている。

血栓溶解剤は、血栓を溶解することで虚血を改善し、脳組織の壊死を防止することができるが、一方で出血のリスクが伴う。また、ウロキナーゼは発症６時間以内、ｔ−ＰＡは発症４．５時間以内と言うように、投与可能時間が限られている。

ｔ−ＰＡは血栓の主成分であるフィブリンを溶解するプラスミンを活性化させることにより他の血栓溶解剤よりも高い血栓溶解力を有するため、現在血栓溶解療法の第一選択となっている。また、ｔ−ＰＡは血小板凝集阻害薬及び血液凝固阻害薬としての作用も併せ持つ。しかしながら、前述のように、脳出血のリスクと４．５時間と言う短い投与可能時間がその適用を制限している。

本発明の医薬は、血栓溶解剤を含む医薬、とくにｔ−ＰＡを含む医薬と併用されることにより、その脳出血のリスクを低減させ、その投与可能時間を延長させることができる。

［血小板凝集阻害薬（抗血小板薬）］
血小板凝集阻害薬（抗血小板薬）は、血小板の凝集を阻害することで血栓形成を予防することができる。血小板凝集阻害薬としては、例えば、アスピリン、クロピドグレル、シロスタゾール、チクロピジン等が挙げられるが、これらに限定されない。

［血液凝固阻害薬（抗凝固剤）］
血液凝固阻害薬（抗凝固剤）は、凝固因子の機能を阻害することで血栓形成を予防することができる。血液凝固阻害薬としては、例えば、ヘパリン、低分子ヘパリン、アルガトロバン、ダナパロイドナトリウム、ダルテパリン、ナドロパリン、ベミパリン、フォンダパリヌクス、アルガトロバン等のアンチトロンビン剤等が挙げられるが、これらに限定されない。

本発明の医薬は、閉塞血管の再開通療法の前に適用しても、後に適用しても、同時に適用してもよい。本発明の医薬（ＭＳＣ）は、静脈投与という簡便な方法により、容易に患部に到達することができる。

［血栓の物理的除去］
血栓の物理的除去方法は、血管内手術等による機械的血栓回収療法や頚動脈内膜剥離術などが挙げられるが、これらに限定されない。また、バイパス手術、ステント治療、バルーン治療、吸引治療、超音波等による破砕等、による血流再開等でも良い。

［相乗効果］
本発明の医薬は、閉塞血管の再開通療法（例えば、血栓溶解剤、血小板凝集阻害薬、血液凝固阻害薬を含む医薬の投与や血栓の物理的除去）と併用されることで、閉塞血管の再開通療法に伴う脳出血のリスクを軽減することができる。とくに、血栓溶解剤ではその投与可能時間が短いことがその適用を制限しているが、本発明の医薬は、血栓溶解剤の投与可能な時間を延長することができる。例えば、本発明の医薬を併用することにより、ｔ−ＰＡの投与可能時間は少なくとも４．５時間、６時間、８時間、１２時間、２４時間あるいはそれ以上延長されることが期待できる。

さらに、血栓溶解剤は、微小循環を改善させることで、ＭＳＣの治療効果を向上させ、ＭＳＣによる運動機能の改善、組織修復効果を単独投与の場合に比べて顕著に増大させる。このように、血栓溶解剤を含む医薬と本発明の医薬の併用は、単独投与からは予測できない、相乗的効果をもたらす。

２．閉塞血管の再開通療法に伴う脳出血の予防薬
本発明は、間葉系幹細胞を含む、閉塞血管の再開通療法（例えば、血栓溶解剤、血小板凝集阻害薬、血液凝固阻害薬を含む医薬の投与や血栓の物理的除去等）に伴う脳出血を予防するための医薬も提供する。前述のとおり、虚血性血管障害における閉塞血管の再開通療法には脳出血のリスクを伴うが、本発明の医薬は、ＭＭＰ（Ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）−９活性化を抑制することで、これに伴う内皮障害を抑制し、脳出血のリスクを低減させることができる。

３．虚血性血管障害の治療方法
本発明は、閉塞血管の再開通療法（血栓溶解剤、血小板凝集阻害薬、血液凝固阻害薬を含む医薬の投与や血栓の物理的除去等）と、ＭＳＣを含む医薬を併用することを特徴とする虚血性血管障害の治療方法を提供する。一実施形態において、閉塞血管の再開通療法はｔ−ＰＡ等の血栓溶解剤の投与、あるいは血栓の物理的除去を含む。また、対象となる疾患は、好適には、脳梗塞等の虚血性脳血管障害や心筋梗塞等の虚血性心疾患であり、より好適には超急性期又は急性期の虚血性脳血管障害（脳梗塞等）及び急性心筋梗塞である。

また、本発明は、閉塞血管の再開通療法（血栓溶解剤、血小板凝集阻害薬、血液凝固阻害薬を含む医薬の投与や血栓の物理的除去等）と、ＭＳＣを含む医薬を併用することを特徴とする、（とくに虚血性脳血管障害や虚血性心疾患における）血栓溶解療法に伴う脳出血を低減又は予防する方法を提供する。一実施形態において、閉塞血管の再開通療法はｔ−ＰＡ等の血栓溶解剤の投与、あるいは血栓の物理的除去を含む。また、対象となる疾患は、好適には、脳梗塞等の虚血性脳血管障害や心筋梗塞等の虚血性心疾患であり、より好適には超急性期又は急性期の虚血性脳血管障害（脳梗塞等）及び急性心筋梗塞である。

さらに、本発明は、閉塞血管の再開通療法（血栓溶解剤、血小板凝集阻害薬、血液凝固阻害薬を含む医薬の投与や血栓の物理的除去等）と、ＭＳＣを含む医薬を併用することを特徴とする、（とくに虚血性脳血管障害における）血栓溶解療法の投与可能期間を延長させる治療方法も提供する。

とくに、本発明の医薬は、血栓溶解剤（例えば、ｔ−ＰＡ）の投与に伴う脳出血を予防し、その投与可能な時間を延長させることで、従来血栓溶解療法が適用できなかった患者に対して血栓溶解療法の適用を可能にする。本発明の医薬は、ＭＳＣの有する組織再生・修復効果により、虚血性脳血管障害に伴う運動機能障害を改善し、梗塞病変部位の治癒を促進させることができるが、血栓溶解剤は微小循環を改善することで、このＭＳＣ本来の効果をさらに向上させる。

このように、本発明の医薬は、血管内皮を保護し、内皮障害を抑制することで、脳出血のリスクを低減させ、安全な閉塞血管の再開通療法（例えば、血栓溶解療法や血栓の物理的除去）を実現させるとともに、ＭＳＣ本来の機能である梗塞部位の組織修復と、それに伴う運動機能及び高次機能障害改善効果を有し、これまでにない虚血性血管障害の治療を可能にする。

以下、実施例により本発明について具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

１．方法
（１）ラット骨髄由来間葉系幹細胞の調製
実験は札幌医科大学の動物実験管理規定にしたがって実施した。既報に従い、成熟ＳＤラットの大腿骨から得た骨髄をダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で２５ｍｌに希釈し、加熱不活化した１０％ ＦＢＳ、２ｍＭ ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌ ペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌ ストレプトマイシンを添加し、５％ＣＯ₂雰囲気下３７℃で３日間インキュベートした（Kim S. et al., Brain Res. 2006;1123:27-33. Ukai R. et al.,J. Neurotrauma. 2007;24:508-520.）。コンフルエントになるまで培養し、接着細胞をトリプシン−ＥＤＴＡで剥離し、１×１０⁴ｃｅｌｌｓ／ｍｌの密度で３回継代培養して間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を得た。

（２）脳梗塞モデル
脳梗塞モデルとして、ラット一過性中大脳動脈閉塞（ｔＭＣＡＯ）モデルを使用した。既報にしたがい、成熟雄性ＳＤラット（２８０−３３０ｇ：ｎ＝１７１）をケタミン（７５ｍｇ／ｋｇ）及びキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）で麻酔し、２０．０−２２．０ｍｍの塞栓糸（ＭＯＮＯＳＯＦ）を外頸動脈から挿入して、一過性中大脳動脈閉塞を誘導した（Honma T. et al., Exp. Neurol. 2006;199:56-66. Sasaki M. et al., Methods Mol. Biol. 2009;549:187-195.）。

（３）実験プロトコル（図１）
一過性中大脳動脈閉塞誘導６０分後に、ＤＷＩ−ＭＲＩを撮影して初期梗塞体積を評価した。初期梗塞体積が基準（２２０〜３７０ｍｍ³）に満たない動物は実験から除外した。
ＤＷＩ−ＭＲＩ撮影３０分後に、挿入した塞栓糸を除去し、以下のとおりラットを無作為に４群に分けた。
グループ１（生理食塩水＋培地；ｎ＝４３）
再開通後すぐに通常の生理食塩水（食塩水；１ｍｌ）を静脈投与し、３０分後に新鮮な培養液（ＤＭＥＭ；１ｍｌ）を投与した。
グループ２（ｒｔ−ＰＡ＋培地；ｎ＝４８）
再灌流後すぐにｒｔ−ＰＡ（１０ｍｇ／ｋｇ；１ｍｌ）を静脈投与し、３０分後に新鮮な培地（ＤＭＥＭ；１ｍｌ）を投与した。
グループ３（生理食塩水＋ＭＳＣ；ｎ＝４２）
再開通後すぐに通常の生理食塩水（食塩水；１ｍｌ）を静脈投与し、３０分後に新鮮な培地（ＤＭＥＭ）で全量１ｍｌとしたＭＳＣｓ（１．０×１０⁶ｃｅｌｌｓ）を静脈投与した。
グループ４（ｒｔ−ＰＡ＋ＭＳＣ；ｎ＝３８）
では、再開通後すぐにｒｔ−ＰＡ（１０ｍｇ／ｋｇ；１ｍｌ）を静脈投与し、新鮮な培地（ＤＭＥＭ）で全量１ｍｌとしたＭＳＣｓ（１．０×１０⁶ｃｅｌｌｓ）を静脈投与した。
すべてのラットに毎日シクロスポリンＡ（１０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内投与した。静脈投与はすべて左大腿静脈から行った。

（４）ＭＲＩ及び梗塞体積の測定
ラットをケタミン（７５ｍｇ／ｋｇ）及びキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）で麻酔し、ＭＲＩ撮影を行った。ＭＲＩ撮影は、既報にしたがい、７−Ｔｅｓｌａｒ、１８ｃｍボア径の縦型超伝導磁石(Ｏｘｆｏｒｄ Ｍａｇｎｅｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ)を備えたＮＭＲスペクトロメーターＵＮＩＴＹ−ＩＮＯＶＡ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて行った（Honma T. et al., Exp. Neurol. 2006;199:56-66., Komatsu K. et al., Brain Res. 2010;1334:84-92.）。

ＤＷＩ−ＭＲＩは一過性中大脳動脈閉塞６０分後に撮影し、Ｔ２ＷＩ−ＭＲＩは閉塞後１、４、７、１４、２１及び２８日に測定した。虚血病変領域はＳｃｉｏｎ Ｉｍａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ Ｂｅｔａ ４．０．２（Ｓｃｉｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いてＭＲＩ画像から計算した。病変体積（ｍｍ³）は大脳から集めた連続画像の高信号領域を解析して決定した。各スライスについて、ＤＷＩ−ＭＲＩ及びＴ２ＷＩ−ＭＲＩにおいてシグナル強度が反対側の脳の損傷に比べて１．２５倍高い高度損傷部位を梗塞病変領域とし、スライス厚（１ｍｍ）を考慮して梗塞体積を計算した。脳出血の存在はＴ２ＷＩ−ＭＲＩが低信号領域にあるときに計測した。初期梗塞体積が基準に満たない動物は実験から除外した。

潅流画像（Ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ−ｗｅｉｇｈｔｅｄ ｉｍａｇｉｎｇ：ＰＷＩ）はＴ２強調（ＴＲ＝１３ｍｓ,ＴＥ＝６．０ｍｓ）グラジエントエコーシーケンスを用いて測定した。ＰＷＩ測定は中大脳動脈閉塞の再開通から２時間後に行った。ＰＷＩによる脳血流量（ＣＢＦ）マップには、Ｂｒｅｇｍａより０．４ｍｍの大脳スライス冠状切片を血流測定するために選んだ。関心領域（ＲＯＩ：６０×６０ピクセル）は虚血脳半球の梗塞病変周辺領域とした。ＲＯＩのＢｒｅｇｍａに対する相対配向は、ＤＷＩ―ＭＲＩ：０．３ｍｍ尾側、１．２５ｍｍ外側、０．１ｍｍ深さであった。各ＲＯＩにおける局所脳血流量（ｒＣＢＦ）はＰｅｒｆｕｓｉｏｎ Ｓｏｌｖｅｒソフトウェアを用いて定量化した。ｒＣＢＦ率は、梗塞脳半球と非梗塞脳半球の比率として求めた。

（５）ゼラチンザイモグラフィー
ゼラチンザイモグラフィーは、一過性中大脳動脈閉塞１日後にラットから取り出した脳組織を用いて実施した。脳サンプルは開通後すぐに、プロテアーゼ阻害剤を含む１０倍量の溶解バッファー（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ ＳＤＳ、０．１％ デオキシコール酸、及び５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）中に氷上でホモジナイズし、遠心力：９０００ｇ、１５分間、４℃で遠心後、上清を集め、使用するまで−８０℃で保存した。全タンパク濃度は、Ｔｈｅｒｍｏ ＢＣＡプロテインアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて測定し、ＭＭＰ（Ｍａｔｒｉｘ Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）−９活性はゼラチンーザイモグラフィーキット（Ｐｒｉｍａｒｙ Ｃｅｌｌ）を用いて測定した。

（６）トレッドミル負荷試験
ラットは、一過性中大脳動脈閉塞前に、傾斜２０°、速度２０ｍ／ｍｉｎに設定したトレッドミル（Ｍｕｒｏｍａｃｈｉ Ｉｎｃ．）上で１週間に２日間、１日あたり２０分走らせて訓化した。ラットがトレッドミル上を走行できる最大スピードを、一過性中大脳動脈閉塞後１、４、７、１４、２１及び２８日に測定した。

（７）統計解析
すべてのデータは特記しない限り平均±標準偏差で示し、統計解析はＪＭＰ統計解析ソフトウェア（ＪＭＰ１０,ＳＡＳＩｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｃ）を用いて行った。各群の相違はＡＮＯＶＡとＴｕｋｅｙ’ｓ ｐｏｓｔ ｈｏｃ ｔｅｓｔを用いて評価した。

２．結果
（１）ｒｔ−ＰＡ静脈投与後の出血
グループ２（ｒｔ−ＰＡ＋培地）における急性出血は、他の３つのグループよりも発症率（グループ１＝９．５％、グループ２＝５０％、グループ３＝３．６％、グループ４＝１０％、ｐ＜０．０１、ＡＮＯＶＡ：図２Ｂ）及び出血体積（グループ１＝０．１４±０．０１ｍｍ³；グループ２＝３．２０±１．５４ｍｍ³；グループ３＝０．０１±０．０１ｍｍ³；グループ４＝０．４８±０．３９ｍｍ³、p＜０．０１、ＡＮＯＶＡ：図２Ｃ）が高かった。注目すべきことに、グループ４では、ｒｔ−ＰＡ療法後の脳出血の発症率がＭＳＣ投与により、グループ２よりも低減した（発症率４０％減少、ｐ＜０．０１、Ｔｕｋｅｙ’ｓ ｐｏｓｔ−ｈｏｃ：体積２．７２ｍｍ³減少、ｐ＜０．０５、Ｔｕｋｅｙ’ｓ ｐｏｓｔ−ｈｏｃ）。このことは、ＭＳＣの静脈投与により脳出血の発症と体積が低減できることを示唆する。

（２）ゼラチンザイモグラフィー
ゼラチンザイモグラフィーにより、同側の脳では、グループ４（ｒｔ−ＰＡ＋ＭＳＣ）のＭＭＰ−９活性はグループ２（ｒｔ−ＰＡ＋培地）よりも低く（ｐ＜０．０１、Ｔｕｋｅｙ’ｓ ｐｏｓｔ−ｈｏｃ）、グループ３（生理食塩水＋ＭＳＣ）のＭＭＰ−９活性はグループ１（生理食塩水＋培地）よりも低いことが確認された（ｐ＜０．０１、Ｔｕｋｅｙ’ｓ ｐｏｓｔ−ｈｏｃ：図３）。ＭＭＰ−９活性のアップレギュレーションは再開通後の出血に寄与する。これらの結果はＭＳＣの静脈投与によりＭＭＰ−９活性が低下し、出血が抑制しうることを示唆する。

（３）ＭＲＩ解析による虚血病変体積
ＤＷＩ−ＭＲＩを用いて虚血病変体積を４つの試験群で評価した。ＤＷＩ−ＭＲＩを６０分（カラム１）で撮影したが、初期梗塞体積に差異は認められなかった（グループ１＝２７４±３３ｍｍ³；ｎ＝９、グループ２＝２７９±２７ｍｍ³；ｎ＝１２、グループ３＝２６７±３８ｍｍ³；ｎ＝１１、グループ４＝２７６±３８ｍｍ³；ｎ＝９、ＡＮＯＶＡ、ｐ＝０．７５）。Ｔ２ＷＩ−ＭＲＩを一過性中大脳動脈閉塞後１日（カラム２）、４日（カラム３）、１４日（カラム４）、２８日（カラム５）に撮影した（図４Ａ）。

すべての群において、評価した虚血病変体積は一過性中大脳動脈閉塞後２８日の間に経時的に徐々に低減した（図４Ｂ）。ＭＳＣ投与群では、１４、２１、および２８日で、培地を投与した群に比べて大きな病変体積の減少を示した（ｐ＜０．０１、Ｔｕｋｅｙ’ｓ ｐｏｓｔ−ｈｏｃ：図４Ｂ）。ｒｔ−ＰＡとＭＳＣを投与した群（グループ４）の虚血病変体積は１４日で２２％、２１日で２２％、２８日で２５％と、いずれもｒｔ−ＰＡと培地を投与した群（グループ２）よりも小さかった。

統計的差異は認められないものの、４、７、１４、２１、２８日目の虚血病変体積の減少はｒｔ−ＰＡとＭＳＣを投与した群（グループ４）で最も大きく、虚血病変体積は２８日間を通してｒｔ−ＰＡと培地を投与した群（グループ２）で最も高かった（図４Ｂ）。これらの結果は、ｒｔ−ＰＡ療法を実施しても、ＭＳＣを投与すれば虚血病変体積を減少させることができることを示す。

（４）脳血流の解析
ｒＣＢＦ評価のために、ＰＷＩによるＣＢＦマップを用いることにより、虚血病変部位における血流動態変化のさらなる定量的解析ができた。一過性中大脳動脈閉塞の再開通１時間後では、ｒｔ−ＰＡ療法群間（グループ２と４）のｒＣＢＦ率、非ｒｔ−ＰＡ療法群間（グループ１と３）のｒＣＢＦ率はそれぞれ似ているが、ｒｔ−ＰＡ療法群のｒＣＢＦ率は非ｒｔ−ＰＡ療法群に比べて約２３％高い（図４Ｃ）。これらの結果は、ｒｔ−ＰＡ療法後のＭＳＣ投与にかかわらず、ｒＣＢＦ率はｒｔ−ＰＡ療法群で２３％増加することを示す（ｐ＜０．０１、ＡＮＯＶＡ）。

（５）行動機能
ラットがトレッドミル上を走行できた最大スピードを記録したところ、一過性中大脳動脈閉塞前では、すべてのラットは７０ｍ/ｍｉｎに到達できたが、閉塞後２４時間において最大速度は低下した。ＭＳＣ投与群（グループ３：ｎ＝１１、グループ４：ｎ＝９）は４〜２８日において非ＭＳＣ投与群（グループ１：ｎ＝９、グループ２：ｎ＝１２）よりも高い速度を示したが、グループ４は７〜２８日においてグループ３よりも高い速度を示した。これらの結果は、ｒｔ−ＰＡ療法にＭＳＣの静脈投与を組み合わせることで、ＭＳＣ単独投与に比べて梗塞後の回復が促進されることを示す（図５）。

３．考察
一過性中大脳動脈閉塞の急性期におけるＭＳＣ静脈投与を併用したｒｔ−ＰＡ療法後の脳出血発症率および出血体積を評価することで、ＭＳＣの投与によって血管内皮機能不全を抑制できることが示された。ＭＳＣを併用しないｒｔ−ＰＡ療法群では、脳出血の発症率が高く、梗塞体積も大きいが、一過性中大脳動脈閉塞後のｒｔ−ＰＡ療法にＭＳＣを併用することで脳出血の発症率と梗塞体積の両方を顕著に減少させることができる。

ｒｔ−ＰＡ療法後の出血の分子メカニズムは明らかではないが、これまでの研究で、ＭＭＰ−９が急性梗塞後の再開通における血管破壊に関与することが知られている。

ＭＳＣには脳の保護作用がある。更に、ＭＳＣの静脈投与はＭＭＰ−９の発現を低減し、血管破壊を防御させることが予測される。脳梗塞の急性期にｒｔ−ＰＡ投与されても、ＭＳＣを投与することで、脳出血の発症率と梗塞体積の両方を抑制することができる。ＭＳＣの治療効果は、これまでの研究結果と一致するものであるが、ｒｔ−ＰＡ療法とＭＳＣ投与の虚血梗塞における相乗効果、すなわち、顕著な機能改善と梗塞体積の減少は注目すべき結果である。

ｒｔ−ＰＡ投与群（グループ２及び４）では、再開通２時間後において、病変部位のｒＣＢＦ（脳血流）増加がみられた。グループ２は、ｒｔ−ＰＡ投与によりｒＣＢＦ増加はみられるが、治療効果は無かった。この為、単に脳血流が改善しても治療効果は無い。しかし、ＭＳＣと組み合わせると（グループ４）治療効果に相乗効果が見られた。この治療効果は、ＭＳＣ単独投与（グループ３）と比べても高かった。よって、ｒｔ−ＰＡ療法は、微小循環を改善させることによりＭＳＣの治療効果を相乗的に向上させ、ＭＳＣによる運動機能及び梗塞病変の改善に寄与することが考えられる。

脳梗塞を含む多くの神経疾患において細胞療法の適用が考慮されている。ｒｔ−ＰＡの使用は今や虚血梗塞数時間内の確立した治療法である。将来的には、急性期にｒｔ−ＰＡ療法を受けた患者はＭＳＣを臨床において投与されるようになるだろう。本研究結果はこのプロトコルを支持する。すなわち、ＭＳＣ投与はｒｔ−ＰＡによる脳出血のリスクを減らす。さらに、ｒｔ−ＰＡ療法はＭＳＣの治療効果を向上させる。

本実施例で用いた一過性脳虚血モデルは、塞栓子を脳血管に挿入することで脳梗塞を誘発するモデルで、一定時間以上、血流遮断をした後に、糸を引き抜く（物理的除去）ことで物理的に血流を再開通させるものである。４つのグループのうち、グループ３（生理食塩水＋ＭＳＣ；ｎ＝４２）では、ＭＳＣの投与による脳出血抑制効果が認められており、このことは、血栓の物理的除去による閉塞血管の再開通療法においても、ＭＳＣは脳出血抑制効果を有することを示す。物理的除去は例えば血管内治療等による血栓除去、機械的血栓回収療法、頚動脈内膜剥離術や、バイパス手術などがあるが、これらの方法にも同様に本発明の方法は適用できる。

さらに、ｔ−ＰＡ（ｒｔ−ＰＡ含む）は血小板凝集阻害薬、及び血液凝固阻害薬としての効果も併せ持つことから、本実施例により、血小板凝集阻害薬、及び血液凝固阻害薬による閉塞血管の再開通においても、ＭＳＣは脳出血抑制効果を有することを示唆する。

本発明によれば、閉塞血管の再開通療法（例えば、血栓溶解剤、血小板凝集阻害薬、血液凝固阻害薬を含む医薬の投与や血栓の物理的除去）に伴う脳出血のリスクを低減し、かつ、虚血性血管障害における治療効果を向上させることができる。本発明は、脳梗塞や心筋梗塞をはじめとする虚血性血管障害の治療に有用である。

Claims (24)

1. 閉塞血管の再開通療法と併用され、前記閉塞血管の再開通療法に伴う脳出血のリスクを低減することを特徴とする、間葉系幹細胞を含む虚血性血管障害の治療用医薬。
2. 閉塞血管の再開通療法が、血栓溶解剤、血小板凝集阻害薬、及び血液凝固阻害薬の投与、ならびに血栓の物理的除去から選ばれるいずれか１又は２以上を含む、請求項１に記載の医薬。
3. 閉塞血管の再開通療法が血栓溶解剤の投与を含む、請求項１又は２に記載の医薬。
4. 血栓溶解剤がプラスミノーゲンアクチベーターである、請求項３に記載の医薬。
5. 血栓溶解剤の投与可能な時間を延長することを特徴とする、請求項２〜４のいずれか１項に記載の医薬。
6. 虚血性血管障害が虚血性脳血管障害又は心筋梗塞である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の医薬。
7. 虚血性血管障害が超急性期又は急性期の虚血性脳血管障害又は急性心筋梗塞である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の医薬。
8. 間葉系幹細胞が骨髄由来の間葉系幹細胞である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の医薬。
9. 間葉系幹細胞を含む、閉塞血管の再開通療法に伴う脳出血を予防するための医薬。
10. 閉塞血管の再開通療法が、血栓溶解剤、血小板凝集阻害薬、及び血液凝固阻害薬の投与、ならびに血栓の物理的除去から選ばれるいずれか１又は２以上を含む、請求項９に記載の医薬。
11. 閉塞血管の再開通療法が血栓溶解剤の投与を含む、請求項９又は１０に記載の医薬。
12. 血栓溶解剤がプラスミノーゲンアクチベーターである、請求項１１に記載の医薬。
13. 血栓溶解剤の投与可能な時間を延長することを特徴とする、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の医薬。
14. 虚血性血管障害の患者に使用される、請求項９〜１３のいずれか１項に記載の医薬。
15. 虚血性血管障害が虚血性脳血管障害又は心筋梗塞である、請求項１４に記載の医薬。
16. 虚血性血管障害が超急性期又は急性期の虚血性脳血管障害又は急性心筋梗塞である、請求項１４又は１５に記載の医薬。
17. 間葉系幹細胞が骨髄由来の間葉系幹細胞である、請求項９〜１６のいずれか１項に記載の医薬。
18. 閉塞血管の再開通療法と併用されることを特徴とする、間葉系幹細胞を含む虚血性血管障害の治療用医薬であって、前記閉塞血管の再開通療法が血栓溶解剤の投与を含む、前記医薬。
19. 閉塞血管の再開通療法に伴う脳出血のリスクを低減することを特徴とする、請求項１８に記載の医薬。
20. 血栓溶解剤がプラスミノーゲンアクチベーターである、請求項１８又は１９に記載の医薬。
21. 血栓溶解剤の投与可能な時間を延長することを特徴とする、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の医薬。
22. 虚血性血管障害が虚血性脳血管障害又は心筋梗塞である、請求項１８〜２１のいずれか１項に記載の医薬。
23. 虚血性血管障害が超急性期又は急性期の虚血性脳血管障害又は急性心筋梗塞である、請求項１８〜２２のいずれか１項に記載の医薬。
24. 間葉系幹細胞が骨髄由来の間葉系幹細胞である、請求項１８〜２３のいずれか１項に記載の医薬。