JP2010528107A - 脂肪組織由来幹細胞を含有する虚血性肢疾患治療用組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
脂肪吸入を通じて腹部から採取された脂肪組織を分離してPBSにより洗浄し、組織を細切した後、コラゲナーゼタイプ1(1mg/mL)を添加したDMEM培地を用いて37℃において2時間分解した。次に、PBSにより洗浄した後、1000rpmにて5分間遠心分離した。上澄液は除去し、底面に残留しているペレットはPBSにより洗浄した後、1000rpmにて5分間遠心分離した。100μmの網目を用いて浮遊物を除去した後、PBSにより再洗浄した。DMEM(10%FBS、2mM NAC、0.2mMアスコルビン酸)培地において培養し、一晩経過後、培養容器の底面に付着された細胞はPBSにより洗浄し、2mM NAC、0.2mMアスコルビン酸、0.09mMカルシウム、5ng/mL rEGF、50μg/mL BPE、5μg/mLインシュリン及び74ng/mLヒドロコルチゾンを含有するケラチノサイト−SFM培地を2日おきに交換しながら培養して多分化能性幹細胞(multipotent stem cells)を分離した(図1)。図1は、前記方法により分離されたヒト脂肪組織由来多分化能性幹細胞(multipotent stem cells)を100倍の倍率にて撮影した写真である。
実施例1において得られたヒト脂肪組織由来多分化能性幹細胞(multipotent stem cells)をPBSにより洗浄し、トリプシンにより処理した後、細胞を回収して5分間1000rpmにて遠心分離した。上澄液を捨て、2%FBS及びPBSの混合液を入れて洗浄した後、1000rpmにて5分間遠心分離した。上澄液を捨てた後、細胞をPBSに浮遊させて各サンプルに対して1×105個の細胞を分注した。各細胞に対しては抗体(R-phycoerythrin-conjugated mouse anti-human monoclonal antibody)を添加して氷中において40分間放置して結合を誘導した。反応が終わると、1000rpmにて5分間遠心分離して上澄液を除去した後、PBSにより2回洗浄した。洗浄後には最終的に1%パラホルムアルデヒドを添加して固定し、FACS方法を通じて得られた多分化能性幹細胞(multipotent stem cells)の表面抗原を分析した(表1及び図2)。
実施例1において得られたヒト脂肪組織由来多分化能性幹細胞(multipotent stem cells)を生理食塩水、生理食塩水+スクロース、生理食塩水+スクロース+5%アルブミン及びPBS+スクロース条件下で保存後のスフィア形成能を確認した。
血管内条件と同様に5dynes/cm2のせん断ストレスを加えた、または、加えなかった細胞を用いて生体外管形成試験を通じて脂肪由来間葉系幹細胞が血管を形成するかどうかを確認した。
5−1:虚血性マウスモデルの製作
8週齢のヌードマウスを用いて全身麻酔後、左脚の正中部を切開して大腿動脈とその側枝を摘出して結紮後、左大腿動脈を完全に除去して虚血性下肢疾患モデルを誘発した。
前記5−1において製作された虚血性マウスモデルを誘発した後、24時間後に細胞濃度別に3グループ{(LDグループ(1×106細胞/kg)、MDグループ(5×106細胞/kg)及びHDグループ(1×107細胞/kg)}に分けて虚血性患部に筋肉注射した。
注射を通じて投与するまで4℃内外の温度において冷蔵保存することを余儀なくされる冷蔵剤形の場合、生理食塩水、ハートマン−D溶液、PBSと、細胞の安定性を維持するのに役立つ等張液としてのスクロースの比率による細胞の生存率に対する比率を確認した。また、冷蔵保存時に細胞が凝集したり沈殿されない条件の設定のために、EDTA、ヒト血清アルブミンを増加または減少するときの効果を比較した(表2)。
幹細胞治療剤を冷凍保存する場合、生理食塩水をベースとし、凍結保護剤をはじめとする種々の添加剤を用いて冷凍及び解凍による安定性を確保するために様々な剤形に対する細胞生存率を検討した。
Claims (5)
- 脂肪組織由来間葉系幹細胞及び賦形剤を含有する虚血性疾患治療用細胞組成物であって、前記脂肪組織由来間葉系幹細胞の濃度は1×105〜1×108細胞/mLであり、前記賦形剤はスクロースまたはマンノースであることを特徴とする虚血性疾患治療用細胞組成物。
- 前記組成物の基剤が、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)及びハートマン−Dよりなる群から選ばれることを特徴とする請求項1に記載の治療用細胞組成物。
- 前記賦形剤として、アルブミンまたは血清をさらに含有することを特徴とする請求項1に記載の治療用細胞組成物。
- 前記賦形剤として、EDTAまたはDMSOをさらに含有することを特徴とする請求項1〜3のいずれか1項に記載の治療用細胞組成物。
- 懸濁剤、溶解補助剤、安定化剤、等張化剤、保存剤、吸着防止剤、界面活性剤、希釈剤、媒体、pH調整剤、無痛化剤、緩衝剤、含硫還元剤及び酸化防止剤よりなる群から選ばれる薬学的に許容可能な量の添加剤をさらに含有することを特徴とする請求項1に記載の治療用細胞組成物。
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