JP6929346B2 - 軟骨無細胞破砕物及び幹細胞を含む軟骨分化促進用複合体及びその用途 - Google Patents

Description

本発明は、軟骨無細胞破砕物及び幹細胞を含む軟骨分化促進用複合体及びその用途に関し、より具体的には、幹細胞又はその培養物と軟骨無細胞破砕物とを含む軟骨分化促進用複合体、前記複合体を用いて軟骨を製造する方法、前記方法で製造された軟骨、前記複合体を含む関節疾患予防又は治療用薬学組成物、前記組成物を用いて関節疾患を予防又は治療する方法、前記製造された軟骨細胞を含む軟骨細胞分化誘導用組成物、及び前記製造された軟骨細胞を用いて軟骨を製造する方法に関する。

関節疾患（arthropathy）とは、痛覚の欠如及び関節異常を伴う疾患の総称であり、関節の神経栄養性疾患の１つに分類される。概して、多発性関節症（Polyarthrosis）、股関節症（Coxarthrosis）、膝関節症（Gonarthrosis）、脊椎関節症（spondyloarthropathy）などを包括するものであり、軟骨の損傷又は軟骨の機能異常を伴うこともあるが、ほとんどの関節疾患は炎症を伴うので、関節炎に進展することが知られている。

前記関節疾患由来の関節炎は、人類が患う疾患のうち有病率１位の多発性疾患であり、それに含まれる退行性関節炎は、６５歳以上の人口の７０〜８０％が発症し、７５歳以上においては約１００％が発症する代表的な老人性疾患である。現在、韓国では全人口の１０％以上が退行性関節炎を発症しており、その有病率は韓国社会の急速な高齢化により急激に増加している。また、最近は若年層でも多く発症しており、全世界的には約５億人以上の退行性関節炎患者がいるものと推定される。さらに、人類の平均寿命の延長に伴って人類の社会活動期間が長くなっているので、人類の生活の質的な面で至急解決しなければならない重要な課題となっている。

前記退行性関節炎は、主に膝関節に位置する軟骨組織が損傷することにより発症するが、前記軟骨組織に含まれる軟骨細胞は、軟骨組織が正常な機能を維持するために必須のコラーゲンやプロテオグリカンなどのマトリクスを合成、分泌し、かつ適正速度で分解することにより、関節軟骨組織の機能恒常性を維持する上で必須の役割を果たしている。このような関節炎症状を治療するための様々な研究が行われている。例えば、特許文献１にはサメ軟骨抽出物を含む関節炎治療用製剤が開示されており、特許文献２には胎盤幹細胞又は臍帯（umbilical cord）幹細胞を用いて関節リウマチを治療する技術が開示されている。しかし、前記サメ軟骨抽出物は、軟骨損傷を抑制するという効果を発揮するにすぎず、損傷した軟骨を治療したり、再生させる効果を発揮することはできず、幹細胞は、関節組織において軟骨細胞でない他の細胞に分化する可能性があり、副作用の恐れがあるという欠点がある。よって、副作用を引き起こすことなく、損傷した軟骨を治療したり、再生させる方法を開発する研究が盛んに行われている現状である。

米国特許第６０２５３３４号明細書 韓国登録特許第１５６９１６８号公報

本発明者らは、軟骨損傷を伴う関節疾患をより効果的に治療する方法を開発すべく鋭意研究を重ねた結果、損傷した軟骨部位に幹細胞又はその培養物と無細胞軟骨破砕物を複合的に投与すると、前記幹細胞が必ず軟骨細胞に分化して軟骨組織を再生させるか、投与部位周辺でパラクリン作用により損傷した軟骨の再生を促進させることにより、前記関節疾患をより効果的に治療できることを確認し、本発明を完成するに至った。

本発明は、幹細胞又はその培養物と軟骨無細胞破砕物とを含む軟骨分化促進用複合体を提供することを目的とする。

また、本発明は、前記複合体を用いて軟骨を製造する方法を提供することを目的とする。

さらに、本発明は、前記方法で製造された軟骨を提供することを目的とする。

さらに、本発明は、前記複合体を含む関節疾患予防又は治療用薬学組成物を提供することを目的とする。

さらに、本発明は、前記組成物を用いて関節疾患を予防又は治療する方法を提供することを目的とする。

さらに、本発明は、前記製造された軟骨細胞を含む軟骨細胞分化誘導用組成物を提供することを目的とする。

さらに、本発明は、前記製造された軟骨細胞を用いて軟骨を製造する方法を提供することを目的とする。

さらに、本発明は、軟骨を製造するための幹細胞又はその培養物と軟骨無細胞破砕物とを含む軟骨分化促進用複合体の用途を提供することを目的とする。

さらに、本発明は、関節疾患を予防又は治療するための幹細胞又はその培養物と軟骨無細胞破砕物とを含む軟骨分化促進用複合体の用途を提供することを目的とする。

本発明が提供する幹細胞又はその培養物と軟骨無細胞破砕物とを含む軟骨分化促進用複合体は、生体内でも副作用を引き起こすことなく軟骨細胞に分化するだけでなく、分化した軟骨細胞において生じるパラクリン作用（Paracrine effect）により、生体内に存在する内在性幹細胞に対しても軟骨細胞への分化を促進させ、損傷した軟骨を効果的に再生させることができるので、軟骨損傷を伴う関節疾患の治療に広く活用することができる。

軟骨分化誘導剤の種類及び処理濃度によるヒト臍帯血由来間葉系幹細胞（ＵＣＢ−ＭＳＣ）の軟骨分化レベルを評価した結果を示す顕微鏡写真である。 ２％（ｗ／ｖ）ＰＣＰで処理して分化させた細胞をアルシアンブルーで染色した結果を示す顕微鏡写真である。 ＵＣＢ−ＭＳＣから分化した軟骨細胞において、軟骨分化誘導剤の種類及び処理濃度によるタンパク質発現レベルの変化を比較した結果を示すグラフである。 ２％（ｗ／ｖ）ＰＣＰで処理して分化させた細胞と０．５％（ｗ／ｖ）ＨＡで処理して分化させた細胞において、アグリカン（ａｇｇ）に対する免疫蛍光染色を行った結果を示す蛍光顕微鏡写真である。 ２％（ｗ／ｖ）ＰＣＰで処理して分化させた細胞と０．５％（ｗ／ｖ）ＨＡで処理して分化させた細胞において、２型コラーゲン（Ｃｏｌ２ａ）に対する免疫蛍光染色を行った結果を示す蛍光顕微鏡写真である。 ２％（ｗ／ｖ）ＰＣＰで処理して分化させた細胞において、ＢＭＰ６の発現レベルを測定した結果を示すグラフである。 ＢＭＰ６で処理してＵＣＢ−ＭＳＣから分化した軟骨細胞において、タンパク質発現レベルの変化を比較した結果を示すグラフである。 ＰＣＰの処理濃度による細胞生存率の変化を比較した結果を示すグラフである。 一次分化した軟骨細胞を用いたＵＣＢ−ＭＳＣの二次分化実験過程を示す概略図である。 ＰＣＰ又はＨＡで処理して分化した軟骨細胞とＵＣＢ−ＭＳＣを共培養した結果を示す顕微鏡写真である。 ＰＣＰ又はＨＡで処理して分化した軟骨細胞と共培養したＵＣＢ−ＭＳＣにおいて、発現したタンパク質（アグリカン、２型コラーゲン及び１型コラーゲン）の発現レベルの変化を比較した結果を示すグラフである。 軟骨欠損モデル動物において、ＵＣＢ−ＭＳＣと軟骨分化誘導剤の組み合わせ処理による軟骨回復レベルを比較した結果を示す写真である。 軟骨欠損モデル動物において、ＵＣＢ−ＭＳＣと軟骨分化誘導剤の組み合わせ処理による軟骨再生面積を定量分析した結果を示すグラフである。 軟骨欠損モデル動物において、ＵＣＢ−ＭＳＣと軟骨分化誘導剤の組み合わせ処理による軟骨欠損部位内のプロテオグリカン含有量を分析するためのサフラニンＯ染色を行った結果を示す顕微鏡写真である。 軟骨欠損モデル動物において、ＵＣＢ−ＭＳＣと軟骨分化誘導剤の組み合わせ処理による軟骨欠損部位内の２型コラーゲンの発現レベルを分析するための免疫蛍光染色を行った結果を示す蛍光顕微鏡写真である。 軟骨欠損モデル動物において、ＵＣＢ−ＭＳＣと軟骨分化誘導剤の組み合わせ処理による軟骨欠損部位内のグリコサミノグリカンのレベルを分析するためのアルシアンブルー染色を行った結果を示すグラフである。 骨関節炎モデル動物において、ＵＣＢ−ＭＳＣとＰＣＰの単独処理又は組み合わせ処理による関節炎改善効果を経時的に撮影したＸ線写真である。 骨関節炎モデル動物において、ＵＣＢ−ＭＳＣとＰＣＰの単独処理又は組み合わせ処理による行動検査結果を示すグラフである。 骨関節炎モデル動物において、ＵＣＢ−ＭＳＣとＰＣＰの単独処理又は組み合わせ処理による関節腔液内のＴＮＦ−αのレベルを比較した結果を示すグラフである。 骨関節炎モデル動物において、ＵＣＢ−ＭＳＣとＰＣＰの単独処理又は組み合わせ処理を行った膝関節の大腿骨顆（femoral condyle）と脛骨プラトー（tibial plateau）部を撮影した写真である。 骨関節炎モデル動物において、ＵＣＢ−ＭＳＣとＰＣＰの単独処理又は組み合わせ処理による関節面のエロージョン（erosion）、表面変化、骨棘及び大腿骨顆の肥大レベルを総合的に定量分析した結果を示すグラフである。

本発明者らは、関節疾患をより効果的に治療する方法を開発すべく様々な研究を行っていたところ、幹細胞に注目するようになった。ほとんどの関節疾患は関節に位置する軟骨の損傷により誘発されるので、前記損傷した軟骨を回復させるか、又は再生することができれば、それにより関節疾患を効果的に治療できるであろうと仮定し、幹細胞を用いて軟骨を再生させる方法に関する研究を行った。しかし、ｉｎ ｖｉｔｒｏ条件では幹細胞を軟骨細胞に分化させる様々な方法が知られているが、ｉｎ ｖｉｖｏ条件では幹細胞を軟骨細胞に分化させることは容易でない。これは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ条件で幹細胞を軟骨細胞に分化させる際に用いられるほとんどの分化誘導促進剤は生体内で副作用を引き起こすからである。よって、本発明者らは、生体内（in vivo）で幹細胞を軟骨細胞に分化させることができ、かつ生体内で副作用を引き起こさない成分を開発すべく様々な研究を行った結果、粉末状のブタ由来無細胞軟骨破砕物（Porcine Catilage Powder, PCP）を用いると、生体内で幹細胞を軟骨細胞に分化させることができ、かつ副作用を引き起こさないことを確認した。

特に、ｉｎ ｖｉｔｒｏ条件で幹細胞を軟骨細胞に分化させることのできる分化誘導促進剤が、生体内（in vivo）では正常な役割を果たせないこともある。実際に、ｉｎ ｖｉｔｒｏ条件で幹細胞を軟骨細胞に分化させることが知られているヒアルロン酸（ＨＡ）において、生体内ではＨＡを同時投与すると幹細胞を軟骨細胞に分化させることができないだけでなく、正常な幹細胞の分化を阻害しうることが確認された。

しかし、前記ＰＣＰは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ条件だけでなく、生体内（in vivo）でも幹細胞を軟骨細胞に分化させる過程を誘導又は促進できることが確認された。それだけでなく、幹細胞単独で処理するよりも、幹細胞と共に前記ＰＣＰで処理すると、軟骨細胞への分化をより促進させ、生体内で発症した関節疾患を効果的に治療できることが確認された。

特に、前記ＰＣＰと幹細胞とを含む複合体を、関節疾患を発症した個体に投与すると、前記複合体に含まれる幹細胞がＰＣＰにより軟骨細胞に分化するだけでなく、前記分化した軟骨細胞により、生体内に存在する内在性幹細胞に対しても軟骨細胞に分化させることができ、より向上した関節疾患治療効果を発揮することができる。

このように、幹細胞と無細胞軟骨破砕物を共に用いて損傷した軟骨を再生させることにより関節疾患を治療する方法は、現在まで報告されておらず、本発明者らによって最初に開発されたものである。

前記目的を達成するための一実施形態として、本発明は、幹細胞又はその培養物と無細胞軟骨破砕物とを含む軟骨分化促進用複合体を提供する。

本発明における「幹細胞」とは、様々な組織に分化する能力を有する細胞、すなわち「未分化細胞」を意味する。

本発明における前記幹細胞は、本発明の無細胞軟骨破砕物により軟骨細胞に分化するものであれば特にこれらに限定されるものではないが、例えば成体幹細胞、多能性幹細胞、人工多能性幹細胞（induced pluripotent stem cells）、臍帯血由来幹細胞（Umbilical Cord Blood Mesenchymal Stem Cell: UCB-MSC）、胚性幹細胞、胎盤幹細胞、自己由来幹細胞などである。

前記多能性幹細胞（multipotent stem cell）とは、骨髄、臍帯血、胎盤（又は胎盤組織細胞）、脂肪（又は脂肪組織細胞）などの様々な成体細胞に由来する多分化性の性質を有する幹細胞である。例えば、骨髄（bone marrow）由来の間葉系幹細胞は、脂肪組織、骨／軟骨組織、筋肉組織に分化することができる多分化性により、細胞治療剤としての開発のために様々な研究が行われている。

一方、前記成体幹細胞は、臍帯、臍帯血、骨髄、脂肪、筋肉、神経、皮膚、羊膜及び胎盤からなる群から選択される組織に由来するものであってもよい。また、前記成体幹細胞は、間葉系幹細胞、間葉系間質細胞（mesenchymal stromal cell）又は多分化能幹細胞であってもよく、ヒト臍帯血由来間葉系幹細胞（Human Umbilical Cord Blood Mesenchymal Stem Cell;hUCB-MSC）であることが好ましい。各組織から幹細胞を得る方法としては、当業界で公知の従来の方法を用いることができ、本発明の実施例の方法に限定されるものではない。

本発明における「培養物」とは、細胞を特定条件で培養して得られた産物を意味する。

本発明における前記培養物には、幹細胞を含む細胞培養液、前記細胞培養液から幹細胞を除去した培養上清、それらの希釈液などが全て含まれる。前記培養物の組成は、通常の幹細胞培養に必要な成分だけでなく、幹細胞増殖に相乗的に作用する成分をさらに含んでもよく、それらの組成は当該技術分野において通常の知識を有する者が容易に選択することができる。

前記幹細胞の培養に用いられる培地としては、当業界において幹細胞培養に適していることが知られている通常の培地を用いることができ、例えばＤＭＥＭ（Dulbecco's modified Eagle medium）又はＫｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ−ＳＦＭ（Keratinocyte serum free medium）を用いることができる。

前記幹細胞培地には添加剤が補充されてもよい。一般に、等張液中の中性緩衝剤（例えば、リン酸塩及び／又は高濃度炭酸水素塩）やタンパク質栄養分（例えば、血清（例えば、ＦＢＳ）、血清代替物、アルブミン、又は必須アミノ酸及び非必須アミノ酸（例えば、グルタミン））を含有してもよい。さらに、脂質（脂肪酸、コレステロール、血清のＨＤＬ又はＬＤＬ抽出物）やこの種の多くの保存液培地で見受けられる他の成分（例えば、インスリンもしくはトランスフェリン、ヌクレオシドもしくはヌクレオチド、ピルビン酸塩、任意のイオン化形態もしくは塩であるグリコーゲン（例えば、グルコース）、セレン、グルココルチコイド（例えば、ヒドロコルチゾン）及び／又は還元剤（例えば、β−メルカプトエタノール））を含有してもよい。

本発明における「軟骨（catilage）」とは、軟骨細胞と相対的に多量の軟骨基質とから構成された生体内結合組織を意味する。結合組織に属する筋肉、軟骨及び骨において、軟骨は、骨よりは柔軟性があり、筋肉よりは固い。

ほとんどの軟骨組織において前記軟骨細胞はほぼ同じであるが、軟骨組織の位置、役割などに応じて軟骨基質が異なるので、軟骨基質により軟骨は概して３種類（硝子軟骨、弾性軟骨及び線維軟骨）に分類される。しかし、軟骨が形成される部位、発達時期、分化誘導方法などの条件により、生成される軟骨基質は異なる構成要素及び前記構成要素の組成比を含んでもよい。

例えば、生体内幹細胞により自然に再生された軟骨基質と、試験管条件で幹細胞を分化させることにより生成された軟骨基質は、それら軟骨基質に含まれるタンパク質の種類及び含有量の面で著しい差異を示すことがある。また、幹細胞を分化させることにより生成された軟骨においては、概して幹細胞を軟骨分化用分化誘導促進剤で処理することにより幹細胞を軟骨細胞に分化させ、その後分化させた軟骨細胞を軟骨基質に分化させるが、ここで用いられる分化誘導促進剤の種類により、生成された軟骨基質に含まれるタンパク質の種類及び含有量の面で著しい差異が生じうる。このように、タンパク質の種類及び含有量が異なる軟骨基質は、生体内で異なる役割を果たす。

本発明の一実施例においては、試験管条件（in vitro）で幹細胞を軟骨細胞に分化させることのできる分化誘導促進剤が、生体内では異なる形態の軟骨分化を誘導しうることが確認された。具体的には、試験管条件（in vitro）で本発明のブタ由来無細胞軟骨破砕物（ＰＣＰ）とヒアルロン酸（ＨＡ）は、それぞれ幹細胞を軟骨細胞に分化させることができることが確認された。次に、動物の関節部位に存在する硝子軟骨部分に損傷を与えたモデル動物を作製し、ＰＣＰと幹細胞とを含む複合体又はＨＡと幹細胞とを含む複合体を投与し、それらの軟骨損傷治療効果を比較した。その結果、ＰＣＰと幹細胞とを含む複合体を投与した場合、幹細胞を単独で投与した場合よりも向上した軟骨再生効果を発揮したのに対して、ＨＡと幹細胞とを含む複合体を投与した場合、幹細胞を単独で投与した場合よりも相対的に低いレベルの軟骨再生効果を発揮することが確認された。前記結果から、ＰＣＰは生体内で幹細胞を硝子軟骨に分化させて損傷した硝子軟骨の再生を向上させたのに対して、ＨＡは生体内で幹細胞を硝子軟骨でない他の種類の軟骨に分化させて損傷した硝子軟骨の再生を阻害する結果を招いたものと分析された。

本発明における「硝子軟骨（hyaline catilage）」とは、「ガラス軟骨」ともいい、基質が概して半透明で、生体内では青白色を帯びた透明であり、目視では均一な組織で形成されており、６０〜８０％の水分を含み、コンドロイチン硫酸を含有する複合タンパク質（ムコイド）及び軟骨膜を含む軟骨を意味する。硝子軟骨の構造上、軟骨細胞は軟骨基質の周辺に存在する。前記硝子軟骨は、生体内で肋軟骨、鼻軟骨、喉頭軟骨、関節軟骨、気管軟骨などを構成することが知られている。

本発明における「弾性軟骨（elastic catilage）」とは、不透明な黄色であり、網構造を含む弾性線維が軟骨基質内に含まれており、軟骨膜を含む軟骨を意味する。前記弾性軟骨は、生体内で耳介軟骨、外耳道軟骨、喉頭蓋軟骨などを構成することが知られている。

本発明における「線維軟骨（fibrous catilage）」とは、白色の線維組織と軟骨基質が様々な割合で混合された形態の軟骨を意味する。線維軟骨に含まれる線維組織は概してコラーゲンで構成されており、概して硝子軟骨と弾性軟骨の中間レベルの特徴を示すが、軟骨膜は含まない。軟骨細胞は、前記線維組織に混合された形態で存在するが、単独で遊離していたり、小規模の細胞集団を形成する。前記線維軟骨は、生体内で椎間円板、関節唇、関節半月などを構成することが知られている。

本発明における「無細胞軟骨破砕物（cell-free crush of catilage）」とは、軟骨から軟骨細胞が除去された軟骨基質を公知の方法で破砕して得られた生体由来物質を意味する。

本発明における前記無細胞軟骨破砕物は、幹細胞に作用して軟骨細胞への分化を誘導する役割を果たすが、前記役割は、無細胞軟骨破砕物に含まれる分化誘導成分だけでなく、無細胞軟骨破砕物自体の物理的な特性により果たされる。すなわち、前記無細胞軟骨破砕物は軟骨細胞に比べて相対的に硬度が高い軟骨基質から構成された粒子形態であるので、前記粒子形態の破砕物は幹細胞の支持体の役割をさらに果たし、幹細胞の分化を促進させることができる。

前記無細胞軟骨破砕物は、幹細胞を軟骨細胞に分化誘導できるものであれば特にこれらに限定されるものではないが、軟骨細胞が除去された軟骨基質を機械的に破砕するか、軟骨細胞が除去された軟骨基質を対象に冷凍／解凍を繰り返すか、又は軟骨細胞が除去された軟骨基質を超音波で処理して得られた破砕物、軟骨細胞が除去された軟骨基質を様々な酵素（トリプシン、エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼなど）で処理して得られた酵素分解物、軟骨細胞が除去された軟骨基質をアルカリもしくは酸性試薬で処理するか、又は軟骨細胞が除去された軟骨基質を界面活性剤で処理して得られた反応産物などであってもよい。

また、前記軟骨基質は、特にこれらに限定されるものではないが、一例として、ブタ、ウシ、ウサギなどの哺乳動物由来の軟骨基質を用いることができ、他の例として、ヒトに最も類似したブタ由来の軟骨基質を用いることができる。

本発明の一実施例においては、ブタの軟骨から軟骨細胞が除去された軟骨基質を得て、その後凍結乾燥及び破砕過程を経て得られた粉末状のブタ由来無細胞軟骨破砕物（Porcine Catilage Powder, PCP）を無細胞軟骨破砕物として用いた。

本発明における「複合体（complex）」とは、幹細胞と軟骨無細胞破砕物とを含む軟骨分化促進用製剤を意味する。

本発明における前記複合体には、単に幹細胞と軟骨無細胞破砕物が混合された組成物だけでなく、前記幹細胞と軟骨無細胞破砕物が担体に固定された形態の複合体、前記幹細胞と軟骨無細胞破砕物がそれぞれ個別に包装された形態のキットなどのように、幹細胞と軟骨無細胞破砕物とを含むいかなる形態の製剤も包括的に含まれる。また、前記製剤の形態以外にも、前記軟骨無細胞破砕物により幹細胞から分化した軟骨細胞、前記軟骨細胞の培養物、前記培養物の培養上清、前記培養物の抽出物、前記抽出物の分画物などのように、幹細胞と軟骨無細胞破砕物の反応により生成された反応産物、又は前記反応産物の副産物までも包括的に全て含まれる。

また、前記複合体は、幹細胞と軟骨無細胞破砕物に加えて、幹細胞の軟骨分化を促進させることのできる軟骨分化促進用製剤をさらに含んでもよい。前記軟骨分化促進用製剤は、軟骨無細胞破砕物と共に作用して幹細胞の軟骨細胞分化を促進させるものであれば特にこれに限定されるものではないが、例えばＢＭＰ６（Bone morphogenetic protein 6）などである。

他の実施形態として、本発明は、前記複合体を用いて軟骨又は軟骨細胞を製造する方法を提供する。具体的には、本発明の軟骨又は軟骨細胞の製造方法は、無細胞軟骨破砕物の存在下で幹細胞から軟骨細胞を分化させるステップを含む。

本発明における「分化（differentiation）」とは、一般に比較的単純な系が２つ以上の質的に異なる部分系に分離する現象を意味するが、具体的には細胞が分裂増殖し、成長する間に互いに構造や機能が特殊化する現象、すなわち生物の細胞、組織などがそれぞれに与えられた働きをするために形態や機能が変化する現象を意味する。例えば、個体発生において最初は同質的であった卵部に頭や胴などの区別が生じたり、細胞に筋細胞や神経細胞などの区別が生じるように、最初はほぼ同質であったある生物系の部分間に質的な相違が生じること、又はその結果として質的に区別できる部域もしくは部分系に分けられる現象が挙げられる。相対的に、「未分化」とは、前述した分化が生じておらず、未だ幹細胞としての特徴を有する状態を意味する。

本発明の目的上、前記分化とは、無細胞軟骨破砕物の処理により、幹細胞が軟骨細胞に変化する一連の過程を意味するものと解される。

例えば、ブタ由来無細胞軟骨破砕物の存在下で臍帯血由来幹細胞を分化させることにより軟骨又は軟骨細胞を製造することができる。

前記軟骨細胞への分化効率を向上させるために、本発明の無細胞軟骨破砕物で幹細胞を処理する前に、処理と同時に、又は処理した後に、前記軟骨分化促進用製剤で処理するステップをさらに含んでもよい。前記軟骨分化促進用製剤は前記定義の通りである。

さらに他の実施形態として、本発明は、前記方法で製造された軟骨又は軟骨細胞を提供する。

前述したように、軟骨は、軟骨が形成される部位、発達時期、分化誘導方法などの条件により、異なる構成要素及び前記構成要素の組成比を含む軟骨基質を含んでもよい。

本発明が提供する軟骨又は軟骨細胞は、前述したように、無細胞軟骨破砕物の存在下で幹細胞から軟骨細胞を分化させることにより製造することができる。このように製造された軟骨又は軟骨細胞は、従来の方法で分化誘導された軟骨とは明確に区別される特性を示す。前記特性の１つは、ヒアルロン酸により分化誘導された軟骨細胞よりも、生体内の軟骨損傷を効果的に治療できるということであり、もう１つは、前述したように製造した軟骨又は軟骨細胞のみでも、パラクリン作用（Paracrine effect）により幹細胞を軟骨細胞に分化させることができるということである。

特に、本発明の軟骨又は軟骨細胞が示すパラクリン作用は、現在まで全く報告されておらず、本発明者によって最初に確認されたものである。

本発明が提供する軟骨又は軟骨細胞は、ブタ由来無細胞軟骨破砕物の存在下で臍帯血由来幹細胞を分化させることにより製造されたものであってもよい。

さらに他の実施形態として、本発明は、前記複合体を含む関節疾患予防又は治療用薬学組成物を提供する。

本発明が提供する前記複合体は、試験管条件（in vitro）で幹細胞を軟骨細胞に分化させることができるだけでなく、生体内条件（in vivo）で損傷した軟骨又は軟骨細胞を再生又は治療するという効果を発揮することができる。さらに、本発明の複合体は、外傷などの外因性要因により損傷した軟骨又は軟骨細胞だけでなく、老化、遺伝的疾患、免疫疾患などの内在的要因により損傷又は損失した軟骨又は軟骨細胞までも再生させることができる。特に、前記内在的要因による軟骨又は軟骨細胞の損傷又は損失は病理症状がすぐには現れず、徐々に現れるので、本発明の複合体を投与して前記内在的要因による軟骨又は軟骨細胞の損傷又は損失を抑制すると、結果的に関節疾患を予防できるという効果が得られる。

よって、本発明の複合体は、関節疾患予防又は治療用薬学組成物の有効成分として用いられてもよい。

本発明における「関節疾患（arthropathy）」とは、「関節症（Arthrosis）」又は「変形性関節症（Osteo-arthrosis）」ともいい、痛覚の欠如及び関節異常を伴う疾患を意味するが、関節の神経栄養性疾患の１つに分類される。概して、多発性関節症（Polyarthrosis）、股関節症（Coxarthrosis）、膝関節症（Gonarthrosis）、脊椎関節症（spondyloarthropathy）などを包括するものであり、軟骨の損傷又は軟骨の機能異常を伴うこともあるが、ほとんどの関節疾患は炎症を伴うので、関節炎に進展しうることが知られている。

本発明における「治療」とは、前記薬学組成物の投与により関節疾患の症状を好転又は有利に変化させるあらゆる行為を意味する。

また、本発明の薬学組成物に含まれる無細胞軟骨破砕物の含有量は、特にこれらに限定されるものではないが、一例として０．１〜１００ｎｇ／ｍｌであってもよく、他の例として１〜１０ｎｇ／ｍｌであってもよく、さらに他の例として５ｎｇ／ｍｌであってもよい。

さらに、本発明の薬学組成物に含まれる幹細胞又はその培養物の含有量は、特にこれらに限定されるものではないが、一例として１ｍｌ当たり１．０×１０^５個〜１．０×１０^９個、他の例として１．０×１０^６個〜１．０×１０^８個、さらに他の例として１．０×１０^７個の細胞が含まれてもよい。

本発明による幹細胞又はその培養物は、凍結せずに用いてもよく、後の使用のために凍結してもよい。凍結しなければならない場合は、通常の冷凍保存剤（例えば、ＤＭＳＯ、グリセリン、エピライフ（Epilife）細胞凍結培地（Cascade Biologics））を凍結前に細胞集団に添加してもよい。

本発明の薬学組成物は、有効成分として幹細胞又はその培養物と無細胞軟骨破砕物とを含み、関節疾患を発症した個体に前記薬学組成物を投与すると、前記組成物に含まれる無細胞軟骨破砕物により共に投与された幹細胞が軟骨細胞に一次的に分化するだけでなく、前記一次的に分化した軟骨細胞のパラクリン作用により、生体内に存在する内在性幹細胞に対しても二次的に軟骨細胞に分化しうるので、より向上した関節疾患治療効果を発揮することができる。

さらに他の実施形態として、本発明は、前記複合体又はそれを含む薬学組成物を用いて関節疾患を予防又は治療する方法を提供する。具体的には、本発明の関節疾患の予防又は治療方法は、前記複合体又はそれが含まれる薬学組成物を、関節疾患を発症するリスクのある個体又は関節疾患を発症した個体に投与するステップを含む。

本発明における「個体」とは、関節疾患を発症したか、発症するリスクのある生物を意味するが、一例として関節組織を含む高等脊椎動物であってもよく、他の例として哺乳動物であってもよく、さらに他の例として霊長類であってもよく、さらに他の例としてヒト、ラット、マウス、家畜などであってもよい。

本発明における「投与」とは、適切な方法で患者に所定の物質を導入する行為を意味し、有効成分をヒト又は動物用に剤形化して様々な経路で投与することができる。

本発明における前記投与とは、関節疾患を発症した個体に本発明の複合体又はそれを含む薬学組成物を導入する行為を意味するものと解される。

本発明の複合体を含む薬学組成物の投与経路は、特にこれらに限定されるものではないが、一例として血管内、静脈内、動脈内、筋肉内、皮下などの非経口経路で投与してもよく、他の例として経口、鼻腔、直腸、経皮又はエアゾールによる吸入経路で投与してもよい。

本発明の複合体は、それに含まれる幹細胞又はその培養物と無細胞軟骨破砕物とを同時に又は順次投与してもよい。

本発明の複合体は、幹細胞を含む軟骨組織に投与してもよい。

また、前記関節疾患の治療効果を向上させるために、本発明の薬学組成物を投与する前に、投与と同時に、又は投与した後に、生体内で副作用を引き起こすことなく、軟骨再生、軟骨分化などを促進させることのできる軟骨分化促進用製剤を投与するステップをさらに含んでもよい。前記軟骨分化促進用製剤は、特にこれらに限定されるものではないが、ＢＭＰ６（Bone morphogenetic protein 6）などであってもよい。

本発明の複合体又はそれを含む薬学組成物は、薬学的に有効な量で投与してもよい。

本発明における「薬学的に有効な量」とは、医学的治療に適用できる合理的な利益／リスク比で疾患を治療するのに十分であり、副作用を引き起こさない程度の量を意味する。

また、本発明による薬学組成物は、薬学的分野における通常の方法による患者の体内投与に適した単回投与型の製剤に剤形化して投与することができ、前記製剤は１回又は数回に分けて投与することにより効果的な投与量で投与することができる。このような目的に適う剤形としては、非経口投与製剤である、注射用アンプルなどの注射剤、注入バッグなどの注入剤、エアゾール製剤などの噴霧剤などが好ましい。前記注射用アンプルは使用直前に注射液と混合調製することができ、注射液としては、生理食塩水、グルコース、マンニトール、リンガー溶液などを用いることができる。また、注入バッグとしては、塩化ポリビニル又はポリエチレン製のものを用いることができ、バクスター（Baxter）、ベクトン・ディッキンソン（Becton Dickinson）、メドセップ（Medcep）、ナショナルホスピタルプロダクツ（National Hospital Products）又はテルモ（Terumo）社の注入バッグが挙げられる。

前記薬学的製剤は、前記有効成分以外にも、１つ又はそれ以上の薬学的に許容される通常の不活性担体、例えば注射剤の場合は、保存剤、無痛化剤、可溶化剤、安定化剤などをさらに含んでもよく、局所投与用製剤の場合は、基剤（base）、賦形剤、滑沢剤、保存剤などをさらに含んでもよい。

本発明による幹細胞又はその培養物と軟骨抽出物とを含む薬学組成物は、当業界で通常用いる投与方法を用いて、移植及びその他の用途に用いる他の幹細胞又は他の関節疾患治療用製剤と共に又は混合物の形態で投与してもよく、治療を必要とする患者の疾患部位に直接生着又は移植するか、腹腔に直接移植又は注入することが好ましいが、これらに限定されるものではない。また、前記投与には、カテーテルを用いた非外科的投与法、及び疾患部位切開後の注入、移植などの外科的投与法の全てが可能であるが、カテーテルを用いた非外科的投与法がより好ましい。さらに、通常の方法による非経口的投与、例えば病変への直接投与以外にも、造血系幹細胞移植の一般的方法である血管内注入による移植も可能である。

前記薬学組成物に含まれる幹細胞の１日投与量は、一例として１．０×１０^４〜１．０×１０^１０細胞／ｋｇ体重、他の例として１．０×１０^５〜１．０×１０^９細胞／ｋｇ体重を１回又は数回に分けて投与してもよい。しかし、有効成分の実際の投与量は、治療する疾患、疾患の重症度、投与経路、患者の体重、年齢、性別などの様々な関連因子を考慮して決定しなければならないことを理解すべきである。よって、前記投与量は、いかなる場合でも本発明を限定するものではない。

さらに他の実施形態として、本発明は、前記方法で製造された無細胞軟骨破砕物の存在下で幹細胞から分化した軟骨又は軟骨細胞を含む軟骨細胞分化誘導用組成物を提供する。

前述したように、本発明の方法で製造された軟骨又は軟骨細胞は、さらなる軟骨無細胞破砕物を用いなくても、それ自体でパラクリン作用（Paracrine effect）により幹細胞を軟骨細胞に分化させることができるので、前述したように製造した軟骨又は軟骨細胞は、軟骨細胞分化誘導用組成物の有効成分として用いられてもよい。

すなわち、前記軟骨又は軟骨細胞を幹細胞と共培養し、前記幹細胞を軟骨細胞に分化させることができる。

また、前記軟骨又は軟骨細胞としては、ブタ由来無細胞軟骨破砕物の存在下で臍帯血由来幹細胞を分化させて製造したものを用いることができる。

さらに他の実施形態として、本発明は、前述したように製造した軟骨細胞を用いて軟骨細胞を製造する方法を提供する。

具体的には、本発明が提供する軟骨細胞を用いた軟骨細胞の製造方法は、（ａ）無細胞軟骨破砕物の存在下で第１幹細胞から第１軟骨細胞を分化させるステップと、（ｂ）前記分化させた第１軟骨細胞と第２幹細胞を共培養し、共培養した第２幹細胞を第２軟骨細胞に分化させるステップとを含む。

ここで、前記（ａ）ステップは、ブタ由来無細胞軟骨破砕物の存在下で臍帯血由来幹細胞（第１幹細胞）を分化させる方法で行われてもよい。

さらに他の実施形態として、本発明は、軟骨を製造するための幹細胞又はその培養物と軟骨無細胞破砕物とを含む軟骨分化促進用複合体の用途を提供する。

さらに他の実施形態として、本発明は、関節疾患を予防又は治療するための幹細胞又はその培養物と軟骨無細胞破砕物とを含む軟骨分化促進用複合体の用途を提供する。

以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明がこれらの実施例に限定されるものではない。

実施例１：無細胞ブタ軟骨抽出物（ＰＣＰ）の軟骨分化能の評価
実施例１−１：ヒト臍帯血由来間葉系幹細胞の軟骨分化誘導
ヒト臍帯血由来間葉系幹細胞（UCB-MSC; Umbilical cord blood derived mesenchymal stem cell）を１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ及び１％（ｗ／ｖ）ゲンタマイシンを含むＫＳＢ−３培地（カンステムバイオテック，韓国）に接種し、３７℃及び５％（ｖ／ｖ）二酸化炭素条件で培養した。

前記培養したＵＣＢ−ＭＳＣを５μｌ当たり５×１０^５個含む液滴を得て、それを４８ウェルプレートの各ウェルに接種し、次いで３７℃及び５％（ｖ／ｖ）二酸化炭素条件で２時間放置して前記ウェルの底に付着させた。

前記付着させた液滴に軟骨分化誘導剤である無細胞ブタ軟骨抽出物（Porcine Catilage Powder, ＰＣＰ；０．５、１又は２％（ｗ／ｖ））又はヒアルロン酸（ＨＡ；０．２５、０．５又は１％（ｗ／ｖ））を含む軟骨分化誘導培地（StemPro Chondrogenesis Differentiation Kit, ThermoFisher）を加えて７日間培養し、前記ＵＣＢ−ＭＳＣを軟骨細胞に分化させた（図１ａ）。ここで、対照群としては、軟骨分化誘導剤で処理していないＵＣＢ−ＭＳＣを用い、前記無細胞ブタ軟骨抽出物は、ブタの軟骨から細胞を除去し、その後細胞を除去したブタ軟骨に凍結乾燥、破砕、濾過などの加工工程を行って得た。

図１ａは、軟骨分化誘導剤の種類及び処理濃度によるヒト臍帯血由来間葉系幹細胞（ＵＣＢ−ＭＳＣ）の軟骨分化レベルを評価した結果を示す顕微鏡写真である。

図１ａから分かるように、公知の軟骨分化誘導剤であるＨＡだけでなく、様々な濃度のＰＣＰで処理した場合に、全てＵＣＢ−ＭＳＣからペレット状の軟骨が形成されることが確認された。

実施例１−２：アルシアンブルー染色分析
実施例１−１の試料のうち、２％（ｗ／ｖ）ＰＣＰで処理して分化させた細胞において、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を加えて１日間反応させ、細胞を固定した。前記固定した細胞に１％アルシアンブルー（Alcian Blue）を加えて２０分間染色し、前記固定した細胞から軟骨マーカーであるプロテオグリカンの一種であるグリコサミノグリカン（GAG; Glycosaminoglycan）が検出されるか否かを確認した（図１ｂ）。

図１ｂは、２％（ｗ／ｖ）ＰＣＰで処理して分化させた細胞をアルシアンブルーで染色した結果を示す顕微鏡写真である。

図１ｂから分かるように、対照群においてはアルシアンブルーで染色されたＧＡＧが検出されなかったが、２％（ｗ／ｖ）ＰＣＰで処理して分化させた細胞においてはアルシアンブルーで染色されたＧＡＧが検出された。

実施例１−３：リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）
実施例１−１で分化した各細胞にＴＲＩｚｏｌ（Invitrogen）溶液を加えてそれぞれの全ＲＮＡを抽出し、抽出した全ＲＮＡとＡｃｃｕＰｏｗｅｒ ＲＴ ＰｒｅＭｉｘ（Bioneer）を用いてそれぞれのｃＤＮＡを合成した。前記合成したｃＤＮＡと下記プライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲを行い、様々なタンパク質（アグリカン（ａｇｇ）、２型コラーゲン（Ｃｏｌ２ａ）、ＳＯＸ９及び１型コラーゲン（Ｃｏｌ１））の発現レベルを比較した（図１ｃ）。ここで、内部対照群としてはＲＰＬ１３ａを用いた。
Ａｇｇｒｅｃａｎ＿Ｆ：５’−ｃｔｇｃａｔｔｃｃａｃｇａａｇｃｔａａｃｃｔ−３’（配列番号１）
Ａｇｇｒｅｃａｎ＿Ｒ：５’−ｇａｃｇｃｃｔｃｇｃｃｔｔｃｔｔｇａａ−３’（配列番号２）
ｃｏｌｌａｇｅｎ ｔｙｐｅ ２ ａｌｐｈａ １＿Ｆ：５’−ｃｔａｃｔｇｇａｔｔｇａｃｃｃｃａａｃｃａａ−３’（配列番号３）
ｃｏｌｌａｇｅｎ ｔｙｐｅ ２ ａｌｐｈａ １＿Ｒ：５’−ｔｃｃａｔｇｔｔｇｃａｇａａａａｃｃｔｔｃａ−３’（配列番号４）
ＳＯＸ９＿Ｆ：５’−ｇａｃｔｔｃｔｇａａｃｇａｇａｇｃｇａｇａ−３’（配列番号５）
ＳＯＸ９＿Ｒ：５’−ｃｃｇｔｔｃｔｔｃａｃｃｇａｃｔｔｃｃｔｃ−３’（配列番号６）
ｃｏｌｌａｇｅｎ ｔｙｐｅ １＿Ｆ：５’−ｃａｇｇａａｇｇｇｃｃａｃｇａｃａａａ−３’（配列番号７）
ｃｏｌｌａｇｅｎ ｔｙｐｅ １＿Ｒ：５’−ｃｔｇｃｇｇｃａｃａａｇｇｇａｔｔｇ−３’（配列番号８）
ＲＰＬ １３ａ＿Ｆ：５’−ｃｔａｔｇａｃｃａａｔａｇｇａａｇａｇｃａａｃｃ−３’（配列番号９）
ＲＰＬ １３ａ＿Ｒ：５’−ｇｃａｇａｇｔａｔａｔｇａｃｃａｇｇｔｇｇａａ−３’（配列番号１０）

図１ｃは、ＵＣＢ−ＭＳＣから分化した軟骨細胞において、軟骨分化誘導剤の種類及び処理濃度によるタンパク質発現レベルの変化を比較した結果を示すグラフである。

図１ｃから分かるように、軟骨マーカータンパク質として知られるアグリカン（ａｇｇ）、２型コラーゲン（Ｃｏｌ２ａ）及びＳＯＸ９の発現レベルは、２％（ｗ／ｖ）ＰＣＰで処理して分化させた軟骨細胞において相対的に最も高いレベルであるのに対して、軟骨マーカータンパク質でない１型コラーゲン（Ｃｏｌ１）の発現レベルは、全ての実験群において低いレベルであることが確認された。

実施例１−４：免疫蛍光分析
実施例１−１の試料のうち、２％（ｗ／ｖ）ＰＣＰで処理して分化させた細胞と０．５％（ｗ／ｖ）ＨＡで処理して分化させた細胞において、アグリカン（ａｇｇ）及び２型コラーゲン（Ｃｏｌ２ａ）に対する免疫蛍光染色を行った。

概略的には、前記分化させた各細胞を固定し、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを加えてブロッキングし、次いでアグリカン又は２型コラーゲンに対する抗体（１：１００，abcam）を加えて４℃で一晩反応させた。次に、細胞をＰＢＳで洗浄し、塩素−Ａｌｅｘａ ４８８−コンジュゲート抗マウスＩｇＧ／ＩｇＭポリクローナル抗体（Invitrogen）を加えて反応させ、その後蛍光顕微鏡で観察した（図１ｄ及び図１ｅ）。ここで、対照染色は、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２ ｔｒｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ，ｔｒｉｈｙｄｒａｔｅ（Invitrogen）を用いて行った。

図１ｄは、２％（ｗ／ｖ）ＰＣＰで処理して分化させた細胞と０．５％（ｗ／ｖ）ＨＡで処理して分化させた細胞において、アグリカン（ａｇｇ）に対する免疫蛍光染色を行った結果を示す蛍光顕微鏡写真であり、図１ｅは、２％（ｗ／ｖ）ＰＣＰで処理して分化させた細胞と０．５％（ｗ／ｖ）ＨＡで処理して分化させた細胞において、２型コラーゲン（Ｃｏｌ２ａ）に対する免疫蛍光染色を行った結果を示す蛍光顕微鏡写真である。

図１ｄ及び図１ｅから分かるように、０．５％（ｗ／ｖ）ＨＡで処理して分化させた細胞よりも、２％（ｗ／ｖ）ＰＣＰで処理して分化させた細胞において、軟骨マーカーであるアグリカンと２型コラーゲンが相対的に高いレベルで発現することが確認された。

実施例１−５：ＢＭＰ６の発現に及ぼす影響
実施例１−１の試料のうち、２％（ｗ／ｖ）ＰＣＰで処理して分化させた細胞において、下記プライマーを用いた実施例１−３の方法を用いて、発現するＢＭＰ６（Bone morphogenetic protein 6）の発現レベルを測定した（図１ｆ）。ここで、対照群としては、ＰＣＰで処理せずに分化させた細胞において測定されたＢＭＰ６の発現レベルを用いた。
ＢＭＰ６＿Ｆ：５’−ｇｃｔａｔｇｃｔｇｃｃａａｔｔａｃｔｇｔｇａｔｇ−３’（配列番号１１）
ＢＭＰ６＿Ｒ：５’−ｔｇｃａｔｔｃａｔｇｔｇｔｇｃｇｔｔｇａ−３’（配列番号１２）

図１ｆは、２％（ｗ／ｖ）ＰＣＰで処理して分化させた細胞において、ＢＭＰ６の発現レベルを測定した結果を示すグラフである。

図１ｆから分かるように、２％（ｗ／ｖ）ＰＣＰで処理して分化させた細胞においてはＢＭＰ６の発現レベルが急激に増加することが確認された。

また、軟骨分化誘導剤として５００ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ６で処理することを除いて、実施例１−１と同様の方法を行ってＵＣＢ−ＭＳＣを分化させ、こうして得られた分化させた細胞において、実施例１−３の方法を用いて、発現する様々なタンパク質（アグリカン（ａｇｇ）、２型コラーゲン（Ｃｏｌ２ａ）、ＳＯＸ９及び１型コラーゲン（Ｃｏｌ１））の発現レベルを比較した（図１ｇ）。

図１ｇは、ＢＭＰ６で処理してＵＣＢ−ＭＳＣから分化した軟骨細胞において、タンパク質発現レベルの変化を比較した結果を示すグラフである。

図１ｇから分かるように、軟骨マーカータンパク質として知られるアグリカン（ａｇｇ）、２型コラーゲン（Ｃｏｌ２ａ）及びＳＯＸ９の発現レベルは、ＢＭＰ６で処理して分化させた軟骨細胞において急激に増加したのに対して、軟骨マーカータンパク質でない１型コラーゲン（Ｃｏｌ１）の発現レベルは変化しないことが確認された。

実施例１−６：ＰＣＰの細胞毒性評価
２４ウェルプレートの各ウェルに３×１０^４個のＵＣＢ−ＭＳＣを接種し、様々な濃度（０．５、１又は２％（ｗ／ｖ））のＰＣＰを添加して３日間培養した。培養終了後に、培養培地１００μｌ当たり１０μｌのＣｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ−８（Dojindo）を加えて１時間反応させ、次いで４５０ｎｍで吸光度を測定してＰＣＰの細胞毒性の有無を確認した（図１ｈ）。

図１ｈは、ＰＣＰの処理濃度による細胞生存率の変化を比較した結果を示すグラフである。

図１ｈから分かるように、ＰＣＰを高い濃度で処理しても、細胞生存率に特に影響を及ぼさないことが確認された。

実施例１−１〜１−６の結果をまとめると、ＰＣＰを安全な軟骨分化誘導剤として使用できることが分かった。

実施例２：ＰＣＰで分化した軟骨細胞のＵＣＢ−ＭＳＣ分化能の評価
実施例２−１：一次分化した軟骨細胞を用いたＵＣＢ−ＭＳＣの二次分化
実施例１−１の方法により、ＵＣＢ−ＭＳＣをＰＣＰ又はＨＡで処理して分化させた軟骨細胞を０．４μｍ孔のポリカーボネート膜インサートが備えられたＴｒａｎｓｗｅｌｌ（Corning）の上側インサートに加え、軟骨細胞分化誘導培地（StemPro Chondrogenesis Differentiation Kit, ThermoFisher）下で、前記培養したＵＣＢ−ＭＳＣを５μｌ当たり５×１０^５個含む液滴と共培養（co-culture）した（図２ａ）。ここで、陰性対照群としては、軟骨分化誘導剤で処理せず、共培養していない状態で、軟骨細胞分化誘導培地で分化させたＵＣＢ−ＭＳＣを用い、陽性対照群としては、軟骨分化誘導剤で処理せずに分化した細胞と共培養したＵＣＢ−ＭＳＣを用い、実験群１は、ＰＣＰで処理して分化した細胞と共培養したＵＣＢ−ＭＳＣを用い、実験群２は、ＨＡで処理して分化した細胞と共培養したＵＣＢ−ＭＳＣを用いた。

図２ａは、一次分化した軟骨細胞を用いたＵＣＢ−ＭＳＣの二次分化実験過程を示す概略図である。すなわち、前記Ｔｒａｎｓｗｅｌｌはインサートが備えられた上側とインサートのない下側に分けられるが、前記上側には分化した細胞を配置し、前記下側にはまだ分化していないＵＣＢ−ＭＳＣを配置し、これら各細胞を共培養した。

実施例２−２：分化能の評価
実施例２−１の方法で７日又は１０日間共培養したＵＣＢ−ＭＳＣの分化結果を顕微鏡で観察した（図２ｂ）。

図２ｂは、ＰＣＰ又はＨＡで処理して分化した軟骨細胞とＵＣＢ−ＭＳＣを共培養した結果を示す顕微鏡写真である。

図２ｂから分かるように、共培養していないＵＣＢ−ＭＳＣ（陽性対照群）や、ＰＣＰで処理せずに分化した細胞と共培養したＵＣＢ−ＭＳＣ（陰性対照群又は実験群２）においては、ＵＣＢ−ＭＳＣを軟骨細胞に分化させられないのに対して、ＰＣＰで処理して分化した細胞と共培養したＵＣＢ−ＭＳＣ（実験群１）においては、ＵＣＢ−ＭＳＣを軟骨細胞に分化させられることが確認された。

実施例２−３：ＲＴ−ＰＣＲ分析
実施例２−１の方法で７日又は１０日間共培養した各ＵＣＢ−ＭＳＣにおいて、発現した軟骨マーカーであるアグリカン（ａｇｇ）及び２型コラーゲン（Ｃｏｌ２ａ）と、軟骨マーカーでない１型コラーゲン（Ｃｏｌ１）の発現レベルを実施例１−３の方法で分析した（図２ｃ）。

図２ｃは、ＰＣＰ又はＨＡで処理して分化した軟骨細胞と共培養したＵＣＢ−ＭＳＣにおいて、発現したタンパク質（アグリカン、２型コラーゲン及び１型コラーゲン）の発現レベルの変化を比較した結果を示すグラフである。

図２ｃから分かるように、７日間共培養したＵＣＢ−ＭＳＣのうち、軟骨マーカーであるアグリカン（ａｇｇ）及び２型コラーゲン（Ｃｏｌ２ａ）の発現レベルは、ＰＣＰで処理して分化した細胞と共培養したＵＣＢ−ＭＳＣ（実験群１）においてどちらも高いレベルであることが確認された。

これに対して、共培養していないＵＣＢ−ＭＳＣ（陽性対照群）や、ＰＣＰで処理せずに分化した細胞と共培養したＵＣＢ−ＭＳＣ（陰性対照群又は実験群２）においては、概して低いレベルであることが確認された。

また、軟骨マーカーでない１型コラーゲン（Ｃｏｌ１）は、全てにおいて概して低いレベルであることが確認された。

実施例２−１〜２−３の結果から分かるように、分化した軟骨細胞のパラクリン作用（paracrine effect）によるＵＣＢ−ＭＳＣの分化誘導は、ＰＣＰで処理して分化した軟骨細胞においてのみ示されたので、分化した軟骨細胞は分化誘導促進剤の種類により全く異なる特性を示し、分化した軟骨細胞が同じではないことが分かった。

実施例３：生体内におけるＰＣＰ及び幹細胞を用いた軟骨損傷治療効果の分析
実施例３−１：軟骨欠損モデル動物を用いた分析
実施例３−１−１：軟骨欠損モデル動物の作製
雄ニュージーランドホワイト（NZW; New Zealand White）ウサギにゾレチル（Zoletil 50, Virbac, １５ｍｇ／ｋｇ）とロムプン（Rompun, Bayer, ５ｍｇ／ｋｇ）を筋肉注射して全身麻酔を施した。右膝周辺の毛を除去し、膝関節の内側皮膚を切開し、筋膜と関節包を切開し、その後膝骨を外側に反らせて関節包を露出させた。大腿骨の内果部（膝関節腔の中央）に、直径１ｍｍのドリルビット（drill bit）を用いて、直径５ｍｍ、深さ２ｍｍの軟骨欠損部位を作製し、キューレットで欠損部位内の軟骨を全て除去し、その後関節包を縫合した。手術後３日間抗生剤であるフォクソリン（Foxolin, 三進製薬, １０ｍｇ／ｋｇ）と鎮痛剤であるマリトロール（Maritrol, 第一製薬, ３ｍｇ／ｋｇ）を毎日２回筋肉注射し、その後３日間フォクソリンで毎日１回さらに処置することにより、軟骨欠損モデル（ACD; Articular Cartilage Defect）動物を作製した。

実施例３−１−２：軟骨欠損モデル動物に対するＰＣＰ及び幹細胞の治療効果
実施例３−１−１で作製した軟骨欠損モデル動物において、軟骨を除去した時点から３０分経過後に、ＰＢＳに希釈したＵＣＢ−ＭＳＣ（実験群１１）、ＵＣＢ−ＭＳＣ／ＰＣＰ（実験群１２）又はＵＣＢ−ＭＳＣ／ＨＡ（実験群１３）をウサギ１匹当たり０．２ｍＬの用量で関節腔内に投与し、４週間飼育した。

飼育したモデル動物の関節の外側大腿顆（femoral condyle）の損傷部位が含まれるように関節面を切断し、軟骨欠損部位の変化、軟骨欠損部位の表面状態、欠損境界部位と新生した組織との境界部の連続性についての肉眼観察、及び写真撮影による軟骨再生の程度を国際軟骨修復学会のスコアリングシステム（International Cartilage Repair Society(ICRS) scoring system）に基づいて点数化して分析した。

概略的には、関節組織は１０％中性ホルマリン溶液に３日間固定し、その後１０％ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）溶液で十分に脱灰してパラフィン切片を作製した。組織切片は、ヘマトキシリン・エオジン染色（H&E; Hematoxylin & eosin staining）を施し、顕微鏡画像解析プログラムであるＩｍａｇｅ Ｊ ４．８ｖ（Wayne Rasband, National Institute of Health, UAS）により［軟骨再生部位／切断面面積］の比率分析を行い、軟骨再生面積をＩＣＲＳスコアで数値化した（図３ａ及び３ｂ）。ここで、対照群としては、軟骨欠損モデル動物にいかなる処理もしていないものを用いた。

図３ａは、軟骨欠損モデル動物において、ＵＣＢ−ＭＳＣと軟骨分化誘導剤の組み合わせ処理による軟骨回復レベルを比較した結果を示す写真である。

図３ａから分かるように、対照群の軟骨回復レベルは欠損部位の９０．４８±０．９％、実験群１１の軟骨回復レベルは欠損部位の９１．８２±０．８％、実験群１２の軟骨回復レベルは欠損部位の９４．４１±５．５８％、実験群１３の軟骨回復レベルは欠損部位の９０．５１±３．３６％であった。

また、図３ｂは、軟骨欠損モデル動物において、ＵＣＢ−ＭＳＣと軟骨分化誘導剤の組み合わせ処理による軟骨再生面積をＩＣＲＳスコアで数値化した結果を示すグラフである。

図３ｂから分かるように、対照群のＩＣＲＳスコアは４．３±０．９点、実験群１１のＩＣＲＳスコアは７．０±０．８７点、実験群１２のＩＣＲＳスコアは８．０±０．８３点、実験群１３のＩＣＲＳスコアは４．３±０．７８点であることが確認された。

図３ａ及び図３ｂの結果から、軟骨欠損モデル動物をＵＣＢ−ＭＳＣとＰＣＰで組み合わせ処理したものにおいて、軟骨回復が最も高いレベルを示し、軟骨欠損モデル動物をＵＣＢ−ＭＳＣとＨＡで組み合わせ処理したものより、ＵＣＢ−ＭＳＣで単独処理したものにおいて、相対的に高い軟骨回復レベルを示すことが分かった。

実施例３−１−３：サフラニンＯ（Safranin-O）染色分析
実施例３−１−２で４週間飼育した軟骨欠損モデル動物から軟骨欠損部位を摘出した。前記摘出した軟骨欠損部位におけるプロテオグリカン（proteoglycan）の含有量を確認するために、サフラニンＯ（Safranin-O）染色を行った（図３ｃ）。

図３ｃは、軟骨欠損モデル動物において、ＵＣＢ−ＭＳＣと軟骨分化誘導剤の組み合わせ処理による軟骨欠損部位内のプロテオグリカン含有量を分析するためのサフラニンＯ染色を行った結果を示す顕微鏡写真である。

図３ｃから分かるように、軟骨欠損モデル動物をＵＣＢ−ＭＳＣとＰＣＰで組み合わせ処理したもの（実験群１２）において、軟骨欠損部位内のプロテオグリカン含有量が最も高いレベルを示した。また、軟骨欠損モデル動物をＵＣＢ−ＭＳＣとＨＡで組み合わせ処理したもの（実験群１３）より、ＵＣＢ−ＭＳＣで単独処理したもの（実験群１１）において、軟骨欠損部位内のプロテオグリカン含有量が相対的に高い軟骨回復レベルを示すことが確認された。

実施例３−１−４：免疫蛍光染色分析
実施例３−１−３で摘出した軟骨欠損部位を対象に、実施例１−４の方法により、２型コラーゲンに対する免疫染色を行った（図３ｄ）。

図３ｄは、軟骨欠損モデル動物において、ＵＣＢ−ＭＳＣと軟骨分化誘導剤の組み合わせ処理による軟骨欠損部位内の２型コラーゲンの発現レベルを分析するための免疫蛍光染色を行った結果を示す蛍光顕微鏡写真である。

図３ｄから分かるように、軟骨欠損モデル動物をＵＣＢ−ＭＳＣとＰＣＰで組み合わせ処理したもの（実験群１２）において、軟骨欠損部位内の２型コラーゲンの発現レベルが最も高いレベルを示した。また、軟骨欠損モデル動物をＵＣＢ−ＭＳＣとＨＡで組み合わせ処理したもの（実験群１３）より、ＵＣＢ−ＭＳＣで単独処理したもの（実験群１１）において、軟骨欠損部位内の２型コラーゲンの発現レベルが相対的に高いレベルを示すことが確認された。

実施例３−１−５：アルシアンブルー染色分析
実施例３−１−３で摘出した軟骨欠損部位を対象に、実施例１−２の方法により、グリコサミノグリカンのレベルを確認するためのアルシアンブルー染色を行った（図３ｅ）。

図３ｅは、軟骨欠損モデル動物において、ＵＣＢ−ＭＳＣと軟骨分化誘導剤の組み合わせ処理による軟骨欠損部位内のグリコサミノグリカンのレベルを分析するためのアルシアンブルー染色を行った結果を示すグラフである。

図３ｅから分かるように、軟骨欠損モデル動物をＵＣＢ−ＭＳＣとＰＣＰで組み合わせ処理したもの（実験群１２）において、軟骨欠損部位内のグリコサミノグリカンのレベルが最も高いレベルを示し、ＵＣＢ−ＭＳＣで単独処理したもの（実験群１１）においても、実験群１２と同等のグリコサミノグリカンのレベルを示すことが確認された。

これに対して、軟骨欠損モデル動物をＵＣＢ−ＭＳＣとＨＡで組み合わせ処理したもの（実験群１３）においては、対照群と同等の軟骨欠損部位内のグリコサミノグリカンのレベルを示すことが確認された。

実施例３−１−１〜３−１−５の結果をまとめると、軟骨欠損モデル動物において、ＵＣＢ−ＭＳＣとＰＣＰの組み合わせ処理は軟骨損傷を有効に治療する効果を発揮したのに対して、ＵＣＢ−ＭＳＣとＨＡの組み合わせ処理は軟骨損傷治療に特に影響を及ぼさないことが分かった。

実施例３−２：骨関節炎モデル動物を用いた分析
実施例３−２−１：骨関節炎モデル動物の作製
雄ニュージーランドホワイトウサギに全身麻酔を施し、膝関節の内側皮膚を切開し、筋膜と関節包を切開し、その後膝骨を外側に反らせて前十字靱帯を露出させた。外科用メス（Surgical blade）で前十字靱帯の中間実質部位と半月板靱帯を完全に切断し、その後関節包を縫合した。手術後に、従来の方法で抗生剤及び鎮痛剤を処方することにより、骨関節炎モデル（ＡＣＬＴ−ＯＡ）動物を作製した。

実施例３−２−２：骨関節炎モデル動物に対するＰＣＰ及び幹細胞の治療効果
実施例３−２−１で作製した骨関節炎モデル動物を８週間飼育し、次いでＸ線検査により骨関節炎の発生の有無を確認した。概略的には、全身麻酔を施し、右膝関節をＣＣ（cranio-caudal）ｖｉｅｗで補正してＸ線（Genoray）放射線画像を撮影した。こうすることにより、関節の間隔の狭まり（narrowed joint space）や脛骨中央（medial tibia）における骨変形などを点数化（ＫＬグレード；KL grade; Kellgren-Lawrence score system）し、骨関節炎の進行の程度を評価した。

前記骨関節炎のグレードが決定された動物の関節腔に、治療候補物質としてＰＢＳ（陽性対照群，ＰＣ）、ＰＢＳに希釈したＰＣＰ（実験群２１）、ＵＣＢ−ＭＳＣ（実験群２２）又はＵＣＢ−ＭＳＣ／ＰＣＰ（実験群２３）をウサギ１匹当たり０．２ｍＬの用量で投与し、３週目、５週目及び７週目にＸ線撮影して点数化（ＫＬグレード）することにより、骨関節炎の進行の程度を評価した（図４ａ）。ここで、陰性対照群（ＮＣ）としては、骨関節炎が誘発されていない動物を用いた。

図４ａは、骨関節炎モデル動物において、ＵＣＢ−ＭＳＣとＰＣＰの単独処理又は組み合わせ処理による関節炎改善効果を経時的に撮影したＸ線写真である。

図４ａから分かるように、陽性対照群（ＰＣ）においては、時間が経過してもＫＬ点数が一定レベルを維持（３週：４．００，５週：３．６７，７週：４．００）するのに対して、ＰＣＰ単独投与群（実験群２１；３週：３．２５，５週：３．５０，７週：３．６３）、ＵＣＢ−ＭＳＣ単独投与群（実験群２２；３週：５．７１，５週：３．５０，７週：３．３８）及びＵＣＢ−ＭＳＣとＰＣＰの併用投与群（実験群２３；３週：２．７５，５週：２．８８，７週：３．１３）においては、骨関節炎が改善される傾向を示した。

特に、ＵＣＢ−ＭＳＣ単独投与群より、ＵＣＢ−ＭＳＣとＰＣＰの併用投与群において、骨関節炎改善効果が増加することが確認された。

実施例３−２−３：行動学的評価
実施例３−２−２で準備した骨関節炎誘発直後と、治療候補物質で処理して３週間、５週間又は７週間経過した時点で、各モデル動物を広い空間で自由歩行させて関節炎誘発による行動検査を行い、歩き方及び足取り（gait）、姿勢及び重心（weight bearing）並びに活動性（activity）を点数化し、ＫＬグレードと共に関節炎の進行の程度を総合的に評価した（図４ｂ）。

図４ｂは、骨関節炎モデル動物において、ＵＣＢ−ＭＳＣとＰＣＰの単独処理又は組み合わせ処理による行動検査結果を示すグラフである。

図４ｂから分かるように、いかなる処理もしていないもの（陽性対照群）においては、経時的に骨関節炎症状が悪化し続けたのに対して（３週−１０．２２；５週−１０．２２；７週−１１．２２）、ＰＣＰで単独処理したもの（実験群２１；３週−８．８７；５週−９．２９；７週−１０．２６）、ＵＣＢ−ＭＳＣで単独処理したもの（実験群２２；３週−８．７１；５週−９．２１；７週−９．５５）及びＵＣＢ−ＭＳＣとＰＣＰで組み合わせ処理したもの（実験群２３；３週−７．９６；５週−８．１７；７週−８．９２）においては、骨関節炎症状が改善されることが確認された。

特に、ＵＣＢ−ＭＳＣとＰＣＰで組み合わせ処理したもの（実験群２３）においては、ＰＣＰ（実験群２１）又はＵＣＢ−ＭＳＣ（実験群２２）で単独処理したものより、骨関節炎改善効果が向上することが分かった。

実施例３−２−４：サイトカインレベルの評価
実施例３−２−２と同様に、各治療候補物質を投与して８週間経過した時点でウサギに麻酔を施し、右側関節炎誘発部位の関節腔に生理食塩水（０．１ｍＬ）を注射し、その後さらに２回繰り返し、関節腔液を採取した。関節腔液は、コラゲナーゼ（collagenase, ４００μｇ／ｍｌ）とヒアルロニダーゼ（hyaluronidase, ４０Ｕ／ｍｌ）で３７℃にて１０分間処理し、その後ＴＮＦ−α（R&D system）酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）により炎症性サイトカインの１つであるＴＮＦ−αのレベルを定量分析した（図４ｃ）。

図４ｃは、骨関節炎モデル動物において、ＵＣＢ−ＭＳＣとＰＣＰの単独処理又は組み合わせ処理による関節腔液内のＴＮＦ−αのレベルを比較した結果を示すグラフである。

図４ｃから分かるように、骨関節炎が誘発されていないもの（ＮＣ）に比べて、骨関節炎が誘発されたモデル動物（ＰＣ）においては、関節腔液内のＴＮＦ−αのレベルが急激に増加したが、ＰＣＰ（実験群２１）、ＵＣＢ−ＭＳＣ（実験群２２）又はＵＣＢ−ＭＳＣ／ＰＣＰ（実験群２３）を投与することにより、関節腔液内のＴＮＦ−αのレベルが減少することが確認された。

特に、ＵＣＢ−ＭＳＣとＰＣＰで組み合わせ処理したもの（実験群２３）においては、ＰＣＰ（実験群２１）又はＵＣＢ−ＭＳＣ（実験群２２）で単独処理したものより、関節腔液内のＴＮＦ−αのレベルが低下し、よくなることが分かった。

実施例３−２−５：組織学的評価
実施例３−２−２と同様に、各治療候補物質を投与して８週間経過した時点でモデル動物を屠殺し、内側関節到達法で膝関節を露出させ、その後軟骨損傷に注意しながら膝関節周囲の縁部組織を除去し、次いで関節炎誘発部位を含む大腿骨顆上部を採取した。次に、膝関節の大腿骨顆（femoral condyle）と脛骨プラトー（tibial plateau）部を撮影し（図４ｄ）、関節面のエロージョン（erosion）、表面変化、骨棘及び大腿骨顆の肥大レベルを総合的に定量分析した（図４ｅ）。

図４ｄは、骨関節炎モデル動物において、ＵＣＢ−ＭＳＣとＰＣＰの単独処理又は組み合わせ処理を行った膝関節の大腿骨顆（femoral condyle）と脛骨プラトー（tibial plateau）部を撮影した写真であり、図４ｅは、骨関節炎モデル動物において、ＵＣＢ−ＭＳＣとＰＣＰの単独処理又は組み合わせ処理による関節面のエロージョン（erosion）、表面変化、骨棘及び大腿骨顆の肥大レベルを総合的に定量分析した結果を示すグラフである。

図４ｄから分かるように、陽性対照群とＰＣＰで単独処理したもの（実験群２１）においては、大腿骨顆の激しい損傷、エロージョン及び骨棘が現れることが確認されたのに対して、ＵＣＢ−ＭＳＣで単独処理したもの（実験群２２）や、ＵＣＢ−ＭＳＣとＰＣＰで組み合わせ処理したもの（実験群２３）においては、中度の大腿骨顆の損傷及び骨棘が現れることが確認された。

図４ｅから分かるように、前記大腿骨顆の損傷レベルと骨棘レベルを定量分析した結果、対照群は１４．００±１．６７、実験群２１は１３．００±１．２６、実験群２２は１２．００±０．７２、実験群２３は１０．００±０．９２の損傷度を示すことがを確認された。

実施例３−２−１〜３−２−５の結果をまとめると、骨関節炎モデル動物において、ＰＣＰ又はＵＣＢ−ＭＳＣで単独処理しても骨関節炎を改善することができ、ＰＣＰで単独処理したものより、ＵＣＢ−ＭＳＣで単独処理したもののほうが向上した骨関節炎改善効果を示すことが確認されたが、このようにＰＣＰ又はＵＣＢ−ＭＳＣで単独処理したものより、ＰＣＰとＵＣＢ−ＭＳＣで組み合わせ処理したものにおいて、相対的に高いレベルの骨関節炎治療効果を示すことが分かった。

つまり、軟骨が損傷した動物において、損傷した軟骨を治療するためには、軟骨分化誘導剤の一種であるＨＡは特に効果を示さなかったが、ＰＣＰ単独でも治療効果を示し、前記ＰＣＰを単独で用いるより、前記ＰＣＰと幹細胞を組み合わせて用いるほうが好ましいことが分かった。

以上の説明から、本発明の属する技術分野の当業者であれば、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施できることを理解するであろう。なお、前記実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本発明には、前記詳細な説明ではなく後述する請求の範囲の意味及び範囲とその等価概念から導かれるあらゆる変更や変形された形態が含まれるものと解釈すべきである。

Claims (6)

1. 臍帯血由来間葉系幹細胞又はその培養物とブタ由来無細胞軟骨破砕物とを含む、軟骨分化促進用複合体。
2. 前記無細胞軟骨破砕物は、破砕物と、酵素分解物と、軟骨細胞が除去された軟骨基質をアルカリもしくは酸性試薬で処理するか、又は軟骨細胞が除去された軟骨基質を界面活性剤で処理して得られた反応産物と、それらの組み合わせとからなる群から選択される、請求項１に記載の軟骨分化促進用複合体。
3. 前記複合体は、幹細胞の軟骨分化を促進させることのできる軟骨分化促進用製剤をさらに含み、前記軟骨分化促進用製剤はＢＭＰ６（Bone morphogenetic protein 6）である、請求項１に記載の軟骨分化促進用複合体。
4. 請求項１に記載の軟骨分化促進用複合体を含む、関節疾患予防又は治療用薬学組成物。
5. 前記関節疾患は、多発性関節症（Polyarthrosis）、股関節症（Coxarthrosis）、膝関節症（Gonarthrosis）又は脊椎関節症（Spondyloarthropathy）である、請求項４に記載の関節疾患予防又は治療用薬学組成物。
6. 臍帯血由来間葉系幹細胞又はその培養物とブタ由来無細胞軟骨破砕物とを含む、軟骨細胞分化誘導用組成物。

Images