KR102097005B1 - 전구세포 배양액 및 다층 그래핀 필름을 포함하는 줄기세포 분화 촉진용 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

전구세포 배양액 및 다층 그래핀 필름을 포함하는 줄기세포 분화 촉진용 조성물 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 전구세포의 배양액 및 다층 그래핀 필름을 포함하는 줄기세포 분화 촉진용 조성물에 관한 것으로, 보다 자세하게는 골·연골 전구세포의 세포 배양액 및 다층의 그래핀 필름을 유효성분으로 포함하는 줄기세포의 골 분화를 촉진시킬 수 있는 분화 촉진용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 줄기세포를 특정 세포로의 분화를 촉진시킴으로써 체내/외의 줄기세포 응용 분야에 다양하게 적용이 가능할 것으로 기대된다.

Description

전구세포 배양액 및 다층 그래핀 필름을 포함하는 줄기세포 분화 촉진용 조성물 및 이의 용도{A composition for stimulating differentiation of stem cell comprising multi-layer graphene film and culture broth of progenitor cell}
본 발명은 전구세포의 배양액 및 다층 그래핀 필름을 유효성분으로 포함하는, 줄기세포 분화 촉진용 조성물 및 이의 용도 등에 관한 것이다.
줄기세포(Stem cell)란 여러 종류의 신체 조직의 세포로 분화할 수 있는 능력, 즉, 줄기세포성(stemness)을 가진 미분화 세포를 총칭하는 광의의 개념을 말하며, 이러한 줄기세포는 크게 배아를 이용하여 제조할 수 있는 배아줄기세포(embryonic stem cell), 성체줄기세포(adult stem cell), 생식세포(gamete), 암 줄기세포(cancer stem cell) 등으로 나뉜다. 이러한 줄기세포는 다양한 세포로 분화가 가능할 뿐만 아니라 과도한 면역 반응의 억제, 유전자 치료용 매개체, 다양한 성장 인자의 생산 등에 다양하게 이용 가능하기 때문에 새로운 세포 치료제로서 활발히 연구되고 있다. 그러나 줄기세포는 배양을 하는 동안 그 성질이 변하지 않아야 하며 필요에 의한 분화 외에는 그 분화능이 억제되어야 되지만 기존의 배양 기구 이용 시에는 이러한 줄기세포의 생장 조절에 대한 한계가 존재하였다. 이에 따라, 줄기세포의 특징을 충분히 고려하여 줄기세포의 배양이 가능할 뿐만 아니라 줄기세포의 목적하는 세포로의 용이한 분화를 가능하게 해주는 분화 촉진용 조성물의 필요성이 대두되고 있는 실정이다.
한편, 최근 전세계적으로 노령화가 가속화됨으로써 골다공증, 골 괴사, 골 결손 질환, 골 손상 등과 같은 다양한 골 관련 질환에 대한 관심이 증가되고 있는 추세이다. 이러한 질환의 치료를 위하여 특별히 줄기세포를 활용한 연구가 활발히 진행되고 있는데, 가장 많이 연구가 되고 있는 분야는 중간엽줄기세포를 골 세포로 분화 유도하는 방법이다. 분화 유도제로 가장 많이 사용되고 있는 화합물은 합성 부신피질호르몬인 덱사메타손, 아스코르브산, 베타-글리세로포스페이트 등이 있으나, 그 효과가 미비하기 때문에 효과적인 골 분화를 유도하기 위하여, 추가로 BMP 관련 단백질, TGF-β 또는 IGF 계열의 재조합 단백질을 첨가하여 골 분화를 촉진시키는 방법에 대한 연구가 진행되고 있다. 그러나 BMP-2와 같은 생물 유래 성장 인자를 추가로 이용하는 방법은 골세포 분화를 촉진시킬 수는 있으나, 면역반응의 문제, 짧은 잔존 주기, 비용 문제 등의 한계점을 가지고 있다.
따라서, 체내 또는 체외에서 줄기세포의 목적하는 세포로의 분화를 촉진시킬 수 있는, 특별히 줄기세포의 골 분화를 촉진시킬 수 있는 분화 촉진용 조성물의 개발은 다양한 줄기세포 응용 분야에 안전하게 적용이 가능할 뿐만 아니라, 조직이나 뼈 손상 시에 높은 치료 효과를 나타낼 수 있을 것으로 기대된다.
국내공개특허 10-2016-0043844
본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 전구세포의 배양액 및 다층 그래핀 필름(multi-layer graphene film)을 유효성분으로 포함하는 줄기세포 분화 촉진용 조성물, 및 이를 이용한 줄기세포 치료용 약학 조성물, 줄기세포의 성장 및 분화를 조절하는 방법 등을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은 전구세포(progenitor cell)의 배양액 및 다층 그래핀 필름(multi-layer graphene film)을 포함하는 줄기세포 분화 촉진용 조성물을 제공한다. 상기 분화 촉진은 바람직하게는 줄기세포의 골 분화 촉진을 의미하며, 더욱 바람직하게는 중간엽줄기세포의 골 분화 촉진을 의미하나, 본 발명의 조성물에서 분화가 촉진되는 종류라면 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 조성물에서 배양된 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 줄기세포 치료용 약학 조성물을 제공한다. 상기 세포 치료용 약학 조성물이란, 바람직하게는 줄기세포를 이용하여 질병을 치료하는 약학 조성물, 즉, 세포 치료제를 의미하나, 본 발명의 조성물에서 배양된 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물이라면 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 조성물에서 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는 줄기세포의 성장 및 분화를 조절하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 바람직하게는 생체 외(in vitro)에서의 줄기세포의 성장 및 분화를 조절하는 방법이나, 본 발명의 줄기세포 분화 촉진용 조성물을 이용하는 방법이라면 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 전구세포의 배양액, 다층 그래핀 필름 및 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 골 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 전구세포의 배양액, 다층 그래핀 필름 및 줄기세포를 포함하는 골 질환 예방 또는 치료용 키트를 제공한다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 전구세포는 골·연골 전구세포(Osteochondroprogenitor Cell)일 수 있으며, 상기 전구세포는 바람직하게는 유추기 닭(starter chick)의 골 내 전구세포일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 유추기 닭의 장골에서 분리된 Sox9 단백질 양성 세포이나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 구체예에 있어서, 상기 배양액은 바람직하게는 전구세포를 배양한 후에 세포를 제거한 배양액일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 무혈청 배지에서 배양한 후에 세포를 제거한 배양액일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 세포 배양액을 농축하여 세포 배양 농축액으로 사용할 수 있으나, 전구세포를 배양한 배양액이라면 이에 제한되지 않는다. 상기 배양액은 액체 배지에서 세포를 일정기간 배양한 후에 세포를 제거하고 남은 용액을 의미하며, 배양 기간 동안 세포로부터 분비된 성장 인자 및 사이토카인 등의 단백질 및 세포 배양시 소모되고 남은 영양성분 등을 모두 포함할 수 있으며, 이를 건조한 건조 분말로 이용할 수도 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 상기 다층 그래핀 필름은 바람직하게는 2층 내지 10층의 그래핀이 적층될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 2층 내지 7층, 더욱 바람직하게는 2층 내지 5층, 더욱 바람직하게는 2층 내지 4층으로 적층될 수 있으나, 줄기세포의 분화를 촉진시킬 수 있는 수라면 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 다층 그래핀 필름은 20 내지 60nm 폭의 주름을 형성할 수도 있고, 추가로 세포 접착 분자(cell adhesion molecule)를 표면에 부착할 수도 있으며, 상기 세포 접착 분자는 바람직하게는 라이신, 피브로넥틴, 피브리노겐, 라미닌, 비트로넥틴 등일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 폴리-D-라이신 또는 폴리-L-라이신일 수 있으나, 세포의 부착 능력을 증가시킬 수 있는 세포 접착 인자라면 이에 제한되지 않는다. 또한, 전자빔 리소그래피, 포토 리소그래피 등을 이용하여 표면을 패턴화할 수도 있으며, 상기 그래핀 필름을 패턴화하는 방법은 줄기세포 배양에 사용되는 것으로 알려져 있는 방법이라면 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 상기 줄기세포는 바람직하게는 배아줄기세포, 생식세포, 성체 줄기세포 등일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 성체 줄기세포인 중간엽 줄기세포, 지방 유래 줄기세포, 조혈 줄기세포, 신경 줄기세포 등일 수 있으나, 본 발명의 조성물에서 분화가 촉진되는 줄기세포라면 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 상기 전구세포의 배양액은 다층 그래핀 필름 표면에 코팅될 수도 있으며, 상기 코팅은 바람직하게는 건조시키는 방법, 도포하는 방법, 프린팅하는 방법, 딥핑(deeping) 방법, 화학물질을 이용하여 결합시키는 방법 등으로 처리할 수 있으나, 일반적으로 알려져 있는 액체를 고체 표면에 코팅하는 방법이라면 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 상기 골질환은 바람직하게는 골질환, 연골질환 등일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 골다공증, 골 괴사, 골 손상, 골연화증, 구루병, 섬유성 골염, 무형성 골질환, 대사성 골질환, 골절의 불유합, 퇴행성 관절염, 외상에 의한 관절 손상, 변형성 관절증, 연골성이상증, 퇴행성 추간판증, 반월판 손상, 연골 손상, 연골 결손 등일 수 있으나, 줄기세포의 골 분화를 이용하여 치료할 수 있는 질환이라면 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 줄기세포 분화 촉진용 조성물에서 배양된 줄기세포를 개체에 투여하는 단계, 또는 전구세포의 배양액, 다층 그래핀 필름 및 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 골 질환의 치료방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 줄기세포 분화 촉진용 조성물에서 배양된 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 조성물, 또는 전구세포의 배양액, 다층 그래핀 필름 및 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 조성물의 골 질환 치료용도를 제공한다.
본 발명에 따른 전구세포의 배양액 및 다층 그래핀 필름을 포함하는 줄기세포 분화 촉진용 조성물은 기존 조골세포 유도 방법과 비교하여 2배 이상 분화 효율이 증가되었으며, 인체에 무해한 탄소 원자 및 전구세포의 세포를 제거한 배양액 만을 사용하여 줄기세포의 분화를 촉진시킬 수 있기 때문에 부작용의 발생을 현저히 감소시킬 수 있기 때문에 다양한 줄기세포를 이용한 질환 치료에 폭넓게 사용가능할 것으로 기대된다. 또한, 그래핀을 코팅하는 기판의 종류를 다양하게 변경할 수 있고, 전구세포 배양액으로 그래핀을 코팅하는 과정에서 다양한 첨가제를 추가할 수 있기 때문에 줄기세포를 이용하는 다양한 분야에 적용이 가능할 것으로 기대된다. 이외에도 시험관 내 골세포 유도 실험을 위한 조골세포 분화 촉진 배양용기, 골 조직 재생용 본 칩(bone chip) 등으로의 개발이 가능할 것으로 기대된다. 따라서, 본 발명은 의료/바이오산업, 나노 과학, 현미경 산업, 재료 산업, 농수산업 등 다양한 연구 분야에 쉽게 응용 가능할 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 그래핀 필름의 제작 방법을 간략하게 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 제작된 그래핀 필름을 주사전자현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 닭의 골·연골 전구세포의 획득 및 배양 방법, 그리고 상기 세포의 배양액 제조 방법을 간략하게 나타낸 도면이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 닭 장골에서 분리된 전구세포를 형태학적, 유전학적으로 분석한 결과를 나타내는 도면으로서, (a)는 4일령 병아리의 장골 내부를 H&E 염색을 통하여 확인한 결과를 나타낸 도면이고, (b)는 병아리의 장골에서 회수하여 배양한 세포를 광학 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 도면이고, (c)는 상기 세포의 단백질 발현량을 확인한 결과를 나타낸 도면이고, (d)는 상기 세포의 유전자 발현량을 확인한 결과를 나타낸 도면이고, (e)는 상기 세포의 다분화능을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 획득된 인간 지방유래 중간엽줄기세포를 분석한 결과를 나타낸 도면으로서, (a)는 중간엽줄기세포를 광학 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 도면이고, (b)는 중간엽줄기세포의 마커를 FACS를 이용하여 확인한 결과를 나타낸 도면이고, (c)는 중간엽줄기세포의 다분화능을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 전구세포 배양 농축액이 줄기세포의 골분화 촉진에 미치는 영향을 알리자린 레드 S로 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 전구세포 배양 농축액이 줄기세포의 골분화 촉진에 미치는 영향을 알리자린 레드 S로 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 전구세포 배양 농축액이 줄기세포 골분화 촉진에 미치는 영향을 정량 분석한 결과를 나타낸 도면으로서, (a)는 알리자린 레드 S 염색의 정량화 결과를 나타낸 도면이고, (b)는 Runx2 유전자의 발현량을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 그래핀의 적층 정도가 줄기세포의 골 분화에 미치는 영향을 확인한 결과를 나타낸 도면으로서, (a)는 그래핀 필름의 적층 정도(1, 3, 5 및 7층)에 따른 줄기세포 배양배지 또는 골세포 유도분화배지 조성에 따른 인간 지방유래 중간엽줄기세포의 분화 정도를 촬영한 결과를 나타낸 도면이고, (b)는 골 분화 정도를 정량적으로 산출한 그래프를 나타낸 도면이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 그래핀의 적층 정도가 줄기세포의 골 분화에 미치는 영향을 확인한 결과를 나타낸 도면으로서, (a)는 그래핀 필름의 적층 정도(1, 2 및 3층)에 따른 중간엽줄기세포의 분화 정도를 촬영한 결과를 나타낸 도면이고, (b)는 골 분화 정도를 정량적으로 산출한 그래프를 나타낸 도면이고, (c)는 Runx2 및 Osteocalcin 유전자의 발현량을 정량적으로 산출한 결과를 나타낸 도면이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 배양액 및 다층 그래핀 필름이 중간엽줄기세포의 골분화에 미치는 영향을 알리자린 레드 S 염색을 통하여 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 알리자린 레드 S 염색을 정량 분석하여 그래프로 나타낸 도면이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 배양액 및 다층 그래핀 필름이 중간엽줄기세포의 골분화에 미치는 영향을 Runx2 유전자의 발현량으로 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
본 발명의 전구세포(progenitor cell)의 배양액 및 다층 그래핀 필름(multi-layer graphene film)을 포함하는 줄기세포 분화 촉진용 조성물은 기존의 줄기세포 분화 방법과 비교하여 효과적으로 줄기세포의 분화를 촉진시킬 수 있으며, 특별히, 다분화능을 가진 중간엽줄기세포를 골세포 특이적으로 분화를 촉진시킬 수 있다는 것을 확인하였기 때문에 본 발명의 전구세포 배양액 및 다층 그래핀 필름을 포함하는 조성물에서 배양된 줄기세포를 이용하여 골 생성, 골 질환의 치료 등 체내/외에서 다양한 줄기세포를 이용하는 분야에 사용할 수 있다.
본 명세서에 있어서, “그래핀(graphene)”이란 탄소 원자로 만들어진 원자 크기의 벌집 형태 구조를 가진 소재로서, 0.2nm의 두께로, 물리적, 화학적 안정성이 매우 높은 차세대 신소재로서, 본 발명의 “다층 그래핀 필름(multi-layer graphene film)”이란 단층의 그래핀이 적층된 구조를 총칭하는 포괄적 의미이다.
본 명세서에 있어서, “전구세포(progenitor cell)”란 위탁줄기세포, 간세포 등이라고도 불리며, 자손에 해당되는 세포(가령 X라 한다)가 특정한 분화 형성 발현이 밝혀진 경우, 분화형질을 발현하지 않은 미분화 친세포를 X의 전구세포라고 한다. 본 발명의 “골·연골 전구세포(Osteochondroprogenitor Cell)”란 골 및 연골로 분화능이 있으나, 그 운명이 아직 결정되지 않은 세포로서, 중간엽줄기세포와 골세포로 분화하는 골 전구세포(Osteoprogenitor Cells)의 사이 단계, 또는 연골세포로 분화하는 연골 전구세포(Chondroprogenitor Cells)의 사이 단계의 세포이고, 골수뿐만 아니라 골조직 내에도 존재한다. 이러한 전구세포의 배양액(culture broth)은 바람직하게는 전구세포를 배지에 배양한 후에 전구세포가 제거된 배양액이며, 더욱 바람직하게는 무혈청 배지에서 배양한 전구세포의 배양액일 수 있으며, 이러한 배양액은 “배양 농축액”으로 제조될 수 있으며, 배양농축액은 진공여과장치 등을 이용하여 전구세포를 배양한 배양액에서 세포 및 세포찌꺼기를 여과하고, 상기 여과된 배양액을 필터를 이용하여 2 내지 1,000배, 바람직하게는 50 내지 150배 농축하여 제조될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 명세서에 있어서, "줄기세포(stem cell)"란 여러 종류의 신체 조직 세포로 분화할 수 있는 능력, 즉, 줄기세포성(stemness)을 가진 미분화 세포를 총칭하는 광의의 개념을 말한다. 이러한 줄기세포는 크게 배아를 이용하여 제조할 수 있는 배아줄기세포(embryonic stem cell), 성체줄기세포(adult stem cell), 생식세포(gamete), 암 줄기세포(cancer stem cell) 등으로 나뉘며, 배아줄기세포는 수정 후 14일이 안된 상태의 구체적 장기를 형성하기 이전의 세포 덩어리 단계를 말하며, 최근에는 역분화를 통하여 정상세포로부터 배아줄기세포를 제조하기도 한다. 따라서, 신체를 이루는 모든 세포와 조직으로 분화할 수 있는 세포라면 이에 제한되지 않는다. 성체줄기세포는 제대혈, 골수, 혈액 등으로부터 추출해 낸 것으로서 뼈, 간, 혈액 등 구체적 장기의 세포로 분화되기 직전의 원시세포를 의미한다. 생식세포란, 생식을 통해서 유전 정보를 다음 세대로 전달하는 세포로서, 인간에게는 정자와 난자가 있으나, 이에 제한되지 않는다. 암 줄기세포란 줄기세포 특유의 능력인 줄기세포성인 자가재생이나 분화능력을 가지는 포괄적인 의미의 암세포를 의미한다. 암 줄기세포는 일반적으로 정상적인 종양생장 조건(세포 성장에 필요한 영양분(포도당)이 충분하고 종양미세환경의 생장여건이 풍족하여 세포 스트레스가 없는 상태를 지칭)에서 일반적인 암세포와 상이하게 느린 속도로 증식하거나 휴지기(dormant state) 상태를 유지하여 항암제에 대한 저항성을 가지고 있을 수 있으며, 예를 들어, PGC-1α 등의 전사조절인자의 발현이 정상적인 종양세포와 달리 통제되어 주요 대사조절물질의 기능이 일반 암세포와 비교하여 상이할 수 있다. 이러한 상이한 대사조절 능력과 이에 기전적으로 연계된 세포신호전달계의 조절을 통해 영양 결핍 상태에서 세포 사멸(apoptosis)에 대하여 저항성을 획득한, 침윤 및 전이능이 있는 세포를 포괄적으로 지칭한다. 그러나 일반적인 암 세포로 분화할 수 있는 세포라면 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에 있어서, “줄기세포 치료용 약학 조성물”이란 개체로부터 분리, 배양 및 특수한 조작을 통해 제조된 세포 및 조직으로 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품(미국 FDA 규정)으로서, 세포 또는 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가, 동종, 또는 이종 세포를 체외에서 증식 선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 말한다.
본 명세서에 있어서, “분화(differentiation)”란 줄기세포가 분열 증식하여 성장하는 동안에 서로 구조나 기능이 특수화 되어, 서로 다른 조직의 세포로 변해가는 것을 말한다.
본 명세서에 있어서, “예방(prevention)”이란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 골 질환 등의 발생을 차단하는 광의의 개념을 말하며, 바람직하게는 발생 이전에 미리 방지하는 1차 예방과, 질환 발생을 조기에 발견하고 적시에 치료하는 2차 예방을 모두 포함하나, 골 질환 발생 이전에 대처하는 과정 및/또는 활동이라면 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에 있어서, “치료(treatment)“란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 골 질환 등의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 명세서에 있어서, “개체(individual)”란 본 발명의 조성물이 투여될 수 있는 대상을 말하며, 그 대상에는 제한이 없다.
본 명세서에 있어서, “약학적 조성물(pharmaceutical composition)”이란 캡슐, 정제, 과립, 주사제, 연고제, 분말 또는 음료 형태임을 특징으로 할 수 있으며, 상기 약학적 조성물은 인간을 대상으로 하는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 약학적 조성물은 이들로 한정되는 것은 아니지만, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 캡슐, 정제, 수성 현탁액 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 약제적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 경구투여시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서(elixir), 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타, 용액, 현탁액, 정제, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형할 수 있다.
한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말디톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다. 경구 또는 비경구 투하가 바람직하다. 본원에 사용된 용어 "비경구"는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 경막내, 병소내 및 두개골내 주사 또는 주입기술을 포함한다. 본 발명의 약학적 조성물은 또한 직장 투여를 위한 좌제의 형태로 투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 사용된 특정 화합물의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 정식, 투여시간, 투여경로, 배출율, 약물 배합 및 예방 또는 치료될 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 다양하게 변할 수 있고, 상기 약학적 조성물의 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있고, 1일 0.0001 내지 50mg/kg 또는 0.001 내지 50mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 본 발명에 따른 의약 조성물은 환제, 당의정, 캡슐, 액제, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁제로 제형화될 수 있다.
본 명세서에 있어서, “키트(kit)”란 본 발명의 전구세포 배양액, 다층 그래핀 및 줄기세포를 포함하는 치료용 기기를 의미하며, 각각의 구성이 서로 다른 구획 및/또는 병에 포함될 수도 있고, 하나에 모두 포함될 수도 있으며, 상기 줄기세포는 개인 맞춤형 줄기세포를 사용할 수도 있으며, 바람직하게는 치료용 미분화 줄기세포, 전구세포 배양액 및 다층 그래핀을 유효성분으로 포함하는 조성물을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 하기 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예
실시예 1: 그래핀 필름의 제작
화학기상증착법(chemical vapor deposition; CVD)을 이용하여 그래핀 필름을 제작하였다. 그래핀 필름 제작을 위하여, 촉매인 니켈 필름 또는 구리 필름을 석영 튜브에 로딩하였다. 그리고 1000℃에서 메탄 또는 아세틸렌 가스를 투입하여 탄소가 촉매층 사이 또는 표면에 들어가도록 하였고, 30분 내지 60분 동안 반응시킨 후에 자연 냉각률과 동일하게 상온으로 냉각시키고 과황산암모늄(ammonium persulfate, APS) 또는 염화철 용액(iron (III) chloride) 등의 식각 용액을 이용하여 촉매 필름을 제거하여 단층 그래핀 필름(single-layer graphene; SLG)을 제작하였다. 제작된 그래핀을 기판으로 전달하기 위하여 그래핀 상에 폴리(메틸 메타크릴레이트)(poly(methyl methacrylate); PMMA)를 스핀 코팅하고, PMMA/그래핀을 유리 기판, 실리콘 웨이퍼 또는 세포 배양용 플레이트로 전사시켰다. 이후 PMMA를 아세톤을 이용하여 제거한 후에 증류수를 이용하여 아세톤을 제거하였다. 또한, 만들어진 단층 그래핀을 증류수 내에서 1층 내지 10층까지 적층시켜 다층 그래핀 필름(multi-layer graphene; MLG)을 제작하였다. 전사방법은 단층 그래핀 필름과 동일한 방법으로 진행하였다. 그래핀 필름 제작 방법은 도 1에 간략하게 나타내었다. 이 후 제작된 그래핀 필름은 주사전자현미경(scanning electron microscope; SEM)을 이용하여 확인하였다. 그 결과는 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타난 바와 같이, 계획했던 층수대로 단층 또는 다층 그래핀 필름이 제작된 것을 확인하였으며, 적층된 그래핀의 수가 증가될수록 그래핀 표면에 30 내지 50nm 정도 폭의 주름이 형성 및 증가된 것을 확인하였다.
실시예 2: 골수 내 골·연골 전구세포 분리 및 상기 세포의 배양액 제조
2.1. 골·연골 전구세포 분리
부화 후 4일 이내의 병아리 양쪽 다리에서 대퇴부뼈(femur)와 종아리 뼈(tibia) 부분을 회수하여 2회 세척한 후에, 뼈에 부착된 근육과 힘줄을 깨끗하게 제거한 후 다시 2회 세척하였다. 모든 세척과정은 1% 항생제 및 항균제가 첨가된 인산염완충용액(phosphate-buffered saline; PBS)을 사용하였다. 이후 수술용 가위를 이용하여 뼈 양쪽의 경화된 부분을 제거하고 18 게이지(gauge, G) 주삿바늘로 구멍을 내고, 1% 항생제와 2% 우태아혈청(fetal bovine serum; FBS)이 첨가된 PBS를 주삿바늘을 부착한 3㎖ 의료용 주사기에 담아 뼈 끝의 구멍에 밀어 넣어 뼈 내의 매트릭스를 회수하였다. 매트릭스 회수는 양쪽 방향으로 3회 반복 실시하였으며, 대퇴부뼈는 18G 주삿바늘을 사용하였고 종아리뼈는 20G 주삿바늘을 사용하여 회수하였다. 1마리 당 총 4개의 뼈에서 회수한 매트릭스를 14㎖ round bottom 튜브에 모으고 회수할 때 사용한 주사기로 10회 통과시켜 조직을 균질화(homogenization)한 후에, 50㎖ conical tube에 100㎛ pore mesh를 걸치고 균질화된 매트릭스를 걸러 회수 당시 유입된 뼛조각이나 잔해 등을 걸러내었다. 그리고 PBS를 튜브에 채우고 320g에서 4분 동안 원심분리하여 상층액을 제거하고 튜브 하단부에 침전된 세포 덩어리인 세포 펠렛(pellet)을 획득하였다. 그리고 획득된 세포 펠렛에 5mL의 F12/DMEM 배지를 첨가하고 파이펫팅으로 단세포의 골·연골 전구세포를 획득하였다. 닭의 골·연골 전구세포의 획득 및 배양, 그리고 상기 세포의 배양액 획득 방법은 도 3에 간략하게 나타내었다.
2.2. 골·연골 전구세포 배양
상기 실시예 2.1과 동일한 방법으로 획득된 닭의 전구세포를 배양용기 1㎠ 면적당 3×106 세포의 밀도로 3.151g/L의 D-glucose, 365㎎/L(2.5mM)의 L-glutamine, 55㎎/L(0.5mM)의 sodium pyruvate, 10% FBS, 및 1% 항생-항균제가 보충된 F12/DMEM 배지에 접종하고, 약 90% 습도 및 37℃ 온도 조건 하에서 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 계대배양은 세포의 컨플루언시(confluency)가 약 80~90% 되었을 때 PBS로 2회 세척한 후에, 0.25% Trypsin-EDTA를 2분 처리하고 세포부유액을 회수하여 320g에서 4분 동안 원심분리하여 세포를 수거한 다음, 일부 세포를 이용하여 세포수 측정과 세포 생존능을 검사한 뒤 다시 3배로 계대배양하였다.
2.3. 골·연골 전구세포의 특성분석
유추기 닭(starter chick) 장골 내부의 형태학적 상태를 분석하기 위하여 헤마토실린-에오신 염색법(hematoxylin-eosin staining; H&E staining)으로 조직학적 염색을 실시하였다. 4일령 병아리의 장골을 4% 파라포름알데하이드 고정액에 담가 24시간 동안 상온에서 고정시킨 후에, 고정된 조직을 세척하고 탈석회(decalcification) 과정 및 탈수화 과정을 거친 후에 파라핀을 이용하여 파라핀 블록으로 제작하였다. 그리고 제작된 파라핀 블록을 6㎛의 두께로 잘라 절편을 제작한 후에 60℃ 가열블락(Heating block)에 45분간 놓아두어 탈파라핀을 진행하였다. 그리고 자일렌(Xylene) 용액에 5분씩 3회 담가 세척하고, 100% 에탄올(Ethanol)에 3분씩 3회, 95% 에탄올에 2분씩 2회, 70% 에탄올에 2분씩 2회, 증류수로 2분씩 2회 담가두어 수화(hydration)시켰다. 수화 과정을 마친 파라핀 절편을 1% 헤마토실린 용액에 30초 동안 담가두어 염색한 후에 증류수로 1회 세척하고, 다시 0.25% 염화수소(HCl)에서 1초 반응시킨 후에 증류수로 세척하였다. 그리고 헤마토실린 매염제인 10% 리튬카보네이트를 2~4초간 반응시킨 후에 증류수로 세척하였다. 이 후 에오신을 2초간 처리하여 세포질을 염색한 뒤에 95% 에탄올과 100% 에탄올을 이용하여 순차적으로 최종 탈수화 및 투명화 단계를 거친 후에 봉입(mounting) 하여 현미경으로 관찰하고 사진을 획득하였다. 그 결과는 도 4a에 나타내었다.
도 4a에 나타난 바와 같이, 4일령의 병아리 장골은 총 면적의 60% 이상이 다양한 상태(stage)의 연골세포로 채워져 있으며, 골말단(epiphysis)은 아직 2차 골화중심이 생성되지 않은 초자연골 상태로 유지되고 있음을 확인하였다.
또한, 상기 실시예 2.1 및 2.2와 동일한 방법으로 회수하여 배양된 세포의 형태를 광학현미경으로 촬영하여 확인하였다. 그 결과는 도 4b에 나타내었다.
도 4b에 나타난 바와 같이, 유추기 닭의 골·연골 전구세포는 입방형태(small and cuboidal shape)를 가지고 있는 것을 확인하였으며, 이는 일반적인 중간엽줄기세포가 방추형 형상을 가지는 것과는 상이한 것을 확인할 수 있었다.
그리고 상기 실시예 2.1 및 2.2와 동일한 방법으로 회수하여 5차 계대배양한 전구세포의 유전자 발현을 확인하기 위하여, Sox9, Collagen typeⅠ, Collagen typeⅡ, Runx2 유전자의 발현량과 Sox9, Collagen typeⅠ, Collagen typeⅡ 단백질 발현량 분석을 실시하였다. 구체적으로, 단백질 발현량을 분석하기 위해서는 상기 세포를 4% 파라포름알데하이드로 상온에서 15분간 고정시킨 후, 고정된 세포를 PBS를 이용하여 3회 세척하고, PBS에 희석된 10% normal goat serum 용액으로 1시간 동안 블로킹(blocking)을 하였다. 그리고 각 단백질에 대한 1차 항체를 처리하고 4℃에서 18시간 동안 반응시켜 결합시킨 후에, PBS로 2회 세척하여 결합되지 않은 1차 항체를 제거하고, 1차 항체에 대한 형광이 붙은 2차 항체(Santa Cruz Biotechnology사 제조)를 처리하여 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 후에는 PBS로 2회 세척하여 결합되지 않은 항체를 제거하고, DAPI(4',6-Diamidine-2'-phenylindole) 용액을 1분간 처리하여 핵을 염색하였다. 염색이 완료된 세포는 마운팅 용액으로 마운팅한 후에 형광현미경을 사용하여 발현 여부를 분석하였다. 그 결과는 도 4c에 나타내었다. 또한, 유전자 발현량 분석을 위해서는 트리졸 시약(Trizol reagent)을 이용하여 페놀-클로로폼 추출(phenol-chloroform extraction) 방법으로 세포로부터 RNA를 추출하고, 역전사-중합효소연쇄반응(RT-PCR)을 이용하여 cDNA를 합성한 후 Sox9, Collagen typeⅠ, Collagen typeⅡ, Runx2, 및 항존유전자인 β-actin 유전자를 대조유전자로 하여 각 유전자에 특이적인 프라이머를 이용하여 PCR(polymerase chain reaction)을 진행하였다. 사용된 프라이머 정보는 하기 표 1에 나타내었고, 상기 PCR 산물은 1% 아가로즈 겔에 전기영동하여 확인하였다. 그 결과는 도 4d에 나타내었다.
유전자 서열번호 염기서열
β-actin 1 5'-ATGAAGCCCAGAGCAAAAGA -3'
2 5'-GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA -3'
Sox9 3 5'-GCTTTCTCGCATGAATCTCC -3'
4 5'-TTGGGGAAGGTGTTCTCTTG -3'
Collagen typeⅠ 5 5'-CAAACCAGGCGAAAGGGGTC -3'
6 5'-AATGGACCACGGCTTCCAA -3'
Collagen type Ⅱ 7 5'-AAGATGTTGTAGGACCCCGA -3'
8 5'-CATCTGCGCCGCAAAGTTTC -3'
Runx2 9 5'-CAGACCAGCAGCACTCCATA -3'
10 5'-TTGGGCAAGTTTGGGTTTAG -3'
도 4c 및 4d에 나타난 바와 같이, 골·연골 전구세포, 골 전구세포, 또는 연골 전구세포의 특징적인 유전자들이 모두 발현되었으며, Sox9, Collagen typeⅠ, Collagen typeⅡ 단백질도 발현됨을 확인하였다. 상기 결과를 통하여, 유추기 닭으로부터 골·연골 전구세포를 정상적으로 획득하였다는 것을 확인할 수 있었다.
2.4. 분리된 골·연골 전구세포의 분화능 확인
상기 실시예 2.1 및 2.2와 동일한 방법으로 회수하여 배양된 골·연골 전구세포가 다분화능을 가지고 있는지 확인하기 위하여, 골세포, 지방세포, 연골세포로 각각 분화를 유도하였다. 골세포로의 분화를 위해서는 10-7M dexamethasone, 0.05mM ascorbate-2-phosphate, 10mM β-glycerophosphate, 10% FBS, 및 1% 항생제가 첨가된 high glucose DMEM 배양액을 3일에 한번씩 교체하며 21일 동안 분화를 유도하였다. 분화 유도 후에는 Alizarin Red S(ARS, Sigma) 염색을 수행하여 골세포로의 분화여부를 확인하였다. 지방세포로의 분화를 위해서는 10-6M dexamethasone, 0.5mM IBMX(3-siobutyl1-methylxanthine), 0.1mM indomethacin, 10μg/㎖ bovine insulin(PH 2.5), 10% FBS, 및 1% 항생제가 첨가된 high glucose DMEM 배양액을 3일에 한번씩 교체하며 21일 동안 분화를 유도하였다. 분화 유도 후에는 Oil Red O(ORO, Sigma) 염색을 수행하여 지방세포로의 분화여부를 확인하였다. 연골세포로의 분화를 위해서는 10ng/㎖ TGF-ß1, 10-7M dexamethasone, 1% ITS, 1.25㎎/㎖ BSA, 5μg/㎖ linoleic acid, 50μg/㎖ ascorbicacid-2-phosphate, 40μg/㎖ L-proline, 10% FBS, 및 1% 항생제가 첨가된 high glucose DMEM 배양액을 3일에 한번씩 교체하며 21일 동안 분화를 유도하였다. 분화 유도 후에는 Alcian blue 염색을 수행하여 연골세포로의 분화여부를 확인하였다. 그 결과는 도 4e에 나타내었다.
도 4e에 나타난 바와 같이, 본 발명의 방법으로 획득된 골·연골 전구세포는 골세포와 연골세포로는 분화되었지만, 지방세포로는 분화되지 않음을 확인하였다. 상기 결과를 통하여, 본 발명의 방법으로 획득된 골·연골 전구세포는 골과 연골로 분화할 수 있는 분화능을 가진 골·연골 전구세포라는 것을 확인할 수 있었다.
2.5. 골·연골 전구세포의 무혈청 배양액 제조
골·연골 전구세포의 무혈청 배양액을 제조하기 위하여, 상기 실시예 2.1 및 2.2와 동일한 방법으로 회수하여 5차 계대배양한 세포의 컨플루언시가 약 90~100% 되었을 때 배양액을 제거하고 차가운 PBS로 3회 세척하였다. 그리고 3.151g/L 의 D-glucose, 657㎎/L(4.5mM)의 L-glutamine, 110㎎/L(1mM)의 sodium pyruvate, 및 1% 항생-항균제가 보충된 무혈청 F12/DMEM 배지를 첨가한 후에 약 90% 습도 및 37℃ 온도 조건 하에서 5% CO2 배양기에서 3일간 배양하고, 상층액을 회수하여 골·연골 전구세포의 무혈청 배양액 제조하였다. 그리고 회수된 무혈청 배양액의 농축액을 제조하기 위하여, 상기 무혈청 배양액을 일회용 진공여과장치(0.45㎛ pore size, Corning)으로 여과시켜 잔존하는 세포와 세포찌꺼기(debris)를 깨끗하게 제거하였다. 그리고 여과된 배양액을 ultra-centrifugal 필터(3KDa cut off, Amicon)를 이용하여 100배 농축하여 무혈청 배양 농축액을 제조하였다. 상기 배양 농축액의 단백질 농도는 2~3㎎/㎖ 이었고, 제조된 배양 농축액은 500㎍(단백질량)의 용량으로 분주하여 -20℃에 보관하였다. 그리고 실험에 사용할 때는 4℃ 냉장고에서 천천히 융해시켜 사용하였다.
실시예 3: 인간 지방조직 유래 중간엽줄기세포 획득 및 그 특성 분석
3.1. 지방조직에서 단세포의 중간엽줄기세포 분리 및 배양
채취된 내장지방 조직(장막 지방조직, omental adipose tissue)을 1% 항생제-항균제가 첨가된 차가운 PBS를 이용하여 3회 세척하고, 세척된 조직에 붙어있는 혈관, 응고된 혈액, 및 결합조직을 포셉과 수술가위로 제거하고 다시 2회 세척하였다. 그리고 세척된 조직을 100㎖ 유리병에 담아 수술가위를 이용하여 5mm2 이하로 잘게 자른 후. 0.1% collagenase type I(sigma-aldrich)이 첨가된 DMEM 배지를 조직 볼륨의 2배가 되도록 첨가하여 37℃ 항온기에서 효소반응이 충분히 일어날 수 있도록 30분간 천천히 교반하며 반응시켰다. 효소반응이 완료된 후에는 배지를 수거하여 새로운 튜브에 넣어 얼음에 꽂아 보관하고, 다시 새로운 효소가 첨가된 배지를 조직과 교반하며 효소반응을 추가로 1회 반복하였다. 1, 2차에 회수된 배지를 모두 합하여 100㎛ pore mesh를 이용하여 여과시킨 후에 320g에서 4분간 원심분리하여, 순수지방층을 제거하고 단핵구층을 회수하였고, 회수된 단핵구층은 PBS를 이용하여 2회 세척한 후에 적혈구 제거를 위하여 적혈구용혈용액(Gibco BRL)을 첨가하고 상온에서 10분간 반응시켰다. 반응이 완료된 후에 PBS로 2회 세척하고, 세포수와 세포생존율을 측정하였다. 그리고 플레이트의 ㎠ 면적당 1×105 세포의 밀도로 5ng/㎖ human recombinant basic fibroblast growth factor(hrbFGF, Gibco BRL), 10% FBS, 및 1% 항생제가 첨가된 F12/DMEM 배지에 분주하여, 약 90% 습도 및 37℃온도 조건 하에서 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 세포 분주 후에는 3일마다 새로운 배지로 교체해주었으며, 컨플루언시가 80~90% 되었을 때 계대배양을 실시하였다. 5회의 계대배양 후에 세포의 형태를 현미경을 이용하여 촬영하고 특성을 분석한 후에 실험에 사용하였다. 현미경 관찰 결과는 도 5a에 나타내었다.
도 5a에 나타난 바와 같이, 인간 지방 조직으로부터 방추형 형태의 중간엽 줄기세포가 정상적으로 획득되었다는 것을 확인하였다.
3.2. 세포 표현형 확인
상기 실시예 3.1과 동일한 방법으로 분리 및 배양한 중간엽줄기세포의 특성을 확인하기 위하여, CD105, CD73, CD31, CD45, HLA-DR, CD166, CD34, 및 CD90 발현 여부를 FACS caliber(B&D Bioscience, CellQuest™Pro)를 이용하여 확인하였다. 그 결과는 도 5b에 나타내었다.
도 5b에 나타난 바와 같이, CD31(혈관내피세포 마커), CD34(조혈모세포 마커), CD45(혈구세포 마커), 및 MHC class II(백혈구항원 클래스II 마커) 항원은 음성이었으며, 중간엽줄기세포 마커인 CD105, CD73, CD166, 및 CD90 항원은 양성으로 분석되었다. 상기 결과를 통하여, 본 발명의 방법으로 분리된 세포가 정상적으로 중간엽줄기세포의 특성을 가지고 있다는 것을 확인할 수 있었다.
3.3. 다분화능 확인
상기 실시예 3.1과 동일한 방법으로 분리 및 배양된 중간엽줄기세포의 다분화능을 확인하기 위하여, 골세포, 지방세포 및 연골세포로 각각 분화를 유도하였다. 분화 유도 및 확인은 실시예 2.4와 동일한 방법으로 실시하였다. 그 결과는 도 5c에 나타내었다.
도 5c에 나타난 바와 같이, 본 발명의 방법으로 분리된 중간엽줄기세포는 골세포, 지방세포, 및 연골세포로 모두 분화할 수 있는 다분화능을 가지고 있다는 것을 확인하였다.
실시예 4: 인간 지방조직 유래 중간엽줄기세포 골분화 촉진 시험
4.1. 골세포로의 분화 유도
본 발명의 배양 농축액이 줄기세포의 분화에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 상기 실시예 3.1과 동일한 방법으로 분리 및 배양된 인간 지방조직 유래 중간엽줄기세포를 10% FBS, 5ng/㎖ hrbFGF 및 1% 항생제가 첨가된 F12/DMEM 배지를 이용하여 배양한 후에, 컨플루언시가 90% 정도 되었을 때, 200㎍/㎖의 배양 농축액이 첨가된 골세포 유도 분화배지(10-7M dexamethasone, 0.05mM ascorbate-2-phosphate, 10mM β-Glycerophosphate, 10% FBS, 및 1% 항생제가 첨가된 low glucose DMEM 배지로 교체하여 14일 또는 21일간 배양하여 골세포로의 분화를 유도하였다. 배지는 3일에 한번씩 새로운 배지로 교체하였으며, 대조군으로는 1) 분화유도제가 포함되지 않은 10% FBS 및 1% 항생제가 첨가된 Low glucose DMEM 배지, 2) 골세포 유도 분화배지(배양 농축액 미첨가 배지), 및 3) 배양 농축액 200㎍/㎖이 첨가된 분화유도제가 포함되지 않은 10% FBS 및 1% 항생제가 첨가된 Low glucose DMEM 배지(단일 배양 농축액 첨가)를 이용하였다.
4.2. 알리자린 레드 S 염색 확인
상기 실시예 4.1과 동일한 방법으로 골세포로 분화 유도 후에 골세포로의 분화 효율을 확인하기 위하여, 알리자린 레드 S(Alizarin Red S; ARS, Sigma) 염색을 실시하였다. ARS는 금속이온과 결합하는 성질이 있기 때문에 세포에서 분비된 칼슘 침전(Calcium Precipitation, Mineralization)을 염색하여 골세포 분화 여부를 판정할 수 있다. 분화 완료 시점의 세포시료에 4% PFA(paraformaldehyde)를 처리하여 상온에서 15분 동안 세포를 고정하였다. 상기 고정된 세포를 증류수로 2회 세척하고 2% ARS 염색용액을 상온에서 15분간 처리하였다. 이때 ARS 용액은 PH 4.5의 증류수에 2% 농도가 되도록 ARS을 첨가하고 마그네틱 바를 이용하여 18시간 동안 교반하고 필터링하여 사용하였다. 염색이 완료된 세포를 증류수로 5회 세척한 후 광학현미경상에서 ARS 염색여부를 확인하고 촬영하였다. 그 결과는 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타난 바와 같이, 골세포 유도 분화배지(골분화 유도제 단독 처리군)에서 키운 대조군과 비교하여 본 발명의 배양 농축액이 첨가된 골세포 유도 분화배지에서 키운 실험군(골분화유도제 및 세포 배양농축액혼합 처리군)의 경우 14일 만에 효과적으로 골세포로의 분화가 촉진되었으며, 21일에는 골분화가 극대화됨을 확인하였다. 그러나 일반적인 줄기세포 배양배지에서 배양한 대조군과 본 발명의 배양 농축액을 단독으로 처리한 대조군에서는 분화가 유도되지 않은 것을 확인하였다.
개인에 따른 차이가 있는지 재확인을 위하여, 3명의 다른 사람의 지방조직 유래 중간엽줄기세포를 대상으로 실시예 4.1과 동일한 방법으로 14일 동안 골 분화 유도 실험을 실시하였다. 그 결과는 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타난 바와 같이, 골세포 유도 분화배지에서 배양한 중간엽줄기세포의 경우에는 골세포 분화가 촉진되었으나, 개인별로 그 차이가 있으며 분화 효율이 높지 않은 것을 확인한 반면, 본 발명의 배양 농축액이 첨가된 골세포 유도 분화배지에서 배양한 중간엽줄기세포의 경우에는 3개의 모든 시료에서 골세포로의 분화 효율 및 분화 속도가 유사하게 촉진된 것을 확인하였다.
또한, 염색된 ARS의 양을 정량하기 위하여, 용기에 남아있는 잔여 물기를 제거한 후 10%의 CPC 완충용액(cetrlpyridinium chloride buffer, Sigma)을 1㎖ 첨가하고 상온에서 30분간 반응시켜 ARS를 용출하였다. 용출한 ARS는 200㎕씩 96 well plate(SPL)에 분주하여 microplate reader기(Molecular Device)를 이용하여 550㎚에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과는 도 8a에 나타내었다.
도 8a에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 배양 농축액이 첨가된 골세포 유도 분화배지에서 배양한 줄기세포의 경우 대조군들과 비교하여 골세포로의 분화가 현저히 촉진된 것을 확인하였다.
4.3. RUNX2 유전자 발현량 확인
상기 실시예 4.1과 동일한 방법으로 골 분화를 유도한 중간엽줄기세포들의 Runx2 유전자의 발현 정도를 Real-time PCR을 이용하여 분석하였다. Runx2 유전자는 골 분화에서 가장 핵심 전사인자로 알려져 있다. 구체적으로, mRNA는 트리졸 시약(Trizol reagent)을 이용하여 페놀-클로로폼 추출(phenol-chloroform extraction) 방법으로 추출하고, 역전사-중합효소연쇄반응(RT-PCR)을 이용하여 cDNA를 합성한 후 Runx2 및 대조유전자 GAPDH 유전자에 특이적인 프라이머를 이용하여 Real-time PCR을 진행하였다. PCR에 이용한 프라이머의 정보는 하기 표 2에 나타내었다. PCR 산물을 아가로즈 겔에 전기영동 하여 상대적 유전자 발현량을 분석한 결과를 도 8b에 나타내었다.
유전자 서열번호 염기서열
humanGAPDH 11 5'- GAGTCAACGGATTTGGTCGT -3'
12 5'- TTGATTTTGGAGGGATCTCG -3'
humanRUNX2 13 5'- GACAGCCCCAACTTCCTGT -3'
14 5'- CCGGAGCTCAGCAGAATAAT -3'
도 8b에 나타난 바와 같이, 본 발명의 배양 농축액이 첨가된 골세포 유도 분화배지에서 배양한 줄기세포의 경우 대조군들과 비교하여 Runx2 유전자의 발현이 현저히 증가되었으며, 이를 통하여 골세포로의 분화가 촉진된 것을 확인하였다.
상기 결과들을 통하여, 닭의 골·연골 전구세포 배양액은 줄기세포의 분화를 현저하게 촉진시킬 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 5: 다층 그래핀 필름을 이용한 중간엽줄기세포의 골분화 촉진 실험
5.1. 골세포로의 분화 유도
실시예 1과 동일한 방법으로 제작된 그래핀 필름을 코팅한 유리 기판, 구체적으로 1, 2, 3, 5 및 7층으로 적층된 그래핀 필름이 코팅된 유리 기판 위에서 인간 지방조직 유래 중간엽 줄기세포의 골분화로의 효과적인 유도 확인 및 최적의 골분화 유도 환경을 확인하기 위하여, 중간엽 줄기세포 1 X 105 cells를 24-well culture plate 크기의 다층 그래핀 필름이 코팅된 유리기판 및 코팅되지 않은 유리기판(대조군) 위에 파종(seeding)한 후 컨플루언시가 90% 정도 되었을 때 골세포 분화를 유도하였다. 골세포 분화는 하기와 같은 배양환경에서 각각 14일간 배양하며 수행하였으며, 배지는 3일에 한번씩 교환하였다. 1) 그래핀 필름이 코팅되지 않은 유리기판에서 분화유도제가 포함되지 않은, 일반적인 줄기세포 배양배지인 10% 우태아혈청 및 1% 항생제가 첨가된 Low glucose DMEM 배지(대조군), 2) 그래핀 필름이 코팅되지 않은 유리기판에서의 골세포 유도 분화배지(대조군), 3) 그래핀 필름이 코팅된 유리기판에서의 일반적인 줄기세포 배양배지(10% 우태아혈청 및 1% 항생제가 첨가된 Low glucose DMEM 배지), 4) 그래핀 필름이 코팅된 유리기판에서의 골세포 유도 분화배지. 골세포 유도 분화배지는 0.05mM ascorbate-2-phosphate, 10mM β-glycerophosphate, 10-7M dexamethasone, 10% 우태아혈청, 및 1% 항생제가 첨가된 Low glucose DMEM 배지를 사용하였다.
5.2. 알리자린 레드 S 염색 확인
상기 실시예 5.1과 동일한 방법으로 줄기세포의 분화를 유도한 후에 실시예 4.2와 동일한 방법으로 알리자린 레드 S 염색을 실시하였다. 그 결과는 도 9에 나타내었다.
도 9에 나타난 바와 같이, 그래핀이 코팅되어 있지 않은 유리기판(대조군)과 비교하여 그래핀 필름이 코팅된 유리기판에서 골분화 증가되었고, 단층 그래핀 필름과 비교하여 다층으로 적층된 그래핀 필름이 코팅된 기판 위에서 14일 만에 골세포로의 분화가 효과적으로 증가되는 것을 확인하였다. 또한, 3층의 다층 그래핀 필름이 가장 줄기세포의 골분화에 효과적이며, 3층 초과로 적층할 경우에는 골세포로의 분화율이 더이상 증가되지 않는 것을 확인하였으며, 기본 배양 배지에서는 줄기세포의 분화가 촉진되지 않은 것을 확인하였다. 추가적으로 다층 그래핀 필름이 줄기세포의 골분화에 미치는 영향을 구체적으로 확인하기 위하여, 1, 2, 및 3층의 그래핀 필름을 이용하여 동일하게 골분화 실험을 진행하였다. 그 결과는 도 10에 나타내었다.
도 10에 나타난 바와 같이, 상기 실험 결과와 동일하게 3층의 다층 그래핀 필름에서 가장 효과적으로 중간엽줄기세포의 골분화가 유의하게 촉진된 것을 확인하였다.
상기 결과들을 통하여, 줄기세포의 골 분화에는 2층 내지 5층의 다층 그래핀 필름이 효과적이며, 그 중에서는 3층 그래핀 필름이 가장 효과적이며, 본 발명의 다층 그래핀 필름을 이용하여 줄기세포 분화 시점을 정확하게 조절할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.
5.3. RUNX2 및 OSTEOCALCIN 유전자 발현량 분석
본 발명의 다층 그래핀 필름, 구체적으로 2 및 3층의 다층 그래핀 필름이 코팅된 유리기판에서의 골세포 분화 유도 촉진을 정확하게 분석하기 위하여, 실시예 5.1과 동일한 방법으로 골분화를 유도한 중간엽줄기세포에서 Runx2 및 Osteocalcin 유전자의 발현 정도를 Real-time PCR을 이용하여 분석하였다. Runx2 와 Osteocalcin 유전자는 골 분화를 위한 핵심 전사인자로 알려져 있다. Real-time PCR은 실시예 4.3과 동일한 방법으로 실시하였으며, PCR에 이용한 프라이머의 정보는 하기 표 3에 나타내었다. PCR 산물을 아가로즈 겔에 전기영동하여 상대적 유전자 발현량을 분석한 결과를 도 10c에 나타내었다.
유전자 서열번호 염기서열
humanGAPDH 11 5'- GAGTCAACGGATTTGGTCGT -3'
12 5'- TTGATTTTGGAGGGATCTCG -3'
humanRUNX2 13 5'- GACAGCCCCAACTTCCTGT -3'
14 5'- CCGGAGCTCAGCAGAATAAT -3'
human
OSTEOCALCIN 		15 5' - AGCAAAGGTGCAGCCTTTGT - 3'
16 5’- GCGCCTGGGTCTCTTCAT - 3’
도 10c에 나타난 바와 같이, 다층 그래핀 필름이 코팅된 유리 기판에서 분화 유도 배지에서 배양한 중간엽 줄기세포의 경우 Runx2 및 Osteocalcin 유전자의 발현이 현저히 증가된 것을 확인하였다.
상기 결과들을 통하여, nm 단위의 미세한 두께 차이가 줄기세포 분화에 영향을 주는 것을 확인할 수 있었으며, 다층 그래핀 필름 중 특별히 3층으로 적층되어진 다층 그래핀 필름에서 다분화능을 가진 중간엽줄기세포의 골분화가 정량적으로 유의하게 촉진된다는 결과를 도출할 수 있었다.
실시예 6: 전구세포 배양액 및 다층 그래핀 필름의 줄기세포 분화 촉진 확인
6.1. 골세포로의 분화 유도
전구세포 배양액 및 다층 그래핀 필름의 조합이 줄기세포의 분화 촉진에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 인간 지방조직 유래 중간엽줄기세포 1X105 cells을 24-well culture plate 크기의 3층 그래핀 필름이 코팅된 유리기판 위에 파종한 후에 컨플루언시가 90% 정도 되었을 때, 골세포로의 분화를 유도하였다. 골세포 분화는 하기와 같은 배양환경에서 8일 또는 14일 동안 배양하며 수행하였으며, 배지는 3일에 한번씩 새로운 배지로 교체해주었다. 1) 3층의 다층 그래핀 필름이 코팅된 유리기판에서 일반 줄기세포 배양배지인 10% 우태아혈청 및 1% 항생제가 첨가된 Low glucose DMEM 배지 이용(다층 그래핀 단독, 대조군), 2) 3층의 다층 그래핀 필름이 코팅된 유리기판에서 골세포 유도 분화배지 이용(다층 그래핀 및 분화 유도제, 대조군), 3) 3층의 다층 그래핀 필름이 코팅된 유리기판에서 배양 농축액 100㎍/㎖이 첨가된 골세포 유도 분화배지 이용(다층 그래핀, 분화유도제 및 배양 농축액, 실험군). 골세포 유도 분화배지는 0.05mM ascorbate-2-phosphate, 10mM β-glycerophosphate, 10-7M dexamethasone, 10% 우태아혈청, 및 1% 항생제가 첨가된 Low glucose DMEM 배지를 사용하였다.
6.2. 알리자린 레드 S 염색 확인
상기 실시예 6.1과 동일한 방법으로 줄기세포의 골분화를 유도시킨 후에 실시예 4.2와 동일한 방법으로 알리자린 레드 S 염색을 실시하였다. 그 결과는 도 11 및 12에 나타내었다.
도 11 및 12에 나타난 바와 같이, 본 발명의 전구세포 배양액을 처리한 실험군에서 대조군과 비교하여 8일부터 골분화 유도가 촉진되었으며, 14일에는 분화율이 현저히 차이가 나는 것을 확인하였다.
6.3. RUNX2 유전자 발현량 확인
상기 실시예 6.1과 동일한 방법으로 줄기세포의 골분화를 유도시킨 후에 실시예 4.3과 동일한 방법으로 Real-time PCR을 실시하였다. 그 결과는 도 13에 나타내었다.
도 13에 나타난 바와 같이, 골분화를 유도하지 않은 3층의 다층 그래핀 필름이 코팅된 대조군과 비교하였을 때, 골분화 유도배지를 첨가한 3층의 다층 그래핀 필름이 코팅된 기판에서 배양한 중간엽줄기세포에서의 Runx2 유전자의 발현이 유의성있게 증가 되었으나, 본 발명의 전구세포 배양 농축액을 100㎍/㎖ 첨가한 골세포 유도 분화배지를 첨가한 3층의 다층 그래핀 필름이 코팅된 기판에서 배양한 중간엽줄기세포의 경우에는 다층 그래핀 필름을 단독으로 사용한 실험군과 비교하여 더욱 현저히 골분화가 촉진된 것을 확인하였다.
상기 결과들을 통하여, 다층 그래핀 필름의 코팅에 의해 다분화능(multipotency)을 가지는 중간엽줄기세포의 골분화가 효과적으로 촉진되며, 2층 내지 5층의 그래핀 층수에서 분화 유도 효과가 효과적으로 향상되는 것을 확인하였다. 또한, 전구세포의 세포 배양액을 추가로 첨가하는 경우 분화 유도가 더욱 현저히 향상되는 것을 확인하였다. 이를 통하여, 전구세포 배양액이 코팅된 다층 그래핀 필름을 유리기판, 실리콘 웨이퍼, 세포배양 플레이트 등 다양한 기판에 전사시켜 줄기세포의 분화 촉진용 배양 지지체로 폭넓게 사용가능할 뿐만 아니라, 본 발명의 전구세포 배양액 및 다층 그래핀 필름의 조합을 통해서 줄기세포를 이용한 다양한 치료에 사용 가능하다는 것을 확인할 수 있었다. 특별히, 줄기세포의 골분화를 현저히 촉진시킬 수 있기 때문에 다양한 골 질환의 치료에 사용 가능하다는 것을 확인할 수 있었다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
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Claims (15)

  1. 중간엽줄기세포의 골 분화 촉진용 조성물로서,
    상기 조성물은 골·연골 전구세포(osteochondroprogenitor cell)의 배양액 및 다층 그래핀 필름(multi-layer graphene film)을 유효성분으로 포함하며,
    상기 다층 그래핀 필름은 단층 그래핀 필름을 한 층씩 적층하여 제조된 것을 특징으로 하는, 중간엽줄기세포의 골 분화 촉진용 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 골·연골 전구세포는 닭 유래인 것을 특징으로 하는, 중간엽줄기세포의 골 분화 촉진용 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 배양액은 전구세포를 배양한 후에 세포를 제거한 배양액인 것을 특징으로 하는, 중간엽줄기세포의 골 분화 촉진용 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 다층 그래핀 필름은 2층 내지 10층의 그래핀이 적층되는 것을 특징으로 하는, 중간엽줄기세포의 골 분화 촉진용 조성물.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 제 1 항에 있어서,
    상기 전구세포의 배양액은 다층 그래핀 필름 표면에 코팅된 것을 특징으로 하는, 중간엽줄기세포의 골 분화 촉진용 조성물.
  9. 제 1 항에 있어서,
    상기 다층 그래핀 필름은 추가로 라이신, 피브로넥틴, 피브리노겐, 라미닌, 및 비트로넥틴으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 세포 부착 분자를 표면에 부착하는 것을 특징으로 하는, 중간엽줄기세포의 골 분화 촉진용 조성물.
  10. 제 1 항에 있어서,
    상기 다층 그래핀 필름은 전자빔 리소그래피 또는 포토 리소그래피를 이용하여 표면을 패턴화하는 것을 특징으로 하는, 중간엽줄기세포의 골 분화 촉진용 조성물.
  11. 제 1 항의 조성물에서 배양된 중간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는, 골 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  12. 제 1 항의 조성물에서 중간엽줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는, 중간엽줄기세포의 골 분화를 촉진시키는 방법.
  13. 골·연골 전구세포의 배양액, 단층 그래핀 필름을 한 층씩 적층하여 제조된 다층 그래핀 필름 및 중간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는, 골 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  14. 제 13 항에 있어서,
    상기 골 질환은 골다공증, 골 괴사, 골 손상, 골연화증, 구루병, 섬유성 골염, 무형성 골질환, 대사성 골질환, 골절의 불유합, 퇴행성 관절염, 외상에 의한 관절 손상, 변형성 관절증, 연골성이상증, 퇴행성 추간판증, 반월판 손상, 연골 손상, 또는 연골 결손인 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
  15. 골·연골 전구세포의 배양액, 단층 그래핀 필름을 한 층씩 적층하여 제조된 다층 그래핀 필름 및 중간엽줄기세포를 포함하는, 골 질환 예방 또는 치료용 키트.
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