CN109689075A

CN109689075A - 包括无软骨细胞破碎物和干细胞的用于促进软骨分化的复合物及其应用

Info

Publication number: CN109689075A
Application number: CN201780053687.7A
Authority: CN
Inventors: 康景宣; 徐光源; 尹卿爱; 全孝珍; 沈润范
Original assignee: Kang Stem Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Kang Stem Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2016-07-04
Filing date: 2017-07-04
Publication date: 2019-04-26
Also published as: WO2018008941A1; EP3479834B1; JP6929346B2; JP2019520388A; ES2930011T3; KR20180005130A; US20190365820A1; EP3479834A1; KR101901568B1; EP3479834A4

Abstract

本发明涉及包含干细胞或其培养物和无软骨细胞破碎物的用于促进软骨分化的复合物、通过利用该复合物制备软骨的方法、通过该方法制备的软骨、包含用于预防或治疗关节病的复合物的药物组合物、利用该组合物预防或治疗关节病的方法、包含制备的软骨细胞的用于诱导软骨细胞分化的组合物、以及利用制备的软骨细胞制备软骨的方法。本发明中提供的包含干细胞或其培养物和无软骨细胞破碎物的用于促进软骨分化的复合物不仅在体内被分化成软骨细胞而无副作用，而且因分化的软骨细胞中产生的旁分泌效应促进体内存在的固有干细胞分化成软骨细胞，从而有效地再生损伤的软骨，并且广泛地用于治疗包括软骨损伤的关节病。

Description

包括无软骨细胞破碎物和干细胞的用于促进软骨分化的复合物及其应用

技术领域

本发明涉及包括无软骨细胞破碎物(crush)和干细胞的用于促进软骨分化的复合物及其应用，以及更具体地，涉及包括干细胞或其培养物和无软骨细胞破碎物的用于促进软骨分化的复合物、通过利用该复合物制备软骨的方法、通过该方法制备的软骨、包括用于预防或治疗关节病的复合物的药物组合物、通过利用该组合物预防或治疗关节病的方法、包括制备的软骨细胞的用于诱导软骨细胞分化的组合物、以及通过利用制备的软骨细胞制备软骨的方法。

背景技术

关节病是统称为涉及痛觉缺失和关节变形的疾病的术语，并且被分类为关节的神经营养性疾病。通常，关节病包括多关节病(polyarthrosis)、髋关节变性病、膝关节病、脊椎关节病等，并且可涉及软骨损伤或软骨机能障碍，并且由于大部分关节疾病涉及炎症，因此已知关节疾病可发展为关节炎。

源自关节病的关节炎是人类患有的疾病中具有最高患病率的多发病，并且其中包括的退行性关节炎(变性关节炎，degenerative arthritis)是代表性老年疾病，其在65岁以上人群中的发病率为70％至80％、以及在75岁以上人群中几乎为100％。目前，在韩国，总人口的10％以上患有退行性关节炎，并且这种患病率因韩国社会的快速老龄化而迅速增加。最近，退行性关节炎甚至已经在很多年轻人中发生，并且还据估计全世界存在超过约5亿人患有退行性关节炎。另外，随着人类社会活动的持续时间增加并且人类的平均寿命也变得更长，退行性关节炎占据了在人类生活质量方面必须迫切克服的重要的位置。

退行性关节炎主要由位于膝关节中的软骨组织的损伤引起。包含在软骨组织中的软骨细胞用于合成和分泌基质，如胶原蛋白(胶原，collagen)和蛋白聚糖，并且还以适当的速度将其分解，这是用于维持软骨组织的正常功能所必需的，并且在维持关节软骨组织的功能性稳态中起至关重要的作用。为了治疗这种关节炎症状，已经进行了各种研究。例如，美国专利登记号6025334公开了用于治疗关节炎的包含鲨鱼软骨提取物的剂，以及韩国专利登记号1569168公开了利用胎盘干细胞或脐带干细胞治疗类风湿性关节炎的技术。然而，由于鲨鱼软骨提取物具有抑制软骨损伤的效果而不展现治疗或再生损伤的软骨的效果，并且干细胞可分化成关节组织中的软骨细胞以外的细胞，因此存在可能发生副作用的缺点。因此，已经积极地进行研究以开发治疗或再生损伤的软骨而没有副作用的方法。

发明内容

技术问题

本发明人已经进行了深入研究以开发更有效地治疗伴随有软骨损伤的关节病的方法。结果，本发明人证实，当将干细胞或其培养物和无软骨细胞破碎物向损伤的软骨复合地给予时，干细胞必然分化成软骨细胞以再生软骨组织或促进损伤的软骨的再生——由于给予位置周围的旁分泌效应——并且更有效地治疗关节病，并且从而完成了本发明。

技术方案

本发明的一个目的是提供包含干细胞或其培养物和无软骨细胞破碎物的用于促进软骨分化的复合物。

本发明的另一个目的是提供用于利用复合物制备软骨的方法。

本发明的又另一个目的是提供通过该方法制备的软骨。

本发明的又另一个目的是提供包含复合物的用于预防或治疗关节病的药物组合物。

本发明的又另一个目的是提供用于利用组合物预防或治疗关节病的方法。

本发明的又另一个目的是提供包含制备的软骨细胞的用于诱导软骨细胞分化的组合物。

本发明的又另一个目的是提供用于利用制备的软骨细胞制备软骨的方法。

本发明的又另一个目的是提供包含干细胞或其培养物和无软骨细胞破碎物的用于促进软骨分化的复合物的用于制备软骨的应用。

本发明的又另一个目的是提供包含干细胞或其培养物和无软骨细胞破碎物的用于促进软骨分化的复合物的用于预防或治疗关节病的应用。

有益效果

本发明中提供的包含干细胞或其培养物和无软骨细胞破碎物的用于促进软骨分化的复合物不仅被分化成软骨细胞而没有副作用(甚至在体内)，而且通过分化的软骨细胞中展现的旁分泌效应促进固有干细胞在体内分化成软骨细胞以有效地再生损伤的软骨，并且因此复合物可广泛用于治疗涉及软骨损伤的关节病。

附图说明

图1A是显示评价根据软骨分化诱导剂的类型和处理浓度的人脐带血源间充质干细胞(UCB-MSC)的软骨分化水平的结果的显微照片。

图1B是显示将通过处理2％(w/v)PCP分化的细胞用爱茜蓝染色的结果的显微照片。

图1C是显示比较根据软骨分化诱导剂的类型和处理浓度的由UCB-MSC分化的软骨细胞中蛋白质表达水平变化的结果的图。

图1D是显示通过处理2％(w/v)PCP分化的细胞和通过处理0.5％(w/v)HA分化的细胞中针对聚集蛋白聚糖(agg)的免疫荧光染色的结果的荧光显微照片。

图1E是显示通过处理2％(w/v)PCP分化的细胞和通过处理0.5％(w/v)HA分化的细胞中针对2型胶原蛋白(Col2a)的免疫荧光染色的结果的荧光显微照片。

图1F是显示测量通过处理2％(w/v)PCP分化的细胞中的BMP 6的表达水平的结果的图。

图1G是显示比较通过处理BMP 6的分化自UCB-MSC的软骨细胞中的蛋白质表达水平变化的结果的图。

图1H是显示比较根据PCP处理浓度的细胞存活率(cell viability)变化的结果的图。

图2A是显示利用初级分化软骨细胞的UCB-MSC的次级分化实验过程的示意图。

图2B是显示将通过处理PCP或HA分化的软骨细胞和UCB-MSC共培养的结果的显微照片。

图2C是显示比较与通过处理PCP或HA分化的软骨细胞共培养的UCB-MSC中表达的蛋白质(聚集蛋白聚糖、2型胶原蛋白、和1型胶原蛋白)的表达水平变化的结果的图。

图3A是显示比较软骨缺陷模型动物中根据UCB-MSC和软骨分化诱导剂的组合治疗的软骨恢复水平的结果的照片。

图3B是显示软骨缺陷模型动物中根据UCB-MSC和软骨分化诱导剂的组合治疗的软骨再生面积的定量分析的结果的照片。

图3C是显示进行番红-O(safranin-O)染色的结果的显微照片，进行番红-O染色是用于分析在软骨缺陷模型动物中以UCB-MSC和软骨分化诱导剂组合治疗的软骨缺陷区域内的蛋白聚糖含量。

图3D是显示进行免疫荧光染色的结果的荧光显微照片，进行免疫荧光染色是用于分析在软骨缺陷模型动物中以UCB-MSC和软骨分化诱导剂组合治疗的软骨缺陷区域内的2型胶原蛋白表达水平。

图3E是显示进行爱茜蓝染色的结果的图，进行爱茜蓝染色是用于分析在软骨缺陷模型动物中以UCB-MSC和软骨分化诱导剂组合治疗的软骨缺陷区域内的糖胺聚糖水平。

图4A是成像骨关节炎模型动物中根据UCB-MSC和PCP的单独治疗或组合治疗随时间的关节炎改善效果的X射线照片。

图4B是显示骨关节炎模型动物中根据UCB-MSC和PCP的单独治疗或组合治疗的行为测试结果的图。

图4C是显示比较骨关节炎模型动物中根据UCB-MSC和PCP的单独治疗或组合治疗的关节腔液内TNF-α水平的结果的图。

图4D是成像骨关节炎模型动物中根据UCB-MSC和PCP的单独治疗或组合治疗的膝关节股骨髁和胫骨坪区域的照片。

图4E是显示骨关节炎模型动物中根据UCB-MSC和PCP的单独治疗或组合治疗的关节面侵蚀(腐蚀、磨损，erosion)、表面变化、骨赘、和股骨肥大水平的综合定量分析结果的图。

具体实施方式

本发明人在进行各种研究的同时已关注于干细胞，以开发用于更有效地治疗关节病的方法。由于大部分类型的关节病是由位于关节中的软骨的损伤所引起，因此假定如果损伤的软骨可被恢复或再生，则可有效地治疗关节病，并且因此进行研究以找到利用干细胞再生软骨的方法。然而，虽然在体外条件下已知将干细胞分化成软骨细胞的各种方法，但在体内条件下，不容易将干细胞分化成软骨细胞，因为在体外条件下，用于将干细胞分化成软骨细胞的大部分分化诱导促进剂体内可在体内引起副作用。因此，本发明人已经进行了各种研究以开发在体内将干细胞体内分化成软骨细胞的同时在体内不引起副作用的成分(组分，component)。结果，本发明人证实，在使用猪软骨粉(PCP)的情况下，在PCP于体内将干细胞分化成软骨细胞的同时不引起副作用。

具体地，能够在体外条件下将干细胞分化成软骨细胞的分化诱导促进剂可能在体内不起正常作用。事实上，在透明质酸(HA)——已知其在体外条件下将干细胞分化成软骨细胞——的情况下，证实了在体内同时给予HA未将干细胞分化成软骨细胞并且抑制正常干细胞的分化。

然而，已经证实，PCP不仅在体外而且在体内也可诱导或促进将干细胞分化成软骨细胞的过程。另外，已经证实，与干细胞单独治疗相比，PCP与干细胞一起的治疗进一步促进了向软骨细胞的分化，从而在体内有效地治疗所引起的关节病。

特别地，当含有PCP和干细胞的复合物被给予患有关节病的个体时，复合物中含有的干细胞通过PCP被分化成软骨细胞，并且在体内固有地存在的干细胞也可通过分化的软骨细胞被分化成软骨细胞，从而展现对关节病更改善的治疗效果。

如上所述，通过使用干细胞和无软骨细胞破碎物再生损伤的软骨治疗关节病的方法迄今为止没有被报道，并且被本发明人首次开发。

作为用于达到上述目标的一个实施方式，本发明提供含有干细胞或其培养物、及无软骨细胞破碎物的用于促进软骨分化的复合物。

本发明的术语“干细胞”意指具有分化成各种组织的能力的细胞，即，‘未分化的细胞’。

在本发明中，干细胞没有特别限制，只要干细胞可通过本发明的无软骨细胞破碎物分化成软骨细胞。然而，干细胞的实例可包括成体干细胞、多能干细胞、诱导多能干细胞、脐带血间充质干细胞(UCB-MSC)、胚胎干细胞、胎盘干细胞、和自体干细胞。

多能干细胞(multipotent stem cell)是源自各种成体细胞——如骨髓、脐带血、胎盘(或胎盘组织细胞)、和脂肪(或脂肪组织细胞)的多能干细胞。例如，可分化成脂肪组织、骨/软骨组织、和肌肉组织的源自骨髓的间充质干细胞凭借多能性已经成为开发作为细胞治疗剂的各种研究的主题。

同时，成体干细胞可源自选自以下的组织：脐带、脐带血、骨髓、脂肪、肌肉、神经、皮肤、羊膜、和胎盘。另外，成体干细胞可以是间充质干细胞、间充质基质细胞、或多潜能干细胞、并且优选人脐带血间充质干细胞(hUCB-MSC)。在每种组织中获得干细胞的方法可通过本领域已知的方法进行，并且不限制于本发明的实施方式的方法。

本发明的术语“培养物”意指通过在特定条件下培养细胞获得的产物。

在本发明中，培养物可包括含有干细胞的细胞培养溶液、通过从细胞培养溶液中除去干细胞获得的培养上清液、其稀释溶液等。培养物的组成不仅可进一步包括培养干细胞所需的成分，而且可进一步包括与干细胞增殖协同地作用的成分。培养物的组成可被本领域技术人员容易地选择。

作为用于培养干细胞的培养基，可使用本领域中已知适合于干细胞培养的一般培养基。例如，培养基可包括Dulbecco’s改良的Eagle培养基(DMEM)或角质形成细胞无血清培养基(Keratinocyte-SFM)。

干细胞培养基可用添加剂补充。通常，添加剂可包括等渗溶液中的中性缓冲剂(例如，磷酸盐和/或高浓度碳酸氢盐)和蛋白质养分(例如，血清，如FBS、血清替代物、白蛋白、或必需氨基酸和非必需氨基酸，如谷氨酰胺)。此外，添加剂可包括脂质(脂肪酸、胆固醇、或血清HDL或LDL提取物)和在其大部分类型的贮存培养基中发现的其他成分(例如，胰岛素或转铁蛋白、核苷或核苷酸、丙酮酸盐、任何离子化形式或盐糖(salt sugars)如葡萄糖、硒、糖皮质素如皮质醇、和/或还原剂如β-巯基乙醇)。

本发明的术语“软骨”意指由软骨细胞和相对大量的软骨基质组成的体内结缔组织。在属于结缔组织的肌肉、软骨、和骨中，软骨比骨更具挠性，而比肌肉更硬。

在大部分软骨组织中，软骨细胞通常相同，但是包括不同软骨基质——取决于软骨组织的位置、作用等。由此，根据软骨基质，软骨通常分类成三种类型的软骨(透明软骨、弹性软骨、和纤维软骨)。然而，根据条件——如软骨形成的位置、发育的时机(timing ofdevelopment)、诱导分化的方法等，生成的软骨基质可包括不同的成分和成分组成比例。

例如，通过体内干细胞自然再生的软骨基质和通过在体外条件下分化干细胞生成的软骨基质可展现这些软骨基质中含有的蛋白质的类型和含量方面的显著差异。另外，在通过分化干细胞生成软骨的情况下，通常使用用于软骨分化的分化诱导促进剂处理干细胞以将干细胞分化成软骨细胞，然后将分化的软骨细胞分化成软骨基质。在根据此时使用的分化诱导促进剂的类型所生成的软骨基质中含有的蛋白质的类型和含量方面存在显著的差异。由此，含有不同蛋白质种类和含量的软骨基质可在体内具有不同作用。

在本发明的一个实施方式中，已经证实，能够在体外条件下将干细胞分化成软骨细胞的分化诱导促进剂可在体内诱导不同类型的软骨分化。具体地，在体外条件下，已经证实本发明的猪软骨粉(PCP)和透明质酸(HA)均可将干细胞分化成软骨细胞。接下来，制备了动物关节区域中存在的透明软骨部分具有损伤的模型动物，并且给予包含PCP和干细胞的复合物或包含HA和干细胞的复合物，然后比较了这些复合物对软骨损伤的治疗效果。结果，已经证实在给予包含PCP和干细胞的复合物的情况下，软骨再生效果与单独给予干细胞的情况相比被进一步增强，而在给予包含HA和干细胞的复合物的情况下，与单独给予干细胞的情况相比展现出相对低水平的软骨再生效果。根据上述结果，分析出在体内PCP将干细胞分化成透明软骨以提高损伤的透明软骨的再生，而HA将干细胞分化成除透明软骨以外的不同类型的软骨以抑制损伤的透明软骨的再生。

本发明的术语“透明软骨”也被称为“玻璃软骨”并且指代具有这样的基质的软骨，所述基质在体内通常是半透明的(带有蓝白色)、透明的、并形成为视觉上均匀的组织，并且包含60％至80％水以及包含含有硫酸软骨素和软骨膜的复合蛋白质(类黏蛋白)。透明软骨结构中的软骨细胞存在于软骨基质周围。已知透明软骨在体内构成肋软骨、鼻软骨、喉软骨、关节软骨、气管软骨等。

本发明的术语“弹性软骨”指代这样的软骨——其是不透明且黄色的、在软骨基质中具有含有网状结构的弹性纤维、并且包含软骨膜。已知弹性软骨构成耳廓软骨、耳道软骨(meatus acusticus cartilage)、会厌软骨等。

本发明的术语“纤维软骨”指代白色纤维组织和软骨基质以各种比例混合的形式的软骨。包含在纤维软骨中的纤维组织通常由胶原蛋白组成，并且通常展现出透明软骨和弹性软骨之间的特征，但不包括软骨膜。软骨细胞以混合形式存在于纤维组织中，其单独游离或形成小的细胞群。已知纤维软骨在体内构成椎间盘、髋臼韧带、关节半月板等。

本发明的术语“无软骨细胞破碎物”意指通过破碎软骨基质获得的生物源材料，在所述软骨基质中通过已知方法将软骨细胞从软骨中除去。

在本发明中，无软骨细胞破碎物作用于干细胞以诱导向软骨细胞的分化。无软骨细胞破碎物的功能不仅可通过无软骨细胞破碎物中含有的分化诱导成分来执行，而且可通过无软骨细胞破碎物本身的物理特性来执行。即，由于无软骨细胞破碎物处于由与软骨细胞相比具有相对高的硬度的软骨基质组成的特定形式，特定破碎物额外地充当干细胞的支持物以促进干细胞的分化。

无软骨细胞破碎物不受具体限制，只要破碎物可诱导干细胞分化成软骨细胞。然而，无软骨细胞破碎物可包括通过机械地破碎其中除去软骨细胞的软骨基质、重复冷冻/解冻其中除去软骨细胞的软骨基质、或用超声波处理其中除去软骨细胞的软骨基质而获得的破碎物；通过用各种酶(胰蛋白酶、核酸内切酶、核酸外切酶等)处理其中除去软骨细胞的软骨基质获得的酶水解物；通过用碱性或酸性试剂或表面活性剂处理其中除去软骨细胞的软骨基质获得的反应产物；及类似物。

另外，虽然不具体限制于此，但作为一个实例，软骨基质可使用源自哺乳动物如猪、牛、兔子等的软骨基质，并且作为另一个实例，可使用源自与人类最相似的猪的软骨基质。

在本发明的一个实施方式中，将猪软骨粉(PCP)——其通过从猪的软骨中生成其中除去软骨细胞的软骨基质，然后进行冷冻干燥和破碎过程而获得——用作无软骨细胞破碎物。

本发明的术语“复合物”指代包含干细胞和无软骨细胞破碎物的用于促进软骨分化的剂。

在本发明中，复合物不仅包括其中混合了干细胞和无软骨细胞破碎物的组合物，而且包含含有干细胞和无软骨细胞破碎物的任何形式的制剂，如其中固定在载体上的干细胞和无软骨细胞破碎物的复合物、和其中干细胞和无软骨细胞破碎物各自包装的试剂盒(套组，kit)。此外，除了制剂形式之外，复合物还包括由干细胞和无软骨细胞破碎物的反应生成的所有反应产物或该反应产物的副产物，如通过无软骨细胞破碎物而分化自干细胞的软骨细胞、该软骨细胞的培养物、该培养物的培养上清液、该培养物的提取物、和该培养物的组分(fraction)。

另外，除了干细胞和无软骨细胞破碎物，复合物可进一步包括能够促进干细胞的软骨分化的用于促进软骨分化的剂。只要剂与无软骨细胞破碎物一起作用从而促进干细胞向软骨细胞的分化，用于促进软骨分化的剂就不具体限制于此，但作为一个实例，可以是骨形态发生蛋白6(BMP 6)。

在另一个实施方式中，本发明提供利用复合物制备软骨或软骨细胞的方法。具体地，本发明的制备软骨或软骨细胞的方法包括在无软骨细胞破碎物存在下将干细胞分化成软骨细胞。

本发明的术语“分化”意指其中相对简单的体系(系，system)通常被分成两种或更多种性质上不同的分体系(partial systems)的现象，具体地，其中细胞分裂和增殖以在生长期间特化成(specified into)不同结构或功能的现象，即，其中有机体的细胞、组织等变成用于执行各自给定任务的形式或功能的现象。例如，分化可包括其中在任何起初几乎均质的生物体系的部分之间发生的性质差异，或作为结果，体系被分成性质上可区分的子结构或分体系的现象，如其中头、躯干等在个体发育的起初是均质的卵部分之间被区分，或者肌肉细胞或神经元甚至在细胞中被区分的现象。相对地，“未分化的”意指包含尚未分化的干细胞的特征的状态。

出于本发明的目的，分化可解释为意指其中通过无软骨细胞破碎物的处理将干细胞转化成软骨细胞的一系列过程。

例如，软骨或软骨细胞可在猪软骨粉的存在下通过分化脐带血源干细胞来制备。

为了提高分化成软骨细胞的效率，在用本发明的无软骨细胞破碎物处理干细胞之前，方法可在处理的同时或在处理之后进一步包括处理用于促进软骨分化的剂。用于促进软骨分化的剂与上述相同。

作为又另一个实施方式，本发明提供通过该方法制备的软骨或软骨细胞。

如上所述，软骨可包含含有不同成分和成分组成比例的软骨基质——取决于诸如软骨形成位置、发育时机、和诱导分化的方法等条件。

如上所述，由本发明提供的软骨或软骨细胞可在无软骨细胞破碎物存在下通过由干细胞分化软骨细胞来制备。上面制备的软骨或软骨细胞展现了与其中通过常规方法诱导分化的软骨清楚地区别的特征。特征之一是与其中由透明质酸诱导分化的软骨细胞相比，有效地治疗体内软骨损伤，以及另一特征是仅用制备的软骨或软骨细胞通过旁分泌效应将干细胞分化成软骨细胞。

具体地，通过本发明的软骨或软骨细胞展现的旁分泌效应迄今为止未曾报道，并且是由本发明人首次证实的。

在本发明中提供的软骨或软骨细胞可通过在猪软骨粉的存在下分化脐带血源干细胞来制备。

作为又另一个实施方式，本发明提供包含复合物的用于预防或治疗关节病的药物组合物。

在本发明中提供的复合物不仅可以在体外条件下将干细胞分化成软骨细胞，而且可以在体内条件下展现再生或治疗损伤的软骨或软骨细胞的效果。另外，本发明的复合物可再生不仅由诸如外伤的外因损伤的软骨或软骨细胞，还有由内在因素——如老化、遗传疾病、和免疫疾病——损伤或丧失的软骨或软骨细胞。具体地，由于内在因素引起的软骨或软骨细胞的损伤或丧失的病理症状不会立即出现，而是逐渐地出现。因此，在通过给予本发明的复合物来抑制由于内在因素引起的软骨或软骨细胞的损伤或丧失的情况下，可展现预防关节病的效果。

因此，本发明的复合物可用作用于预防或治疗关节病的药物组合物的有效成分。

本发明的术语“关节病”还被称为“关节病(arthrosis)”或“骨关节病”并且指代涉及痛觉缺失和关节变形的疾病，并且其被分类为关节的神经营养性疾病。通常，关节病包括多关节病、髋关节变性病、膝关节病、和脊椎关节病等，并且可涉及软骨损伤或软骨机能障碍。已知大部分类型的关节病由于涉及炎症而发展成关节炎。

本发明的术语“治疗”意指通过给予药物组合物改善或减轻关节病的症状的任何行为。

另外，在本发明的药物组合物中含有的无软骨细胞破碎物的含量不受具体限制，并且作为一个实例可以是0.1ng/mL至100ng/mL，作为另一个实例，可以是1ng/mL至10ng/mL，并且作为又另一个实例，可以是5ng/mL。

另外，包含在本发明的药物组合物中的干细胞或其培养物的含量不受具体限制，但作为一个实例可以是1.0×10⁵至1.0×10⁹个细胞/1mL，作为另一个实例，可以是1.0×10⁶至1.0×10⁸个细胞/1mL，并且作为又另一个实例，可以是1.0×10⁷个细胞/1mL。

根据本发明的干细胞或其培养物可在不冷冻的情况下使用，或可冷冻以备后用。如果需要冷冻，可将标准冷冻防腐剂(例如，DMSO、甘油、或Epilife细胞冷冻培养基(Cascade Biologics))添加到预冷冻细胞群。

本发明的药物组合物作为活性成分包含干细胞或其培养物和无软骨细胞破碎物，并且当将药物组合物给予患有关节病的个体时，一起给予的干细胞可通过包含于组合物中的无软骨细胞破碎物被初级分化成软骨细胞，并且在体内固有存在的干细胞可通过初级分化的软骨细胞的旁分泌效应被次级分化成软骨细胞，从而展现对关节病更改善的治疗效果。

作为又另一个实施方式，本发明提供利用复合物或包含该复合物的药物组合物预防或治疗关节病的方法。

具体地，预防或治疗关节病的方法包括将复合物或包含该复合物的药物组合物给予可能发展为关节病或发展了关节病的受试者。

本发明的术语“受试者”意指发展了或可能发展关节病的活有机体，并且作为实例，可以是包含关节组织的更高等的脊椎动物，并且作为另一个实例，可以是哺乳动物，并且作为又另一个实例，可以是灵长类，并且作为又另一个实例，可以是大鼠、小鼠、和家畜等，包括人类。

本发明的术语“给予”意指通过适当的方法向患者引入预定物质的行为，并且活性成分可针对人类或兽医配制，然后通过各种途径给予。

在本发明中，给予可解释为意指向发展了关节病的受试者引入本发明的复合物或包含该复合物的药物组合物的行为。

包含本发明的复合物的药物组合物的给予途径不受具体限制，但作为实例，可通过肠胃外的途径，如血管内、静脉内、动脉内、肌肉内、或皮下途径给予，并且作为另一个实例，可通过口、鼻、直肠、经皮、或气溶胶吸入途径给予。

包含在本发明的复合物中的干细胞或其培养物和无软骨细胞破碎物可同时或相继给予。

本发明的复合物可给予到包含干细胞的软骨组织。

另外，为了改善对关节病的治疗效果，该方法可进一步包括在给予本发明的药物组合物之前、期间或之后，给予能够促进软骨再生、软骨分化等的用于促进软骨分化的剂，而在体内无副作用。用于促进软骨分化的剂不受具体限制，但可以是骨形态发生蛋白6(BMP6)等。

本发明的复合物或包含该复合物的药物组合物可以药学有效量进行给予。

本发明的术语“药学有效量”意指足以以可适用于医学治疗而不引起副作用的合理收益/风险比率治疗疾病的量。

另外，根据本发明的药物组合物可根据药学领域中的一般方法配制成适合于向患者的身体给予的单位给予型制剂并进行给予，并且该制剂包括按一次或若干次给予的有效剂量。作为肠胃外给予的制剂，适合于该目的的制剂优选地包括注射剂如注射安瓿、输注剂如输注袋、喷雾剂如气溶胶剂等。注射安瓿可在使用之前立即与注射溶液混合并制备，而注射溶液可使用生理盐水、葡萄糖、甘露醇、林格液等。另外，输注袋可由聚氯乙烯或聚乙烯制成，并且可包括由Baxter、Becton Dickinson、Medcep、National Hospital Products、和Terumo公司制备的输注袋。

药剂可进一步包含一种或多种一般药学上可接受的惰性载体，例如，在注射剂的情况下，可包含防腐剂、无水剂(anhydrous agent)、增溶剂、稳定剂等，并且在局部给予剂的情况下，可包括基质(base)、赋形剂、润滑剂、防腐剂等。

根据本发明的包含干细胞或其培养物和软骨提取物的药物组合物可与用于治疗用于移植和其它应用的其它干细胞或其它关节病的剂通过本领域通常使用的给予方法或以混合物的形式一起给予。优选地，药物组合物可直接地移入(engrafted)或移植到待治疗患者的疾病位置或者直接移植或注射到腹腔，但不限制于此。另外，给予可使用利用导管的非手术给予和诸如切割疾病位置后注射或移植的手术给予，但利用导管的非手术给予方法是更优选的。另外，根据一般方法，作为例如肠胃外的给予，作为造血干细胞移植的通常方法，通过血管内注射的移植也是可能的——除了直接给予到病变之外。

包含在药物组合物中的干细胞的每日剂量，作为一个实例，可以1.0×10¹⁰个细胞/kg体重，以及作为另一个实例，可以1.0×10⁵至1.0×10⁹个细胞/kg体重一次或若干次地给予。然而，应当理解，活性成分的实际剂量应由各种相关因素——如待治疗的疾病、疾病的严重性、给予的途径、体重、或患者的年龄和性别等决定。因此，剂量不以任何方式限制于本发明的范围。

作为又另一个实施方式，本发明提供在通过该方法制备的无软骨细胞破碎物存在下包含分化自干细胞的软骨或软骨细胞的用于诱导软骨细胞分化的组合物。

如上所述，由于通过本发明的方法制备的软骨或软骨细胞可在没有额外的无软骨细胞破碎物的情况下通过其自身的旁分泌效应将干细胞分化成软骨细胞，所制备的软骨或软骨细胞可用作用于诱导软骨细胞分化的组合物的活性成分。

即，软骨或软骨细胞可与干细胞共培养以将干细胞分化成软骨细胞。

另外，软骨或软骨细胞可在猪软骨粉的存在下通过分化脐带血源干细胞进行制备。

作为又另一个实施方式，本发明提供利用所制备的软骨细胞制备软骨细胞的方法。

具体地，利用本发明中提供的软骨细胞制备软骨细胞的方法包括(a)在无软骨细胞破碎物存在下，由第一干细胞分化第一软骨细胞；以及(b)将第二干细胞与分化的第一软骨细胞共培养并且将共培养的第二干细胞分化成第二软骨细胞。

此时，可在猪软骨粉的存在下通过分化脐带血源干细胞(第一干细胞)来进行步骤(a)。

作为又另一个实施方式，本发明提供包含干细胞或其培养物和无软骨细胞破碎物的用于促进软骨分化的复合物用于制备软骨的应用。

作为又另一个实施方式，本发明提供包含干细胞或其培养物和无软骨细胞破碎物的用于促进软骨分化的复合物用于预防或治疗关节病的应用。

实施例

在下文中，将参考实施例更详细地描述本发明。然而，这些实施例仅用于示例本发明，并且本发明的范围不受限于这些实施例。

实施例1：猪软骨粉(PCP)的软骨分化潜能的评价

实施例1-1：人脐带血源间充质干细胞的软骨分化的诱导

将脐带血源间充质干细胞(UCB-MSCs)在含有10％(v/v)FBS和1％(w/v)庆大霉素的KSB-3培养基(Kangstem biotech，韩国)中接种，并且在37℃和5％(v/v)二氧化碳的条件下培养。

获得每5μL含有5×10⁵个培养的UCB-MSC的小滴(液滴，droplet)，并将其接种在48孔板的每个孔中，在37℃和5％(v/v)二氧化碳的条件下放置2小时，然后附着到孔的底部。

向附着的小滴添加含有猪软骨粉(PCP；0.5％、1％、或2％(w/v))或透明质酸(HA；0.25％、0.5％、或1％(w/v))作为软骨分化诱导剂的软骨分化诱导培养基(StemProChondrogenesis Differentiation Kit，ThermoFisher)并且培养7天以将UCB-MSC分化成软骨细胞。此时，使用未经软骨分化诱导剂处理的UCB-MSC作为对照组，并且PCP是通过从猪软骨除去细胞，然后进行其中除去细胞的猪软骨的冷冻干燥、破碎、和过滤的过程而获得的。

如图1A所示，证实了在以各种浓度处理PCP以及HA(作为已知软骨分化诱导剂)的情况下，由UCB-MSC形成丸片状(弹丸状，pellet-shaped)软骨。

实施例1-2：爱茜蓝染色分析

在实施例1-1的样本中，将通过处理2％(w/v)PCP分化的细胞用4％多聚甲醛(PFA)处理，并且反应1天以固定细胞。将固定的细胞用1％爱茜蓝处理并且染色20分钟，并且证实了是否在固定的细胞中检测到糖胺聚糖(GAG)——其是作为软骨标志(标记、标记物，marker)的一种蛋白聚糖(图1B)。

如图1B所示，在对照组中没有检测到经爱茜蓝染色的GAG，但是在通过处理2％(w/v)PCP分化的细胞中检测到了经爱茜蓝染色的GAG。

实施例1-3：实时聚合酶链反应(RT-PCT)

在实施例1-1中分化的每个细胞用TRIzol(Invitrogen)溶液处理以提取每个细胞的总RNA，并且利用提取的总RNA和AccuPower RT PreMix(Bioneer)合成每个cDNA。利用合成的cDNA和下列引物进行RT-PCR以比较各种蛋白质(聚集蛋白聚糖(ag g)、2型胶原蛋白(Col2a)、SOX9和1型胶原蛋白(Col1))的表达水平(图1C)。此时，RPL13a被用作内部对照组。

聚集蛋白聚糖_F：5′-ctgcattccacgaagctaacct-3′(SEQ ID NO:1)

聚集蛋白聚糖_R：5′-gacgcctcgccttcttgaa-3′(SEQ ID NO:2)

2型胶原蛋白α1_F：5′-ctactggattgaccccaaccaa-3′(SEQ ID NO:3)

2型胶原蛋白α1_R：5′-tccatgttgcagaaaaccttca-3′(SEQ ID NO:4)

SOX9_F：5′-gacttctgaacgagagcgaga-3′(SEQ ID NO:5)

SOX9_R：5′-ccgttcttcaccgacttcctc-3′(SEQ ID NO:6)

1型胶原蛋白_F：5′-caggaagggccacgacaaa-3′(SEQ ID NO:7)

1型胶原蛋白_R：5′-ctgcggcacaagggattg-3′(SEQ ID NO:8)

RPL 13a_F：5′-ctatgaccaataggaagagcaacc-3′(SEQ ID NO:9)

RPL 13a_R：5′-gcagagtatatgaccaggtggaa-3′(SEQ ID NO:10)

图1C是显示比较根据软骨分化诱导剂的类型和处理浓度的由UCB-MSC分化的软骨细胞中的蛋白质表达水平变化的结果的图。

如图1C所示，证实了在通过用2％(w/v)PCP处理而分化的软骨细胞中聚集蛋白聚糖(agg)、2型胶原蛋白(Col2a)、和SOX9——其已知为软骨标志蛋白——的表达水平是最高的，而在所有实验组中1型胶原蛋白(Col1)——其不是软骨标志蛋白——的表达水平是低的。

实施例1-4：免疫荧光分析

在实施例1-1的样本中，在通过处理2％(w/v)PCP分化的细胞和通过处理0.5％(w/v)HA分化的细胞中，对聚集蛋白聚糖(agg)和2型胶原蛋白(Col2a)进行免疫荧光染色。

大约地，将分化的细胞固定并且用1％(w/v)BSA处理以封闭，然后用针对聚集蛋白聚糖或2型胶原蛋白的抗体(1:100，abcam)处理，并且在4℃下反应过夜。接下来，将细胞用PBS洗涤，与氯-Alexa 488缀合的抗小鼠IgG/IgM多克隆抗体(Invitrogen)反应，然后利用荧光显微镜观察(图1D和1E)。此时，利用Hoechst 33342三盐酸化物和三水合物(Invitrogen)进行对照染色。

图1D是显示针对通过处理2％(w/v)PCP分化的细胞和通过处理0.5％(w/v)HA分化的细胞中的聚集蛋白聚糖(agg)进行免疫荧光染色的结果的荧光显微照片，并且图1E是显示针对通过处理2％(w/v)PCP分化的细胞和通过处理0.5％(w/v)HA分化的细胞中的2型胶原蛋白(Col2a)进行免疫荧光染色的结果的荧光显微照片。

如图1D和1E所示，证实了在通过处理2％(w/v)PCP分化的细胞中——而非在通过处理0.5％(w/v)HA分化的细胞中，作为软骨标志的聚集蛋白聚糖和2型胶原蛋白以相对高的水平表达。

实施例1-5：对BMP 6表达的影响

在实施例1-1的样本中，在通过处理2％(w/v)PCP分化的细胞中表达的骨形态发生蛋白6(BMP 6)的表达水平通过实施例1-3的方法利用以下引物测量(图1F)。此时，作为对照组，在没有处理PCP而分化的细胞中测量的BMP6表达水平被使用。

BMP 6_F：5′-gctatgctgccaattactgtgatg-3′(SEQ ID NO:11)

BMP 6_R：5′-tgcattcatgtgtgcgttga-3′(SEQ ID NO:12)

图1F是显示测量通过处理2％(w/v)PCP分化的细胞中BMP 6表达水平的结果的图。

如图1F所示，证实了在通过处理2％(w/v)PCP分化的细胞中BMP 6的表达水平快速地增加。

另外，除了500ng/mL的BMP 6被当作软骨分化诱导剂之外，进行实施例1-1的方法以分化UCB-MSC，并且利用实施例1-3的方法将在由此获得的分化细胞中表达的各种蛋白质(聚集蛋白聚糖(agg)、2型胶原蛋白(Col2a)、SOX9、和1型胶原蛋白(Col1))的表达水平进行比较(图1G)。

图1G是显示比较通过处理BMP 6的由UCB-MSC分化的软骨细胞中蛋白质表达水平变化的结果的图。

如图1G所示，证实了在通过处理BMP 6分化的软骨细胞中聚集蛋白聚糖(agg)、2型胶原蛋白(Col2a)、和SOX9——其已知为软骨标志蛋白——的表达水平快速增加，而1型胶原蛋白(Col1)——其不是软骨标志蛋白——的表达水平没有变化。

实施例1-6：PCP的细胞毒性的评价

在24孔板的每个孔中接种3×10⁴个UCB-MSC并且以各种浓度(0.5％、1％、或2％(w/v))添加PCP，然后培养3天。在培育完成后，每100μL的培养基利用10μL的细胞计数试剂盒-8(Cell Counting Kit-8)(Dojindo)处理细胞并且反应1小时，然后测量在450nm处的吸光度以证实PCP的细胞毒性(图1H)。

图1H是显示比较根据PCP的处理浓度的细胞生存率(活力，存活率，viability)变化的结果的图。

如图1H所示，证实了甚至当以高浓度处理PCP时，细胞生存率也不被显著影响。

当描述实施例1-1至1-6的结果时，可以看出可将PCP用作安全的软骨分化诱导剂。

实施例2：通过PCP分化的软骨细胞的UCB-MSC分化潜能的评价

实施例2-1：利用初级分化的软骨细胞的UCB-MSC的次级分化

根据实施例1-1的方法，将通过处理PCP或HA分化的软骨细胞与UCB-MSC一起添加到配备有0.4μm聚碳酸酯膜插入物(插入件，insert)的Transwell(Corning)的上端插入物，并且在软骨分化-诱导培养基(StemPro Chondrogenesis Differentiation Kit，ThermoFisher)中与每5μL含有培养的5×10⁵个UCB-MSC的小滴共培养(图2A)。作为阴性对照组，使用了在不处理软骨分化诱导剂并且不共培养的情况下软骨分化-诱导培养基中分化的UCB-MSC。作为阳性对照组，使用了与在不处理软骨分化诱导剂的情况下分化的细胞共培养的UCB-MSC；作为实验组1，使用了与通过处理PCP分化的细胞共培养的UCB-MSC；和作为实验组2，使用了与通过处理HA分化的细胞共培养的UCB-MSC。

图2A是显示利用初级分化的软骨细胞的UCB-MSC的次级分化实验过程的示意图。即，Transwell被分成具有插入物的上端和不具有插入物的下端，并且将分化的细胞置于上端并且将未分化的UCB-MSC置于下端，然后将这些细胞共培养。

实施例2-2：分化潜能的评价

在显微镜下观察通过实施例2-1的方法共培养7天或10天的UCB-MSC的分化结果(图2B)。

如图2B所示，证实了在不进行共培养的UCB-MSC(阳性对照组)和与不进行处理PCP的分化细胞共培养的UCB-MSC(阴性对照组或实验组2)的情况下，UCB-MSC未被分化成软骨细胞。同时，证实了在与通过处理PCP分化的细胞共培养的UCB-MSC(实验组1)中，UCB-MSC被分化成软骨细胞。

实施例2-3：RT-PCT分析

在通过实施例2-1的方法共培养7天或10天的UCB-MSC中，通过实施例1-3的方法分析作为表达的软骨标志的聚集蛋白聚糖(agg)和2型胶原蛋白(Col2a)和不是软骨标志的1型胶原蛋白(Col1)的表达水平(图2C)。

图2C是显示比较与通过处理PCP或HA分化的软骨细胞共培养的UCB-MSC中表达的蛋白质(聚集蛋白聚糖、2型胶原蛋白、和1型胶原蛋白)表达水平变化的结果的图。

如图2C所示，证实了在共培养7天的UCB-MSC中，在与通过处理PCP分化的细胞共培养的UCB-MSC(实验组1)中，作为软骨标志的聚集蛋白聚糖和2型胶原蛋白的表达水平是高的。

另一方面，证实了在不进行共培养的UCB-MSC(阳性对照组)和与不进行处理PCP的分化细胞共培养的UCB-MSC(阴性对照组或实验组2)的情况下，聚集蛋白聚糖和2型胶原蛋白的表达水平几乎都是低的。

另外，证实了1型胶原蛋白(Col1)——其不是软骨标志——的表达水平在所有情况下通常是低的。

如实施例2-1至2-3的结果所示，通过分化的软骨细胞的旁分泌效应的UCB-MSC的分化诱导仅在经PCP处理的分化的软骨细胞中显示。结果，发现了根据分化诱导促进剂的类型，分化的软骨细胞具有不同特征，并且分化的软骨细胞彼此不同。

实施例3：在体内利用PCP和干细胞的软骨损伤治疗效果的分析

实施例3-1：利用软骨缺陷模型动物的分析

实施例3-1-1：软骨缺陷模型动物的制备

将Zoletil 50(Virbac，15mg/kg)和rompum(Bayer，5mg/kg)肌肉内注射到雄性新西兰白色(NZW)兔子中以进行全身麻醉。除去右膝盖周围的软毛，切割膝关节的内侧(medial)皮肤，切割筋膜和关节囊，并且向外弯曲膝盖骨以暴露关节囊。利用直径为1mm的钻头在股骨的内部(膝关节沟的中间)制作直径为5mm和深度为2mm的软骨缺陷区域，通过刮匙完全除去缺损区域中的软骨，然后缝合关节囊。手术后3天，将抗生素Foxolin(SamjinPharmaceutical，10mg/kg)和镇痛药Maritrol(Cheil Pharmaceutical，3mg/kg)肌肉内注射，每日两次，此后，将Foxolin额外治疗3天，每日一次，以制备关节软骨缺陷(ACD)模型动物。

实施例3-1-2：PCP和干细胞对软骨缺陷模型动物的治疗效果

自从实施例3-1-1中制备的软骨缺陷模型动物中除去软骨30分钟之后，将经PBS稀释的UCB-MSC(实验组11)、UCB-MSC/PCP(实验组12)、或UCB-MSC/HA(实验组13)以每只兔子0.2mL的体积关节内给予，并且将兔子饲养4周。

在切开包括饲养的模型动物的关节的外股骨和股骨髁的损伤部位的关节表面之后，根据国际软骨修复学会(International Cartilage Repair Society，ICRS)评分系统评分和分析软骨缺陷区域的变化、软骨缺陷区域的表面状态、缺损边界部位和新形成组织的连续性的目视观察、以及通过拍照的软骨再生程度。

大约地，将关节组织以10％中性福尔马林溶液固定3天，然后用10％EDTA(pH 8.0)溶液彻底脱矿质，并且制备石蜡切片。将组织切片进行苏木精&曙红(H&E)染色，利用显微图像分析程序Image J 4.8v(Wayne Rasband，National Institute of Health，UAS)分析[软骨再生部位/切开表面宽度]的比率，并且通过ICRS评分量化软骨再生面积(图3A和3B)。此时，作为对照组，未治疗的软骨缺陷模型动物被使用。

如图3A所示，对照组的软骨恢复水平被测量为缺陷区域的90.48±0.9％，实验组11的软骨恢复水平被测量为缺陷区域的91.82±0.8％，实验组12的软骨恢复水平被测量为缺陷区域的94.41±5.58％，以及实验组13的软骨恢复水平被测量为缺陷区域的90.51±3.36％。

图3B是显示通过ICRS评分量化软骨缺陷模型动物中根据UCB-MSC和软骨分化诱导剂的组合治疗的软骨再生面积的结果的照片。

如图3B所示，证实了对照组的ICRS评分为4.3±0.9，实验组11的ICRS评分为7.0±0.87，实验组12的ICRS评分为8.0±0.83，以及实验组13的ICRS评分为4.3±0.78。

从图3A和3B的结果可知，在软骨缺陷模型动物中UCB-MSC和PCP的组合治疗的情况下，软骨恢复水平最高，并且与软骨缺陷模型动物中UCB-MSC和HA的组合治疗的情况相比，在单独治疗UCB-MSC的情况下，软骨恢复水平是相对高的。

实施例3-1-3：番红-O染色分析

从实施例3-1-2中饲养4周的软骨缺陷模型动物中提取软骨缺陷区域。进行番红-O染色以确认提取的软骨缺陷区域中含有的蛋白聚糖含量(图3C)。

图3C是显示进行番红-O染色的结果的显微照片，进行番红-O染色是用于分析软骨缺陷模型动物中以UCB-MSC和软骨分化诱导剂组合治疗的软骨缺陷区域中的蛋白聚糖含量。

如图3C所示，在软骨缺陷模型动物中的UCB-MSC和PCP(实验组12)的情况下，软骨缺陷区域中的蛋白聚糖含量是最高的。另外，证实了与软骨缺陷模型动物中UCB-MSC和PCP的组合治疗相比，在单独治疗UCB-MSC(实验组11)的情况下，软骨缺陷区域中的蛋白聚糖含量是相对高的。

实施例3-1-4：免疫荧光染色分析

通过对实施例3-1-3中提取的软骨缺陷区域进行实施例1-4的方法，进行针对2型胶原蛋白的免疫染色(图3D)。

图3D是显示进行免疫荧光染色的结果的荧光显微照片，进行免疫荧光染色是用于分析软骨缺陷模型动物中以UCB-MSC和软骨分化诱导剂组合治疗的软骨缺陷区域中的2型胶原蛋白的表达水平。

如图3D所示，在软骨缺陷模型动物中的UCB-MSC和PCP的组合治疗(实验组12)的情况下，软骨缺陷区域中的2型胶原蛋白的表达水平是最高的。另外，证实了与软骨缺陷模型动物中UCB-MSC和HA的组合治疗(实验组13)相比，在单独治疗UCB-MSC(实验组11)的情况下，软骨缺陷区域中的2型胶原蛋白的表达水平是相对高的。

实施例3-1-5：爱茜蓝染色分析

通过对实施例3-1-3中提取的软骨缺陷区域进行实施例1-2的方法，进行爱茜蓝染色以确认糖胺聚糖水平(图3E)。

图3E是显示进行爱茜蓝染色的结果的图，进行爱茜蓝染色是用于分析软骨缺陷模型动物中以UCB-MSC和软骨分化诱导剂组合治疗的软骨缺陷区域中的糖胺聚糖水平。

如图3E所示，证实了在软骨缺陷模型动物中的UCB-MSC和PCP组合治疗(实验组12)的情况下，软骨缺陷区域中的糖胺聚糖水平是最高的，和甚至在单独治疗UCB-MSC(实验组11)的情况下，糖胺聚糖水平类似于实验组12的糖胺聚糖水平。

同时，在软骨缺陷模型动物中的UCB-MSC和HA组合治疗(实验组13)的情况下，软骨缺陷区域中的糖胺聚糖水平类似于对照组的糖胺聚糖水平。

在实施例3-1-1至3-1-5的结果中，发现在软骨缺陷模型动物中，UCB-MSC和PCP的组合治疗展现了有效治疗软骨损伤的效果，而UCB-MSC和HA的组合治疗未显著地影响软骨损伤治疗。

实施例3-2：利用骨关节炎模型动物的分析

实施例3-2-1：骨关节炎模型动物的制备

对雄性新西兰白色兔子进行全身麻醉，切割膝关节的内侧皮肤，切割筋膜和关节囊，然后向外弯曲膝盖骨以暴露前十字韧带。用手术刀片完全切开前十字韧带和半月板韧带的内侧实质，并缝合关节囊。在手术之后，以与之前相同的方式开具抗生素和镇痛药的处方，然后骨关节炎模型(ACLT-OA)动物被制备。

实施例3-2-2：PCP和干细胞对骨关节炎模型动物的治疗效果

饲养实施例3-2-1中制备的骨关节炎模型动物达8周，然后进行X射线检查以确认骨关节炎的发生。大约地，通过全身麻醉将右膝关节矫正至头尾向(CC)视图，并且通过X射线(Genoray)拍摄放射照片。结果，将窄的关节空间(关节间隙，joint space)和内侧胫骨处的骨变形评分(KL等级；Kellgren-Lawrence评分系统)以评价骨关节炎的进展程度。

具有确定的骨关节炎等级的动物的关节腔被给予作为治疗性候选材料的以下：用PBS治疗的阳性对照组(PC)、用PBS稀释的PCP(实验组21)、UCB-MSC(实验组22)、或UCB-MSC/PCP(实验组23)，量为每只兔子0.2mL，在3、5、和7周通过X射线拍摄，并评分(KL等级)，并因此评价骨关节炎的进展程度(图4A)。此时，未引起骨关节炎的动物被用作阴性对照组(NC)。

如图4A所示，在阳性对照组(PC)中，KL评分随时间被维持在恒定水平(3周：4.00、5周：3.67、和7周：4.00)，而在仅PCP给予组(实验组21；3周：3.25、5周：3.50、和7周：3.63)中、在仅UCB-MSC给予组(实验组22；3周：5.71、5周：3.50、和7周：3.38)中、和UCB-MSC/PCP组合给予组(实验组23；3周：2.75、5周：2.88、和7周：3.13)中，骨关节炎存在改善倾向。

具体地，证实了在UCB-MSC/PCP组合给予组中，骨关节炎的改善效果比仅UCB-MSC给予组的改善效果更为增加。

实施例3-2-3：行为评价

在实施例3-2-2中制备的骨关节炎的诱导之后立即和在治疗治疗性候选材料3、5、或7周后，允许每个模型动物在广阔空间中自由行走以进行根据关节炎诱导的行为测试。结果，对行走、步态、姿势、承重(weight bearing)、和活力(activity)进行评分，并且与KL等级一起综合评价关节炎的进展程度(图4B)。

如图4B所示，证实了在未治疗组(阳性对照组)中，骨关节炎症状随时间持续地恶化(3周-10.22；5周-10.22；7周-11.22)，而在仅PCP治疗组(实验组21；3周-8.87；5周-9.29；7周-10.26)、仅UCB-MSC治疗组(实验组22；3周-8.71；5周-9.21；7周-9.55)、和UCB-MSC/PCP组合治疗组(实验组23；3周-7.96；5周-8.17；7周-8.92)中，骨关节炎症状被改善。

具体地，证实了在UCB-MSC/PCP组合治疗组(实验组23)中，骨关节炎的改善效果比仅PCP治疗组(实验组21)或仅UCB-MSC治疗组(实验组22)的改善效果更好。

实施例3-2-4：细胞因子水平的评价

如同实施例3-2-2，自给予每种治疗性候选材料8周后，麻醉兔子，然后将生理盐水(0.1mL)注射到右关节炎诱导部位的关节腔中，并且通过两次重复来收集关节腔液。在37℃下用胶原蛋白酶(400μg/mL)和透明质酸酶(40U/mL)处理关节腔液10分钟，然后通过TNF-α的酶联免疫吸附测定(ELISA)(R&D system)量化TNF-α——其是炎性细胞因子——的水平(图4C)。

图4C是显示比较骨关节炎模型动物中根据UCB-MSC和PCP的单独治疗或组合治疗的关节腔液中TNF-α水平的结果的图。

如图4C所示，证实了与非骨关节炎诱导的动物(NC)相比，骨关节炎诱导的模型动物(PC)的关节腔液中TNF-α水平显著增加，但随着给予PCP(实验组21)、UCB-MSC(实验组22)、或UCB-MSC/PCP(实验组23)，关节腔液中的TNF-α的水平是降低的。

具体地，证实了在UCB-MSC/PCP组合治疗组(实验组23)中，关节腔液中的TNF-α水平与仅PCP治疗组(实验组21)或仅UCB-MSC治疗组(实验组22)相比是减少的。

实施例3-2-5：组织学评价

如实施例3-2-2中所示，自给予每种治疗性候选材料8周后，处死模型动物并且通过内侧关节入路方法(medial articular approach method)暴露膝关节，并且在注意避免软骨损伤的同时除去膝关节周围的软组织，并提取包括关节炎诱导区域的股骨踝上部(踝上，supracondylar)。接下来，对膝关节的股骨髁和胫骨坪拍照(图4D)，并且综合定量分析关节表面侵蚀、表面变化、骨赘、和股骨肥大(图4E)。

图4D是成像骨关节炎模型动物中根据UCB-MSC和PCP的单独治疗或组合治疗的膝关节的股骨髁和胫骨坪区域的照片，以及图4E是显示骨关节炎模型动物中根据UCB-MSC和PCP的单独治疗或组合治疗的关节表面侵蚀、表面变化、骨赘、和股骨肥大水平的综合定量分析结果的图。

如图4D所示，证实了在阳性对照组和仅PCP治疗组(实验组21)中，显示了股骨的严重损伤和侵蚀以及骨赘，而在仅UCB-MSC治疗组(实验组22)和UCB-MSC/PCP组合治疗组(实验组23)中，显示了股骨的严重损伤和骨赘。

如图4E所示，作为量化股骨的损伤水平和骨赘水平的结果，证实了对照组的损伤度为14.00±1.67，实验组21的损伤度为13.00±1.26，实验组22的损伤度为12.00±0.72，以及实验组23的损伤度为10.00±0.92。

作为实施例3-2-1至3-2-5的结果，证实了在骨关节炎模型动物中，可通过单独治疗PCP和UCB-MSC来改善骨关节炎，并且仅UCB-MSC治疗比仅PCP治疗具有更好的骨关节炎改善效果。然而，证实了与PCP和UCB-MSC单独治疗相比，在PCP和UCB-MSC组合治疗的情况下，骨关节炎治疗效果是相对高的。

结果，为了治疗软骨损伤的动物中的损伤的软骨，HA——作为一种软骨分化诱导剂——未显示任何效果，但是PCP也单独地显示了治疗效果；进一步，优选组合使用PCP和干细胞，而不是单独地使用PCP。

如上所述，本领域技术人员将能够理解，本发明可在不改变其技术精神或必要特征的情况下容易地以其它具体形式实施。因此，应理解，上述实施方式是在所有方面示例而非限制。本发明的范围由所附权利要求而非详细的说明书表示，并且应解释为权利要求的含义和范围以及衍生自其等同物的所有变化或修改形式均包含在本发明的范围内。

<110> 康干细胞生物技术有限公司

<120> 包括无软骨细胞破碎物和干细胞的用于促进软骨分化的复合物及其应用

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<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

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Claims

1.包括干细胞或其培养物和无软骨细胞破碎物的用于促进软骨分化的复合物。

2.权利要求1所述的用于促进软骨分化的复合物，其中所述干细胞包括成体干细胞、多能干细胞、诱导多能干细胞、脐带血间充质干细胞、胚胎干细胞、胎盘干细胞、或自体干细胞。

3.权利要求1所述的用于促进软骨分化的复合物，其中所述无软骨细胞破碎物选自通过机械地破碎其中除去所述软骨细胞的软骨基质、重复冷冻/解冻其中除去所述软骨细胞的软骨基质、或利用超声波处理其中除去所述软骨细胞的软骨基质而获得的破碎物；通过用酶处理其中除去所述软骨细胞的软骨基质而获得的酶水解物；通过利用碱性或酸性试剂处理其中除去所述软骨细胞的软骨基质、或利用表面活性剂处理其中除去所述软骨细胞的软骨基质而获得的反应产物；以及其组合。

4.权利要求1所述的用于促进软骨分化的复合物，其中所述无软骨细胞破碎物是猪软骨粉(PCP)，所述猪软骨粉(PCP)通过生成其中从猪的软骨中除去所述软骨细胞的软骨基质，然后进行冷冻干燥和破碎过程而获得。

5.权利要求1所述的用于促进软骨分化的复合物，其进一步包括：

能够促进所述干细胞的软骨分化的用于促进软骨分化的剂。

6.权利要求5所述的用于促进软骨分化的复合物，其中所述用于促进软骨分化的剂是骨形态发生蛋白6(BMP 6)。

7.用于制备软骨或软骨细胞的方法，其包括在无软骨细胞破碎物存在下由干细胞分化软骨细胞。

8.权利要求7所述的用于制备软骨或软骨细胞的方法，其进一步包括：

在利用所述无软骨细胞破碎物处理所述干细胞之前、期间、或之后处理用于促进软骨分化的剂。

9.软骨或软骨细胞，其在猪软骨粉的存在下由脐带血源干细胞分化。

10.用于预防或治疗关节病的药物组合物，其包括权利要求1至6中任一项所述的用于促进软骨分化的复合物。

11.权利要求10所述的用于预防或治疗关节病的药物组合物，其中所述关节病包括多关节病、髋关节变性病、膝关节病、或脊椎关节病。

12.用于预防或治疗关节病的方法，其包括向可能发展关节病或发展了关节病的受试者给予权利要求1至6中任一项所述的用于促进软骨分化的复合物或包含其的药物组合物。

13.权利要求12所述的用于预防或治疗关节病的方法，其中包括在所述用于促进软骨分化的复合物中的所述干细胞或其培养物和无软骨细胞破碎物被同时地或相继地给予。

14.权利要求12所述的用于预防或治疗关节病的方法，其进一步包括：

在所述复合物的给予之前、期间、或之后处理用于促进软骨分化的剂。

15.权利要求12所述的用于预防或治疗关节病的方法，其中将所述用于促进软骨分化的复合物或所述药物组合物向包括所述干细胞的软骨组织给予。

16.权利要求12所述的用于预防或治疗关节病的方法，其进一步包括：

在给予所述用于促进软骨分化的复合物或所述药物组合物之前、期间、或之后处理用于促进软骨分化的剂。

17.用于诱导软骨细胞分化的组合物，其包括在无软骨细胞破碎物存在下由干细胞分化的软骨或软骨细胞。

18.权利要求17所述的用于诱导软骨细胞分化的组合物，其中将所述软骨或软骨细胞与所述干细胞共培养以将所述干细胞分化成所述软骨细胞。

19.权利要求17所述的用于诱导软骨细胞分化的组合物，其中所述软骨或软骨细胞在猪软骨粉的存在下通过分化脐带血源干细胞被制备。

20.利用软骨细胞制备软骨细胞的方法，其包括：

(a)在无软骨细胞破碎物存在下由第一干细胞分化第一软骨细胞；和

(b)将第二干细胞与分化的所述第一软骨细胞共培养，并且将共培养的所述第二干细胞分化成第二软骨细胞。

21.权利要求20所述的制备软骨细胞的方法，其中在猪软骨粉的存在下通过分化脐带血源干细胞(第一干细胞)来进行步骤(a)。