KR101360162B1 - 반월상 연골 이식을 위한 연골세포의 증식방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 이식을 위한 효과적인 연골세포 증식(확장) 방법 및 이를 이용한이식용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 콜라게네이즈를 처리한 연골절편을 신선 동결된 반월상 연골내 삽입하여 이식하거나 배양하여 이식하면 중심부 및 주변부에서 효과적으로 연골세포가 증식하므로, 연골 이식을 요하는 연골 질환 치료에 매우 유용하다.

Description

반월상 연골 이식을 위한 연골세포의 증식방법{A Method for Proliferating Chondrocytes For Meniscus Transplantation}

본 발명은 반월상 연골 이식을 위한 연골세포의 증식 방법 및 이러한 연골세포 집단을 함유하는 이식용 조성물에 관한 것이다.

반월상 연골의 손상으로 반월상 연골 전절제술이나 아전절제술을 시행 받은 슬관절은 향후 퇴행성 관절염이 진행될 가능성이 많다고 알려져 있으며, 1989년 Milachowski 등이 최초로 반월상 연골이식술을 시행한 이후에 여러 저자들에 의해 시행되고 있으며, 경험의 축척과 기술적인 발전이 있어왔다.

그러나, Rodeo는 반월상 연골 이식술 후 기존의 관절 연골 손상은 그대로 유지되거나 오히려 더 악화되었다고 하였고, Rath 등은 이식된 반월상 연골 자체가 정상에 비해 생역학적으로 부피가 감소하거나 변성이 빨리 되는 경향이 있으며, 퇴행성 변화에 대한 효과는 장기적 관점에서 더 관찰할 필요가 있다 하였다. Verdonk 등은 MRI 소견상 이식된 반월상 연골의 변연부의 탈구 및 아탈구가 많이 발생한다고 하였고, Rodeo는 이러한 아탈구와 탈구가 관절연골의 손상과 관련이 있으며, 임상적인 결과를 나쁘게 한다고 하였다.

Stollsteimer 등은 1년 내지 5년간의 MRI 추적관찰에서 반월상 연골이 63%(31%-100%)정도로 위축되어 있다고 하였고, Noyes 등은 28%는 실패였으며 30%는 변형되었다고 하면서, 단기 추시로는 통증이 줄어들었지만, 장기적으로는 어떤 결과일지 알 수 없다고 하였다. Verdonk 등은 평균 7.2년 관찰하였을 때, 내측 반월상 연골의 28%와 외측 반월상 연골의 16%가 실패하였다고 하였고, 생존율 분석에서는 약 10년 후 70%의 환자에서 도움이 되었다고 하였다. 그러나, 동시에 만일 이 시술을 받지 않은 사람들과의 비교하였을 때 얼마나 더 우위에 있을지 객관적인 연구가 필요하다고 언급하였다.

이와 같이, 이식된 반월상 연골에 자가 연골세포가 성공적으로 자라 들어가서 생존한다는 확실한 증거는 없으며 자가 연골세포가 성공적으로 자라 들어가기 위해서 어떻게 해야 하는지도 알려져 있지 않다.

이상의 선행연구자들의 결과를 종합해 볼 때, 이식된 반월상 연골은 수술적으로 단단히 봉합하였음에도 불구하고, 재파열, 아탈구, 탈구, 위축 등이 많이 발생하고 있으며, 퇴행성 변화를 예방함에 있어서도 확실한 방법이라고 말할 수가 없는 것으로 보인다.

세포적 차원에서의 연구도 제한적으로 시행되었다.

Rath 등은 22예를 2-8년 추시 관찰 중 8예(36%)가 파열이 발생하여 6 예는 부분 절제술을, 2예는 전절제술이 필요하였다고 하였다. 그리고 이식된 반월상 연골은 정상에 비해 적은 수의 세포가 있는데, 이것이 파열의 원인중의 하나일 것으로 생각하였다. Arnoczky 등은 개를 이용한 동물실험에서 이식된 반월상연골의 변연부에서 세포가 자라 들어가게 되는데, 가운데 부분으로 갈수록 세포의 수가 적음을 관찰하였다. Rodeo 등은 실패한 반월상 연골의 조직학적 소견에서 반월상 연골에 세포의 숫자가 적으면서 특히 변연부보다는 중심부일수록 세포의 수가 적었고, 세포는 섬유아세포, 섬유연골세포, 활막세포 등 다양한 세포로 구성되어 있었다라고 하였다.

이를 종합해 볼 때, 이식된 반월상 연골의 실패의 원인 중 하나로 자가 연골세포가 충분히 침식하여 들어가서 생존하지 못함으로써 적합한 기질을 만들어 내지 못하기 때문임을 가정할 수 있다.

이에, 본 발명자들은 이식될 동결 건조된 반월상 연골에 연골조각을 콜라게네이즈를 처리한 상태로 주입하면, 동결연골 내부에 둥근 모양의 연골 덩어리에 국한된 세포의 증식상이 보이며, 시간이 경과할 수록 주변부 즉 세포가 없었던 부분인 동결건조된 반월상 연골에 살아 있는 세포의 밀도가 높아짐을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 주된 목적은 이식을 위해 반월상 연골내에서의 연골세포 증식방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 방법에 의해 증식된 연골세포 집단 및 이를 유효성분으로 함유하는 이식용 조성물을 제공하는데 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 반월상 연골내 이식에 적합한 효과적인 연골세포 처리방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 콜라게네이즈 처리된 연골절편을 반월상 연골 내에 삽입하여 배양하는 단계를 포함하는 연골세포 증식방법을 제공한다.

상기 콜라게네이즈는 종류와 농도에 관계없이 적절히 사용될 수 있고, 예를 들어 3 ~ 5% 농도일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 4% 농도로 사용하였다.

또한, 연골절편은 비제한적으로 원기둥, 사각기둥, 삼각기둥 등을 포함하는 기둥 형상으로 이루어질 수 있다.

한편, 상기 연골절편은 비특이적 콜라게네이즈 이외에도, 각종의 특이적 콜라게네이즈(type II 콜라게네이즈, type I 콜라게네이즈 등)를 사용할 수도 있으며, 반월상 연골의 세포외 기질에 작용하는 각종의 효소, 예를 들어 히알류로네이즈, 테라타네이즈, 콘드로이티네이즈 등으로 처리될 수도 있다.

본 발명은 콜라게네이즈 처리된 연골절편 또는 상기 콜라게네이즈 처리된 연골절편이 삽입된 반월상 연골을 포함하는 이식용 조성물을 제공한다.

이 때, 이식용으로 사용되는 상기 반월상 연골은 제한은 없으나, 신선 동결된 것을 사용하는 것이 바람직하다.

뿐만 아니라, 이를 배양하여 사용할 수도 있다. 즉, 배양된, 콜라게네이즈 처리된 연골절편이 삽입된 반월상 연골을 포함하는 이식용 조성물을 제공할 수도 있다.

상기 배양은 통상 이식용 세포 배양에 적합한 성분들을 당해 분야의 통상의 기술자의 지식에 근거하여 적절히 선택하여 첨가하여 수행할 수 있다. 배양조건, 배양기간 역시 크게 제한은 없다.

이와 같이, 본 발명은 콜라게네이즈 처리한 반월상 연골 조각을 신선동결된 반월상 연골편에 삽입하여, 또는 이를 배양하여 연골 이식이 필요한 환자에게 삽입하는 형태로 이용할 수 있다. 이를 통해 이식된 반월상 연골에 자가 연골세포가 성공적으로 자라도록(증식토록) 하여 이식의 효과를 극대화할 수 있다.

본 발명의 방법은 연골 세포를 효과적으로 증폭시킬 수 있을 뿐만 아니라 이를 이용하여 반월상 연골내 연골세포의 이식 성공율을 크게 높일 수 있어, 연골질환을 위한 세포치료에 응용할 수 있다. 따라서, 본 발명은 연골세포 증식을 통해 반월상 연골이 결손된 무릎에 반월상 연골 이식술의 성공 가능성을 높일 것으로 기대된다.

도 1은 본 발명의 반월상 연골에 연골절편을 삽입하는 공정의 모식도를 나타낸 그림이다.
도 2 내지 도 4는 1주~3주의 실험 결과를 나타낸 현미경 사진이다.
도 5는 3주째 실험군 및 대조군의 결과를 나타낸 현미경 사진이다.
도 6은 본 발명의 실험과정 일 례의 전체적인 모식도를 나타낸 그림이다.

본 발명에서 사용되는 용어에 대한 정의는 이하와 같다.

본 발명에서 "반월상 연골(Meniscus)"은 대퇴골과 경골의 관절면 사이에 위치하며, 슬관절의 기능을 유지하는 데 매우 중요한 구조물로 압력의 슬관절 통과를 돕고, 접촉 면적을 증가시켜 관절 연골의 접촉 스트레스를 감소시키고, 충격을흡수하며, 관절의 안정성에도 기여하고, 관절 연골의 윤활작용과 연골 세포의 영양 공급에 관여한다

"증식(proliferation)"이라는 용어는 세포가 분열되어 동질의 것이 불어나는 것으로서 보통 다세포생물의 체내에서 세포수가 증가되어 가는 것을 말한다. 세포수가 증식(증폭)되어 어느 시기에 이르면, 형질이 변화(분화)되어 가는 것과 동시에 제어되고 있는 것이 보통이다. 체내에서 세포가 증가되어 가는 것과, 또 세포 내에서 세포질이 신생(新生)되어 가는 경우에는 생장으로 구별하는 경우가 많다. 그러나 생물학적으로 세포수가 증가된다는 점에서 보면, 다세포생물의 발생기에서 분화가 일어나지 않는 시기는 증식으로 보는 것이 정당하다.

"연골 질환"이란, 연골, 연골 조직 및/또는 관절조직(활막, 관절포, 연골하골 등)이 기계적 자극이나 염증 반응에 의해 상해됨으로써 발생하는 질환을 말한다.

"연골 질환 치료"란, 기계적 자극이나 염증 반응에 의해 상해된 조직의 각종 병의 용태를 완화시키고, 개선 및/또는 치유하는 것을 말한다. 예를 들면, 변형성 관절증에 있어서는 관절연골의 마모, 연골 조직의 변성, 활막의 염증, 염증에 수반되는 동통 등의 병의 용태가 복합적으로 발생한다. 한편, 견관절 주위염에서는 활막이나 관절포의 염증과 그것에 수반되는 동통이 중심이 되어, 연골의 마모나 변성은 인정되지 않는 경우도 있다. 연골 질환은 복합적인 병의 용태를 나타내는 질환이고, 그 치료는 연골을 마모로부터 보호하는 효과, 마모나 염증에 의한 연골의 변성 변화를 억제하는 효과, 연골 손상부를 수복시키는 효과,염증이나 동통을 억제하는 효과 등, 복합적인 효과를 겸비할 것이 요구된다.

"치료"는 (a) 질환 또는 질병의 발전의 억제; (b) 질환 또는 질병의 경감; 및 (c) 질환 또는 질환의 제거를 의미한다. 따라서, 본 명세서에서 용어 “치료학적 유효량”은 상기한 약리학적 효과를 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.

치료 목적을 위한 "포유류"는 인간, 가축 및 농장 가축 및 동물원, 스포츠 혹은 개, 말, 고양이, 소, 원숭이 등의 애완용 동물을 포함하여 포유류로 분류되는 어떠한 동물도 가리킨다. 바람직하게는 상기 포유류는 인간이다.

"배지"는 당, 아미노산, 각종 영양물질, 혈청, 성장인자, 무기질 등의 세포의 성장 및 증식 등에 필수적인 요소를 포함하는 생체 외에서 세포 등의 성장 및 증식을 위한 혼합물을 말한다. 특히, 본 발명의 배지는 연골세포의 증식(확장)을 위한 배지이다.

'기본배지'는 세포가 살아가기 위해 필요한 필수적인 당, 아미노산, 물 등이 포함된 혼합물로서, 혈청, 영양 물질 및 각종 성장인자를 제외한 혼합물이다. 본 발명의 기본배지는 인위적으로 합성하여 제조하여 사용하거나 상업적으로 제조된 배지를 사용할 수 있다. 상업적으로 제조된 배지는 예를 들면,DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), EDM(Endothelial differentiation medium), MEM(Minimal Essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI 1640, F-10, F-12, α-MEM(α-Minimal Essential Medium), G-MEM(Glasgow's Minimal Essential Medium) 및 Iscove's Modified Dulbecco's Medium 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 일 구체예에서는 DMEM를 사용하였다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 반월상 연골 이식을 위한 것이다.

무릎의 반월상 연골은 섬유연골로서 주로 타입 I 콜라겐이 풍부하고, 변연부(peripheral)로 갈수록 섬유세포와 비슷한 양상을 보이면서, 변연부의 3-5mm에 해당하는 부분만 혈관이 있고, 중심부(central)로 갈수록 혈관이 없다.

반월상 연골은 체중 전달, 외력의 분산, 관절 연골의 보호, 관절의 안정성 및윤활 기능 등의 중요한 기능을 가지고 있고, 직립시 슬관절에 부하되는 체중의 약 40-60%는 반월상 연골을 통해서 전달되는 것으로 알려져 있다. 대퇴골 및 경골의 접촉 면을 증가시켜 관절 면에 가해지는 스트레스를 분산 감소시켜서 관절연골을 보호하고, 활액을 관절에 골고루 분산시켜 윤활 기능을 촉진시키고, 관절 운동시 활액막이 관절 사이에 키이는 것을 방지하기도 한다.

반월상 연골의 파열 즉 찢어짐은 다양한 형태로 나타나며, 잠김(locking), 관절내 부종(effusion) 등의 증상을 보이면서 통증을 유발하게 된다. 파열된 부분을 제거하는 것으로 파열이 계속 진행하는 것을 막아주는 것이 주된 치유이며, 이는 반월상 연골은 봉합(suture) 등의 방법을 하더라도 세포외 기질이 결합하여 붙지 않기 때문이다. 간혹 반월상 연골 자체가 건전하며, 변형이 적고, 파열 부위가 변연부의 경우에는 봉합의 방법으로 치유하기도 하나, 성공적인 경우는 상대적으로 제한적이다.

이에 파열의 범위가 크고, 연골의 상태가 불량한 경우에는 아전절제술이나 전절제술로 거의 전범위에 해당하는 반월상연골을 제거해야만, 잠김과 재발성 관절 부종, 통증 등을 막을 수 있으나 장기적으로는 퇴행성 관절염이 생기는 것을 피할 수는 없다.

반월상 연골 손상은 비가역적인 과정으로 반월상 연골은 희박한 혈관분포로 인하여 재생과 치유가 매우 제한적이다. 치유되지 않은 반월상 연골의 파열은 파열된 조각 또는 충격 흡수재로서의 역할 부재로 인하여 관절 연골의 손상으로 이어지게 되어 결국 퇴행성 관절염의 발생으로 이어진다는 것이 정설이다. 하지만 다양한 시도를 이용한 동물 실험에서 아직 만족할 만한 반월상 연골의 재생과 관절 연골 보호 효과를 증명하지 못하고 있다.

특히, 이식된 반월상 연골은 신선 동결되는 과정에서 이식될 당시 살아 있는 세포가 거의 없다는 것이 널리 알려져 있으며, 자기 몸 즉 변연부에서 일부의 연골세포나 그 전구세포 또는 다른 세포들이 침식하여 동종 이식편에 생존할 것을 기대하게 되는데, 일반적으로 성인에서는 연골세포 자체가 생체 내에서 증식이 거의 없는 세포로 알려져 있어, 자기의 연골세포가 이식된 동종 이식편의 변연부로부터 점차 침식되어 생존하리라 기대하기가 어렵다고 생각된다. 또한 반월상 연골 자체가 매우 조밀한 조직이고, 혈관이 없는 조직이므로 세포가 자라 들어갈 수 있는 다른 경로가 부족하다.

그러므로 이식된 반월상 연골이 과연 생체내에서 살아 있는 것인지, 즉 살아있는 세포가 있을 것인지 의문이 있다. 또한 생존하고 있다고 할 때, 이식된 반월상 연골 내부의 세포가 과연 연골 세포일지 혹은 다른 세포 즉 섬유 세포 등 연골 세포보다 반월상 연골에 적합하지 않은 다른 세포일 가능성도 있다.

따라서, 아전절제술과 전절제술을 시행한 경우에는 타인의 반월상 연골을 시선 동결 등의 방법으로 보관하였다가 이식하는 방법이 사용되어 오고 있으며, 앞에서 언급한 바와 같이 성공여부는 불확실하며 연구와 개선의 여지를 남기고 있다.

여러 연구자들이 반복적으로 지적하는 바와 같이 반월상 연골 이식술에서 이식된 부분은 세포가 없는 부분으로 연골세포의 특징이 자라서 들어가는(infilteration)하는 성격이 약하므로, 이렇게 이식된 반월상 연골은 생체내에서 살아 있는 조직화되기가 어렵다.

이에, 본 발명자들은 살아있는 연골절편에 콜라게네이즈 처리를 하여 신선동결된 반월상 연골에 삽입한 경우 원래의 연골절편에서도 세포가 증식하며, 신선동결되어 있어서 일반적으로는 세포가 관찰될 수 없는 주변의 연골 조직내에도 군집을 이루는 세포가 증식함을 발견하였고, 이를 이용하여 동종 반월상 연골이식술의 성공률을 높일 수 있게 하였다.

본 발명은 일 관점에서, 콜라게네이즈 처리된 연골절편을 반월상 연골 내에서 배양하는 단계를 포함하는 연골세포 증식방법에 관한 것이다.

본 발명은 연골절편에 "콜라게네이즈(collagenase)" 처리를 하여 반월상 연골에 삽입함으로써 반월상 연골에서 연골세포를 효과적으로 증식시키는 것을 주요한 특징으로 한다.

상기 연골절편은 당업계에 공지된 방법에 따라 연골조직으로부터 분리할 수 있으며, 필요에 따라 적당한 크기로 잘라서 사용할 수 있다. 예를 들어, 사각기둥, 삼각기둥, 원기둥 가닥 형상(국수가락 모양) 등으로 잘라 사용할 수 있다. 이처럼반월상 연골 내부에 삽입할 수 있도록 가느다란 기둥 형상으로 잘라 사용할 수 있지만 형상에 제한은 없다. 본 발명의 일 실시예에서는 반월상 연골조각을 2*2*10mm 절편으로 만들어 사용하였다.

그리고, 상기 연골절편에 콜라게네이즈(collagenase)를 처리한다.

콜라게네이즈(collagenase)는 천연 콜라겐의 나선 영역을 작은 조각으로 분해시키는 메탈로프로테인 분해효소이다. 바람직한 분할은 서열 -Pro-Xaa-Gly-Pro- 중의 -Gly 이다. 2 개의 계열로 그룹화된 6개의 주요 형태가 면역학적으로 교차 반응하나, 상이한 서열 및 상이한 특이성을 갖는 클로스트리디움 히스톨리티쿰 (Clostridium histolyticum), 바실러스 세레우스 (Bacilluscereus), 엠페도박테르 콜라게노리티쿰 (Empedobacter collagenolyticum), 슈도모나스 마리노글루티노사(Pseudomonas marinoglutinosa), 및 비브리오 (Vibrio) 및 스트렙토마이세스 (Streptomyces) 의 종으로부터 단리할 수 있다.

본 발명에서 사용될 수 있는 콜라게네이즈의 종류에는 특별한 제한이 없다. 바람직하게는 콜라겐의 여러 종류에 상관없이 작용하는 비특이적 콜라게네이즈(non-specific collagenase)를 사용할 수 있지만, 특정의 콜라겐 종류에만 작용하는 콜라게네이즈를 당해 분야의 통상의 지식을 가진 자가 적절히 선택하여 사용할 수도 있다. 즉, 본 발명에서는 비특이적 콜라게네이즈 이외에도, 각종의 특이적 콜라게네이즈(type II 콜라게네이즈, type I 콜라게네이즈 등을 사용할 수 있다.

또한, 콜라게네이즈를 적용하는 농도와 시간 또한 당해 분야의 통상의 지식을 가진 자가 적절히 선택할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 상기 콜라게네이즈는 4% 농도로 처리하여 사용하였다.

한편, 본 발명에서는 상기 콜라게네이즈 외에도, 반월상 연골의 세포외 기질의 다른 성분, 즉 콜라겐 외의 다른 성분, 예를 들어 히알류론산, 황산 케라틴, 황산 콘드로이틴 등 주성분 및 이들을 연결해주는 다양한 결합단백질을 분해하는 효소도 함께 추가로 사용할 수 있다.

세포외 기질이 완성된 경우 연골세포의 증식이 제한되므로, 연골 기질의 일부분을 적절한 효소로 분해함으로써 연골세포의 증식을 도모하는 것이 본 발명의 주요한 특징인 바, 콜라게네이즈 뿐만 아니라 반월상 연골의 세포외 기질의 다른 성분을 분해할 수 있는 다른 효소도 함께 사용될 수 있는 것이다. 반월상 연골의 세포외 기질에 작용하는 각종의 효소, 예를 들어 히알류로네이즈, 테라타네이즈, 콘드로이티네이즈 등을 사용할 수 있다.

본 발명에서는 상기 콜라게네이즈 처리된 연골절편을 반월상 연골의 내부에 삽입한다. 이러한 공정을 도 1에 간략한 모식도로 도시하였다.

도 1을 통해 알 수 있는 바와 같이, 상기 반월상 연골의 내부에 콜라게네이즈 처리된 연골절편을 삽입하기 위해 철사 등을 이용하여 구멍을 앞뒤로 뚫는다. 예를 들어, 2~4mm두께의 스테인레스 철사 등을 이용하여 뚫은 구멍으로 상기 콜라게네이즈 처리된 연골절편을 끼워넣는다. 본 발명의 일 실시예에서는 3mm 두께의 철사를 이용하여 구멍을 뚫어 연골절편을 삽입하였다. 그리고, 상기 연골절편이 흘러나오지 않도록 실로 봉합하는 것이 좋다.

이처럼, 콜라게네이즈 처리된 연골절편을 신선 동결된 반월상 연골 내에 삽입하여 배양하면 반월상 연골 중심부 연골절편에서도 세포가 증식하며, 주변부의 신선 동결된 반원상 연골내부에도 군집을 이루는 세포가 증식한다.

또한, 본 발명은 다른 관점에서 반월상 연골 이식용 조성물 및 이의 사용방법에 관한 것이다.

상기 반월상 연골 조성물은 콜라게네이즈 처리된 연골절편 또는 이를 내부에 함유하는 이식용 반월상 연골을 포함할 수 있다. 즉, 이식이 필요한 대상의 반월상 연골에 직접적으로 콜라게네이즈 처리된 연골절편을 삽입할 수도 있고, 체외에서 이식용 반월상 연골 내부에 상기 연골절편을 삽입하여 제공하거나, 이를 배양ㆍ증식시켜 이식에 제공할 수도 있다.

이식용 반월상 연골은 신선 동결 보존 처리된 것, 동결 건조된 것, 방사선 및 약품 처리된 것 등 이식에 적합한 것이라면 어느 것이든 사용 가능하나, 바람직하게는 신선 동결보존된 것을 사용한다.

신선 동결(fresh frozen)된 경우에는 내부에 세포의 생존 가능성이 거의 없으며, 이물반응이 거의 없이 타인에게 삽입될 수 있으므로, 동종 이식에 사용되기에 유리하다. 자신의 연골 조각을 일부 콜라게네이즈 또는 기타 효소 처리하게 된 경우에는 자신의 연골 세포가 증식가능하게 되어, 이 신선 동결된 동종의 즉, 타인의 연골 조직내에도 침투하게 되어 이식된 동종 반월 연골이 자신의 세포로 채워져서 활성을 지닐 수 있게 되는 것이다.

신선 동결(fresh frozen) 보존에 사용되는 동결보존액은 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 1~20중량%의 디메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide, DMSO) 및 80~99중량%의 인간혈청 알부민 또는 우태아 혈청을 포함할 수 있다. 가장 바람직하게는 동결보존액은 10중량%의 디메틸설폭사이드 및 90중량%의 인간혈청 알부민을 포함할 수 있다. DMSO의 경우 상기 수치범위 미만에서는 동결보존 효과를 발휘하기 힘들고, 상기 수치범위 초과에서는 DMSO의 독성으로 세포가 사멸할 수 있기 때문이다. 또한 상기 인간혈청 알부민을 사용하는 것은 수용성 성분이 포함된 배양액을 사용하는 경우 수용성 성분이 다량 함유될 수 있어, 조직이나 세포의 동결시 악영향을 미칠 수 있기 때문이다. 다만 상기와 같은 조성을 갖는 동결보존액이라면, 자가혈청 및 소혈청 알부민으로 구성된 그룹에서 선택된 하나 이상의 영양성분을 추가적으로 포함할 수 있다.

또한 신선 동결보존된 반월상 연골을 해동하여 이식하는 경우, 동결보존하지 않은 경우보다 이식 부위의 부피가 더욱 잘 유지될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 -70℃에서 동결 보존한지 약 6개월된 반월상 연골을 해동하여 사용하였다.

이처럼, 반월상 연골을 신선 동결보존한 다음 이를 해동하여 이식하더라도 생물학적 활성이 그대로 유지되어, 이식될 동결 건조된 반월상 연골에 연골조각을 적절히 처리한 상태로 주입하면, 연골세포가 생존가능하고, 동결 건조된 반월상 연골에 콜라게네이즈 처리된 연골절편을 제공하여 연골세포가 효과적으로 증식시킴으로써 동종 반월상 연골이식술의 성공률을 높일 수 있다.

한편, 선택적으로, 상기 연골절편이 삽입된 반월상 연골을 체외에서 배양하여 투여할 수 있다.

이 때 사용하는 기본배지는 동물세포 배양용 기본배지로서, 무기염류, 아미노산, 비타민류 및/또는 보조인자를 포함하는 포유동물 세포요법용 배지로서 동물세포 배양 기술분야에서 동물세포 배양을 위해 통상적으로 사용하는 배지를 사용할 수 있다. 예를 들어, Eagles's MEM (Eagle's minimum essential medium, Eagle, H. Science 130:432(1959)), α-MEM(Stanner, C.P. et al., Nat. New Biol. 230:52(1971)), Iscove's MEM (Iscove, N. et al., J. Exp. Med.147:923(1978)), 199 배지 (Morgan et al., Proc. Soc. Exp. Bio. Med., 73:1(1950)), CMRL 1066, RPMI 1640(Moore et al., J. Amer. Med. Assoc. 199:519(1967)), F12 (Ham, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 53:288(1965)), F10 (Ham, R.G. Exp. Cell Res. 29:515(1963)), DMEM (Dulbecco's modification of Eagle's medium, Dulbecco, R. et al., Virology 8:396(1959)), DMEM과 F12의 혼합물 (Barnes, D. et al., Anal.Biochem. 102:255(1980)), Way-mouth's MB752/1 (Waymouth, C. J. Natl. Cancer Inst. 22:1003(1959)), McCoy's 5A (McCoy, T.A., et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 100:115(1959)) 및 MCDB 시리즈 (Ham, R.G.et al., In Vitro 14:11(1978)) 등이 이용될 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는 DMEM을 사용하였다.

상기 배양에 있어서, 이하 성분들을 추가적으로 포함할 수도 있다.

예를 들어, 피브린 젤(fibrin gel), 히아루론산(hyaluronic acid), 콜라겐(collagen), 키토산(chitosan), 알긴산(alginic acid), 젤라틴(gelatin) 및 덱스트란(dextran)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 추가하여 배양할 수 있고, 자가 혈소판, 필수 지방산, 인간혈청 알부민, 소혈청 알부민(bovine serum albumin) 및 자가혈청으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 영양성분을 추가하여 배양할 수도 있다. 또한, 스트렙토마이신, 페니실린, 토브라마이신, 아미카신, 겐타마이신, 네오마이신 및 암포테리신 B 등의 항생 물질, 아스피린, 비스테로이드성 해열 진통제(NSAIDs), 아세토아미노펜 등의 항염증약 등을 추가로 포함시킬 수도 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 히알루론산, FBS(fetal bovine serum), 페니실린, 스트렙토마이신을 함유한 DEME 배지에서 상기 이식용 반월상 연골을 배양하였다.

이처럼, 본 발명의 조성물은 체외에서 이식용 반월상 연골 내부에 상기 연골절편을 삽입하여 제공되거나, 이를 배양하여 이식에 제공될 수 있다.

일부 예에서, 본 발명의 조성물은 예컨대 확장된 연골세포를 지지하고, 골, 연골 및/또는 그외 연결 조직 성장을 위한 표면을 제공하기 위하여, 적절한 매트릭스와 조합하여 투여할 수 있다. 상기 매트릭스는 전통적인 매트릭스 생물질의 형태일 수 있다. 매트릭스는 발현된 단백질 및 분화된 세포 및/또는 그의 존재를 위한 적합한 환경의 느린 방출을 제공할 수 있다. 일부 예에서, 다양한 콜라겐성 및 비-콜라겐성 단백질은 상향 조절되어 확장된 내피전구세포로부터 방출되는 것으로 예상된다. 이러한 현상은 매트릭스 침착(deposition)을 증강함으로써 조직 재생을 가속화시킨다. 또한, 매트릭스 단백질은 유전자 조작된 세포에서 발현시킬 수 있으며, 이식 부위로 형질전환된 세포의 생착 및 부착을 증강시킬 수 있다.

매트릭스 재료의 선택은 생체적합성, 생분해성, 기계적 특성, 표면 외양(cosmetic appearance) 및 인터페이스 특징을 기초로 한다. 세포성 조성물의 특정한 적용은 적합한 제형을 제한할 것이다. 조성물에 대해 사용가능한 매트릭스는 생분해성이며, 화학적으로 칼슘 설페이트, 트리칼슘 포스페이트, 하이드록시아파티트, 폴리락트산 및 폴리안하이드라이드로 규정될 수 있다. 그외 가능성 있는 물질은 생분해성이며, 골 또는 진피 콜라겐과 같이 생물학적으로 잘 규정된 것이다. 다른 매트릭스는 순수한 단백질 또는 세포외 매트릭스 성분으로 구성되어 있다. 그외 가능성 있는 매트릭스는 비-생분해성이며,소결된 하이드록시아파티트, 바이오글라스, 알루미네이트 또는 다른 세라믹류와 같이 화학적으로 규정된다. 매트릭스는 폴리락트산 및 하이드록시아파티트 또는 콜라겐 및 트리칼슘 포스페이트와 같이, 전술한 타입의 물질의 임의 조합으로 구성될 수 있다. 바이오세라믹류는 칼슘-알루미네이트-포스페이트와 같은 조성물중에서 변형될 수 있으며, 이를 가공하여 기공 크기, 입자 크기, 입자 형태 및 생분해성을 변경시킬 수 있다.

그러나, 본 발명에서 사용하는 연골 절편은 상기와 같은 매트릭스 없이 단독으로 사용할 수도 있다.

즉, 반월상 연골 이식술에 사용되는 신선동결 반월상연골 조각에 콜라게네이즈 처리한 반월상 연골 절편은 연골세포의 공여자로서 기능할 뿐만 아니라, 자체적으로도 연골세포가 증식하는 3차원 배지의 역할을 한다.

따라서, 본 발명은 동종 반월상 연골이식술 당시에 남아있는 본인의 반월상 연골조각을 콜라게네이즈 처리를 한 뒤 동종 반월상 연골이식편에 주입한 뒤에 수술할 수 있으므로, 한 번의 수술로 처치가 가능하다.

이처럼, 본 발명에 의한 콜라게네이즈를 처리한 연골절편 조직은 그 자체가 하나의 폴리머로서 연골세포가 증식하고, 반월상 연골 중심부의 연골조각에서 시간이 지남에 따라 연골세포의 밀도가 증가하므로 반월상 연골 이식술의 성공율을 현저하게 높일 수 있을 것이다.

실시예

이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1 : 이식용 반월상 연골 내 연골세포 증식의 체외( in vitro ) 확인

적법한 조건에 따라 채취되어 적법한 방법으로 보관된 신선동결 반월상 연골이식용 조직을 준비한다.

모든 조작은 무균적으로 시행되었다.

(1) 신선동결 연골조각 만들기

신선동결 반월상 연골을 상온의 생리 식염수에 담가 약 10분 정도 두어 해동시켰다.

도 1에 도시한 바와 같이, 가운데 부분(반월상 연골을 잘랐을 때 단면이 3각형이 되도록 한다면, 이 3각형의 중심부위를 가운데 부분이라고 칭한다)을 꿰는 듯이 3mm 두께의 스테인레스 철사로 뚫어서 구멍을 만들고, 다시 철사를 빼 주었다.

(2) 연골 절편 만들기

이식받고자 하는 환자의 슬부에서, 통상적으로 조금 남아있으면서 반월상 연골의 부착을 위해 제거하거나 갈아내기도 하는 남은 부분의 반월상 연골을 채취하여 가능한 가느다란 원기둥 또는 국수 가락과 같은 모양으로 만든 다음 4% 콜라게네이즈에 4분간 담구었다가 생리식염수로 수차례 씻어 주었다.

(3) 연골 조각과 연골 절편 결합하기

국수 가락 모양의 신선동결 반월상 연골의 스테인레스 철사로 뚫은 구멍으로 모기 겸자를 이용하여 끼워 넣었다.

이렇게 만들어진 신선동결 반월상 연골은 겉모양으로는 기존의 신선동결 반월상 연골과 같으나 내부에는 콜라게네이즈 처리가 된 절편이 삽입되어 있는 형태, 즉 긴 핫도그에 긴 소시지가 삽입된 것과 같은 형상과 비슷하였다(도 1 참조)

(4) 이식하기

이렇게 만들어진 신선동결 반월상 연골을 기존의 반월상 연골 이식술과 같은 방법으로 이식하였다.

이식술을 하면서 이식편을 실로 꼬매어, 신선동결 반월상 연골과 내부의 절편은 고정이 되어(마치 핫도그와 소시지가 실에 의해 꿰매어 지듯이) 다시 빠질 가능성을 없게 하였다.

(5) 생체외부에서 연골세포가 풍부한 연골조직 만들기

한편으로는 (3)단계에서 만들어진 조직을 (5)단계로 가기 전에 생체외에서 배양하는 방법으로도 실험하였다. 이렇게 하여 세포가 충분히 증식된 상태에서 다시 (4) 단계의 이식술을 시행할 수도 있음은 자명한 사실이다.

배양을 위해, 각각 24 well plate에 담았다. 10% 우태혈청(fetal bovine serum, Gibco BRP, Grand Island, NY, USA)와 1% Penicillin 및 streptomycin이 첨가된 DMEM (Gibco, Grand Island, NY, USA) 37.5 ml와 hyaluronic acid(신풍제약, 서울, 한국) 2.5 ml를 혼합하여 배지를 만들었다.

대조군과 실험군은 주 2회 간격으로 동일한 배지를 교환하여 주었으며, 5% 의 이산화탄소가 포함된 섭씨 37.5도의 인큐베이터 속에 보관되었다. 대조군은 3주후, 실험군은 1주, 2주, 3주 후에 채취하여 고정하였고, H&E 염색을 하여 광학 현미경하에서 관찰하였다. 이러한 실험과정의 전체적인 모식도를 도 6에 나타내었다.

그리고, 상기 배양 실험 결과는 이하와 같이 나타났다.

1주 실험군에서는 중심부에 원형의 연골 조각에 는 많은 세포들이 관찰되었으나, 주변의 연골조각에는 세포의 핵이 드물게 관찰되었다. 전체적으로 주변부에서는 세포의 증식이 관찰되지 않았다(도 2).

2주 실험군에서 중심부의 연골조각에서도 연골의 밀도가 증가하였고, 주변부에서도 부분적으로 세포가 밀집되어 있고, 띠모양의 배열을 보이면서 모여있는 세포군을 군데군데 관찰할 수 있었다. 중심부와 주변부의 경계는 여전히 분명하였다(도 2).

3주 실험군에서는 2주 실험군과 비슷한 양상이었으며, 중심부의 연골조각에서 연골의 밀도가 더욱 증가하였다. 주변부의 세포들의 배열도 띠모양이었고, 세포의 숫자 및 군집의 숫자가 2주 실험군에 비해 증가하였다(도 2, 3).

3주 대조군에서는 가운데 연골조직은 여전히 4각형 모양의 흔적을 가지고 있었고, 세포는 관찰되었으나 세포의 밀도는 1주 실험군보다 적었다. 주위의 신선동결 조직에서는 세포가 거의 관찰되지 않았으나, 한 군데의 세포군집이 관찰되며, 이곳에는 여러세포가 모여있었다(도 2, 4).

즉, 대조군에서는 3주에서도 중심부의 연골조각에서도 세포가 증식하지 않았으나, 콜라게네이즈 처리를 한 실험군에서는 시간이 지날 수로 중심부 연골조각에서도 세포가 증식하며, 주변부에도 군집을 이루는 세포의 증식을 관찰할 수 있었다(도 5).

이처럼, 생체외실험(in vitro)이긴 하지만, 연골 세포가 반월상 연골세포로의 침투 및 증식할 가능성을 본 실험으로 확인할 수 있었다.

또한, 실험실 내의 환경은 반월상 연골 내부에 이식된 연골 세포에 영양물질이 도달하기에 생체에 비해 불리한 환경으로, 확산에 의해 영양분을 공급받는 것으로 알려진 연골 세포의 경우 생체내에서는 관절운동에 따라 적절히 흐르는 활막과 반월상 연골자체의 움직임으로 보다 더 영양 공급을 잘 받으므로 생체 내에서는 보다 더 오랜 기간 생존할 수 있음을 알 수 있다.

Claims (10)

1. 이식용 반월상 연골의 중앙부에 삽입용 구멍을 형성하는 단계; 및
   콜라게네이즈 처리된 연골절편을 이식용 반월상 연골의 상기 삽입용 구멍 내에 삽입하여 배양하는 단계를 포함하는 연골세포 증식방법.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 콜라게네이즈는 3 ~ 5% 농도인 것을 특징으로 하는 연골세포 증식방법.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 콜라게네이즈는 비특이적 콜라게네이즈 또는; type II 콜라게네이즈 및 type I 콜라게네이즈에서 선택된 특이적 콜라게네이즈인 것을 특징으로 하는 연골세포 증식방법.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 연골절편은 기둥 형상으로 이루어진 것을 특징으로 하는 연골세포 증식방법
   
5. 제1항에 있어서, 상기 연골절편은 히알류로네이즈, 케라티네이즈 및 콘드로이티네이즈로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 효소로 추가 처리된 것을 특징으로 하는 연골세포 증식방법.
   
6. 삭제
7. 중앙부에 삽입용 구멍이 형성되고, 상기 삽입용 구멍에 콜라게네이즈 처리된 연골절편이 삽입된 이식용 반월상 연골을 포함하는 이식용 조성물.
   
8. 제7항에 있어서, 상기 연골절편은 히알류로네이즈, 케라티네이즈 및 콘드로이티네이즈로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 효소로 추가 처리된 것을 특징으로 하는 이식용 조성물.
   
9. 제7항에 있어서, 상기 이식용 반월상 연골은 신선 동결된 것임을 특징으로 하는 이식용 조성물.
   
10. 제7항에 있어서, 콜라게네이즈 처리된 상기 연골절편이 삽입된 상기 이식용 반월상 연골은 15일~25일 동안 배양되는 것을 특징으로 하는 이식용 조성물.

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