JP7017913B2 - 軟骨組織の製造方法及び軟骨組織 - Google Patents
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Description
また、特許文献2及び特許文献3には、生体吸収性素材の発泡体と、同様素材により補強した心血管系組織培養基材、並びにチューブ状の神経再生基材が開示されている。
更に、特許文献4には、スポンジ状または、不織布状の高分子材料成形物からなる骨格の内部に細胞を分散したゲルを有する医用材料が開示されている。
以下に本発明を詳述する。
原料となる軟骨組織から軟骨細胞を回収して播種した場合、回収時に軟骨細胞にダメージが蓄積し、軟骨組織の再生が困難となることがある。これに対して、一辺の長さが50~1000μmのブロック状に切り出した軟骨組織片にコラゲナーゼ処理を施し、該軟骨組織片を播種することにより、ダメージの蓄積を最小限に抑え、安定した軟骨組織の再生を行うことができる。
従来の技術常識では、このような小片のブロック状に切り出した軟骨組織片を播種しても、ほとんど軟骨組織を製造することはできないと言われていた。しかしながら、本発明の発明者らは、コラゲナーゼ処理を施した軟骨組織片を用いることにより、安定して軟骨組織を製造できる。
なお、原料となる軟骨組織は、例えば、人や動物等から得た耳介から、皮膚、結合織、軟骨膜を除去する等の従来公知の方法により採取することができる。また、原料となる軟骨組織は、軟骨膜付の軟骨組織であってもよく、軟骨膜を取り除いた軟骨組織であってもよい。
上記微細加工装置としては特に限定されないが、例えば、図5に示したマイクロスライサーを用いることができる。マイクロスライサーを用いれば、x軸、y軸及びz軸方向に自在に軟骨組織を細切することができ、最小限のダメージで、容易に一辺の長さが50~1000μmのブロック状に軟骨組織片を切り出すことができる。
上記播種の方法は特に限定されないが、例えば、上記コラゲナーゼ処理が施された軟骨組織片を適当な緩衝液や培養液に懸濁した懸濁液を調製し、該懸濁液を上記生体吸収性材料からなる多孔質基材上に注ぐ方法等が挙げられる。
上記コラゲナーゼ処理が施された軟骨組織片を播種する際の播種密度は特に限定されないが、播種する軟骨組織片の面積が、目標とする軟骨組織の面積の1/4程度となるよう播種することが好ましい。この範囲内であれば、確実かつ短期間のうちに軟骨組織を形成させることができる。
なお、本明細書においてポリグリコリドは、ポリグリコール酸等のグリコリドの重合体を意味するが、本願発明の効果を阻害しない範囲で、乳酸、ε-カプロラクトン、p-ジオキサノン、炭酸トリメチレン等の他の生体吸収性の成分との共重合体としてもよい。また、本願発明の効果を阻害しない範囲で、ポリラクチド等の他の生体吸収性材料との混合物としてもよい。
なお、本明細書において不織布の平均孔径は、バブルポイント法により測定された平均孔径を意味する。
バブルポイント法とは、測定対象となる膜をよく濡らす液体を予め膜の細孔内に吸収させておき、図1に示したような器具に設置し、膜の裏側から空気圧をかけて、膜表面に気泡の発生が観察できる最小圧力(バブルポイント)を測定し、液体の表面張力とバブルポイントとの関係式から孔径分布を推算する(図2)方法である。
具体的には、測定対象となる不織布に湿潤液(例えば、フッ素系溶媒、商品名Porofil(商標))を吸収させた後、図1に示したような器具(例えば、日本ベル社製、Porometer 3G)に試験片寸法が直径25mmの円状になるように設置した後、不織布の裏側から空気圧をかけて、膜表面に気泡の発生が観察できる最小圧力(バブルポイント)を測定する。
なお、図2に記載された細孔径を算出する式において、γは浸潤液の表面張力を表し、θは不織布素材上の浸潤液の接触角を表し、ΔPはバブルポイント圧を表す。
なお、不織布の平均繊維径は、走査型電子顕微鏡を用いて1000倍で撮影した不織布の像をもとに、繊維径を測定可能な全ての繊維についてその中点の直径を計測し、その平均値を算出することにより得ることができる。
上記不織布を構成する繊維がマルチフィラメントである場合、当該マルチフィラメントを構成する単繊維の繊度は特に限定されないが、不織布の組織片保持性や柔軟性の観点から、好ましい下限は1デニール、好ましい上限は10デニールである。
上記不織布を構成する繊維がマルチフィラメントである場合、当該マルチフィラメントを構成する単繊維の本数は特に限定されないが、不織布の組織片保持性や柔軟性の観点から、好ましい下限は8本、好ましい上限は15本である。
なお、上記方法により得られた不織布を、更に熱圧縮することにより厚みや平均孔径を調整した不織布を用いることもできるが、細胞進入性の観点からは、熱圧縮されていない不織布を用いることが好ましい。熱圧縮されていない不織布は、綿毛状の外観を有し、細胞進入性に極めて優れる。
上記小孔径多孔質基材を構成する生体吸収性材料としては、上記多孔質基材に用いるものと同様の生体吸収性材料を用いることができる。上記小孔径多孔質基材を構成する生体吸収性材料は、上記多孔質基材を構成する生体吸収性材料と同じであってもよく、異なっていてもよい。
得られる軟骨組織の形状を整えるとともに、軟骨組織に充分な力学的強度を付与するという型枠の役割から、上記型枠を構成する生体吸収性材料は上記多孔質基材を構成する生体吸収性材料よりも分解に長期間を要するものを選択することが好ましい。上記多孔質基材を構成する生体吸収性材料よりも分解に長期間を要する生体吸収性材料を用いて型枠を構成することにより、上記多孔質基材中において軟骨細胞が増殖して軟骨組織が再生するとともに、多孔質基材が徐々に分解吸収される間も、軟骨組織の形状を維持することができる。
例えば、上記多孔質基材を構成する生体吸収性材料としてポリグリコリドを用いる場合、上記型枠を構成する生体吸収性材料としてはポリカプロラクトンが好適である。ポリカプロラクトンは、ポリグリコリドよりも分解に長期間を要することに加え、適度な力学的強度と柔軟性とを有する。
上記親水化処理としては特に限定されず、従来公知の親水化処理を用いることができる。なかでも、簡便、かつ、生体に対する影響が少ないことから、エタノール等のアルコールによる処理が好適である。
耳介軟骨等の、特定の形状を有する軟骨組織を製造する場合には、上記型枠の形状を製造しようとする軟骨組織の形状にあわせて成形することで、任意の形状の軟骨組織を得ることができる。
なお、本明細書において上記型枠と上記多孔質基材とが複合一体化しているとは、得られた軟骨組織を組織又は器官に移植する際に、折り畳んで移植しても上記型枠が上記多孔質基材から剥離しないことを意味する。
上記型枠に複合一体化された多孔質基材の態様の一例を示す模式図を図3に示した。
図3(a)に記載した型枠に複合一体化された多孔質基材1では、矩形の多孔質基材11の周りを取り囲むように型枠12が配置されている。また、図3(b)に記載した型枠に複合一体化された多孔質基材1’では、型枠12を挟み込むようにして2枚の矩形の多孔質基材11が配置されている。
図4(a)に記載した型枠に複合一体化された多孔質基材2では、型枠22の形状を外耳状に整え、該型枠22の内側に多孔質基材21を配置している。また、図4(b)に記載した型枠に複合一体化された多孔質基材2’では、形状を外耳状に整えた型枠22を挟み込むようにして2枚の多孔質基材21が配置されている。
生体吸収性材料からなる多孔質基材上に、コラゲナーゼ処理が施された、一辺が50~1000μmのブロック状の軟骨組織片が播種されたものである軟骨組織もまた、本発明の1つである。
(1)不織布の調製
生体吸収性材料として重量平均分子量が250000のポリグリコリドを用い、これを紡糸して得た糸からなる布をニードルパンチ法により不織布化する方法により、平均繊維径が約16μm、厚さが約0.5mmの綿毛状の不織布を得た。
なお、得られた細胞侵入層に、湿潤液としてフッ素系溶媒(商品名Porofil(商標))を吸収させた後、日本ベル社製のPorometer 3Gに試験片寸法が直径25mmの円状になるように設置し、細胞侵入層の裏側から空気圧をかけて、膜表面に気泡の発生が観察できる最小圧力(バブルポイント)を測定した。得られたバブルポイントをもとに不織布の孔径分布を示すグラフを得て、該グラフより平均孔径を算出したところ、28μmであった。
Prominent ear(たち耳)治療のために切除して得られたヒト耳介軟骨を、皮膚、結合組織、軟骨膜を除去し、長さ5mm、幅5mm、厚さ1mmのヒト耳介軟骨を得た。該ヒト耳介軟骨を、微細加工装置を用いて細切し、一辺が約800μmの軟骨組織片を得た。
得られた軟骨組織片を、濃度0.3%のコラゲナーゼ溶液中で、温度37℃、回転数160rpmの条件で60分間振盪することにより、コラゲナーゼ処理を施した。
コラゲナーゼ処理が施された軟骨組織片を50μLのリン酸バッファー中に懸濁した後、ピペットを用いて不織布に均等に播種した。ここで、目標とする軟骨組織の面積1cm2に対して、播種する軟骨組織片の面積が5mm2となるように播種を行った。
得られた軟骨組織片を播種した不織布を4~6週齢無胸腺マウス(平均体重28g、雄)に移植した。全身麻酔後、後頸部に切開し、皮下に軟骨組織を移植した。移植後10週間後に犠牲死させて、各々のサンプルを取り出した。
図6に、移植後10週間後の軟骨組織片を播種した不織布の断面のサフラニン染色像(a)及びヴェノホッフ染色像(b)を示した。図6(a)より、プロテオグリカンの生成が認められ、再生軟骨が誘導されていることが確認できた。また、図6(b)において、黒く染まったエリアは移植軟骨片を示し、薄く暗く染まったエリアが再生軟骨を示している。黒く染まったエリアが少なくことからも、再生軟骨が誘導されていることが確認できた。また、不織布を構成するポリグリコリドは全て分解していた。
軟骨組織片に施すコラゲナーゼ処理条件を(1)15分間、(2)30分間、(3)45分間及び(4)60分間とした以外は、実施例1と同様にして不織布に軟骨組織片を播種し、移植及び軟骨組織再生の評価を行った。
図7に、各コラゲナーゼ処理軟骨組織片を移植後10週間後の軟骨組織片を播種した不織布の断面のサフラニン染色像(a)及びヴェノホッフ染色像(b)を示した。
軟骨組織片にコラゲナーゼ処理を施さなかった以外は、実施例1と同様にして不織布に
軟骨組織片を播種し、移植及び軟骨組織再生の評価を行った。
図8に、移植後10週間後の軟骨組織片を播種した不織布の断面のサフラニン染色像(a)及びヴェノホッフ染色像(b)を示した。図8より、比較例1では、プロテオグリカンの生成が少なく、再生軟骨の誘導はほとんど認められなかったことがわかった。また、軟骨組織片は残存していたが、吸収像が見られた。
(1)不織布の調製
生体吸収性材料として重量平均分子量が250000のポリグリコリドを用い、これを紡糸して得た糸からなる布をニードルパンチ法により不織布化する方法により、平均繊維径が約16μm、厚さが約0.5mmの綿毛状の不織布を得た。
なお、得られた細胞侵入層に、湿潤液としてフッ素系溶媒(商品名Porofil(商標))を吸収させた後、日本ベル社製のPorometer 3Gに試験片寸法が直径25mmの円状になるように設置し、細胞侵入層の裏側から空気圧をかけて、膜表面に気泡の発生が観察できる最小圧力(バブルポイント)を測定した。得られたバブルポイントをもとに不織布の孔径分布を示すグラフを得て、該グラフより平均孔径を算出したところ、28μmであった。
生体吸収性材料として重量平均分子量が250000のポリグリコリドを用い、メルトブロー法により、平均繊維径が約2μm、厚さが約50μmの小孔径不織布を得た。
なお、得られた小孔径不織布について、バブルポイント法により平均孔径を算出したところ、12μmであった。
厚さが50μmの小孔径不織布と、厚さが0.5mmの不織布とを重ね、四隅を5-0ナイロン縫合糸で縫合して積層体を得た。
Prominent ear(たち耳)治療のために切除して得られたヒト耳介軟骨を、皮膚、結合組織、軟骨膜を除去し、長さ5mm、幅5mm、厚さ1mmのヒト耳介軟骨を得た。該ヒト耳介軟骨を、微細加工装置を用いて細切し、一辺が約800μmの軟骨組織片を得た。
得られた軟骨組織片を、濃度0.3%のコラゲナーゼ溶液中で、温度37℃、回転数160rpmの条件で60分間振盪することにより、コラゲナーゼ処理を施した。
コラゲナーゼ処理が施された軟骨組織片を50μLのリン酸バッファー中に懸濁した後、ピペットを用いて積層体の不織布側に均等に播種した。ここで、目標とする軟骨組織の面積1cm2に対して、播種する軟骨組織片の面積が5mm2となるように播種を行った。
得られた軟骨組織片を播種した不織布を4~6週齢無胸腺マウス(平均体重28g、雄)に移植した。全身麻酔後、後頸部に切開し、皮下に軟骨組織を移植した。移植後10週間後に犠牲死させて、各々のサンプルを取り出した。
図9に、移植後10週間後の軟骨組織片を播種した不織布の断面のサフラニン染色像(a)及びヴェノホッフ染色像(b)を示した。図9(a)より、多くのプロテオグリカンの生成が認められ、実施例1よりも更に再生軟骨が誘導されていることが確認できた。また、図9(b)において暗く染まったエリアが少ないことからも、再生軟骨が誘導されていることが確認できた。また、不織布を構成するポリグリコリドは全て分解していた。
軟骨組織片に施すコラゲナーゼ処理条件を(1)15分間、(2)30分間、(3)45分間及び(4)60分間とした以外は、実施例3と同様にして不織布に軟骨組織片を播種し、移植及び軟骨組織再生の評価を行った。
図10に、各コラゲナーゼ処理軟骨組織片を移植後10週間後の軟骨組織片を播種した不織布の断面のサフラニン染色像(a)及びヴェノホッフ染色像(b)を示した。
軟骨組織片にコラゲナーゼ処理を施さなかった以外は、実施例3と同様にして不織布に
軟骨組織片を播種し、移植及び軟骨組織再生の評価を行った。
図11に、移植後10週間後の軟骨組織片を播種した不織布の断面のサフラニン染色像(a)及びヴェノホッフ染色像(b)を示した。図11より、比較例2では、プロテオグリカンの生成が少なく、再生軟骨の誘導はほとんど認められなかったことがわかった。また、軟骨組織片は残存していたが、吸収像が見られた。
(1)軟骨組織片の調製と播種
イヌから片耳を切除し、皮膚、結合組織、軟骨膜を除去して、イヌ耳介軟骨組織を得た。該イヌ耳介軟骨を、微細加工装置を用いて細切し、一辺の長さが100μm、200μm及び400μmのブロック状の軟骨組織片を得た。
得られた各大きさの軟骨組織片を、濃度0.3%のコラゲナーゼ溶液中で、温度37℃、回転数160rpmの条件で、0分間、15分間及び60分間振盪することにより、コラゲナーゼ処理を施した。
コラゲナーゼ処理が施された各大きさの軟骨組織片を50μLのリン酸バッファー中に懸濁して懸濁液を得た。実施例3と同様の方法により調製た積層体の不織布側に、ピペットを用いて懸濁液を均等に播種した。ここで、目標とする軟骨組織の面積1cm2に対して、播種する軟骨組織片の面積が5mm2となるように播種を行った。
軟骨組織片を播種した不織布を上記(1)で片耳を切除したイヌに移植した。全身麻酔後、頭部を切開し、皮下に軟骨組織を移植した。移植後20週間後に犠牲死させて、各々の不織布を取り出した。
移植後20週間後の不織布の断面切片を作製し、サフラニン染色及びヴェノホッフ染色像を行った。図12に、移植後20週間後の、コラゲナーゼ処理を15分間施した一辺の長さが100μmのブロック状の軟骨組織片を播種した不織布の断面のサフラニン染色像(a)及びヴェノホッフ染色像(b)を示した。図13に、移植後20週間後の、コラゲナーゼ処理を15分間施した一辺の長さが200μmのブロック状の軟骨組織片を播種した不織布の断面のサフラニン染色像(a)及びヴェノホッフ染色像(b)を示した。図14に、移植後20週間後の、コラゲナーゼ処理を60分間施した一辺の長さが400μmのブロック状の軟骨組織片を播種した不織布の断面のサフラニン染色像(a)及びヴェノホッフ染色像(b)を示した。
この結果より、軟骨組織片の大きさ(一辺の長さ)によって、最適なコラゲナーゼ処理条件があることがわかる。
(1)軟骨組織片の調製と播種
イヌから片耳を切除し、皮膚、結合組織、軟骨膜を除去して、イヌ耳介軟骨組織を得た。得られたイヌ耳介軟骨を1cm×1cm(1cm2)で切り出し、微細加工装置を用いて細切し、一辺の長さが400μmのブロック状の軟骨組織片を得た。
得られた軟骨組織片を、濃度0.3%のコラゲナーゼ溶液中で、温度37℃、回転数160rpmの条件で15分間振盪することにより、コラゲナーゼ処理を施した。
コラゲナーゼ処理が施された軟骨組織片を50μLのリン酸バッファー中に懸濁して懸濁液を得た。実施例3と同様の方法により調製し、2cm×2cm(4cm2)の大きさに切断した積層体の不織布側に、ピペットを用いて懸濁液の全量を均等に播種した。
軟骨組織片を播種した不織布を上記(1)で片耳を切除したイヌに移植した。全身麻酔後、頭部を切開し、皮下に軟骨組織を移植した。移植後20週間後に犠牲死させて、不織布を取り出した。
移植後20週間後の不織布の断面切片を作製し、サフラニン染色を行ったところ、赤く染色された軟骨組織部が不織布の全面に形成されていることが確認された。
この結果より、ごくわずかな軟骨組織片があれば、より大きな軟骨組織を再生できることがわかる。
11 矩形の多孔質基材
12 型枠
2、2’ 型枠に複合一体化された多孔質基材
21 多孔質基材
22 形状を外耳状に整えた型枠
Claims (7)
- 生体吸収性材料からなる多孔質基材上に、コラゲナーゼ処理が施された、一辺の長さが50~1000μmのブロック状の耳介軟骨組織片を播種する軟骨組織片播種工程を有することを特徴とする耳介軟骨組織の製造方法。
- 耳介軟骨組織片は、一辺の長さが100~800μmのブロック状であることを特徴とする請求項1記載の耳介軟骨組織の製造方法。
- 多孔質基材は、平均孔径が20~50μmである不織布であることを特徴とする請求項1又は2記載の耳介軟骨組織の製造方法。
- 多孔質基材を構成する生体吸収材料がポリグリコリドであることを特徴とする請求項1、2又は3記載の耳介軟骨組織の製造方法。
- 多孔質基材は、生体吸収性材料からなる型枠に固定され複合一体化されていることを特徴とする請求項1、2、3又は4記載の耳介軟骨組織の製造方法。
- 型枠を構成する生体吸収材料がポリカプロラクトンであることを特徴とする請求項5記載の耳介軟骨組織の製造方法。
- 生体吸収性材料からなる多孔質基材上に、コラゲナーゼ処理が施された、一辺が50~1000μmのブロック状の耳介軟骨組織片が播種されたものであることを特徴とする耳介軟骨組織。
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