JP6581994B2 - 組織再生基材の製造方法 - Google Patents
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Description
再生医療においては、細胞が増殖分化して三次元的な生体組織様の構造物を構築できるかがポイントであり、例えば、基材を患者の体内に移植し、周りの組織又は器官から細胞を基材中に侵入させ増殖分化させて組織又は器官を再生する方法が行われている。
しかしながら、実際には、従来の生体吸収性材料からなる不織布を用いても、期待したほどには組織の再生が促進されないことがあるという問題があった。
以下に本発明を詳述する。
これは、平均孔径が5〜20μmである不織布からなる層は、体液や血液等に浮遊している細胞をほとんど通過させることがない一方、体液はスムーズに通過させることができる。一方、細胞漏出防止層の孔径が当該孔径であれば、細胞侵入層から細胞漏出防止層への接着細胞の侵入を促すとともに、細胞侵入層において増殖する細胞への栄養の供給が充分となるためではないかと考えられる。また、体液の浸潤により発生した応力を緩和できることから、組織再生基材の患部への密着性も保てるものと考えられる。
上記細胞侵入層は、生体吸収性材料からなる不織布からなる。
上記細胞侵入層を構成する生体吸収性材料としては、例えば、ポリグリコリド、ポリラクチド、ポリ−ε−カプロラクトン、ラクチド−グリコリド共重合体、グリコリド−ε−カプロラクトン共重合体、ラクチド−ε−カプロラクトン共重合体、ポリジオキサノン、ポリクエン酸、ポリリンゴ酸、ポリ−α−シアノアクリレート、ポリ−β−ヒドロキシ酸、ポリトリメチレンオキサレート、ポリテトラメチレンオキサレート、ポリオルソエステル、ポリオルソカーボネート、ポリエチレンカーボネート、ポリ−γ−ベンジル−L−グルタメート、ポリ−γ−メチル−L−グルタメート、ポリ−L−アラニン等の合成高分子や、デンプン、アルギン酸、ヒアルロン酸、キチン、ペクチン酸及びその誘導体等の多糖類や、ゼラチン、コラーゲン、アルブミン、フィブリン等のタンパク質等の天然高分子等が挙げられる。これらの生体吸収性材料は単独で用いてもよく、2種以上を併用してもよい。
上記ポリグリコリドがラクチド、ε−カプロラクトン、p−ジオキサノン等の他の生体吸収性の成分との共重合体である場合、該共重合体におけるグリコリド成分の配合量の好ましい下限は60モル%である。グリコリド成分の配合量を60モル%以上とすることにより、細胞の侵入性に優れ、かつ、正常な組織の再生を行うという本発明の優れた効果を特に発揮することができる。
上記ポリグリコリドとポリラクチド等の他の生体吸収性材料との混合物を用いる場合、該混合物におけるポリグリコリドの配合量の好ましい下限は50モル%である。ポリグリコリドの配合量を50モル%以上とすることにより、細胞の侵入性に優れ、かつ、正常な組織の再生を行うという本発明の優れた効果を特に発揮することができる。
なお、メルトフローレートの測定条件は、ポリグリコリドを240℃、10分間、シリンダー内で保持して溶融した後、荷重4kgfの条件で測定した値を意味する。
なお、本明細書において不織布の平均孔径は、バブルポイント法により測定された平均孔径を意味する。
バブルポイント法とは、測定対象となる膜をよく濡らす液体を予め膜の細孔内に吸収させておき、図1に示したような器具に設置し、膜の裏側から空気圧をかけて、膜表面に気泡の発生が観察できる最小圧力(バブルポイント)を測定し、液体の表面張力とバブルポイントとの関係式から孔径分布を推算する(図2)方法である。
具体的には、測定対象となる不織布に湿潤液(例えば、フッ素系溶媒、商品名Porofil(商標))を吸収させた後、図1に示したような器具(例えば、日本ベル社製、Porometer 3G)に試験片寸法が直径25mmの円状になるように設置した後、不織布の裏側から空気圧をかけて、膜表面に気泡の発生が観察できる最小圧力(バブルポイント)を測定する。
なお、図2に記載された細孔径を算出する式において、γは浸潤液の表面張力を表し、θは不織布素材上の浸潤液の接触角を表し、ΔPはバブルポイント圧を表す。
なお、不織布の平均繊維径は、走査型電子顕微鏡を用いて1000倍で撮影した不織布の像をもとに、繊維径を測定可能な全ての繊維についてその中点の直径を計測し、その平均値を算出することにより得ることができる。
上記細胞漏出防止層は、生体吸収性材料からなる不織布からなる。
上記細胞漏出防止層を構成する生体吸収性材料としては、上記細胞侵入層に用いるものと同様の生体吸収性材料を用いることができる。上記細胞漏出防止層を構成する生体吸収性材料は、上記細胞侵入層を構成する生体吸収性材料と同じであってもよく、異なっていてもよい。
なかでも、上記三層の積層構造を有する組織再生基材は、移植したときに組織再生基材の両面から細胞が侵入することができる一方、中央の細胞漏出防止層により侵入した細胞が組織再生基材の外に漏出してしまうことがないことから、極めて高い効率で組織の再生を促進することができる。
上記細胞侵入層と上記細胞漏出防止層とが複合一体化していないと、本発明の組織再生基材に細胞を播種したり、組織又は器官に移植したりする際に、上記細胞侵入層と上記細胞漏出防止層との一部又は全部が剥離してしまうことがある。上記細胞侵入層と上記細胞漏出防止層とが一部でも剥離すると、該剥離部に形成された空間に細胞溜まりが生じて、正常な組織又は器官が再生されないことがある。
なお、本明細書において上記細胞侵入層と上記細胞漏出防止層とが複合一体化しているとは、本発明の組織再生基材を組織又は器官に移植する際に、折り畳んで移植しても上記細胞侵入層と上記細胞漏出防止層とが剥離しないことを意味する。より定量的には、JIS L 1021−9に規定される剥離強さ試験方法に準じて測定された剥離強さが0.1N以上であることが好ましく、0.3N以上であることがより好ましい。
本発明者らは、鋭意検討の結果、上記細胞侵入層を調製する工程と、上記細胞侵入層上に、メルトブロー法により生体吸収性材料からなる糸を吐出して上記細胞漏出防止層を形成して積層体を得る工程と、上記積層体にニードルパンチを行い、上記細胞侵入層と上記細胞漏出防止層とを複合一体化させる工程とを有する組織再生基材の製造方法によれば、接合面において塞孔することなく、細胞侵入層と細胞漏出防止層とを複合一体化できることを見出した。このような組織再生基材の製造方法もまた、本発明の1つである。(以下、「第1の本発明の組織再生基材の製造方法」ともいう。)
本発明者らは、また、鋭意検討の結果、上記細胞侵入層を調製する工程と、上記細胞漏出防止層を調製する工程と、得られた細胞侵入層と細胞漏出防止層とを積層して積層体を得る工程と、上記積層体にニードルパンチを行い、上記細胞侵入層と上記細胞漏出防止層とを複合一体化させる工程とを有する組織再生基材の製造方法によれば、接合面において塞孔することなく、細胞侵入層と細胞漏出防止層とを複合一体化できることを見出した。このような組織再生基材の製造方法もまた、本発明の1つである。(以下、「第2の本発明の組織再生基材の製造方法」ともいう。)
以下、本発明の組織再生基材の製造方法を詳しく説明する。(以下、第1の本発明の組織再生基材の製造方法と第2の本発明の組織再生基材の製造方法に共通する事項は、単に「本発明の組織再生基材の製造方法」ともいう。)
上記細胞侵入層を調製する方法は特に限定されず、例えば、エレクトロスピニングデポジション法、メルトブロー法、ニードルパンチ法、スパンボンド法、フラッシュ紡糸法、水流交絡法、エアレイド法、サーマルボンド法、レジンボンド法、湿式法等の従来公知の方法を用いることができる。なかでも、上記細胞侵入層の調製にはニードルパンチ法が好適である。
上記羽毛立ち処理は、具体的には例えば、起毛機を用いて上記細胞侵入層の上記細胞漏出防止層を積層する側の表面を起毛処理する方法等が挙げられる。なお、上記細胞侵入層の製造方法としてニードルパンチ法を用いた場合には、得られた細胞侵入層の表面は既に起毛していることから、羽毛立ち処理を施したのと同様の効果が得られる。
メルトブロー法は、原料となる生体吸収性材料を1段階で不織布にする溶融紡糸法である。具体的には、押出機で溶融した生体吸収性材料を、幅方向に多数の口金を有するダイから繊維捕集点に向かって高温、高速の空気流で糸状に吹き出し、繊維状に延伸された樹脂をコンベア上で集積する。吐出から集積の間に繊維同士の絡み合い及び融着が起こることから不織布が形成される。第1の本発明の組織再生基材の製造方法では、上記細胞侵入層をコンベア上、メルトブロー法による繊維捕集点よりも手前となるように配置し、該細胞侵入層をコンベアで移動させながら、細胞侵入層上に繊維を吐出して細胞漏出防止層を形成させる。
この際、メルトブロー法のポリマー吐出量、吐出出口付近のエア風速、コンベアの速度等を調節することにより、形成される細胞漏出防止層の繊維径、密度、厚み等を制御することができる。
上記細胞漏出防止層を調製する方法は特に限定されないが、例えば、メルトブロー法により生体吸収性材料からなる糸を吐出することにより形成することができる。
また、上記積層体は、細胞侵入層と細胞漏出防止層を重ね合わせることにより得ることができる。
ニードルパンチにより、接合面において各層の孔を塞ぐことなく、上記細胞侵入層と上記細胞漏出防止層とを確実に複合一体化させることができる。
なお、上記積層体にニードルパンチを行う際のニードルの進入方向は特に限定されない。
上記熱セット処理の方法としては、例えば、上記積層体を構成するポリマーの結晶化点以上の温度下でローラープレスを施す方法等が挙げられる。
これらの組織や器官の再生方法としては、例えば、再生しようとする組織や器官の部位に、本発明の組織再生基材を移植する方法が挙げられる。この際、本発明の組織再生基材に予め細胞を播種しておいてもよい。
本発明の組織再生基材は、手術後、脆弱な組織を覆うように貼付する。自動縫合器を使用する場合には、本発明の組織再生基材を組織に貼りつけた後に自動縫合器を用いて縫合操作を行うことにより、肺の空気漏れや種々の組織からの体液漏れを防止できる点でも有用である。
(1)細胞侵入層の調製
生体吸収性材料として重量平均分子量が250000のポリグリコリドを用い、これを紡糸して得た糸からなる布をニードルパンチ法により不織布化する方法により、平均繊維径が約16μm、厚さが約1.5mmの細胞侵入層を得た。
得られた細胞侵入層を、メルトブロー法による繊維捕集点よりも手前となるようにコンベア上に設置した。コンベアを移動させながら、細胞侵入層上にメルトブロー法によりポリグリコリドからなる糸を吐出して細胞漏出防止層を積層した。
メルトブロー法は、原料として重量平均分子量が250000のポリグリコリドを用い、ポリマー吐出量0.2kg/h、吐出出口付近のエア風速11m/秒の条件として行った。また、コンベアの移動速度は、上記メルトブロー法により得られる細胞漏出防止層の密度が10g/m2となる速度に設定した。
なお、別に同様の条件で細胞漏出防止層のみを製造し、バブルポイント法により細胞漏出防止層の平均孔径を算出したところ、12μmであった。
得られた積層体の細胞漏出防止層側からニードルが進入するようにニードルパンチを行い、細胞侵入層と細胞漏出防止層とを複合一体化させた。
細胞侵入層の調製において、ニードルパンチ法により得た細胞侵入層に熱プレス処理を施して表面を平滑にした以外は実施例1と同様にして、組織再生基材を得た。
細胞侵入層の調製において、ニードルパンチ法により得た細胞侵入層に熱プレス処理を施して表面を平滑にした後、真鍮製のブラシによりブラッシングを施す方法により羽毛立ち処理を施し、細胞漏出防止層を羽毛立ち処理を施した側に積層した以外は実施例1と同様にして、組織再生基材を得た。
(1)細胞侵入層の調製
生体吸収性材料として重量平均分子量が250000のポリグリコリドを用い、これを紡糸して得た糸からなる布をニードルパンチ法により不織布化する方法により、平均繊維径が約16μm、厚さが約1.5mmの細胞侵入層と、平均繊維径が約16μm、厚さが約0.5mmの細胞侵入層の2種の細胞侵入層を得た。
なお、得られた細胞侵入層について、バブルポイント法により平均孔径を算出したところ、いずれも28μmであった。
生体吸収性材料として重量平均分子量が250000のポリグリコリドを用い、メルトブロー法により、平均繊維径が約2μm、厚さが約50μmの細胞漏出防止層を得た。なお、得られた細胞漏出防止層について、バブルポイント法により平均孔径を算出したところ、12μmであった。
厚さが約1.5mmの細胞侵入層、厚さが約50μmの細胞漏出防止層、及び、厚さが約0.5mmの細胞侵入層をこの順に重ね合わせて三層構造の積層体を得た。
得られた三層構造の積層体の厚さが約0.5mmの細胞侵入層の側からニードルパンチを行い、三層を複合一体化させて、組織再生基材を得た。
生体吸収性材料として重量平均分子量が250000のポリグリコリドを用い、これを紡糸して得た糸からなる布をニードルパンチ法により不織布化する方法により、平均繊維径が約16μm、厚さが約1.5mmの不織布を得、これを組織再生基材とした。なお、得られた不織布について、バブルポイント法により平均孔径を測定したところ28μmであった。
生体吸収性材料として重量平均分子量が250000のポリグリコリドを用い、メルトブロー法により、平均繊維径が約2μm、厚さが約50μmの不織布を得、これを組織再生基材とした。なお、得られた不織布について、バブルポイント法により平均孔径を測定したところ12μmであった。
ニードルパンチによる複合一体化処理を行わなかった以外は実施例1と同様にして、組織再生基材を得た。
ニードルパンチによる複合一体化処理を行わなかった以外は実施例2と同様にして、組織再生基材を得た。
ニードルパンチによる複合一体化処理を行わなかった以外は実施例3と同様にして、組織再生基材を得た。
実施例及び比較例で得た組織再生基材について、以下の方法により評価を行った。
結果を表1に示した。
平均粒子径が20μmのポリスチレン粒子を、エタノール水溶液(水/エタノール(体積比)=80/20)に分散させた粒子分散液を調製した。
組織再生基材を20mm×20mmの正方形に切断し、金属メッシュ上に固定した。組織再生基材の細胞侵入層側(実施例4においては、厚さが約1.5mmの細胞侵入層側)から、粒子分散液2mLをゆっくりと滴下して、組織再生基材を透過させた。透過前後の粒子分散液の波長230nmにおける吸光度を測定し、濃度既知のポリスチレンラテックス粒子分散液の吸光度測定より得た検量線を用いて粒子濃度(個/mL)を算出した。得られた透過前後の粒子分散液の粒子濃度と、透過前後の分散液の重量より計算した分散液体積を用いて透過前後の粒子分散液中の粒子数を求め、下記式により粒子補足率(%)を算出した。
粒子補足率(%)=(透過前の粒子分散液中の粒子数−透過後の粒子分散液中の粒子数)/透過前の粒子分散液中の粒子数
図3に示した培養方法により、組織再生基材に細胞を播種し、その増殖を評価した。
即ち、シャーレ4上に、スポンジ状体5を配置し、培養液6をスポンジ状体5の表面が液状になるように注いだ。(これにより、培養液はスポンジ状体5からのみ供給される。)このスポンジ状体5の上に、実施例及び比較例で製造した組織再生基材7を配置した。なお、実施例及び比較例3〜5では、細胞漏出防止層側を下にしてスポンジ状体5に接するようにした。また、実施例4では、厚さが約0.5mmの細胞侵入層側を下にしてスポンジ状体5に接するようにした。
このような状態で配置した組織再生基材7に、1×105個/cm2の播種密度となるように線維芽細胞を播種した。その後、1日毎に培養液6を交換しながら7日間培養した。7日間培養後に組織再生基材7に含まれる細胞数を、MTTアッセイ法により計数し、比較例1の組織再生基材に含まれる細胞数を100として、他の実施例及び比較例の組織再生基材に含まれる細胞数を表した。結果を表1に示した。
細胞再生基材の複合一体性を以下の基準により評価した。
◎:組織再生基材を折り畳んだときに細胞侵入層と細胞漏出防止層とが剥離することがなく、かつ細胞侵入層と細胞漏出防止層とを手で剥離させようとすると先に細胞侵入層又は細胞漏出防止層が破断した。
○:組織再生基材を折り畳んだときに細胞侵入層と細胞漏出防止層とが剥離することがなく、かつ細胞侵入層と細胞漏出防止層とを手で剥離させようとしても容易には剥離できなかった。
△:組織再生基材を折り畳んだときに細胞侵入層と細胞漏出防止層との一部が剥離してしまい、かつ細胞侵入層と細胞漏出防止層とを手で容易に剥離できた。
×:組織再生基材を折り畳んだときに細胞侵入層と細胞漏出防止層とが全部剥離してしまい、かつ細胞侵入層と細胞漏出防止層とを手で容易に剥離できた。
細胞再生基材の複合一体性を、JIS L 1021−9に規定される剥離強さ試験方法に準じて剥離強さを測定して評価した。
具体的には、まず得られた組織再生基材を横20mm×縦50mmに細切し、細胞侵入層と細胞漏出防止層とを手で予め縦方向に25mm剥離してつかみ部を形成したものをサンプルとした。得られたサンプルの各々の層のつかみ部をチャックではさみ(つかみ距離20mm)、オートグラフ(島津製作所社製「AGS−J」、ロードセル50N)を用いて引張速度100mm/minの条件で引っ張り、剥離強さを測定した。なお、JIS L 1021−9では、サンプルは横50mm×縦200mm、あらかじめ剥離する長さ(つかみ部長さ)は50mmとされているが、細胞再生基材が組織又は器官に移植するものであることを考慮して上記サンプルとした。また、同JISでは、サンプルは恒温恒湿室(20℃、65%)で24時間静置することとなっているが、本サンプルは分解性高分子からなる基材であることからこの操作は省略し、サンプル作製直後に測定を行った。
実施例4の細胞再生基材では、サンプル調製において、20mm×50mmの試験片の各層を縦方向に25mmまで剥離し、厚さが約1.5mmの細胞侵入層と厚さが約50μmの細胞漏出防止層とをそれぞれチャックではさみ、上記条件下で引張試験を行って、この二層の間の剥離強さを測定した。
5 スポンジ状体
6 培養液
7 組織再生基材
Claims (3)
- 生体吸収性材料からなる不織布からなり、平均孔径が20〜50μmである不織布からなる層と、平均孔径が5〜20μmである不織布からなる層とが複合一体化した積層構造を有する組織再生基材を製造する方法であって、
平均孔径が20〜50μmである不織布からなる層を調製する工程と、
前記平均孔径が20〜50μmである不織布からなる層上に、メルトブロー法により生体吸収性材料からなる糸を吐出して平均孔径が5〜20μmである不織布からなる層を形成して積層体を得る工程と、
前記積層体にニードルパンチを行い、前記平均孔径が20〜50μmである不織布からなる層と前記平均孔径が5〜20μmである不織布からなる層とを複合一体化させる工程とを有する
ことを特徴とする組織再生基材の製造方法。 - 生体吸収性材料からなる不織布からなり、平均孔径が20〜50μmである不織布からなる層と、平均孔径が5〜20μmである不織布からなる層とが複合一体化した積層構造を有する組織再生基材を製造する方法であって、
平均孔径が20〜50μmである不織布からなる層を調製する工程と、
平均孔径が5〜20μmである不織布からなる層を調製する工程と、
前記平均孔径が20〜50μmである不織布からなる層と前記平均孔径が5〜20μmである不織布からなる層とを積層して積層体を得る工程と、
前記積層体にニードルパンチを行い、前記平均孔径が20〜50μmである不織布からなる層と前記平均孔径が5〜20μmである不織布からなる層とを複合一体化させる工程とを有する
ことを特徴とする組織再生基材の製造方法。 - 平均孔径が20〜50μmである不織布からなる層を調製する工程後に、平均孔径が20〜50μmである不織布からなる層の平均孔径が5〜20μmである不織布からなる層を積層する側の表面に羽毛立ち処理を施す工程を有することを特徴とする請求項1又は2記載の組織再生基材の製造方法。
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