JPWO2016088821A1 - 組織再生基材及び組織再生基材の製造方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、細胞の侵入性に優れるとともに、組織再生基材からの細胞の漏出を効果的に防止して、組織の再生を促進することができる組織再生基材、及び、該組織再生基材の製造方法を提供することを目的とする。本発明は、生体吸収性材料からなる不織布からなる組織再生基材であって、平均孔径が２０〜５０μｍである不織布からなる層と、平均孔径が５〜２０μｍである不織布からなる層とが複合一体化した積層構造を有する組織再生基材である。

Description

本発明は、細胞の侵入性に優れるとともに、組織再生基材からの細胞の漏出を効果的に防止して、組織の再生を促進することができる組織再生基材、及び、該組織再生基材の製造方法に関する。

近年の細胞工学技術の進展によって、ヒト細胞を含む数々の動物細胞の培養が可能となり、また、それらの細胞を用いてヒトの組織や器官を再構築しようとする、いわゆる再生医療の研究が急速に進んでいる。より具体的には、例えば、軟骨、骨、皮膚、血管等の組織や器官の再生を目的とした再生医療の研究が進められている。
再生医療においては、細胞が増殖分化して三次元的な生体組織様の構造物を構築できるかがポイントであり、例えば、基材を患者の体内に移植し、周りの組織又は器官から細胞を基材中に侵入させ増殖分化させて組織又は器官を再生する方法が行われている。

また、生体組織に生じた病巣を内視鏡下で切除する方法として、自動縫合器等を用いた切除術が行われている。肺、気管支、肝臓、消化管等の脆弱な組織や、病変によって脆弱化した組織に対して切除術を行う場合、縫合を行ったのみでは組織の断裂のおそれがあり、また、例えば肺の手術においては空気漏れが発生するおそれがある。そこで、縫合補強材を生体組織の切除部位に縫い合わせるということが行われている。

このような再生医療用の基材や縫合補強材として、例えば、特許文献１に開示されるような生体吸収性材料からなる不織布を用いることが提案されている。生体吸収性材料からなる不織布は、再生医療用の基材や縫合補強材として用いた場合には、その空隙部分に細胞が侵入して増殖し、早期に組織が再生されることが期待される。また、脆弱な組織の補強材として用いた場合には、組織の断裂を防止し、空気漏れの発生等を防止することができる。更に、一定期間経過後には分解して生体に吸収されることから、再手術により取り出す必要もないという優れた性能を有する。
しかしながら、実際には、従来の生体吸収性材料からなる不織布を用いても、期待したほどには組織の再生が促進されないことがあるという問題があった。

特開平０５−０７６５８６号公報

組織再生基材を構成する不織布については、細胞の侵入性を確保するために５〜３０μｍ程度の平均孔径であることが好適であることが知られている。本発明者は、鋭意検討の結果、このような従来の組織再生基材は、細胞の侵入性の点では優れているものの、侵入した細胞の一部が組織再生基材を通過して、組織再生基材の外に漏出してしまうことがあることを見出した。侵入した細胞が組織再生基材の外に漏出してしまうことにより、実際に患部に留まる細胞成分の濃度が不足するため、期待したほどには組織の再生が促進されないものと考えられた。一方、細胞の漏出を防止するために不織布の平均孔径を小さくした場合には、細胞の侵入性が損なわれて、組織再生を促進することができない。

本発明は、上記現状に鑑み、細胞の侵入性に優れるとともに、組織再生基材からの細胞の漏出を効果的に防止して、組織の再生を促進することができる組織再生基材、及び、該組織再生基材の製造方法を提供することを目的とする。

本発明は、生体吸収性材料からなる不織布からなる組織再生基材であって、平均孔径が２０〜５０μｍである不織布からなる層と、平均孔径が５〜２０μｍである不織布からなる層とが複合一体化した積層構造を有する組織再生基材である。
以下に本発明を詳述する。

本発明者は、鋭意検討の結果、平均孔径が２０〜５０μｍである不織布からなる層（以下、「細胞侵入層」ともいう。）に対して、平均孔径が５〜２０μｍである不織布からなる層（以下、「細胞漏出防止層」ともいう。）を複合一体化した積層構造を有する組織再生基材は、優れた細胞侵入性を維持したまま、細胞が組織再生基材の外に漏出してしまうことを防止して、組織の再生を促進することができることを見出し、本発明を完成した。

ここで、上記細胞漏出防止層も一定範囲の平均孔径を有する不織布からなる層であることが重要である。単に体液や血液等に含まれる浮遊細胞の漏出を防止するだけであれば、例えば生体吸収性材料からなるフィルムを積層することによっても同様の効果を発揮することができる。しかしながら、フィルムを積層した場合には、組織の再生を促進する効果が充分に得られない。本願発明の優れた効果は、平均孔径が５〜２０μｍである不織布からなる層を細胞漏出防止層とすることによりはじめて発揮される。
これは、平均孔径が５〜２０μｍである不織布からなる層は、体液や血液等に浮遊している細胞をほとんど通過させることがない一方、体液はスムーズに通過させることができる。一方、細胞漏出防止層の孔径が当該孔径であれば、細胞侵入層から細胞漏出防止層への接着細胞の侵入を促すとともに、細胞侵入層において増殖する細胞への栄養の供給が充分となるためではないかと考えられる。また、体液の浸潤により発生した応力を緩和できることから、組織再生基材の患部への密着性も保てるものと考えられる。

上記細胞侵入層は、体液や血液等に含まれる浮遊細胞の捕捉、および接着後の細胞や周囲組織から侵入する細胞増殖の足場となり、組織の再生を促進する役割を有する。
上記細胞侵入層は、生体吸収性材料からなる不織布からなる。
上記細胞侵入層を構成する生体吸収性材料としては、例えば、ポリグリコリド、ポリラクチド、ポリ−ε−カプロラクトン、ラクチド−グリコリド共重合体、グリコリド−ε−カプロラクトン共重合体、ラクチド−ε−カプロラクトン共重合体、ポリジオキサノン、ポリクエン酸、ポリリンゴ酸、ポリ−α−シアノアクリレート、ポリ−β−ヒドロキシ酸、ポリトリメチレンオキサレート、ポリテトラメチレンオキサレート、ポリオルソエステル、ポリオルソカーボネート、ポリエチレンカーボネート、ポリ−γ−ベンジル−Ｌ−グルタメート、ポリ−γ−メチル−Ｌ−グルタメート、ポリ−Ｌ−アラニン等の合成高分子や、デンプン、アルギン酸、ヒアルロン酸、キチン、ペクチン酸及びその誘導体等の多糖類や、ゼラチン、コラーゲン、アルブミン、フィブリン等のタンパク質等の天然高分子等が挙げられる。これらの生体吸収性材料は単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。

上記生体吸収性材料のなかでも、ポリグリコリドが好適である。ポリグリコリドを用いた場合には、特に細胞の侵入性に優れ、正常な組織の再生を行うことができる。ポリグリコリドは、例えば繊維状にして３７℃の生理食塩水中に浸漬した場合に、引張強度が浸漬前の１／２になるまでの期間が約１４日である。このような分解性を有することにより、細胞が増殖して組織が再生する時期に基材が徐々に分解吸収されることとなり、基材内部まで再生した組織が構築され、その結果として良質な再生組織が構築されるものと考えられる。更に、生体内に埋入後数日間で炎症系の細胞が消失することから、組織の癒着を引き起こしにくいという優れた効果をも発揮できる。

なお、本明細書においてポリグリコリドは、ポリグリコール酸等のグリコリドの重合体を意味するが、本発明の効果を阻害しない範囲で、ラクチド、ε−カプロラクトン、ｐ−ジオキサノン等の他の生体吸収性の成分との共重合体としてもよい。また、本発明の効果を阻害しない範囲で、ポリラクチド等の他の生体吸収性材料との混合物としてもよい。
上記ポリグリコリドがラクチド、ε−カプロラクトン、ｐ−ジオキサノン等の他の生体吸収性の成分との共重合体である場合、該共重合体におけるグリコリド成分の配合量の好ましい下限は６０モル％である。グリコリド成分の配合量を６０モル％以上とすることにより、細胞の侵入性に優れ、かつ、正常な組織の再生を行うという本発明の優れた効果を特に発揮することができる。
上記ポリグリコリドとポリラクチド等の他の生体吸収性材料との混合物を用いる場合、該混合物におけるポリグリコリドの配合量の好ましい下限は５０モル％である。ポリグリコリドの配合量を５０モル％以上とすることにより、細胞の侵入性に優れ、かつ、正常な組織の再生を行うという本発明の優れた効果を特に発揮することができる。

上記生体吸収性材料がポリグリコリドである場合、該ポリグリコリドの重量平均分子量の好ましい下限は３００００、好ましい上限は４０００００である。上記ポリグリコリドの重量平均分子量が３００００未満であると、強度が不足して充分な組織補強効果が得られないことがあり、４０００００を超えると、生体内における分解速度が遅くなり、異物反応を起こすことがある。上記ポリグリコリドの重量平均分子量のより好ましい下限は５００００、より好ましい上限は３０００００である。

上記生体吸収性材料がポリグリコリドである場合、当該ポリグリコリドの分子量の代替指標としてメルトフローレートを用いてもよい。該ポリグリコリドのメルトフローレートの好ましい下限は０．１ｇ／１０分、好ましい上限は１００ｇ／１０分である。この範囲内であると、ポリグリコリドからなる不織布を作製することが容易となる。ポリグリコリドのメルトフローレートのより好ましい下限は１ｇ／１０分、より好ましい上限は５０ｇ／１０分である。
なお、メルトフローレートの測定条件は、ポリグリコリドを２４０℃、１０分間、シリンダー内で保持して溶融した後、荷重４ｋｇｆの条件で測定した値を意味する。

上記細胞侵入層を構成する不織布は、平均孔径の下限が２０μｍ、上限が５０μｍである。上記細胞侵入層がこのような平均孔径を満たす場合に、細胞の侵入性に優れ、かつ、正常な組織の再生に好適な組織再生基材を提供できる。不織布中の孔径が２０〜５０μｍの孔には、細胞が容易に侵入することができ、細胞侵入層中で増殖、分化して組織を形成することができる。これに対して、平均孔径が２０μｍ未満であると、血液等に含まれる浮遊細胞が効率よく侵入することができず、平均孔径が５０μｍを超えると、浮遊細胞の侵入は可能であるものの、細胞間の距離が離れすぎるため、細胞侵入層に接着した細胞や、周囲組織から侵入してくる細胞が充分に増殖、分化することができない。上記細胞侵入層を構成する不織布の平均孔径の好ましい下限は２２μｍ、好ましい上限は４０μｍであり、より好ましい下限は２４μｍ、より好ましい上限は３０μｍである。
なお、本明細書において不織布の平均孔径は、バブルポイント法により測定された平均孔径を意味する。

上記バブルポイント法による不織布の孔径分布の測定について説明する。
バブルポイント法とは、測定対象となる膜をよく濡らす液体を予め膜の細孔内に吸収させておき、図１に示したような器具に設置し、膜の裏側から空気圧をかけて、膜表面に気泡の発生が観察できる最小圧力（バブルポイント）を測定し、液体の表面張力とバブルポイントとの関係式から孔径分布を推算する（図２）方法である。
具体的には、測定対象となる不織布に湿潤液（例えば、フッ素系溶媒、商品名Ｐｏｒｏｆｉｌ（商標））を吸収させた後、図１に示したような器具（例えば、日本ベル社製、Ｐｏｒｏｍｅｔｅｒ ３Ｇ）に試験片寸法が直径２５ｍｍの円状になるように設置した後、不織布の裏側から空気圧をかけて、膜表面に気泡の発生が観察できる最小圧力（バブルポイント）を測定する。
なお、図２に記載された細孔径を算出する式において、γは浸潤液の表面張力を表し、θは不織布素材上の浸潤液の接触角を表し、ΔＰはバブルポイント圧を表す。

上記細胞侵入層を構成する不織布の平均繊維径は特に限定されないが、好ましい下限は１０μｍ、好ましい上限は５０μｍである。上記不織布の平均繊維径がこの範囲にある場合には、平均孔径を上記規定の範囲に調整することが容易となる。上記不織布の平均繊維径のより好ましい下限は１５μｍ、より好ましい上限は４０μｍである。
なお、不織布の平均繊維径は、走査型電子顕微鏡を用いて１０００倍で撮影した不織布の像をもとに、繊維径を測定可能な全ての繊維についてその中点の直径を計測し、その平均値を算出することにより得ることができる。

上記細胞侵入層の厚さは特に限定されないが、好ましい下限は３００μｍ、好ましい上限は２．０ｍｍである。上記細胞侵入層の厚さが３００μｍ未満であると、強度が不足して脆弱な組織の補強には用いることができないことがあり、２．０ｍｍを超えると、取り扱い性に劣る。上記細胞侵入層の厚さのより好ましい下限は４５０μｍ、より好ましい上限は１．５ｍｍである。

上記細胞漏出防止層は、体液や血液等に含まれる浮遊細胞が組織再生基材の外に漏出してしまうことを防止するとともに、体液はスムーズに通過させることにより、上記細胞侵入層への細胞の侵入を促し、上記細胞侵入層において増殖する細胞への栄養の供給を確保する役割を有する。また、細胞侵入層で増殖した細胞が細胞漏出防止層内部へも侵入することができ、当該細胞漏出防止層のみが脱落することも防ぐことができる。
上記細胞漏出防止層は、生体吸収性材料からなる不織布からなる。
上記細胞漏出防止層を構成する生体吸収性材料としては、上記細胞侵入層に用いるものと同様の生体吸収性材料を用いることができる。上記細胞漏出防止層を構成する生体吸収性材料は、上記細胞侵入層を構成する生体吸収性材料と同じであってもよく、異なっていてもよい。

上記細胞漏出防止層を構成する不織布は、平均孔径の下限が５μｍ、上限が２０μｍである。上記細胞漏出防止層がこのような平均孔径を満たす場合に、組織再生基材からの体液や血液等に含まれる浮遊細胞の漏出を防止することができるとともに、体液をスムーズに通過させることができ、上記細胞侵入層への細胞の侵入を促し、上記細胞侵入層において増殖する細胞への栄養の供給を確保することができる。さらに、細胞侵入層で増殖した細胞が細胞漏出防止層内部へも侵入することができ、当該細胞漏出防止層のみが脱落することも防ぐことができる。上記細胞漏出防止層を構成する不織布の平均孔径が２０μｍを超えると、組織再生基材からの細胞の漏出を充分に防止することができない。上記細胞漏出防止層を構成する不織布の平均孔径が５μｍ未満であると、上記細胞侵入層への細胞の侵入性が低下したり、上記細胞侵入層中の細胞への栄養の供給が不充分となったりして、充分に組織の再生を促進できないことがある。上記細胞漏出防止層を構成する不織布の平均孔径の好ましい下限は６μｍ、好ましい上限は１８μｍであり、より好ましい下限は７μｍ、より好ましい上限は１６μｍである。

上記細胞漏出防止層を構成する不織布の平均繊維径は特に限定されないが、好ましい下限は０．７μｍ、好ましい上限は７．０μｍである。上記不織布の平均繊維径がこの範囲にある場合には、平均孔径を上記規定の範囲に調整することが容易となる。上記不織布の平均繊維径のより好ましい下限は０．９μｍ、より好ましい上限は５．０μｍである。

上記細胞漏出防止層の厚さは特に限定されないが、好ましい下限は１０μｍ、好ましい上限は１５０μｍである。上記細胞漏出防止層の厚さが１０μｍ未満であると、組織再生基材からの細胞の漏出を充分に防止できないことがあり、１５０μｍを超えると、上記細胞侵入層への細胞の侵入性が低下したり、上記細胞侵入層中の細胞への栄養の供給が不充分となったりして、充分に組織の再生を促進できないことがある。上記細胞漏出防止層の厚さのより好ましい下限は３０μｍ、より好ましい上限は１００μｍである。

本発明の組織再生基材は、上記細胞侵入層と上記細胞漏出防止層との二層が複合一体化した積層構造を有するものであってもよく、上記細胞侵入層と上記細胞漏出防止層と上記細胞侵入層との三層がこの順に複合一体化した積層構造を有するものであってもよい。
なかでも、上記三層の積層構造を有する組織再生基材は、移植したときに組織再生基材の両面から細胞が侵入することができる一方、中央の細胞漏出防止層により侵入した細胞が組織再生基材の外に漏出してしまうことがないことから、極めて高い効率で組織の再生を促進することができる。

本発明の組織再生基材が上記細胞侵入層と上記細胞漏出防止層との二層が複合一体化した積層構造を有するものである場合、上記細胞漏出防止層の上記細胞侵入層側とは反対側の面に、更に、平均繊維径が０．１〜０．７μｍの繊維が集合した層（以下、「微細繊維集合体層」ともいう。）が積層されていてもよい。このような微細繊維集合体層を積層することにより、組織再生基材からの細胞の漏出をよりいっそう防止することができる。

上記微細繊維集合体層を構成する生体吸収性材料としては、上記細胞侵入層や細胞漏出防止層に用いるものと同様の生体吸収性材料を用いることができる。上記微細繊維集合体層を構成する生体吸収性材料は、上記細胞侵入層や細胞漏出防止層を構成する生体吸収性材料と同じであってもよく、異なっていてもよい。

上記微細繊維集合体層を構成する繊維の平均繊維径の好ましい下限は０．２μｍ、好ましい上限は０．６５μｍである。上記微細繊維集合体層の繊維がこの範囲にある場合に、上記細胞侵入層への細胞の侵入性や上記細胞侵入層中の細胞への栄養の供給性に影響することなく、組織再生基材からの細胞の漏出をよりいっそう防止することができる。上記微細繊維集合体層の繊維の平均繊維径のより好ましい下限は０．３μｍ、より好ましい上限は０．６μｍである。

上記微細繊維集合体層の厚さは特に限定されないが、好ましい下限は１．０μｍ、好ましい上限は１００μｍである。上記微細繊維集合体層の厚さが１．０μｍ未満であると、組織再生基材からの細胞の漏出を防止する効果が得られないことがあり、１００μｍを超えると、上記細胞侵入層への細胞の侵入性が低下したり、上記細胞侵入層中の細胞への栄養の供給が不充分となったりして、充分に組織の再生を促進できないことがある。上記微細繊維集合体層の厚さのより好ましい下限は１．５μｍ、より好ましい上限は８０μｍである。

本発明の組織再生基材は、上記細胞侵入層と上記細胞漏出防止層とが複合一体化している。
上記細胞侵入層と上記細胞漏出防止層とが複合一体化していないと、本発明の組織再生基材に細胞を播種したり、組織又は器官に移植したりする際に、上記細胞侵入層と上記細胞漏出防止層との一部又は全部が剥離してしまうことがある。上記細胞侵入層と上記細胞漏出防止層とが一部でも剥離すると、該剥離部に形成された空間に細胞溜まりが生じて、正常な組織又は器官が再生されないことがある。
なお、本明細書において上記細胞侵入層と上記細胞漏出防止層とが複合一体化しているとは、本発明の組織再生基材を組織又は器官に移植する際に、折り畳んで移植しても上記細胞侵入層と上記細胞漏出防止層とが剥離しないことを意味する。より定量的には、ＪＩＳ Ｌ １０２１−９に規定される剥離強さ試験方法に準じて測定された剥離強さが０．１Ｎ以上であることが好ましく、０．３Ｎ以上であることがより好ましい。

上記細胞侵入層と上記細胞漏出防止層とを複合一体化させる方法としては、医療用接着剤を用いて貼り合わせる方法や、細胞侵入層又は細胞漏出防止層の表面の一部を溶剤で溶解してから貼り合わせる方法等が考えられる。しかしながら、これらの方法で細胞侵入層と細胞漏出防止層とを接合した場合、接合面において各層の孔が塞がれてしまい、体液のスムーズな通過を妨げて、細胞侵入層における細胞への栄養の供給を阻害してしまうことがある。
本発明者らは、鋭意検討の結果、上記細胞侵入層を調製する工程と、上記細胞侵入層上に、メルトブロー法により生体吸収性材料からなる糸を吐出して上記細胞漏出防止層を形成して積層体を得る工程と、上記積層体にニードルパンチを行い、上記細胞侵入層と上記細胞漏出防止層とを複合一体化させる工程とを有する組織再生基材の製造方法によれば、接合面において塞孔することなく、細胞侵入層と細胞漏出防止層とを複合一体化できることを見出した。このような組織再生基材の製造方法もまた、本発明の１つである。（以下、「第１の本発明の組織再生基材の製造方法」ともいう。）
本発明者らは、また、鋭意検討の結果、上記細胞侵入層を調製する工程と、上記細胞漏出防止層を調製する工程と、得られた細胞侵入層と細胞漏出防止層とを積層して積層体を得る工程と、上記積層体にニードルパンチを行い、上記細胞侵入層と上記細胞漏出防止層とを複合一体化させる工程とを有する組織再生基材の製造方法によれば、接合面において塞孔することなく、細胞侵入層と細胞漏出防止層とを複合一体化できることを見出した。このような組織再生基材の製造方法もまた、本発明の１つである。（以下、「第２の本発明の組織再生基材の製造方法」ともいう。）
以下、本発明の組織再生基材の製造方法を詳しく説明する。（以下、第１の本発明の組織再生基材の製造方法と第２の本発明の組織再生基材の製造方法に共通する事項は、単に「本発明の組織再生基材の製造方法」ともいう。）

本発明の組織再生基材の製造方法では、まず、上記細胞侵入層を調製する工程を行う。
上記細胞侵入層を調製する方法は特に限定されず、例えば、エレクトロスピニングデポジション法、メルトブロー法、ニードルパンチ法、スパンボンド法、フラッシュ紡糸法、水流交絡法、エアレイド法、サーマルボンド法、レジンボンド法、湿式法等の従来公知の方法を用いることができる。なかでも、上記細胞侵入層の調製にはニードルパンチ法が好適である。

本発明の組織再生基材の製造方法では、上記細胞侵入層を調製する工程後に、上記細胞侵入層の上記細胞漏出防止層を積層する側の表面に羽毛立ち処理を施す工程を有することが好ましい。予め上記細胞侵入層の表面に羽毛立ち処理を施すことにより、上記細胞漏出防止層との密着性がより向上する。
上記羽毛立ち処理は、具体的には例えば、起毛機を用いて上記細胞侵入層の上記細胞漏出防止層を積層する側の表面を起毛処理する方法等が挙げられる。なお、上記細胞侵入層の製造方法としてニードルパンチ法を用いた場合には、得られた細胞侵入層の表面は既に起毛していることから、羽毛立ち処理を施したのと同様の効果が得られる。

第１の本発明の組織再生基材の製造方法では、次いで、上記細胞侵入層上に、メルトブロー法により生体吸収性材料からなる糸を吐出して上記細胞漏出防止層を形成して積層体を得る工程を行う。
メルトブロー法は、原料となる生体吸収性材料を１段階で不織布にする溶融紡糸法である。具体的には、押出機で溶融した生体吸収性材料を、幅方向に多数の口金を有するダイから繊維捕集点に向かって高温、高速の空気流で糸状に吹き出し、繊維状に延伸された樹脂をコンベア上で集積する。吐出から集積の間に繊維同士の絡み合い及び融着が起こることから不織布が形成される。第１の本発明の組織再生基材の製造方法では、上記細胞侵入層をコンベア上、メルトブロー法による繊維捕集点よりも手前となるように配置し、該細胞侵入層をコンベアで移動させながら、細胞侵入層上に繊維を吐出して細胞漏出防止層を形成させる。
この際、メルトブロー法のポリマー吐出量、吐出出口付近のエア風速、コンベアの速度等を調節することにより、形成される細胞漏出防止層の繊維径、密度、厚み等を制御することができる。

一方、第２の本発明の組織再生基材の製造方法では、上記細胞侵入層とは別に上記細胞漏出防止層を調製する工程を行い、得られた細胞侵入層と細胞漏出防止層とを積層して積層体を得る工程を行う。
上記細胞漏出防止層を調製する方法は特に限定されないが、例えば、メルトブロー法により生体吸収性材料からなる糸を吐出することにより形成することができる。
また、上記積層体は、細胞侵入層と細胞漏出防止層を重ね合わせることにより得ることができる。

本発明の組織再生基材の製造方法では、次いで、上記積層体にニードルパンチを行い、上記細胞侵入層と上記細胞漏出防止層とを複合一体化させる工程を行う。
ニードルパンチにより、接合面において各層の孔を塞ぐことなく、上記細胞侵入層と上記細胞漏出防止層とを確実に複合一体化させることができる。
なお、上記積層体にニードルパンチを行う際のニードルの進入方向は特に限定されない。

本発明の組織再生基材の製造方法では、次いで、上記積層体に熱セット処理を施してもよい。熱セット処理を施すことにより、得られる組織再生基材の表面が平滑となり、取り扱い性が向上することが期待できる。
上記熱セット処理の方法としては、例えば、上記積層体を構成するポリマーの結晶化点以上の温度下でローラープレスを施す方法等が挙げられる。

本発明の組織再生基材が上記微細繊維集合体層を有する場合には、例えば、上記細胞漏出防止層上にエレクトロスピニングデポジション法により微細繊維を吐出する方法により微細繊維集合体層を形成して積層体を形成した後、該積層体にニードルパンチを行い、上記細胞侵入層と上記細胞漏出防止層と上記微細繊維集合体層を複合一体化させる工程を行う。

本発明の組織再生基材は、上記細胞侵入層と細胞漏出防止層とが複合一体化した積層構造を有することから、組織の補強や組織再生の促進の足場として埋植したときに、細胞の捕捉性や侵入性に優れ、かつ、組織再生基材からの細胞の漏出を防止できることから、組織再生基材中における細胞の密度を高め、早期に組織が再生するのを促進することができる。より具体的には、例えば、軟骨、骨、皮膚、血管等の組織や器官の再生を目的とした再生医療用の基材として好適である。
これらの組織や器官の再生方法としては、例えば、再生しようとする組織や器官の部位に、本発明の組織再生基材を移植する方法が挙げられる。この際、本発明の組織再生基材に予め細胞を播種しておいてもよい。

また、本発明の組織再生基材は、肺漏、気管支断端、膵液瘻、胆汁漏等の早期治癒することが望ましい部位に貼付することにより、脆弱な組織の補強及び組織再生を促す足場として有用であり、特に組織の動きの少ない気管支断端、膵液瘻、胆汁漏等の部位に添付した場合にその効果が顕著である。
本発明の組織再生基材は、手術後、脆弱な組織を覆うように貼付する。自動縫合器を使用する場合には、本発明の組織再生基材を組織に貼りつけた後に自動縫合器を用いて縫合操作を行うことにより、肺の空気漏れや種々の組織からの体液漏れを防止できる点でも有用である。

本発明によれば、細胞の侵入性に優れるとともに、組織再生基材からの細胞の漏出を効果的に防止して、組織の再生を促進することができる組織再生基材、及び、該組織再生基材の製造方法を提供することができる。

バブルポイント法による不織布の孔径分布の測定方法を説明する模式図である。 バブルポイント法によって得られたデータから不織布の孔径分布を推算する方法を説明する模式図である。 実施例及び比較例における評価方法を説明する模式図である。

以下に実施例を挙げて本発明の態様を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例にのみ限定されるものではない。

（実施例１）
（１）細胞侵入層の調製
生体吸収性材料として重量平均分子量が２５００００のポリグリコリドを用い、これを紡糸して得た糸からなる布をニードルパンチ法により不織布化する方法により、平均繊維径が約１６μｍ、厚さが約１．５ｍｍの細胞侵入層を得た。

なお、得られた細胞侵入層に、湿潤液としてフッ素系溶媒（商品名Ｐｏｒｏｆｉｌ（商標））を吸収させた後、日本ベル社製のＰｏｒｏｍｅｔｅｒ ３Ｇに試験片寸法が直径２５ｍｍの円状になるように設置し、細胞侵入層の裏側から空気圧をかけて、膜表面に気泡の発生が観察できる最小圧力（バブルポイント）を測定した。得られたバブルポイントをもとに細胞侵入層の孔径分布を示すグラフを得て、該グラフより平均孔径を算出したところ、２８μｍであった。

（２）細胞漏出防止層の積層
得られた細胞侵入層を、メルトブロー法による繊維捕集点よりも手前となるようにコンベア上に設置した。コンベアを移動させながら、細胞侵入層上にメルトブロー法によりポリグリコリドからなる糸を吐出して細胞漏出防止層を積層した。
メルトブロー法は、原料として重量平均分子量が２５００００のポリグリコリドを用い、ポリマー吐出量０．２ｋｇ／ｈ、吐出出口付近のエア風速１１ｍ／秒の条件として行った。また、コンベアの移動速度は、上記メルトブロー法により得られる細胞漏出防止層の密度が１０ｇ／ｍ^２となる速度に設定した。
なお、別に同様の条件で細胞漏出防止層のみを製造し、バブルポイント法により細胞漏出防止層の平均孔径を算出したところ、１２μｍであった。

（３）細胞侵入層と細胞漏出防止層との複合一体化
得られた積層体の細胞漏出防止層側からニードルが進入するようにニードルパンチを行い、細胞侵入層と細胞漏出防止層とを複合一体化させた。

（実施例２）
細胞侵入層の調製において、ニードルパンチ法により得た細胞侵入層に熱プレス処理を施して表面を平滑にした以外は実施例１と同様にして、組織再生基材を得た。

（実施例３）
細胞侵入層の調製において、ニードルパンチ法により得た細胞侵入層に熱プレス処理を施して表面を平滑にした後、真鍮製のブラシによりブラッシングを施す方法により羽毛立ち処理を施し、細胞漏出防止層を羽毛立ち処理を施した側に積層した以外は実施例１と同様にして、組織再生基材を得た。

（実施例４）
（１）細胞侵入層の調製
生体吸収性材料として重量平均分子量が２５００００のポリグリコリドを用い、これを紡糸して得た糸からなる布をニードルパンチ法により不織布化する方法により、平均繊維径が約１６μｍ、厚さが約１．５ｍｍの細胞侵入層と、平均繊維径が約１６μｍ、厚さが約０．５ｍｍの細胞侵入層の２種の細胞侵入層を得た。
なお、得られた細胞侵入層について、バブルポイント法により平均孔径を算出したところ、いずれも２８μｍであった。

（２）細胞漏出防止層の調製
生体吸収性材料として重量平均分子量が２５００００のポリグリコリドを用い、メルトブロー法により、平均繊維径が約２μｍ、厚さが約５０μｍの細胞漏出防止層を得た。なお、得られた細胞漏出防止層について、バブルポイント法により平均孔径を算出したところ、１２μｍであった。

（３）細胞侵入層と細胞漏出防止層との複合一体化
厚さが約１．５ｍｍの細胞侵入層、厚さが約５０μｍの細胞漏出防止層、及び、厚さが約０．５ｍｍの細胞侵入層をこの順に重ね合わせて三層構造の積層体を得た。
得られた三層構造の積層体の厚さが約０．５ｍｍの細胞侵入層の側からニードルパンチを行い、三層を複合一体化させて、組織再生基材を得た。

（比較例１）
生体吸収性材料として重量平均分子量が２５００００のポリグリコリドを用い、これを紡糸して得た糸からなる布をニードルパンチ法により不織布化する方法により、平均繊維径が約１６μｍ、厚さが約１．５ｍｍの不織布を得、これを組織再生基材とした。なお、得られた不織布について、バブルポイント法により平均孔径を測定したところ２８μｍであった。

（比較例２）
生体吸収性材料として重量平均分子量が２５００００のポリグリコリドを用い、メルトブロー法により、平均繊維径が約２μｍ、厚さが約５０μｍの不織布を得、これを組織再生基材とした。なお、得られた不織布について、バブルポイント法により平均孔径を測定したところ１２μｍであった。

（比較例３）
ニードルパンチによる複合一体化処理を行わなかった以外は実施例１と同様にして、組織再生基材を得た。

（比較例４）
ニードルパンチによる複合一体化処理を行わなかった以外は実施例２と同様にして、組織再生基材を得た。

（比較例５）
ニードルパンチによる複合一体化処理を行わなかった以外は実施例３と同様にして、組織再生基材を得た。

（評価）
実施例及び比較例で得た組織再生基材について、以下の方法により評価を行った。
結果を表１に示した。

（１）粒子補足率の評価
平均粒子径が２０μｍのポリスチレン粒子を、エタノール水溶液（水／エタノール（体積比）＝８０／２０）に分散させた粒子分散液を調製した。
組織再生基材を２０ｍｍ×２０ｍｍの正方形に切断し、金属メッシュ上に固定した。組織再生基材の細胞侵入層側（実施例４においては、厚さが約１．５ｍｍの細胞侵入層側）から、粒子分散液２ｍＬをゆっくりと滴下して、組織再生基材を透過させた。透過前後の粒子分散液の波長２３０ｎｍにおける吸光度を測定し、濃度既知のポリスチレンラテックス粒子分散液の吸光度測定より得た検量線を用いて粒子濃度（個／ｍＬ）を算出した。得られた透過前後の粒子分散液の粒子濃度と、透過前後の分散液の重量より計算した分散液体積を用いて透過前後の粒子分散液中の粒子数を求め、下記式により粒子補足率（％）を算出した。
粒子補足率（％）＝（透過前の粒子分散液中の粒子数−透過後の粒子分散液中の粒子数）／透過前の粒子分散液中の粒子数

（２）細胞保持性の評価
図３に示した培養方法により、組織再生基材に細胞を播種し、その増殖を評価した。
即ち、シャーレ４上に、スポンジ状体５を配置し、培養液６をスポンジ状体５の表面が液状になるように注いだ。（これにより、培養液はスポンジ状体５からのみ供給される。）このスポンジ状体５の上に、実施例及び比較例で製造した組織再生基材７を配置した。なお、実施例及び比較例３〜５では、細胞漏出防止層側を下にしてスポンジ状体５に接するようにした。また、実施例４では、厚さが約０．５ｍｍの細胞侵入層側を下にしてスポンジ状体５に接するようにした。
このような状態で配置した組織再生基材７に、１×１０^５個／ｃｍ^２の播種密度となるように線維芽細胞を播種した。その後、１日毎に培養液６を交換しながら７日間培養した。７日間培養後に組織再生基材７に含まれる細胞数を、ＭＴＴアッセイ法により計数し、比較例１の組織再生基材に含まれる細胞数を１００として、他の実施例及び比較例の組織再生基材に含まれる細胞数を表した。結果を表１に示した。

（３）複合一体性の評価（定性評価）
細胞再生基材の複合一体性を以下の基準により評価した。
◎：組織再生基材を折り畳んだときに細胞侵入層と細胞漏出防止層とが剥離することがなく、かつ細胞侵入層と細胞漏出防止層とを手で剥離させようとすると先に細胞侵入層又は細胞漏出防止層が破断した。
○：組織再生基材を折り畳んだときに細胞侵入層と細胞漏出防止層とが剥離することがなく、かつ細胞侵入層と細胞漏出防止層とを手で剥離させようとしても容易には剥離できなかった。
△：組織再生基材を折り畳んだときに細胞侵入層と細胞漏出防止層との一部が剥離してしまい、かつ細胞侵入層と細胞漏出防止層とを手で容易に剥離できた。
×：組織再生基材を折り畳んだときに細胞侵入層と細胞漏出防止層とが全部剥離してしまい、かつ細胞侵入層と細胞漏出防止層とを手で容易に剥離できた。

（４）複合一体性の評価（定量評価）
細胞再生基材の複合一体性を、ＪＩＳ Ｌ １０２１−９に規定される剥離強さ試験方法に準じて剥離強さを測定して評価した。
具体的には、まず得られた組織再生基材を横２０ｍｍ×縦５０ｍｍに細切し、細胞侵入層と細胞漏出防止層とを手で予め縦方向に２５ｍｍ剥離してつかみ部を形成したものをサンプルとした。得られたサンプルの各々の層のつかみ部をチャックではさみ（つかみ距離２０ｍｍ）、オートグラフ（島津製作所社製「ＡＧＳ−Ｊ」、ロードセル５０Ｎ）を用いて引張速度１００ｍｍ／ｍｉｎの条件で引っ張り、剥離強さを測定した。なお、ＪＩＳ Ｌ １０２１−９では、サンプルは横５０ｍｍ×縦２００ｍｍ、あらかじめ剥離する長さ（つかみ部長さ）は５０ｍｍとされているが、細胞再生基材が組織又は器官に移植するものであることを考慮して上記サンプルとした。また、同ＪＩＳでは、サンプルは恒温恒湿室（２０℃、６５％）で２４時間静置することとなっているが、本サンプルは分解性高分子からなる基材であることからこの操作は省略し、サンプル作製直後に測定を行った。
実施例４の細胞再生基材では、サンプル調製において、２０ｍｍ×５０ｍｍの試験片の各層を縦方向に２５ｍｍまで剥離し、厚さが約１．５ｍｍの細胞侵入層と厚さが約５０μｍの細胞漏出防止層とをそれぞれチャックではさみ、上記条件下で引張試験を行って、この二層の間の剥離強さを測定した。

本発明によれば、細胞の侵入性に優れるとともに、組織再生基材からの細胞の漏出を効果的に防止して、組織の再生を促進することができる組織再生基材、及び、該組織再生基材の製造方法を提供することができる。

４ シャーレ
５ スポンジ状体
６ 培養液
７ 組織再生基材

Claims (10)

1. 生体吸収性材料からなる不織布からなる組織再生基材であって、
   平均孔径が２０〜５０μｍである不織布からなる層と、平均孔径が５〜２０μｍである不織布からなる層とが複合一体化した積層構造を有する
   ことを特徴とする組織再生基材。
2. 平均孔径が２０〜５０μｍである不織布からなる層と、平均孔径が５〜２０μｍである不織布からなる層と、平均孔径が２０〜５０μｍである不織布からなる層との三層がこの順に複合一体化した積層構造を有することを特徴とする請求項１記載の組織再生基材。
3. 平均孔径が２０〜５０μｍである不織布の平均繊維径が１０〜５０μｍであり、かつ、平均孔径が５〜２０μｍである不織布の平均繊維径が０．７〜７μｍであることを特徴とする請求項１又は２記載の組織再生基材。
4. 平均孔径が２０〜５０μｍである不織布からなる層の厚さが３００μｍ〜２．０ｍｍであることを特徴とする請求項１、２又は３記載の組織再生基材。
5. 平均孔径が５〜２０μｍである不織布からなる層の厚さが１０〜１５０μｍであることを特徴とする請求項１、２、３又は４記載の組織再生基材。
6. 生体吸収性材料は、ポリグリコリドであることを特徴とする請求項１、２、３、４又は５記載の組織再生基材。
7. ポリグリコリドの重量平均分子量が３００００〜４０００００であることを特徴とする請求項６記載の組織再生基材。
8. 請求項１、２、３、４、５、６又は７記載の組織再生基材を製造する方法であって、
   平均孔径が２０〜５０μｍである不織布からなる層を調製する工程と、
   前記平均孔径が２０〜５０μｍである不織布からなる層上に、メルトブロー法により生体吸収性材料からなる糸を吐出して平均孔径が５〜２０μｍである不織布からなる層を形成して積層体を得る工程と、
   前記積層体にニードルパンチを行い、前記平均孔径が２０〜５０μｍである不織布からなる層と前記平均孔径が５〜２０μｍである不織布からなる層とを複合一体化させる工程とを有する
   ことを特徴とする組織再生基材の製造方法。
9. 請求項１、２、３、４、５、６又は７記載の組織再生基材を製造する方法であって、
   平均孔径が２０〜５０μｍである不織布からなる層を調製する工程と、
   平均孔径が５〜２０μｍである不織布からなる層を調製する工程と、
   前記平均孔径が２０〜５０μｍである不織布からなる層と前記平均孔径が５〜２０μｍである不織布からなる層とを積層して積層体を得る工程と、
   前記積層体にニードルパンチを行い、前記平均孔径が２０〜５０μｍである不織布からなる層と前記平均孔径が５〜２０μｍである不織布からなる層とを複合一体化させる工程とを有する
   ことを特徴とする組織再生基材の製造方法。
10. 平均孔径が２０〜５０μｍである不織布からなる層を調製する工程後に、平均孔径が２０〜５０μｍである不織布からなる層の平均孔径が５〜２０μｍである不織布からなる層を積層する側の表面に羽毛立ち処理を施す工程を有することを特徴とする請求項８又は９記載の組織再生基材の製造方法。
    

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