CN105979977A - 支架 - Google Patents

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Abstract

一种用于组织修复或者伤口敷料的支架，该支架包括：材料层；聚合物纤维层；以及材料层和聚合物纤维层之间的粘合组件，其中，粘合组件包含与材料层和聚合物纤维层相比具有较低的熔融温度(Tm)的材料。

Description

支架
技术领域
本发明涉及用于组织修复的生物可降解的支架、制备这种支架的方法以及它们的用途。
背景技术
肌腱炎症以及年龄相关的退化导致肩痛，其影响了大于30％的群体。当保守治疗失败时，越来越普遍地进行肩袖手术，其中自从2001起在英国其速率已经增长超过500％。然而，通过临床和成像研究已经质疑了肩袖修复手术的有效性，表明20-90％的案例中修复的结构失效。为了应对这个问题，已经提出了新的修复策略。其中，由于可降解的合成支架可以结合良好调节的机械特性、生物添加剂、以及通过及时地完全吸收而最小化感染的风险，因此它们的使用已经示出了高潜力。然而，就生物相容性或者机械特性而言，这些支架仍是受限的。
在将这些生物可降解的聚合物加工成支架的所有技术之中，静电纺丝已经是近十年的方法中最有希望的一种。其产生亚微米纤维结构，该亚微米纤维结构可以模仿肌腱中胶原纤维的超微结构和取向，并且甚至模仿在肌腱至骨插入位点处从线形取向至无规取向的转变。已经表明，大量线形支架引导细胞取向以及影响基质蛋白的表达(Moffat2009Tissue Eng Part A,Xie 2010Nanoscale,Yin 2010Biomaterials,Beason 2012JShoulder Elbow research)。一些研究者还已经提出将化学的或生物的组分包含至合成支架以增强它们的生物性能(Ker 2011Biomaterials,Dines 2012Growth Factors)。由聚二噁烷酮(PDO)制备的静电纺丝结构的体外研究已经表现出优异的细胞响应以及与人类腱细胞的生物相容性(Hakimi 2012J Biomed Mat Res,Hakimi 2012Eur Cell Mater)。进一步的评估还已经证实了，相比于加工至素铁中的相同材料，静电纺丝材料可能导致体内降低的免疫应答。动物模型中的合成可降解贴片的初步功效测试同样示出了良好的结果。植入在鼠模型中的静电纺丝的线形PCL也是良好耐受的，具有至多达8周的良好的细胞渗透(Beason,D.P.et al.Special issue on rotator cuff biology and healing Fiber-aligned polymer scaffolds for rotator cuff repair in a rat model.Volume 21,Issue 2,February 2012,Pages 245-250)。然而，尽管静电纺丝材料示出了优异的细胞和组织响应，但是主要缺点是它们不良的机械特性。这个问题已经知晓很长一段时间，但是仍没有适当地解决并且通常在肌骨胳的组织工程中被低估。
已经发展了一些策略来改善静电纺丝支架的机械特性。许多作者已经试图通过更佳的纤维排列、或者后处理如交联和粘结以改善材料本身，但是那些技术提供通常低于需要范围的受限的机械改良。其他方法包括，通过共静电纺丝方法、多层压、或者通过将静电纺丝层与单纤丝、非编织的织物以及编织的织物结合，与其他材料加固。编织的织物(包括针织、编制、和刺绣)的使用是特别有趣的，因为独立地，这种基质已经能够提供相当于天然肌腱的机械特性。当将织物与静电纺丝支架结合时，报道的主要问题是两种材料之间的粘结。为了解决这个难题，一些作者已经建议使用其中将织物沉浸的粘合溶液。随后纤维沉积在润湿表面上并且使最终的复合物经受干燥。其他人已经相信在沉积的纤维中剩余溶剂的存在通过直接在其上静电纺丝生成与针织织物的粘结。还已经尝试了化学处理和等离子体处理以改善粘结。
发明内容
本发明的目的是提供用于生产层状支架(优选地具有合适的机械特性和生物特性)的改善方法。
根据本发明的第一方面，提供用于组织修复或者伤口敷料的支架，包括：
材料层；
聚合物纤维层；以及
材料层和聚合物纤维层之间的粘合组件，其中，与材料层和聚合物纤维层相比，粘合组件具有较低的熔融温度(Tm)。
可以将材料层和聚合物纤维层粘结至粘合组件，并且经由粘合组件进行粘结。粘结可以是通过纤维缠结。粘结可以是通过化学键、范德华力、和/或纤维缠结。在粘结期间/在熔融粘合层之后，粘合层的熔融材料可以渗透材料层和聚合物纤维层的裂缝或孔、和/或信封纤维(包封纤维，envelop fibre)，在将粘合层冷却至低于它的Tm时，其可以固定在原位。
有利地，通过在高于粘合组件的Tm温度下熔融，粘合组件的较低Tm允许将粘合组件粘结至材料层和聚合物纤维层，而没有破坏材料层或者聚合物纤维层的结构。这提供了适合作为用于组织修复或伤口敷料的组织支架的支架。有利地，聚合物纤维层的孔隙率、孔形态和/或完整性不会受到粘合剂或者粘结方法的损害。
该支架可以是生物可降解的。可替代地，该支架可以是不生物可降解的。在支架的上下文中，在本文中使用的术语“生物可降解的”可以认为是由在使用其的环境中，例如在水中、哺乳动物身体或组织中，随着时间而降解的材料形成的支架。该支架可以是能够被活生物体分解的。可以通过破裂和/或溶解进行降解。可以通过代谢进行降解，如酶催降解。可以通过水解进行降解。降解可以部分的或完全的。对于开始降解的时间可以是约5天至约2年之间。对于开始降解的时间可以是约0天至约6个月之间、或者约0天至约2年之间。对于完全降解的时间可以取决于支架的用途或者应用。对于完全降解的时间可以是约3天至约2年之间。对于完全降解的时间可以是约3天至约6个月之间。对于完全降解的时间可以是约30天至约1年之间。对于完全降解的时间可以是不超过2个月、3个月或者4个月。
粘合组件的降解速率可以是小于/慢于聚合物纤维层和/或材料层的降解速率。粘合组件的降解速率可以是至少80％、70％、60％或50％的小于/慢于聚合物纤维层和/或材料层的降解速率。这可以有利地预防支架的过早瓦解。
支架可以是生物相容的。在本文中使用的术语“生物相容的”可以认为是涵盖将打算被使用的量对哺乳动物身体或组织是非毒性的材料。术语“生物相容的”还可以认为是表示在哺乳动物身体或者组织中为生物可降解的材料。还可以将生物相容的认为是不是过敏原的或者免疫刺激剂的材料。还可以将生物相容的认为是涵盖在哺乳动物的身体或者组织中是惰性的材料。
该支架可以是合成的。在生物可降解的合成支架的上下文中，在本文中使用的术语“合成的”可以认为是非天然的材料或者起源。例如，在支架中使用的材料可能不是在自然中发现的。该支架的材料可以不是由从有机体回收的组织外植体材料部分地或者完全地形成。
材料层可以包含聚合物或者由聚合物组成。材料层可以包括编织层或者由编织层组成。材料层可以包括针织层或者由针织层组成。材料层可以包括刺绣层或者由刺绣层组成。材料层可以包括编织的聚合物或者由编织的聚合物组成。可替代地，材料层可以包括非编织的聚合物纤维或者由非编织的聚合物纤维组成。材料层可以包括与聚合物纤维层基本上相同的材料和/或结构。材料层和/或聚合物纤维层可以包括静电纺丝的聚合物或者由静电纺丝的聚合物组成。材料层可以包括静电纺丝的聚合物或者由静电纺丝的聚合物组成。材料层可以包括不光滑的(matt)或者网格状(mesh)的聚合物纤维或纱线或者由不光滑的或者网格状的聚合物纤维或纱线组成。
材料层可以包括任何已知的组织支架或者由任何已知的组织支架组成，如陶瓷支架。材料层可以是多孔的。材料层可以是渗透性的或者不可渗透性的。材料层可以包括不可渗透的膜或者由不可渗透的膜组成。不可渗透的膜可以是对细胞不可渗透性的，例如，形成屏障以控制细胞迁移、渗透和/或定殖(集群，colonisation)。该不可渗透的膜可以是对液体不可渗透性的。不可渗透的膜可以是对蛋白质或者其他生物活性分子不可渗透性的。不可渗透的膜可以是聚合物鞘(sheath)。材料层可以包括具有基本上等于或者大于待修复的组织如肌腱的机械强度的机械强度的材料。材料层可以包括结构支撑层或者材料。材料层可以包括PDO移植物的表面或者由PDO移植物的表面组成。材料层可以包括3D打印结构或者3D铸造结构的表面或者由3D打印结构或者3D铸造结构的表面组成。材料层可以包括膜或者由膜组成。材料层可以包括缝线或者由缝线组成。材料层可以包括移植物的表面或者由移植物的表面组成，如金属移植物。
材料层和聚合物纤维层可以包括相同的材料或者不同的材料或者由相同的材料或者不同的材料组成。材料层和聚合物纤维层可以源自相同的制造方法，如静电纺丝。
有利地，材料层如编织组件(woven component)可以为可生物降解支架提供机械强度，例如足够高以在修复期间支撑肌腱组织的机械强度。
在编织组件的上下文中，在本文中使用的术语“编织”可以认为是交织的材料细线，其中，在一个方向将一系列的细线排列并且通过另一系列的细线通过。可以基本上相互交叉地排列细线，例如基本上垂直。也可以将细线可交替地向上以及向下相互交叉。可以通过在织机上编织形成编织组件。交织可以基本上是均匀的和/或规则的。编织组件可以包括交织的经细线和纬细线。编织组件可以包括任何编织图案，或者编织图案的组合。编织组件可以包含平纹编织物；可替代地，缎纹编织物或者斜纹编织物。编织组件可以包括3D编织(多层的编织，例如具有垂直与水平二者的编织结构)。编织组件可以包括刺绣，例如以改善在编织区域中的机械强度，例如用于缝线保留特性。
其中材料层包含聚合物或者由聚合物组成，聚合物可以包括生物相容的聚合物或者由生物相容的聚合物组成。聚合物可以包括脂肪族的聚合物、生物可降解的聚酯、或者其他生物可降解的聚合物或者由脂肪族的聚合物、生物可降解的聚酯、或者其他生物可降解的聚合物组成。该聚合物可以是热塑性的。该聚合物可以包括PGA(聚乙交酯)、PLGA(聚(乳酸-共-乙醇酸))、PLLA(聚l-乳酸)、或PDO(聚二噁烷酮)或者由PGA(聚乙交酯)、PLGA(聚(乳酸-共-乙醇酸))、PLLA(聚l-乳酸)、或PDO(聚二噁烷酮)组成。聚合物可以包括聚二噁烷酮(PDO)或者由聚二噁烷酮(PDO)组成。聚合物可以包括PCL(聚已酸内酯)。
聚合物纤维层可以包含选自以下组的任何聚合物或者由其组成，该组包括：聚(α-羟基酸)、聚乳酸或聚乙醇酸、聚-交酯聚乙交酯共聚物、聚交酯聚乙二醇(PEG)共聚物、聚酯、聚(ε-己内酯)、聚(3-羟基-丁酸酯)、聚(s-己酸)、聚(对二噁烷酮)、聚(富马酸丙二醇酯)、聚(原酸酯)、多元醇/双烯酮缩醛加成聚合物、聚酐、聚(癸二酸酐)(PSA)、聚(羧基双羧基苯氧基苯氧基己烷)(PCPP)、聚[双(对羧基苯氧基)甲烷](PCPM)，SA、CPP和CPM的共聚物，聚(氨基酸)，聚(伪氨基酸)，聚磷腈，聚[(二氯)磷腈]、聚[(有机)磷腈]聚合物的衍生物，聚磷酸酯/盐(polyphosphate)，聚乙二醇聚丙烯嵌段共聚合物，天然聚合物，蚕丝，弹性蛋白，壳质，壳聚糖，纤维蛋白，纤维蛋白原，多糖(包括果胶)，藻酸盐(alginate)，胶原，聚(氨基酸)，肽、多肽或蛋白质，由这些聚合物的单体、这些聚合物的无规共混物或它们的混合物以及它们的组合制备的共聚合物。
材料层可以包含单纤丝、纤维或者纱线或者由单纤丝、纤维或者纱线组成。纤维可以由纺丝，如静电纺丝形成。材料层可以包含静电纺丝的聚合物或者由静电纺丝的聚合物组成。材料层的单纤丝、纤维或者纱线的直径可以是在约3nm至约2mm之间。材料层的单纤丝、纤维或者纱线的直径可以是在约3nm至约1mm之间。材料层的单纤丝、纤维或者纱线的直径可以是在约3nm至约500μm之间。材料层的单纤丝、纤维或者纱线的直径可以是在约3nm至约200μm之间。材料层的单纤丝、纤维或者纱线的直径可以是在约3nm至约100μm之间。材料层的单纤丝、纤维或者纱线的直径可以是在约10nm至约200μm之间。材料层的单纤丝、纤维或者纱线的直径可以是在约100nm至约200μm之间。材料层的单纤丝、纤维或者纱线的直径可以是在约500nm至约200μm之间。材料层的单纤丝、纤维或者纱线的直径可以是在约1μm至约200μm之间。材料层的单纤丝、纤维或者纱线的直径可以是在约1μm至约500μm之间。材料层的单纤丝、纤维或者纱线的直径可以是100μm或更小。材料层的单纤丝、纤维或者纱线的直径可以是150μm或更小。材料层的单纤丝、纤维或者纱线在直径上可以是50μm或更小。材料层的纤维可以是基本上对齐的。
有利地，提供100μm或更小直径的材料层的单纤丝、纤维或者纱线可以改善至粘合组件的粘结。
材料层可以是多孔的。材料层可以是无孔的。材料层的孔隙率可以是在约0％至约99％的空隙/体积之间。材料层的孔隙率可以是在约0％至约50％之间。材料层的孔隙率可以是在约50％至约99％之间。材料层的孔隙率可以是至少约40％。材料层的孔隙率可以是至少约50％。材料层的孔隙率可以是至少约80％。材料层的孔隙率可以是至少约90％。材料层的孔隙率可以是小于约50％。材料层的孔隙率可以是小于约30％。材料层的孔隙率可以是小于约20％。材料层的平均孔径，或者基本上每个孔径在直径上可以是至少4μm。材料层的平均孔径，或者基本上每个孔径在直径上可以是至少10μm。材料层的平均孔径，或者基本上每个孔径在直径上可以是至少12μm。材料层的平均孔径，或者基本上每个孔径在直径上可以是至少100μm。材料层的平均孔径，或者基本上每个孔径在直径上可以是100μm或更小。材料层的平均孔径，或者基本上每个孔径在直径上可以是1μm或更小。材料层的平均孔径，或者基本上每个孔径在直径上可以是在约4μm至约100μm之间。材料层的平均孔径，或者基本上每个孔径在直径上可以是在约8μm至约20μm之间。
聚合物纤维层可以由纤维形成。聚合物纤维层的纤维可以由纺丝，如静电纺丝形成。聚合物纤维层可以包含静电纺丝的聚合物。聚合物纤维层的纤维的直径可以是在约10nm至约10μm之间。聚合物纤维层的纤维的直径可以是在约5nm至约50μm之间。聚合物纤维层的纤维的直径可以是在约8nm至约20μm之间。纤维可以基本上在相同的方向取向(例如，基本上对齐的)。可替代地，纤维可以是无规取向的。聚合物纤维层可以包含基本上不均匀的和/或不规则的交织或者缠结的纤维或者由其组成。聚合物纤维层的纤维可以是机械地、热地、或者化学的粘结在一起。聚合物纤维层可以包含无规的和对齐的纤维的混合物。聚合物纤维层的纤维可以是以规则的和/或均匀的图案进行排列。可以将聚合物纤维层的纤维排列成网格。聚合物纤维层可以包括包含纳米级或微米级的规则的或不规则的孔、裂缝、沟槽、和/或拉伸结构(例如通过3D打印制备)的聚合物的层。可以以规则的图案空间排列孔、裂缝、沟槽、和/或拉伸结构，或者可以不规则地空间排列孔、裂缝、沟槽、和/或拉伸结构。
聚合物纤维层可以是非编织的。在聚合物纤维层的上下文中，在本文中使用的术语“非编织的”可以认为是那些不是以编织的图案排列的，或者没有通过编织(例如在织机中)制造的材料的纤维。在聚合物纤维层的上下文中，在本文中使用的术语“非编织的”可以认为是由不同于编织，如静电纺丝或者三维打印制备的材料的层。
纺丝，特别是静电纺丝，有利地允许在支架生产期间因子(例如，生物活性分子如生长因子或者维生素)的截留，因此将活性成分合并在纤维内。静电纺丝可以有利地提供高的比表面积，例如用于主动递送。高表面积提供更佳的生物活性剂的释放分布并且控制释放。可以在静电纺丝之前(在聚合物溶液中)或者在静电纺丝之后(通过吸附，通过高的比表面积促进)将活性剂并入。纺丝，特别是静电纺丝，有利地允许具有与细胞外基质相似的尺寸的纤维的生产，从而模仿细胞环境，提供细胞信号传递以及经由地貌特征引导。
聚合物纤维层可以包含聚合物如生物相容的聚合物或者由其组成。聚合物纤维层可以包含脂肪族的聚合物、生物可降解的聚酯、或者其他生物可降解的聚合物或者由其组成。聚合物可以是热塑性的。聚合物纤维层可以包含PGA(聚乙交酯)、PLGA(聚(乳酸-共-乙醇酸))、PLLA(聚l-乳酸)、或PDO(聚二噁烷酮)，或者由其组成。聚合物纤维层可以包含聚二噁烷酮(PDO)或者由其组成。
聚合物纤维层可以包含选自以下组的任何聚合物或者由其组成，该组包括聚(α-羟基酸)、聚乳酸或聚乙醇酸、聚-交酯聚乙交酯共聚物、聚交酯聚乙二醇(PEG)共聚物、聚酯、聚(ε-己内酯)、聚(3-羟基-丁酸酯)、聚(s-己酸)、聚(对二噁烷酮)、聚(富马酸丙二醇酯)、聚(原酸酯)、多元醇/双烯酮缩醛加成聚合物、聚酐、聚(癸二酸酐)(PSA)、聚(羧基双羧基苯氧基苯氧基己烷)(PCPP)、聚[双(对羧基苯氧基)甲烷](PCPM)，SA、CPP和CPM的共聚物，聚(氨基酸)，聚(伪氨基酸)，聚磷腈，聚[(二氯)磷腈]、聚[(有机)磷腈]聚合物的衍生物，聚磷酸酯，聚乙二醇聚丙烯嵌段共聚合物，天然聚合物，蚕丝，弹性蛋白，壳质，壳聚糖，纤维蛋白，纤维蛋白原，多糖(包括果胶)，藻酸盐，胶原，聚(氨基酸)，肽、多肽或蛋白质，由这些聚合物的单体、这些聚合物的无规共混物或它们的混合物以及它们的组合制备的共聚合物。
聚合物纤维层可以是多孔的，如足够的孔以允许生物活性分子、或者蛋白质、或者细胞、或者血管的通过。聚合物纤维层的平均孔径、或者基本上每个孔径在直径上可以是至少4μm。聚合物纤维层的平均孔径、或者基本上每个孔径在直径上可以是至少10μm。聚合物纤维层的平均孔径，或者基本上每个孔径在直径上可以是至少12μm。聚合物纤维层的平均孔径，或者基本上每个孔径在直径上可以是至少100μm。聚合物纤维层的平均孔径，或者基本上每个孔径在直径上可以是至少150μm。聚合物纤维层的平均孔径，或者基本上每个孔径在直径上可以是至少500μm。聚合物纤维层的平均孔径，或者基本上每个孔径在直径上可以是至少1mm。聚合物纤维层的平均孔径，或者基本上每个孔径在直径上可以是100μm或更小。聚合物纤维层的平均孔径，或者基本上每个孔径在直径上可以是1μm或更小。聚合物纤维层的平均孔径，或者基本上每个孔径在直径上可以是在约4μm至约100μm之间。聚合物纤维层的平均孔径，或者基本上每个孔径在直径上可以是在约8μm至约20μm之间。聚合物纤维层的平均孔径，或者基本上每个孔径在直径上可以是在约1nm至约500μm之间。聚合物纤维层的平均孔径，或者基本上每个孔径可以足够大以足以容许细胞通过和/或血管生长。聚合物纤维层的孔隙率可以是在约0％至约99％的空隙/体积之间。聚合物纤维层的孔隙率可以是在约0％至约50％之间。聚合物纤维层的孔隙率可以是在约50％至约99％之间。聚合物纤维层的孔隙率可以是至少约40％。聚合物纤维层的孔隙率可以是至少约50％。聚合物纤维层的孔隙率可以是至少约80％。聚合物纤维层的孔隙率可以是至少约90％。聚合物纤维层的孔隙率可以是小于约50％。聚合物纤维层的孔隙率可以是小于约30％。
有利地，高孔隙度的聚合物纤维层允许细胞和/或蛋白质的有效截留以及血管长入。
材料层和聚合物纤维层可以包含基本上相同的材料，如基本上相同的生物相容的聚合物。可替代地，聚合物层和聚合物纤维层可以包含不同的材料。不同的材料可以具有基本上相似的特性，如基本上相同的熔融温度。基本上相同的熔融温度可以是Tm上约15℃的差异之内，Tm上约10℃的差异之内，Tm上约5℃的差异之内，或者Tm上约2℃的差异之内。基本上相同的熔融温度可以是Tm上约1℃的差异之内。
粘合组件可以包含聚合物或者由聚合物组成。粘合组件可以包含生物相容的聚合物或者由生物相容的聚合物组成。粘合组件可以包含热塑性聚合物或者由热塑性聚合物组成。粘合组件可以包含热塑性、生物相容的聚合物或者由热塑性生物相容的聚合物组成。粘合组件可以包含生物相容的、静电纺丝的聚合物或者由其组成。粘合组件可以包含热塑性、生物相容的、静电纺丝的聚合物或者由其组成。粘合组件可以包含共聚物，如PCL与一种或多种其他聚合物的共聚物或者由其组成。粘合组件可以包含具有110℃或更小的Tm的聚合物或者由其组成。粘合组件可以包含具有约65℃至约70℃之间的Tm的聚合物或者由其组成。粘合组件可以包含具有小于材料层和聚合物纤维层的Tm的Tm的任何聚合物或者由其组成。粘合组件可以包含聚已酸内酯(PCL)或者由聚已酸内酯(PCL)组成。粘合组件可以包含PGLA或者由PGLA组成。粘合组件可以包含PDO或者由PDO组成。
粘合组件可以包含纤维或者由纤维组成。粘合组件可以包含粉末或者由粉末组成。粘合组件可以包括片材(sheet material)，如穿孔的片材或者由其组成。粘合组件可以包含静电纺丝的聚合物或者由其组成。粘合组件的纤维可以由纺丝，如静电纺丝形成。粘合组件的纤维可以是由纺丝，如静电纺丝在网格上形成的。该网格可以是以规则的空隙图案化的。粘合组件的纤维可以基本上是对齐的。粘合组件的纤维可以基本上是以网格图案排列的。粘合组件的纤维可以基本上是网状的。粘合组件的纤维可以基本上是缠结的。
粘合组件的纤维的直径可以是在约10nm至约10μm之间。粘合组件的纤维的直径可以是在约1nm至约2mm之间。粘合组件的纤维的直径可以是在约5nm至约50μm之间。粘合组件的纤维的直径可以是在约8nm至约20μm之间。
粘合组件可以是多孔的，如足够的孔以允许生物活性分子、或者蛋白质、或者细胞、或者血管通过。粘合组件可以是无孔的。粘合组件的平均孔径，或者基本上每个孔径在直径上可以是至少4μm。粘合组件的平均孔径，或者基本上每个孔径在直径上可以是至少10μm。粘合组件的平均孔径，或者基本上每个孔径在直径上可以是至少12μm。粘合组件的平均孔径，或者基本上每个孔径在直径上可以是至少100μm。粘合组件的平均孔径，或者基本上每个孔径在直径上可以是至少150μm。粘合组件的平均孔径，或者基本上每个孔径在直径上可以是至少500μm。粘合组件的平均孔径，或者基本上每个孔径在直径上可以是至少1mm。粘合组件的平均孔径，或者基本上每个孔径在直径上可以是100μm或更小。粘合组件的平均孔径，或者基本上每个孔径在直径上可以是1μm或更小。粘合组件的平均孔径，或者基本上每个孔径在直径上可以是在约4μm至约100μm之间。粘合组件的平均孔径，或者基本上每个孔径在直径上可以是在约8μm至约20μm之间。粘合组件的平均孔径，或者基本上每个孔径在直径上可以是足够大以足以允许细胞通过和/或血管生长。
有利地，可以通过静电纺丝生产粘合层，以允许不同的层之间的多孔结构的连续性。如果足够薄，那么热处理的/粘结的粘合层将保持它的初始的多孔形态，然而较厚的层在熔融/凝固之后可以形成无孔的膜。
粘合组件可以是聚合物片，如无孔的聚合物片。
粘合组件可以具有小于约350℃或300℃的熔融温度(Tm)。粘合组件可以具有小于约200℃的熔融温度(Tm)。粘合组件可以具有小于约150℃的熔融温度(Tm)。粘合组件可以具有小于约100℃的熔融温度(Tm)。粘合组件可以具有小于约70℃的熔融温度(Tm)。粘合组件可以具有小于约68℃、或约65℃、或更小的熔融温度(Tm)。粘合组件可以具有至少约45℃的熔融温度(Tm)。粘合组件可以具有在约45℃至约350℃之间的熔融温度(Tm)。粘合组件可以具有在约45℃至约200℃之间的熔融温度(Tm)。粘合组件可以具有在约45℃至约100℃之间的熔融温度(Tm)。粘合组件可以具有在约45℃至约70℃之间的熔融温度(Tm)。
材料层可以具有至少约70℃的熔融温度(Tm)。材料层可以具有至少约80℃、或至少约85℃的熔融温度(Tm)。聚合物材料层可以具有至少约90℃、约95℃、约100℃、约105℃、约110℃、或约110℃、或更多的熔融温度(Tm)。材料层可以具有小于约500℃的熔融温度(Tm)。材料层可以具有小于约400℃的熔融温度(Tm)。材料层可以具有小于约300℃的熔融温度(Tm)。材料层可以具有小于约200℃的熔融温度(Tm)。材料层可以具有在约70℃至约450℃之间的熔融温度(Tm)。材料层可以具有在约70℃至约400℃之间的熔融温度(Tm)。材料层可以具有在约300℃至约400℃之间的熔融温度(Tm)。材料层可以具有在约100℃至约400℃之间的熔融温度(Tm)。材料层可以具有在约150℃至约450℃之间的熔融温度(Tm)。材料层可以具有在约180℃至约400℃之间的熔融温度(Tm)。材料层可以具有在约70℃至约150℃之间的熔融温度(Tm)。
聚合物纤维层可以具有至少约70℃的熔融温度(Tm)。聚合物纤维层可以具有至少约80℃、或至少约85℃的熔融温度(Tm)。聚合物纤维层可以具有至少约90℃、约95℃、约100℃、约105℃、约110℃、或约110℃或更大的熔融温度(Tm)。聚合物纤维层可以具有小于约500℃的熔融温度(Tm)。聚合物纤维层可以具有小于约400℃的熔融温度(Tm)。聚合物纤维层可以具有小于约300℃的熔融温度(Tm)。聚合物纤维层可以具有小于约200℃的熔融温度(Tm)。聚合物纤维层可以具有在约70℃至约450℃之间的熔融温度(Tm)。聚合物纤维层可以具有在约70℃至约400℃之间的熔融温度(Tm)。聚合物纤维层可以具有在约300℃至约400℃之间的熔融温度(Tm)。聚合物纤维层可以具有在约100℃至约400℃之间的熔融温度(Tm)。聚合物纤维层可以具有在约150℃至约450℃之间的熔融温度(Tm)。聚合物纤维层可以具有在约180℃至约400℃之间的熔融温度(Tm)。聚合物纤维层可以具有在约70℃至约150℃之间的熔融温度(Tm)。
支架可以包括材料层和/或聚合物纤维层中的两个或更多个层或者由其组成。支架可以包括材料层和/或聚合物纤维层中的十个或更多个层或者由其组成。支架可以包括材料层和/或聚合物纤维层中的五十个或更多个层或者由其组成。支架可以包括材料层和/或聚合物纤维层中的一百个或更多个层或者由其组成。材料层和聚合物纤维层的层可以是交替的，例如在材料层的每个层之间具有聚合物纤维层的层，或者反之亦然。在交替层中，或者在任何顺序的有规律或者无规律的分层中可以任一提供材料层和聚合物纤维层的多层。通过在其之间的粘合组件可以将每个层粘结。
支架可以包括PDO层，优选静电纺丝的PDO层；以及PCL粘合层，优选静电纺丝的PCL层；以及第二PDO层，优选编织的PDO层。
支架的厚度可以是在约50μm至约10cm之间。支架的厚度可以是在约50μm至约2cm之间。支架的厚度可以是在约50μm至约1cm之间。支架的厚度可以是在约50μm至约10mm之间。支架的厚度可以是在约200μm至约10mm之间。支架的厚度可以是在约50μm至约1mm之间。支架的厚度可以是在约0.1mm至约1mm之间。支架的厚度可以是在约50μm至约500μm之间。支架的厚度可以是在约100μm至约500μm之间。支架的厚度可以是在约200μm至约300μm之间。支架的厚度可以是在约230μm至约290μm之间。支架的厚度可以是至少约50μm或者至少约150μm。
支架在尺寸上可以具有至少0.1cm2的面积。支架在尺寸上可以具有至少1cm2的面积。支架在尺寸上可以具有至少10cm2的面积。支架在尺寸上可以具有至少20cm2的面积。支架在尺寸上可以具有至少25cm2的面积。
材料层的厚度可以是在约20μm至约1cm之间。材料层的厚度可以是在约20μm至约5mm之间。材料层的厚度可以是在约20μm至约1mm之间。材料层的厚度可以是在约20μm至约100μm之间。聚合物纤维层的厚度可以是在约20μm至约1cm之间。聚合物纤维层的厚度可以是在约20μm至约5mm之间。聚合物纤维层的厚度可以是在约20μm至约1mm之间。聚合物纤维层的厚度可以是在约20μm至约100μm之间。粘合组件的厚度可以是在约20μm至约10mm之间。粘合组件的厚度可以是在约20μm至约1mm之间。粘合组件的厚度可以是在约20μm至约0.1mm之间。
支架可以具有例如使用Zwick机器以0.5mm/min的速率直至损坏测量的至少等于或大于肌腱的拉伸强度。支架可以具有例如使用Zwick机器以0.5mm/min的速率直至损坏测量的至少30MPa的拉伸强度。支架可以具有例如使用Zwick机器以0.5mm/min的速率直至损坏测量的至少62MPa的拉伸强度。支架可以具有例如使用Zwick机器以0.5mm/min的速率直至损坏测量的至少80MPa的拉伸强度。支架可以具有例如使用Zwick机器以0.5mm/min的速率直至损坏测量的至少100MPa的拉伸强度。
生物可降解的支架可以具有例如使用Zwick机器以0.5mm/min的速率直至损坏测量的至少等于或大于肌腱的断裂应变。生物可降解的支架可以具有例如使用Zwick机器以0.5mm/min的速率直至损坏测量的至少30％的断裂应变。生物可降解的支架可以具有例如使用Zwick机器以0.5mm/min的速率直至损坏测量的至少38％的断裂应变。生物可降解的支架可以具有例如使用Zwick机器以0.5mm/min的速率直至损坏测量的至少45％的断裂应变。生物可降解的支架可以具有例如使用Zwick机器以0.5mm/min的速率直至损坏测量的至少55％的断裂应变。
有利地，本发明的支架保持了高度纹理化的表面。另外的优势是，支架是柔韧的和有弹性的，这提供用于组织修复的合适特性，如肌腱修复。支架的形态可以与肌腱是基本上相似的。
支架可以是通过超声波可体内检测的。
支架可以包括分散或者浸渍在其中，或者在其上接种的一种或多种试剂。支架可以利用试剂至少部分地涂覆，或者全部地涂覆。材料层和/或聚合物纤维层可以包括分散或者浸渍在其中，或者在其上接种的一种或多种试剂。粘合组件可以包括分散或者浸渍在其中，或者在其上接种的一种或多种试剂。可以在制造期间或者在制造之后提供一种或多种试剂。可以通过将支架浸渍在试剂中，或者包含试剂的组合物中将一种或多种试剂合并至支架中。
一种或多种试剂可以是活性剂，如生物活性分子。该试剂可以包括选自以下的组中的任一项的试剂，该组包括抗生素；抗炎药；成形素；治疗剂；阻凝剂；营养物，如维生素；生长因子；和化学诱导剂；镇痛剂；抗霉剂；抗氧化剂；信号传递分子；活性肽，如结合基序RGD；富血小板血浆；纤维蛋白胶；ECM蛋白；以及非粘附蛋白，如润滑素；或者它们的组合。
生物可降解的支架可以包含细胞。该细胞可以包括哺乳动物的，如人类的。该细胞可以来源于可以使用该生物可降解的支架的患者。该细胞可以包括干细胞。该细胞可以包括祖细胞。该细胞可以包括实质细胞和/或非实质细胞。该细胞可以包括免疫细胞。该细胞可以包括炎症细胞。该细胞可以包括是肌腱、骨、软骨、或者韧带组织的典型组分的细胞。该细胞可以包括肌腱细胞。该细胞可以是诱导多能干细胞。该细胞可以是成纤维细胞。
支架可以基本上不含残留溶剂如有机溶剂。
根据本发明的另一方面，根据本文中的发明提供了支架，用作药物。
用途可以是用于受试者的损伤(如断裂)或者退化的肌腱的修复或者替换。用途可以是用于损伤或者退化的韧带、骨和/或软骨的修复或者替换。用途可以是用于肩袖修复。用途可以是用于肩峰下减压。用途可以是用于慢性退行性肩袖肌腱病变。用途可以是用于部分或者全部厚度的冈上肌断裂。用途可以是用于伤口敷料。用途可以是用于减轻损伤肌腱周围的炎症。用途可以是促进治愈。用途可以是加强至骨的肌腱组织。用途可以是用于将治疗剂如富血小板血浆(PRP)或者贫血小板血浆(PPP)定位递送至组织损伤部位。
受试者可以是哺乳动物受试者。该哺乳动物受试者可以是人类受试者。
根据本发明的另一方面，根据在本文中的发明提供了支架，用作伤口敷料。
根据本发明的另一方面，根据在本文中的发明提供了支架作为过滤器的用途。过滤器可以是环境过滤器、水过滤器、污水过滤器、空气过滤器或者气体过滤器。该过滤器可以用于防毒面具或者气体传感器。该过滤器可以是纳米颗粒的过滤器。该过滤器可以是细菌过滤器。该过滤器可以是可降解的。该过滤器可以包括<0.2μm的平均孔径。
根据本发明的另一方面，根据在本文中的发明提供了支架用作包装的用途。
根据本发明的另一方面，提供了用于要求损伤或者退化的肌腱、韧带、骨和/或软骨的修复或者替换，或者从其中受益的病症的治疗方法，包括使用根据在本文中本发明的支架以修复、补充或者替换组织。
该组织可以包括肌腱、韧带、骨和/或软骨。
根据本发明的另一方面，提供了用于伤口的治疗方法，包括将根据在本文中发明的支架应用至伤口。
该伤口可以是来自烧伤、切割、擦伤、断裂、传染、或者炎症。该伤口可以是皮肤伤口，或者别的组织或者器官的伤口。
根据本发明的另一方面，提供了生产用于组织修复的支架的方法，该方法包括以下步骤：
利用在其之间的粘合组件将材料层层压至聚合物纤维层上以形成层状材料；以及
将层状材料加热至高于粘合组件的熔融温度的温度，然后将层状材料冷却至低于粘合组件的熔融温度的温度，从而将层状材料粘结在一起以形成支架。
根据本发明的另一方面，提供了生产用于组织修复的支架的方法，该方法包括以下步骤：
利用粘合组件将材料层层压以形成层状材料；以及
将层状材料加热至高于粘合组件的熔融温度的温度，然后将层状材料冷却至低于粘合组件的熔融温度的温度，从而将层状材料粘结在一起；以及
将层状材料层压在聚合物纤维层上；并且加热至高于粘合组件的熔融温度的温度，然后将层状材料冷却至低于粘合组件的熔融温度的温度，从而将层状材料粘结至聚合物纤维层以形成支架。
根据本发明的另一方面，提供了生产用于组织修复的支架的方法，该方法包括以下步骤：
利用粘合组件将聚合物纤维层层压以形成层状材料；以及
将层状材料加热至高于粘合组件的熔融温度的温度，然后将层状材料冷却至低于粘合组件的熔融温度的温度，从而将层状材料粘结在一起；以及
将层状材料层压在材料层上；并且加热至高于粘合组件的熔融温度的温度，然后将层状材料冷却至低于粘合组件的熔融温度的温度，从而将层状材料粘结至材料层以形成支架。
在加热和冷却期间，为了将层挤压在一起，可以将压力施加至层状材料。该压力可以是在约0.1psi至约50psi之间。在加热和冷却期间，可以将层夹紧在一起。
可以将层状材料加热至小于材料层和聚合物纤维层的熔融温度(Tm)的温度。可以将层状材料加热至约80℃的温度。可以将层状材料加热至至少60℃、或80℃的温度。可以将层状材料加热至在约60℃至约100℃之间的温度。
在冷却之前，可以将层状材料加热约60秒。在冷却之前，可以将层状材料加热至少约30秒、或者40秒。在冷却之前，可以将层状材料加热至少约60秒。在冷却之前，可以将层状材料加热至少约120秒。在冷却之前，可以将层状材料加热至少约3分钟。在冷却之前，可以将层状材料加热至少约5分钟。在冷却之前，可以将层状材料加热至少约1小时。在冷却之前，可以将层状材料加热至少约3小时。在冷却之前，可以将层状材料加热至少约6小时。
在其中以来自聚合物纤维层的粘结的单独的步骤将材料层和/或粘合组件粘结的方面，在冷却之前，可以将材料层和/或粘合组件加热至少约1小时。在冷却之前，可以将材料层和/或粘合组件加热至少约3小时。在冷却之前，可以将材料层和/或粘合组件加热至少约6小时。
在其中以来自材料层的粘结的单独的步骤将聚合物纤维层和/或粘合组件粘结的方面，在冷却之前，可以将聚合物纤维层和/或粘合组件加热至少约1小时。在冷却之前，可以将聚合物纤维层和/或粘合组件加热至少约3小时。在冷却之前，可以将聚合物纤维层和/或粘合组件加热至少约6小时。
可以以不同于粘结聚合物纤维层的单独的步骤/方法，将粘合组件粘结至材料层。单独的步骤/方法可以包括使用不同的加热时间和/或温度。
可以通过在室温下放置将层状材料冷却。可以通过冷冻，或者通过应用冷却剂，将层状材料冷却。
有利地，在例如大约80℃下进行热处理期间，粘合材料如PCL熔融(Tm＝65℃)，同时材料层和/或聚合物纤维层如PDO保持完好(Tm＝110℃)。这允许来自层的纤维截留至粘合层中，其在凝固之后充当粘合剂。热处理可以改善贴片的机械特性，其导致纤维如PDO纤维的增强粘结。
一旦形成之后，支架可以浸泡、接种或者涂覆有另外的试剂和/或细胞。
材料层可以包含聚合物或者由聚合物组成。材料层可以是编织的聚合物或者聚合物纤维层。材料层可以包含纤维、纱线、细线或者单纤丝。
可以通过将纤维、纱线、细线或者单纤丝编织成编织物，如平纹编织物，提供材料层。可以通过织机进行编织。
可以通过纺丝形成材料层的纤维、纱线、细线或者单纤丝。可以通过纺丝形成材料层和/或聚合物纤维层的纤维。可以通过纺丝形成粘合组件的纤维。该纺丝可以是静电纺丝。可以通过静电纺丝形成材料层和/或聚合物纤维层。在促进纤维对齐的条件下，如在滚筒上静电纺丝，可以通过静电纺丝形成材料层和/或聚合物纤维层。
在纺丝过程期间，可以将另外的试剂合并至材料层中。在纺丝过程期间，可以将另外的试剂合并至聚合物纤维层的纤维中。在纺丝过程期间，可以将另外的试剂合并至粘合组件的纤维中。
可以将支架切割成一定尺寸和/或成形。可以将支架编织至需要的尺寸。通过熔融边缘可以避免散口边缘，例如，通过将边缘与热板接触或者利用热切割机或者笔进行切割。热板可以比可生物降解支架的熔融温度更热，如至少150℃。通过在支架的边缘刺绣或者缝合可以避免散口边缘。
在利用粘合组件粘结之前，可以利用六氟-2-丙醇(HFIP)、碱液或者血浆处理材料层，如包含PDO的材料层。当该材料层包含PDO 7.0或者其他具有更大的纤维直径(例如具有大于100μm的直径)的PDO单纤丝，在利用粘合组件粘结之前，可以利用六氟-2-丙醇(HFIP)、碱液或者血浆处理该材料层。当层中的一个具有光滑的表面特征，例如较大直径的单纤丝这种处理有利地帮助粘合过程。
通过本发明的方法制造的支架可以保持足够的孔隙率以及孔径用于细胞和蛋白捕获、细胞生长、和/或细胞渗透和迁移。通过本发明的方法制造的生物可降解的支架可以保留足够的生物相容性。
根据本发明的另一方面，提供了PCL用于将材料层粘合至聚合物纤维层的用途；其中，与材料层和聚合物纤维层相比，PCL具有较低的熔融温度(Tm)。
根据本发明的另一方面，提供了PCL用于将静电纺丝的聚合物层的两个或更多个层粘合的用途；其中，与两个或更多个静电纺丝的聚合物层相比，PCL具有较低的熔融温度(Tm)。
根据本发明的另一方面，提供了包括根据在本文中本发明的支架的支架贴片(patch)。
该支架贴片可以适合于在哺乳动物受试者中的组织修复。该支架贴片可以是生物相容的。该支架贴片可以是伤口敷料或者膏药。
当支架和/或支架贴片的用途是用于伤口敷料时，材料层可以包含聚合物纤维层或者由聚合物纤维层组成。
本领域技术人员应理解，本发明的一个实施方式或者方面的可选特征，在适当的情况下，可以可应用至本发明的其他实施方式或者方面。
附图说明
现在将仅通过实施例并参考附图，更详细地描述本发明的实施方式。
图1-示出了根据本发明由静电纺丝和非静电纺丝垫(mat)形成多层状支架的方法以及描述了层状静电纺丝/编织的支架的原型的结构。常规的静电纺丝垫是扁平的、精细的片并且它们作为组织支架的应用通常受限于不足够的厚度(由于纺丝技术)和低强度。本发明介绍了使用热塑性垫(A)将静电纺丝和非静电纺丝层堆叠和粘结的简单、非破坏性的技术。使用热塑性垫以将层以稳定的方式彼此粘结，并且因为其是静电纺丝的，所以可以控制层之间界面处的孔隙率。根据应用，可以将得到的构造调节至具有适当的厚度、质地和拉伸特性。例如，B和C是不同原型的扫描电子显微照片，该原型可以是使用该方法进行组装：(B)，多层状的静电纺丝片；以及(C)，夹在两个静电纺丝垫之间的编织的聚二噁烷酮织物。在该研究中，设计和测试了用于肩袖增强的特定支架。(D)是原型支架的示意图；(E)是支架的截面图；(F)，编织层；(G)，无规的静电纺丝PCL热塑性粘合层；(H)，对齐的PDO静电纺丝垫，面对肌腱的支架层，在以2000rpm旋转的滚筒上进行收集。除非指定，比例尺是100μm。
图2-示出了使用PCL作为热响应的胶液，利用良好粘合至纳米纤丝的静电纺丝组件的编织的单纤丝层组装的构造的SEM图像。
图3-示出了在组装之前贴片的静电纺丝PDO层组件(a)以及编织的PDO单纤丝组件(B)的大体外观的SEM图像。
图4-示出了穿过组装的层状组件的横向切割。
图5-证实了可以调节层状编织的和静电纺丝的支架以产生与天然肌腱相似的机械特性。在与静电纺丝层粘结之后，编织层的机械特性得以保存，并且通过改变编织图案，可以将缝线拉出增强。A、B和C，静电纺丝层(E)、编织层(W)和组装支架(W+E)的拉伸强度(MPa)、破坏应变(strain to failure)(％)和杨氏模量(MPa)；D，与挑选的商业可获得的贴片(Restore、Orthotape、Graft Jacket和Polytape)以及人类肩袖肌腱相比的层状支架的两种变体(平坦的或者斜纹的)的缝线保留特性；E、F，平坦编织物和斜纹编织物的极限拉伸强度(MPa)和缝线破坏载荷(N)；G，斜纹编织物[W(T)]的扫描电子显微照片；H，平纹编织物[W(P)]的扫描电子显微照片；比例尺是200μm。
图6-示出了单一静电纺丝层以及相同材料的4个层和8个层的组装部件的拉伸强度和破坏应变％。
图7-示出了单一静电纺丝层以及相同材料的4个层和8个层的组装部件的厚度之间的比较。
图8-示出了使用AB(n＝3)测量的源自肌腱的细胞在单个PDO支架和多层PDO支架上在21天内的生长。在多层的静电纺丝层构造和单个的静电纺丝层构造之间的细胞生长上(相对于第1天)不存在显著性差异。
图9-比较了源自肌腱的细胞至单层的静电纺丝PDO和PCL的粘合并且示出了在接种之后24小时粘附至这些材料的活细胞没有统计学上的差异。使用AlamarBlue监测粘合。
图10-示出了使用AB(n＝4)测量的源自肌腱的细胞在单层的静电纺丝PCL支架和PDO支架上在14天内的生长。在这两种材料之间的细胞生长(相对于第1天)不存在统计学差异。
图11-暴露于利用静电纺丝PCL、PDO和PGA调节的磷酸盐缓冲盐水的细胞示出了对这些材料的不同反应。同时相比于PBS对照，暴露至PGA的细胞示出了降低的细胞生长，暴露于PCL和PDO调节的PBS中的细胞不存在生长抑制。将PBS调节1个月并且将细胞暴露至最大值为0.5mg/ml的材料。
图12-证实了对齐的静电纺丝层的添加增强了细胞粘附和生长并且调整了细胞形状和取向。将来自断裂肩袖的人类原始源自肌腱的细胞单独地接种至编织组件上(W)以及接种至层状支架上(W+E)。框和须分别是平均值并且是最小-至-最大。a、b，在第1天(a)和第7天(b)时统计学上显著较大量的有活力的源自肌腱的细胞粘附至层状支架，使用alamarBlue代谢检验(n＝8)测量的；c、d、e，相比于在编织组件上生长的细胞，在层状支架上生长的细胞具有更长(c)、更窄的形状(d)以及至贴片的轴心更加定向的取向(轴心设定为0，e)。相比于编织组件(f)，在支架上生长3天的细胞的荧光图像示出了在静电纺丝表面上更高的细胞密度以及分化形态(g)。对于肌动蛋白荧光标记细胞，比例尺200μm。(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)。
图13-证实了对齐的静电纺丝层的添加促进了细胞粘附并且增强了互连单层的形成。扫描电子显微照片示出了处于不同时间点的在层状支架(W+E)和编织组件(W)上生长的源自肌腱的细胞的外观。a，在细胞接种之后的第一个24小时的显微照片，示出了相比于编织组件，在层状支架上的细胞在3小时内变扁平并且延伸。比例尺是10μm；b，在培养2、4和8周之后的支架的显微照片，示出了在层状支架和编织组件两者上，细胞覆盖度逐渐增加以及单层的形成，其中在层状支架上具有更密集以及更佳的互连细胞群体。比例尺是100μm。层状支架的对齐/卷曲的纳米纤维在2周和4周是可见的，在细胞似乎是深入地嵌入于纤维基质中时，在8周是不可见的；c，层状支架在8周的更高放大倍数的显微照片示出了PDO是部分退化的。箭头表示编织物的挤出单纤丝的裂缝以及在静电纺丝组件中纳米纤维的破坏，其看起来是嵌入于密集基质中。比例尺是10μm。
图14-示出了通过控制结合层(PCL)的厚度，可以允许或者阻止肌腱细胞迁移穿过构造的SEM图像。该研究比较了单一静电纺丝网格层(左列，图像A、D、G、J和M)、由具有结合组件静电纺丝PCL的薄层的4层静电纺丝网格形成的构造(中间列，图像B、E、H、K和N)以及由具有静电纺丝PCL的厚结合层的4层的静电纺丝网格形成的构造(右列，图像C、F、I、L和O)。a-c：初始的支架(没有细胞)；d-f：培养7天，上侧；g-i：培养7天，下侧；j-l：培养14天，上侧；m-o：培养7天，下侧。比例尺：20μm。如在图像J/N中可以看出的，结合具有薄PCL层的4个层使得细胞能够迁移，并且它们覆盖支架的两侧。图像L/O示出了极少数的受控细胞迁移穿过具有4层厚的结合PCL层的支架。因此，改变结合层的厚度/密度可以用于控制细胞迁移。
图15-示出了在不同的放大倍数中的本发明的另一实施例的一系列的横向切割视图。支架包括由粘合组件PCL保持在一起的多个非编织的静电纺丝的聚合物层(如在图3a中示出的一个)。这证实了使用报道的技术，堆叠精细的静电纺丝层直至形成有效体积的支架是有可能的。当需要更大的支架时，可以使用这种构造，例如填充软骨病变。
图16-对齐的静电纺丝层的添加增强了肌腱标记物的相对基因表达。在层状支架(W+E)上或仅编织组件(W)上培养7天之后，分析胶原I(Col1A1)、胶原III(Col3A1)、胶原VI(Col6A2)、原纤蛋白1(FBN1)、纤连蛋白(FN1)、整联蛋白β1(ITGB1)、钙粘蛋白11(CDH11)和β-肌动蛋白(ACTB)。将基因表达标准化至GAPDH以及至塑料控制(ΔΔCT)。在层状支架上生长的细胞具有显著增加的胶原III表达(B)，通常与早期的肌腱再生有关。与弹性纤维形成有关的原纤蛋白-1、以及细胞骨架纤维蛋白β-肌动蛋白(H)和钙粘蛋白11(G)也是上调的(D)，这表明增加的细胞-细胞接触。对纤连蛋白(E)或者整联蛋白β1表达(F)没有显著的作用，后者是与纤连蛋白结合有关(n＝6贴片；*p<0.05)。
图17-示出了本发明的层状支架良好地整合至鼠模型的体内。A，放置在鼠肩部中的支架的示意图。在肩胛骨的远心端形成切口，将冈下肌暴露并且横断，以及将层状支架用作在缺陷内的修复。B-E，示出了在(C)2周之后、在(D)4周之后、在(E)6周之后以及在(F)12周之后长入至层状支架中的组织的扫描电子显微照片；f，在体内增长直到2周的囊体大小，之后，在12周内其是变小的并且是更好限定的。(G)层状支架在体外的破坏载荷示出了在2周时明显降低，但是直至8周机械强度增加(由于使用平纹编织物以及降低尺寸以适应鼠的肩部，所以测量的破坏载荷低于图5中的破坏载荷)。
图18-PDO和PCL示出了在体外等效的肌腱细胞响应。在层状支架中两种可降解的聚合物(PDO和PCL)的组合需要细胞响应的比较性评估。虽然最初地，将细胞粘附至PDO垫，但是在4-6周内，PDO的降解将暴露热塑性粘结层(PCL)。将PDO和PCL的无规静电纺丝垫用于比较性研究。对于以无规、静电纺丝形式的两种聚合物，细胞粘合、生长、扩散、形态以及对调节培养基的响应是等效的。a，在14天内在垫上的肌腱细胞的数量，使用alamarBlue代谢检验(n＝4)测量的；b，在调节培养基(n＝3)中细胞的生长；c、d，将细胞荧光标记用于肌动蛋白(红色)，复染用于核DNA(蓝色)以及通过共聚焦显微术成像，示出了在PDO(c)和PCL(d)上大体相似的伸长率和扩散。应注意PDO支架，而不是PCL支架，在UV范围下示出了自发荧光，使得静电纺丝纤维以蓝色可见。
图19-示出了在大鼠模型中层状支架的植入。苏木精-伊红染色的截面示出了在12周内静电纺丝组件的逐渐细胞渗透。贴片的整个视图示出了随着时间层状支架增加的整合，到12周具有密集的组织围绕纤维。由细胞渗透支架的静电纺丝侧，在很多捆苍白的纤维内该细胞看起来是以定向阵列布置的。在1周时静电纺丝材料是最清楚可见的。在4周后，尽管在这个时间点，难以区分任何苍白的静电纺丝样纤维，但是围绕静电纺丝层的相关组织化的组织看起来是变厚的并且更加明显。在6周和12周时，在支架附近仍存在良好取向的细胞的清晰阵列。在4周时在支架的静电纺丝侧上FBGC是最可见的，并且此后它们的数量明显降低。
图20-示出了用于大鼠模型的对照。将聚丙烯缝线修复(仅仅缝线)用作用于免疫应答的阴性对照，将薇乔编织用作阳性对照。从4周起向前，大量的异体巨细胞将薇乔编织的贴片围绕，并且将此保持直到12周。在仅仅缝线的对照组中几乎没有或没有看到FBGC。
图21-就异体巨细胞(FBGC)和巨噬细胞分型而言，在体内的鼠模型中，层状支架示出了优异的组织反应。(A)示出了整合的支架在体内6周之后的整个视图的苏木精-伊红染色截面。(B)在6周之后，包围支架的编织侧的组织示出了较高的细胞结构并且几乎没有或没有FBGC，(C)在6周之后，静电纺丝组件看起来是由细胞状的、良好对齐的组织吞噬的，(D)直到4周围绕支架的FBGC的数量增加，但是此后返回至与阴性对照(仅仅缝线)可比较的水平。将编织的薇乔(polygalactin 910)用作阳性对照，因为在12周内其诱导更加持续的异体响应。(E)、(F)，随着时间巨噬细胞分型1和2在包围支架的组织中的比率。在层状支架和阴性对照(仅仅缝线)之间几乎没有或没有差异。使用iNOS将巨噬细胞染色用于分型M1(E)并且使用甘露糖受体用于分型M2(F)。****p<0.0001。**p<0.01，****p<0.0001。
图22-示出了围绕层状支架的巨噬细胞群体。就在包围组织中的巨噬细胞群体而言，在层状支架和阴性对照(仅仅缝线)之间几乎没有或没有差异。对于分型M1使用iNOS将组织切片染色以及对于分型M2使用甘露糖受体。
图23-是代表基于体内观察的对支架的组织反应的示意图
具体实施方式
实施例
实施例1：用于肩袖修复的多层贴片的制造：使用非破坏性结合组合编织的织物和静电纺丝织物
本研究的目的是生产具有优异的机械特性以及生物特性的肩袖修复贴片。通过将编织的织物(其将提供机械支撑)与非编织的静电纺丝组件(其通过呈现精细的、纳米级的形态将为天然细胞提供线索和引导)组合来实现本目的。
介绍
在这个实施例中，探究了用于多层静电纺丝材料和织物的新型的、生物相容的和非破坏性的粘合方法的使用。此实施例首先讨论了由连接至非编织的静电纺丝组件的编织织物组成的贴片的机械特性和体外特性。非编织组件是定向的PDO静电纺丝支架，设计用于提供优异的生物特性。编织组件是PDO单纤丝的平纹编织物并且将其设计以提供机械强度、缝线保留(因此其防止缝线拉出)和稳健的操纵特性，因此其可以是在肩袖中在肌腱上进行外科地缝线至骨结点。
然后此实施例将证实该粘合方法保留了静电纺丝材料的表面形态、孔隙率和生物相容性。为了该目的，使用新型粘合技术将网格类静电纺丝支架堆叠，并且研究了肌腱细胞穿过所得结构的迁移。
材料和方法
静电纺丝溶液的制备
通过分别以9％(w/v)和8％的浓度将聚二噁烷酮(PDO，1.5-2.2dl/g，Sigma-Aldrich Chemical Company Ltd.，Dorset，UK)或聚已酸内酯(PCL，Mw：80,000kDa，Sigma-Aldrich)溶解于1,1,1,3,3,3-六氟异丙醇(HFIP，Apollo Scientific Limited，Cheshire，UK)中来制备聚合物溶液。在室温下在辊上将溶液搅拌至少24小时以允许聚合物完全溶解。
静电纺丝
通过在以2000rpm旋转(以生成具有8.2kV电压的定向结构)的滚筒上静电纺丝PDO溶液2小时来生产PDO静电纺丝支架。可以使用较低的旋转速度(例如100rpm)，其导致纤维的无规对齐。更高的旋转速度(通常在1000-5000之间)可以导致对齐的纤维。通过在以100至120rpm以及8.4kV的电压旋转的滚筒上静电纺丝PCL溶液2小时来生产PCL静电纺丝支架。通过静电纺丝10分钟至接地的镍网格(具有50μm的宽度以及300x300μm的间隔)上来生产PDO网格支架。为了制造“多孔的”层状构造的元件，利用PCL溶液进行第二静电纺丝步骤1分钟。为了制造“无孔的”层状构造的元件(其将防止细胞迁移)，在初始的PDO网格上将PCL静电纺丝10分钟。对于每个试验，将喷嘴收集器以20cm的距离设置。使用乙醇70％将所有样品从它们的收集器中分离并且存储在干燥器中。在一个实施方式中，可以使用图案化的接地的镍网格作为收集器来形成PCL网格。可以将此完成以改善对齐的PDO层之间的迁移。
编织
使用手动的织机由PDO单纤丝(PDS II，7.0，Ethicon，France)来制造平纹编织结构。为了避免受散口，通过与在150℃下的热板非常短暂的接触来将从主要编织垫中切割的样品边缘熔融。
编织的和非编织组件的粘合
利用浸渍在六氟-2-丙醇(HFIP)中的实验室组织将编织的PDO层简单地刷洗。然后将PCL层(粘合组件)迅速地放置在编织组件上并且施加温和的压力以帮助两种组件之间的粘合。(注意：对于由具有高于100μm的直径的单纤丝纱线制备的编织结构，此第一步骤是有利的以改善PCL至编织组件的粘合。由具有较小直径的纱线制备的编织织物以及静电纺丝层通常不需要此步骤)。
然后将非编织的静电纺丝PDO层放置在PCL粘合组件上并且利用温和的压力将该组装部件保持在一起，同时在80℃下施加热处理2分钟。在此温度下，PCL熔融(Tm＝65℃)而PDO保持完好(Tm＝110℃)。在冷却期间在凝固之后，通过截留来自不同细纤丝的PDO纤维，PCL层充当粘合剂。当添加更多层的静电纺丝PDO时，在热处理之前将纯的PCL网格夹入在每个新的PDO层以及先前的一个层中间。在那个温度下的热处理还可能稍微地改善贴片的机械特性，这是由于PDO纤维的温和粘结。
机械测试
对于每种类型的静电纺丝贴片，使用8个单独的测量为50mm长度和5mm宽度的试样。生成了哑铃状的测试材料。这些7mm的条在它们的最窄点是2mm以最小化由于在贴片-夹具界面处的压力上升所导致的中等贴片(midpatch)的破坏。还测试了具有/不具有静电纺丝层的测量为20mm长度和2mm宽度的5个编织组件。使用环境电子扫描显微镜测量静电纺丝支架的厚度。
测试协议是基于先前公开的贴片机械特性的研究的修改版本(Derwin et al,2006&Chaudhury et al.,2012)。使用改进的夹钳夹紧贴片的末端，留下用于静电纺丝支架的30mm以及用于编织的PDO组件的15mm的额定夹具至夹具(grip-to-grip)计量长度。使用Zwick机器以0.5mm/min的速率直至破坏测试试样至拉伸损坏。评估极限强度(MPa)、断裂应变(％)。这些值是与试样形状无关的，从而，测量的贴片的材料特性可以与在其他商业可获得的贴片上公开的数据相比较。
SEM
在安装于桩(stub)之前，将生物样品固定并且脱水。将样品固定在戊二醛(在去离子水中2.5％v/v)中过夜。在分级的乙醇系列(40％、70％、90％、95％至100％的处于去离子水中的乙醇，每个步骤10分钟)中经受连续的脱水之前，将固定液除去并且在PBS中将样品冲洗两次。使用六甲基硅氮烷将支架进一步脱水并且留在通风橱内过夜以完全干燥。将样品存储在干燥器中直至使用。然后使用碳粘合盘将样品安装在铝桩上并且使用SC7620MiniSputter Coater System(Quorum Technologies Ltd，East Sussex)涂覆金。使用环境扫描电子显微镜得到高分辨率的图像(Carl Zeiss Evo LS15Variable Pressure ScanningElectron Microscope)。
人类肌腱材料、捐献者人口统计和临床数据
从Oxford Musculoskeletal Biobank获得肌腱组织，其中告知的捐献者同意完全符合国家和组织机构的伦理要求，United Kingdom Human Tissue Act(HTA)。
冈上肌肌腱样品收集自患有慢性退化的肩袖肌腱病以及部分/全部厚度的冈上肌断裂的患者。所有的患者经受用于肩袖修复或者肩峰下减压的手术，在手术期间，将肌腱组织从肌腱的远端断裂边缘切除并且立即地转移至包含DMEM F12(Lonza，U.K.)的无菌管中用于说明。从2名年龄为70-72岁的女性捐献者中获得用于该研究的源自肌腱的细胞。单独地使用来自每个捐献者的细胞。
源自肌腱的细胞的分离和培养
在无菌条件下将肌腱样品切割成统一的小块并且转移至补充有生长培养基的6孔板(Corning,U.S.A.)。使用的生长培养基是包含50％的胎牛血清(FBS,Biosera U.K.)以及1％的青霉素-链霉素溶液的DMEM F12。在标准条件(37℃，5％CO2)下温育板并且每2-3天更换生长培养基。一旦细胞已经从外植体迁移，在大约7天之后，利用包含10％FBS的DMEM F12更新培养基。在这些条件下维持培养物直至孔达到汇合。然后将细胞刮去并且在相同的条件下在10cm的皮氏培养皿(Greiner,Germany)中继代以允许增殖。对于所有的实验，为了保持一致，并且为了避免在传代5代之后描述的表型偏移(Poulsen et al.，2011；Yao etal.，2006)，使用第二次传代的源自肌腱的细胞。
在材料上的细胞接种
为了评估在静电纺丝贴片上的生长，使用如先前所描述的alamarBlue检验(Hakimi et al.,2012)。简言之，将静电纺丝贴片切割成一定尺寸并且悬浮在24孔cellcrown插入物(Sigma)中。将这些放置在12孔(Corning)中，使用70％乙醇灭菌并且在无菌条件下在40℃中干燥过夜。然后将在2代中的源自肌腱的细胞接种至包含静电纺丝贴片的插入物中并且允许粘附至少12小时。
监测贴片上的细胞生长
在选定时间点，将具有贴片的cell crowns转移至新鲜的包含具有5％alamarBlue的完全培养基(AbD Serotec,U.K.)的孔板中。为了不包括粘附至聚苯乙烯孔的细胞并且排他地测量粘附至贴片的细胞的代谢，在每个时间点将贴片转移至新鲜的孔中。在两个小时的温育之后，将来自每个孔的两份的100μl的培养基样品转移至白色的96孔板(Corning)用于在SpectraMax Gemini酶标仪(Molecular Devices,U.K.)中分析，其中在544nm的刺激波长和590nm的发射波长下荧光测量。将剩余的alamarBlue培养基除去并且利用新鲜的标准培养基更换。
调节的PBS对细胞生长的影响
为了监测暴露至材料的影响，将在10mg/mL的浓度下的PDO、PCL和PGA(由于它快速退化，将后者用作对照)在70％乙醇中灭菌2小时，干燥并且在无菌的PBS中在37℃、5％CO2下温育1个月。在温育一个月之后，一式三份地将6x103个细胞接种至96孔板中。允许细胞粘附过夜，并且在12小时之后，将10ul的经材料调节的PBS添加到每个孔，导致0.5mg/ml的最终浓度。在5天的暴露之后，测量增殖。
荧光显微术
为了使用荧光显微术形象化细胞，将构造物固定在10％的福尔马林(FisherScientific)中5分钟并且使用0.1％的Triton-X(Sigma-Aldrich)渗透5分钟。因此，根据制造商的说明(分子探针)，使用罗丹明鬼笔环肽(Invitrogen，UK)和DAPI核复染剂(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)对细胞染色。使用荧光显微镜或者共聚焦显微镜(Zeiss Axio ImagerM1或Zeiss LSM710NLO)将样品形象化。
基因表达
使用Gentle Macs组织裂解器(Milteny Biotec，UK)在1mL的组织裂解液，(Sigma-Aldrich，Dorset，UK)中裂解支架。随后均质化，将样品在4℃下在12,000×g下离心10min。将样品在室温下温育并且添加200μl的氯仿，剧烈振荡15秒，并且在4℃下在12,000g下离心15min。将上面的水相(～50％的总体积)转移至另一管中。使用100％的异丙醇将RNA沉淀10min，随后在4℃下在12,000×g下离心10min。然后利用1ml的70％乙醇将RNA颗粒洗涤。最后，将提取的RNA溶解于不含RNase的水中并且洗脱。使用第一链cDNA合成试剂盒(First Strand cDNA Synthesis Kit)(Roche,Germany)按照生产商的协议将1μg的RNA转化成cDNA。使用具有ViiATMv1.2软件版本(Applied Biosystems，USA)的ViiA7(LifeTechnologies)，使用Sybr Green(AB applied biosystems powerSYBR)以及QuantiTect引物检验，根据制造商的说明(QIAGEN)，进行实时qPCR(Real-time qPCR)。对于使用Sybrgreen的相对定量，循环条件是默认参数。将未处理的细胞用作对照并且将GAPDH用作持家基因。以相对表达(RE)来分析数据。
体内研究
该研究是在总公司许可下并且根据组织机构准则进行的。将六十只Lewis大鼠分成4个组，其中从它的插入处将冈下肌外科地横切3mm。利用编织的和静电纺丝的聚二噁烷酮贴片和5-0聚丙烯缝线修复肌腱。薇乔和Silk贴片或者简单的聚丙烯缝线修复用作对比物。使动物在1、2、4、6和12周时牺牲以检查移植物的生物相容性。使用免疫组织化学检查巨噬细胞亚群并且使用苏木素伊红染色评估异体巨细胞并且二者都利用具有设定显著性在p<0.05的单向ANOVA进行分析。利用半定量分析仔细检查关节软骨。将Hind手掌炎症性指数用于测定系统效果。
通过多层贴片的细胞迁移
为了证实分层技术提供对多层静电纺丝材料的孔隙率的控制，将细胞接种至三种不同的悬浮在如以上描述的cell crowns中的静电纺丝片上。该不同的材料是：
1.多孔网格结构的单片
2.使用厚的、无孔的密集的PCL片结合的多层(4层)网格结构--利用温和的压力将层保持在一起同时在80℃施加热处理1分钟。
3.使用精细的、多孔的PCL片结合的多层(4层)网格结构。
将大约5x104个细胞直接接种至每个插入物上。将12孔板(Corning)涂覆有血纤蛋白凝胶(由25μl的10mg/ml纤维蛋白原以及2μl的100u/ml的来自牛血浆的凝血酶(二者都是Sigma-Aldrich)制备)，作为化学诱导剂以诱导细胞迁移通过静电纺丝贴片。然后将插入物转移至包含血纤蛋白、布满生长培养基的孔中并且温育5天。此后，如以上描述进行alamarBlue检验以测量在膜上的细胞生长并且使用ESEM评估两侧上的细胞存在。
ESEM
将样品切割并且使用碳粘合盘将样品安装在铝桩上。然后在必要时，使用Cressington 208HR溅射镀敷器(Vortex Control Systems，TX，USA)利用金或者铂涂覆样品并且使用扫描电子显微镜得到支架的高分辨率图像。
统计分析
将数据表示为平均值±SEM。由GraphPad Prism软件版本5生成曲线图。利用GraphPad Prism软件进行统计分析。对于所有的体外粘合测试，进行至少两组独立的实验并且确定平均值。对于所有的研究，使用具有Tukey事后检验的单向ANOVA测试以检查多个组之间的统计学差异。使用未配对的t检验以检查两个独立的组之间的统计学差异。当获得≤0.05的P值时，认为获得的结果是有意义的。
结果
多层贴片的制造
我们的方法(图1a)涉及使用静电纺丝热塑性粘结剂的静电纺丝和非静电纺丝片的分层。与普遍用于纺织工业的热塑性片或粉末相比，静电纺丝垫的使用使得能够与最小数量的聚合物均匀粘结，以及控制孔隙率。对于呈现在此的特定原型，将静电纺丝聚已酸内酯(PCL)层放置在静电纺丝PDO垫(E)与编织的PDO织物(W)之间。使该构造在80℃下经受热处理。在此温度下，PCL层熔解但是PDO组件保持完好，这是由于PDO更高的熔融温度(PCL Tm＝65℃；PDO Tm＝110℃)。在凝固之后，熔融的PCL层充当粘合剂，截留PDO纤维。得到的织物(图1D和E)是编织物和静电纺丝组件的层状复合物，通过精细的、熔融的PCL膜将其分隔。值得指出的是，静电纺丝的对齐的PDO纤维呈现出卷曲的、肌腱类形态(图1H)。使用空气驱动的静电纺丝，利用一些有目的地制造，已经先前报道了卷曲的纳米纤维，以及在标准的静电纺丝之后自发地自卷曲。如在本文呈现的图像(图1)中可以看出，与先前报道的更加盘绕的、断裂的外观相比，PDO对齐的垫呈现出灵巧的自卷曲效果，保持总的对齐的以及高度组织化的外观。重要地，该粘结方法是非破坏性的，并且制造后的静电纺丝侧的显微照片(图1F)示出了已经保持了原始的对齐的/卷曲的图案。
新型多层贴片的形态
参照图2，SEM图像示出了组装的构造，使用PCL作为热响应胶液，其中编织的单纤丝层良好地粘合至纳米纤丝的静电纺丝组件。参照图3，ESEM图像示出了在组装之前的贴片的静电纺丝PDO板组件(a)以及编织的PDO单纤丝组件(B)的大体外观。
机械研究：
为了测定分层和粘结对支架的机械特性的影响，使用Zwick拉伸试验机(5kN)以及Deben拉伸实验台(600N)进行了拉伸和缝线保留测试。计算了层状支架和它的组件的拉伸强度、％破坏应变和杨氏模量。正如所料，与静电纺丝层其自身相比，编织物和静电纺丝层的组合产生了更强的支架(至少20倍，图5a)。而且，其确定粘结过程没有降低编织物PDO层的强度(63.72±10.56MPa)。组装贴片的最大应力(65.76±10.32MPa)不是显著不同于任一的编织组件(错误！没有找到参考来源。b、c)。然后进行实验以更好地匹配层状支架和人类肌腱之间的缝线拉出(图5d-f)。将编织图案‘平纹’(P，图5g)以及‘斜纹’(T，图5l)相比较，发现在这些编织物之间的极限拉伸强度不是显著不同的(65.76±10.32以及73.9±8.79)，但是通过斜纹编织的缝线保留是显著更高的(167±34)。该斜纹编织层能够承受超过用于人类冈下肌肌腱所报道的那些的力度(极限应力＝15-30MPa并且在最大收缩期间力度～196N(55，56))。改变编织图案以及成功地匹配支架至期望组织和应用的机械特性的能力保持了开发另外的原型的潜在性。
如在图6中示出的，可以通过将一些层粘着在一起来增加静电纺丝组件的机械特性。在1个层、4个层和8个层的支架之间，最大应力值是显著不同的。而且，4个层的支架示出了最高的破坏应变(％)。在图7中示出了1个层、4个层和8个层的静电纺丝支架的平均厚度。
贴片上的细胞生长以及材料的细胞毒性
参照图8，示出了在21天内在单层和多层PDO支架上源自肌腱的细胞的生长，其是使用AB(n＝3)测量的。在多层和单层的构造之间的细胞生长(相对于第1天)上不存在显著性差异。因此，堆叠静电纺丝层没有改变细胞增长的方式以及其上的存活。
参照图9，源自肌腱的细胞至PDO和PCL的粘合显示，在接种之后24小时，在粘附至这些材料的活细胞中不存在统计学差异。使用AlamarBlue监测粘合。因此，堆叠静电纺丝层没有改变细胞粘附至它们的方式。
参照图10，显示了在14天内的源自肌腱的细胞在PCL和PDO支架上的生长，其是使用AB(n＝4)测量的。在这两种材料之间的细胞生长(相对于第1天)上不存在统计学差异。这支持了以下提议：PDO和PCL是类似相容的，而且将PCL添加至PDO构造(为了生成多层)不应该改变细胞与支架相互作用的方式。
参照图11，暴露于PCL、PDO和PGA的细胞示出了至这些静电纺丝材料的不同反应。虽然与PBS对照相比，暴露于PGA的细胞示出了降低的细胞生长，但是在暴露于PCL和PDO调节的PBS的细胞中不存在生长抑制。使PBS调节1个月并且将细胞暴露于最大值为0.5mg/ml的材料。这表明，与较快降解的聚合物如PGA相比，对于源自肌腱的细胞，PDO和PCL是相容的并且是非毒性的。
组件层对体外细胞行为的影响
在进一步的研究中，就细胞粘附和生长而言，在一系列的研究中评估了静电纺丝组件的贡献，其中将编织物层其自身(W)与具有对齐的静电纺丝垫的完全层状的支架(W+E)相比。这些研究示出了，在这两者基底上活细胞粘附并且增殖，但是在第1天和第7天的时间点，在静电纺丝组件上的细胞数量显著更高(图12a和b)。通过在接种之后的1小时、3小时和24小时的不同表面上的细胞的SEM显微照片进一步证实了这种趋势。该图像证实了更加迅速的截留以及在静电纺丝表面上的细胞变扁平。粘附至编织物结构的细胞趋向卷绕细纤丝或者习惯于在由编织方法在细纤丝之间形成的巢和间隙中(图12c)。相反，粘附至静电纺丝层的细胞呈现出均匀的分布和垫的覆盖，并且看起来嵌入在静电纺丝基质中。在培养3天之后使用细胞骨架的荧光图像的细胞尺寸的定量(图12c-g)证实了添加静电纺丝层调整细胞长度、宽度和定向。与编织层相比，在静电纺丝表面上的细胞显著地是更长、更窄以及更加定向的(图12c-g)，尽管在编织组件上存在一定程度的定向，但这可能是由于来自挤出过程的凹槽(在图13a中可见)。长期培养物的显微照片(2、4、和8周，图13b)示出了对于层状支架和编织组件两者在细胞覆盖度上的逐渐增加，同时细胞在编织垫上形成松散网状以及在静电纺丝组件上形成密集的、良好嵌入阵列。直到第4周，对齐的静电纺丝垫仍是可见的并且显示出良好排序的对齐形态。在第8周时，似乎是，在编织层上的细胞网状以更加可见的方式扩张以覆盖间隙。
通过多层网格贴片的细胞迁移
为了证实分层技术的灵活性，以及其保存PDO静电纺丝材料的形态和孔隙率的事实，将细胞接种在由静电纺丝网格制备的4层构造上。图14表明，根据在热处理之前存在于层之间的PCL胶液的量，可以将支架材料调节至多孔的或者无孔的(子图14B和C)。为了使支架的层之间高效粘合，仅需要少量的PCL。
组件层对细胞表型的影响
观察到对齐的静电纺丝层的添加调整细胞形状是与细胞表型高度有关的，该观察促使对是否在细胞表型上存在任何影响进行调查。使用实时PCR测量十种不同基因的RNA表达(图16)。选择标记物以体现对细胞外基质生产(胶原I和胶原III)、细胞外周基质(胶原VI和原纤蛋白1)、细胞-基质粘合(纤连蛋白和整联蛋白β1)、以及形状的标记物(β-肌动蛋白)和细胞-细胞接触(钙粘着蛋白11)的可能影响。对于单层，胶原I、胶原VI、纤连蛋白和整联蛋白β1是在基础水平并且在编织组件和层状支架上生长的群体之间不存在显著性差异。在层状支架上胶原I的相对表达是稍高而不是显著更高。测量胶原III、原纤蛋白1、β-肌动蛋白和钙粘蛋白11的表达中的显著性差异，并且观察到这四种基因在层状支架上明显是更高度表达的。
体内的生物相容性和细胞浸润(cell infiltration)
评估移植于大鼠肩部之后的贴片的生物相容性和细胞浸润。进行这些动物研究以证实层状设计的安全性而不是功效。在1、2、4、6和12周的时期，进行组装贴片的初步体内评估。图17示出了直接将贴片放置在大鼠肩部中的冈下肌上。在一般性检查之后，注意到所有的动物具有围绕修复肌腱的纤维囊，其直至第2周增加至一定大小然后逐渐降低。还注意到，在整段研究的时期内，移植物保持完好。没有发生层的分层或者分离。在随后第6周和第12周的时间点，存在紧密粘合至材料的纤维组织，并且在一般性检查和扫描电子显微术上编织图案不是可见的(图17)。外植支架的机械评估显示了直到第2周显著的初始强度降低并且此后直到第8周机械强度增加(图17)，这表明显著的组织长入或者新组织形成。
层状支架以及包围组织的组织切片证实了异体响应的程度以及细胞浸润至贴片中的程度。将仅用不可降解的聚丙烯的缝线修复用作阴性对照，并且将用编织薇乔垫(polygalactin 910)的修复用作阳性对照。苏木精-伊红染色的截面(图18、图19和图20)证实了，在支架的静电纺丝侧上，细胞在多捆苍白的纤维(可能是静电纺丝材料)内以良好定向阵列伸长(在第1周最可见)。在第4周之后这些相对组织化的组织看起来更厚并且更加明显，尽管在这个时间点难以区分任何苍白的静电纺丝类纤维。在第6周和第12周的时间点，在支架附近仍存在清晰的良好定向的细胞的阵列。为了多核异体巨细胞(FBGC)的形成也检查了组织切片。在第4周，相比于仅缝线的对照，在实验贴片周围存在更高数量的FBGC(图21)，但是在所有的其他时间点，FBGC水平是与仅缝线的对照是可比的。观察到在第4周时FBGC增加，并行的是静电纺丝组件逐渐消失，其在第6周时在组织中仅仅稀疏可见。在12周的时期内，相比于阳性对照(薇乔)，层状支架周围的FBGC数量是降低的。还进行实验以表征修复部位周围的巨噬细胞存在和亚型。在图22中呈现了对于可诱导的一氧化氮合酶诱导同工型(iNOS)、巨噬细胞亚型M1(与感染有关的杀伤巨噬细胞)和甘露糖的标记物、巨噬细胞亚型M2(与伤口愈合有关)的标记物的染色的组织切片。与阳性对照周围两种巨噬细胞亚型升高的比例相比，这些标记物的评估显示了实验组和阴性对照之间的相似的M1和M2与计数细胞的总数的比例(图21)。
在图23中呈现了基于一般性观察以及组织学观察的在体内对于层状支架的组织反应的总览。
讨论
在本文中呈现的研究中，已经测试了为提供机械强度和生物引导而设计的多层新型贴片。贴片的两个组件是由聚二噁烷酮(PDO)、通过水解而降解的生物相容的聚合物制备。使用传统的织机由单纤丝或者静电纺丝纱线组装编织组件。使用静电纺丝形成非编织组件，从而生成高孔隙度的结构，该结构允许细胞和蛋白质溶液的有效截留。静电纺丝还允许在贴片生产期间生物活性因子(如生长因子或者维生素)的截留，从而将活性成分合并在纤维内。
放置在编织层和非编织层之间的粘合层，是由另一生物相容和生物可降解的聚合物，聚已酸内酯(PCL)制备的。在约80℃下进行热处理期间，PCL熔融(Tm＝65℃)同时PDO保持完好(Tm＝110℃)。这允许将来自两个PDO组件的纤维粘结至PCL层，PCL层在凝固之后充当粘合剂。
在该研究中，已经显示，改变粘合PCL层的厚度和图案导致多孔结构或者无孔结构。例如，使用精细的静电纺丝的PCL片粘附一些静电纺丝PDO的层，如果足够薄的话，粘结的PCL将保留PDO构造的初始的多孔形态。
机械测试清楚地显示了编织组件的重要性，其比静电纺丝组件强大于20倍。
以上呈现的结果表明，细胞可以迁移穿过这种多层的构造，而且最外层的表面外观是保持完好的，最外层可以用作用于肌腱治愈的引导模板。
还显示，PCL组件和PDO组件两者是可相容的，并且存在相似的细胞粘附以及细胞生长，从而最小化改变对组合这两种组件的更加复杂结构的细胞响应的风险。
在本文中呈现的结果确认了这种预测的稳定性，示出了在体外直至第8周在该构造上良好的细胞存活以及在体外直至第12周良好的完整性和组织整合，其中该构造看起来是完好的并且在该时间段内没有可见的层的分层或者分离发生。
结论
呈现了粘结用于组织工程的医用纺织品的不同层的新型方法。这种粘合方法是生物相容的，最小化对纳米图案(如静电纺丝表面)的破坏并且使得能够通过控制粘合层的形态来控制孔隙率。还已经呈现了使用这种方法生产的肌腱修复贴片的原型。
在该实施例中，将稳固的编织组件(其会为治愈肌腱提供机械支撑)与精细的纳米结构的片(其对于细胞是高度诱导性的)组合。结果表明，得到的材料保持了强度、安全性和纳米图案，并且对于肩袖中肌腱断裂的加强可以是有用的。
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Claims (54)

1.一种用于组织修复或者伤口敷料的支架，包括：
材料层；
聚合物纤维层；以及
所述材料层和所述聚合物纤维层之间的粘合组件，其中，所述粘合组件包含与所述材料层和所述聚合物纤维层相比具有较低的熔融温度(Tm)的材料。
2.根据权利要求1所述的支架，其中，所述支架是生物可降解的。
3.根据权利要求1或权利要求3所述的支架，其中，将所述材料层和所述聚合物纤维层粘结至所述粘合组件并且经由所述粘合组件粘结。
4.根据任一前述权利要求所述的支架，其中，所述聚合物纤维层包含静电纺丝的聚合物或者由静电纺丝的聚合物组成。
5.根据任一前述权利要求所述的支架，其中，所述材料层包含静电纺丝的聚合物或者由静电纺丝的聚合物组成。
6.根据任一前述权利要求所述的支架，其中，所述粘合组件包含静电纺丝的聚合物或者由静电纺丝的聚合物组成。
7.根据权利要求4至6中任一项所述的支架，其中，所述静电纺丝的聚合物包含热塑性聚合物。
8.根据任一前述权利要求所述的支架，其中，所述支架是生物相容的。
9.根据任一前述权利要求所述的支架，其中，所述支架是合成的。
10.根据任一前述权利要求所述的支架，其中，所述材料层和/或所述聚合物纤维层包含生物相容的聚合物。
11.根据权利要求9所述的支架，其中，所述生物相容的聚合物包含聚二噁烷酮(PDO)。
12.根据任一前述权利要求所述的支架，其中，所述材料层和/或所述聚合物纤维层具有至少约70℃的熔融温度(Tm)。
13.根据任一前述权利要求所述的支架，其中，所述材料层包含编织组件或者由编织组件组成；并且可选地所述编织组件是由单纤丝、纤维或者纱线形成。
14.根据权利要求11所述的支架，其中，所述单纤丝、纤维或者纱线是由纺丝并且可选地由静电纺丝形成。
15.根据任一前述权利要求所述的支架，其中，所述聚合物纤维层和/或所述粘合组件是由纤维形成。
16.根据权利要求15所述的支架，其中，所述纤维是由纺丝并且可选地由静电纺丝形成。
17.根据任一前述权利要求所述的支架，其中，所述聚合物纤维层是多孔的。
18.根据任一前述权利要求所述的支架，其中，所述材料层和非编织的纤维组件包含基本上相同的聚合物。
19.根据权利要求1至12和15至18中任一项所述的支架，其中，所述材料层包含聚合物纤维层或者由聚合物纤维层组成；和/或其中，所述材料层和所述聚合物纤维层包含基本上相同的结构和/或材料。
20.根据任一前述权利要求所述的支架，其中，所述粘合组件具有小于约70℃的熔融温度(Tm)。
21.根据任一前述权利要求所述的支架，其中，所述粘合组件包含生物相容的聚合物。
22.根据任一前述权利要求所述的支架，其中，所述粘合组件包含聚已酸内酯(PCL)。
23.根据任一前述权利要求所述的支架，其中，所述支架包括所述材料层和/或所述聚合物纤维层中的两个或更多个层。
24.根据权利要求23所述的支架，其中，由在所述材料层和/或所述聚合物纤维层之间的粘合组件粘结每个层。
25.根据任一前述权利要求所述的支架，其中，所述支架包含分散或者浸渍其中的或者涂覆或接种于其上的一种或多种试剂。
26.根据任一前述权利要求所述的支架，其中，所述支架的厚度在约50μm至约2cm之间。
27.根据任一前述权利要求所述的支架，其中，所述支架具有至少30MPa的拉伸强度和/或至少25％的断裂应变。
28.根据任一前述权利要求所述的支架，其中，所述支架包含细胞。
29.根据任一前述权利要求所述的支架，其中，所述粘合组件包含静电纺丝至网格中的聚合物纤维。
30.根据任一前述权利要求所述的支架，其中，所述粘合组件的降解速率可以小于/慢于所述聚合物纤维层和/或所述材料层的降解速率。
31.一种根据任一前述权利要求所述的支架，用作药物。
32.根据权利要求31所使用的支架，用于修复或者替换损伤或者退化的肌腱、韧带、骨和/或软骨，或者用于伤口敷料。
33.根据权利要求1至28中任一项所述的支架作为过滤器的用途。
34.一种治疗需要修复或者替换损伤或者退化的肌腱、韧带、骨和/或软骨的病症的方法，包括使用根据权利要求1至28中任一项所述的支架修复、补充或者替换组织。
35.一种治疗伤口的方法，包括在所述伤口上应用根据权利要求1至28中任一项所述的支架。
36.一种生产用于组织修复的支架的方法，包括以下步骤：
利用在材料层和聚合物纤维层之间的粘合组件将所述材料层层压至所述聚合物纤维层上以形成层状材料；以及
将所述层状材料加热至高于所述粘合组件的熔融温度的温度，并且然后将所述层状材料冷却至低于所述粘合组件的熔融温度的温度，从而将所述层状材料粘结在一起以形成生物可降解的支架。
37.根据权利要求36所述的方法，其中，在所述加热和所述冷却期间，将压力施加至所述层状材料以便将所述层挤压在一起。
38.根据权利要求36或者权利要求37所述的方法，其中，将所述层状材料加热至约60℃至约100℃的温度。
39.根据权利要求36至38中任一项所述的方法，其中，在冷却之前，将所述层状材料加热至少约30秒。
40.根据权利要求36至39中任一项所述的方法，其中，所述支架浸渍、接种或者涂覆有另外的试剂和/或细胞。
41.根据权利要求36至40中任一项所述的方法，其中，所述材料层包括编织组件或者由编织组件组成，所述编织组件是通过将纤维、纱线、细线或者单纤丝编织成编织物如平纹编织物提供。
42.根据权利要求41中任一项所述的方法，其中，所述编织组件的所述纤维、纱线、细线或者单纤丝是由纺丝并且可选地由静电纺丝形成。
43.根据权利要求36或42中任一项所述的方法，其中，所述聚合物纤维层和/或所述粘合组件是由纺丝并且可选地由静电纺丝形成。
44.根据权利要求43所述的方法，其中，所述静电纺丝是在网格上。
45.根据权利要求42或44中任一项所述的方法，其中，在纺丝过程期间，将另外的试剂合并在编织组件的纤维、纱线、细线或者单纤丝中。
46.根据权利要求43至45中任一项所述的方法，其中，在纺丝过程期间，将另外的试剂合并在非编织的聚合物组件和/或所述粘合组件中。
47.根据权利要求36至45中任一项所述的方法，其中，所述材料层、和/或所述聚合物纤维层是由PDO形成。
48.根据权利要求36至47中任一项所述的方法，其中，所述粘合组件是由PCL形成。
49.PCL用于将材料层粘合至聚合物纤维层的用途，其中，与所述材料层和/或所述聚合物纤维层相比，所述PCL具有较低的熔融温度(Tm)。
50.一种支架贴片，包括根据权利要求1至28中任一项所述的支架。
51.一种支架，基本上如在本文中描述的并且可选地参照附图。
52.一种生产基本上如在本文中描述的并且可选地参照附图的支架的方法。
53.基本上如在本文中描述的并且可选地参照附图的支架的用途。
54.一种基本上如在本文中描述的并且可选地参照附图的支架贴片。
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