KR102663219B1 - 조직 공학 및 외과 수술용 정렬된 다공성 섬유 스캐폴드 - Google Patents

조직 공학 및 외과 수술용 정렬된 다공성 섬유 스캐폴드 Download PDF

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Abstract

본 발명은 제1생분해성 또는 생체 적합성 고분자의 필라멘트 직물 조각을 제공하는 단계, 제2고분자의 코팅을 상기 필라멘트 배열에 도포하는 단계, 및 상기 종축의 확장을 따라 상기 조각을 신장시키는 단계, 따라서 정렬된 미세섬유 스캐폴드를 얻는 단계를 포함하는 고분자 스캐폴드를 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 인공 조직을 제공하는 방법 및 본 발명의 방법에 의해 얻어진 정렬된 필라멘트의 미세섬유 스캐폴드에 관한 것이다.

Description

조직 공학 및 외과 수술용 정렬된 다공성 섬유 스캐폴드
본 발명은 인공 조직의 생성 또는 적절한 조직 치유를 위한 고분자 스캐폴드의 외과적 이식(surgical implantation)에서 진핵 세포(eukaryotic cell)의 부착을 위한 생분해성 또는 생체적합성 고분자 스캐폴드(scaffold)의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 발명의 방법에 의해 생성된 스캐폴드 및 이로 유래된 인공 조직에 관한 것이다.
생체 내(in vivo)에서 조직과 세포는 발달과 형태 형성(morphogenesis)에서 형성되는 주로 선호하는 방향으로 조직(organized)되어 있다. 시험관 내(in vitro) 조건에서 조직 기능을 복제하는 것이 목적인 공학적 조직(engineered tissue)의 경우 특정 세포 조직(cellular organization)을 달성하는 것이 공학적 조직의 미래 기능에 영향을 줄 수 있다. 일부 예로 근육 섬유의 평행 정렬(parallel alignment), 힘줄(tendon)의 콜라겐 섬유 및 혈관 평활근 세포의 나선형 정렬이 있다. 예를 들어, 조직화된 근육 섬유의 누적 미세 수축은 강력한 수축을 가능하게 하고, 힘줄 및 심장 판막(heart valve)과 같은 하중(load bearing) 조직에서 세포 외 매트릭스(ECM)의 일부로서 콜라겐 섬유의 평행 정렬은 조직의 인성(toughness)을 현저하게 향상시킨다. 더욱이, 척수와 같은 연한 조직(soft tissue)에서는 신경(neural cord) 손상의 복구를 개선하기 위해 고유 조직과 유사한 올바른 방향(correct direction)으로 자극을 전달하기 위해 축색 돌기 정렬이 필요하다.
3차원(3D) 세포 성장을 이용하는 조직 공학 및 외과적 재건(surgical reconstruction) 응용은 생체 내에서 기능적으로 보장하기 위한 적절한 스캐폴드(scaffold)를 필요로 한다. 세포가 ECM 침착(deposition) 및 콜라겐 섬유의 성숙 이후에는 성숙한 매트릭스를 거의 개조할 수 없기 때문에, 시험관 내 세포 정렬의 조기 유도(Early induction)가 중요하다.
다른 방법이 현재 세포 정렬(cell alignment)을 유도하는 데 사용된다. 첫 번째 접근법은 접촉 안내면(contact guidance)으로서 미세-나노토포그래피(micro-nanotopography)를 포함하는 조작된 표면 또는 재료상에 세포를 국한시키는(confining) 것에 기초한다. 두 번째 접근법은 세포의 수축 활성 또는 외부 스트레인(strain)에 의해 생성되는 기계적 힘의 적용에 기반하며, 따라서 정렬을 수반한다. 표면에 적용될 수 있는 신장 응력(stretching stress)과 같은 외부 기계적 힘, 예를 들어 내피세포 배양에서 접종된(seeded) 세포를 포함하는 엘라스토머 시트 또는 세포 위에 흐름 전단 응력(마찰)은 또한 정렬을 유도할 수 있다. 그러나 이러한 방법은 2차원 조직으로 제한되며, 이 방법에서는 서로 위에 세포층이 거의 성장하지 않는다. 하이드로겔 시스템에서 3D 세포 정렬은 하이드로겔 내에서 영양 관류(nutrition perfusion)의 부족으로 인해 몇 개의 세포 층으로 제한된다.
상업적으로 이용 가능한 부직포(unwoven) 펠트-유사(felt-like) 폴리글리콜릭 산(polyglycolic acid; PGA) 스캐폴드(Biofelt®)는 PGA 섬유의 용융 방사(melt spinning) 및 추가 카딩(carding) 및 니들 펀치(needle-punch) 가공에 의해 제조되었다. 이 프로세스는 산업 기계를 사용하여 수행된다; 그러므로 상기 제조된 스캐폴드는 다른 모양과 크기로 이용 가능하며 다른 생체 재흡수성(bioresorbable) 고분자로 만들 수 있다. 솔벤트가 없는(solvent-less) 이 공정은 전기 방사와 같은 솔벤트 캐스팅(solvent casting) 절차보다 위험이 적지만 공정상의 어려움으로 인해 스캐폴딩 재료를 개발하는 경우는 거의 없다. 중요한 것은 전기방사(electrospun) 스캐폴드와 달리 그것은 약 90%의 높은 다공성을 초래하고 세포를 빠르게 성장시키고 3D 조직 구조를 형성하는 능력을 성공적으로 입증했다. PGA 메쉬(mesh)를 스캐폴딩 재료로 사용하여 원위치(in situ)에서 힘줄 재생(tendon regeneration)뿐만 아니라 항상성(homeostatic) 심장 및 복벽(abdominal wall) 수술이 보고되었다. 그러나 이러한 용융-방사(melt-spun) 스캐폴드는 스캐폴드 무결성(integrity) 문제로 인해 주로 3D 정렬된 조직을 제조하는데 사용된 적이 없다. 전기 방사에 사용되는 섬유 정렬 기술은 마이크로 섬유(직경 ~ 15μm)를 갖는 용융 방사된 스캐폴드의 섬유 무결성 손실(fiber integrity loss)을 초래한다.
전술한 기술 수준에 기초하여, 본 발명의 목적은 3D 세포 배양 및 인공 조직의 후속 발생(generation)에 유용한 방법 및 물질을 제공하는 수단 및 방법을 제공하는 것이다. 이 목적은 본 명세서의 청구 범위에 의해 달성된다.
용어 및 정의
본 명세서의 문맥에서 생분해성 고분자(biodegradable polymer) 또는 생체 흡수성 고분자(bioresorbable polymer)라는 용어는 인체 내에서 또는 세포 배양 조건하에서, 일(day)에서 년(year)의 범위의 시간 프레임 내에서 능동적으로(효소적 가수분해에 의해) 또는 수동적으로(화학적 가수 분해에 의해) 분해될 중합체에 관한 것이다. 상기 생분해성 고분자는 두 가지 특성으로 특징지어진다: 상기 고분자는 생물학적으로 의미 있는 시간 프레임 내에서 생리학적 조건하에서 그의 구성 단량체 부분 또는 이의 유도체로 천천히 용해되고(lysed) 및 이러한 분해의 생성물은 적어도 용해 상태에서 발생하는 농도에서 이들이 함유하는 유기체(organism)에 대해 독성이 없다. 분해 또는 재흡수에 필요한 시간은 상기 고분자의 성질, 주입(implantation) 위치 및 상기 중합체의 크기 및 다공성에 따라 달라진다. 일반적인 생분해성 또는 생체 흡수성 고분자는 PLA, PGA, PGLA 또는 폴리부티릭산(polybutyric acid)이다.
본 명세서의 문맥에서 생체 적합성 고분자(biocompatible polymer)라는 용어는 반드시 용해될 필요없이 인체 내에서 용인되는 고분자에 관한 것이다. 비-분해성 스캐폴드는 예를 들어 재건/성형외과 수술 및 척수 수복(spinal cord repair) 수술에서 뉴런의 지침(guidance)으로 사용될 수 있다. 뉴런은 보호 조직을 만들 수 없으므로 현장(in situ) 지지체로 보호해야 한다. 신경외과에서, 신경 발달은 정렬된 스캐폴드를 제공함과 동시에 비-분해성 스캐폴드에 의한 기계적 무결성(integrity)을 지지함으로써 뒷받침된다.
본 명세서의 문맥에서 폴리글리콜라이드(polyglycolide) 및 PGA라는 용어는 일반 화학식 1에 의해 기술된 고분자 폴리[옥시(1-옥소-1,2-에탄디일)](poly[oxy(1-oxo-1,2-ethanediyl)])(CAS No. 26009-09-0)에 관한 것이다.
[화학식 1]
　특히 상기 화학식 1의 고분자는 n이 900 내지 1200 사이 또는 상기 고분자의 평균 분자량(molecular mass)은 약 60.000 g/mol이다.
본 명세서의 문맥에서 폴리(락트산), 폴리락트산(polylactic acid) 및 PLA라는 용어는 일반 화학식 2에 의해 기술된 락트산의 폴리에스테르(polyester)(CAS No. 26100-51-6)에 관한 것이다.
[화학식 2]
Figure 112019052756504-pct00002
특히 상기 화학식 2의 고분자는 n이 700 내지 1000 사이 또는 상기 고분자의 평균 분자량은 약 60.000 g/mol이다.
본 명세서의 문맥에서 폴리-3-하이드록시부티레이트(poly-3-hydroxybutyrate) 또는 P3HB라는 용어는 3-하이드록시부티릭산(3-hydroxybutyric acid)의 폴리 에스테르에 관한 것으로, 이는 그의 생합성 경로에도 불구하고 비교적 간단한 구조를 갖는 강한 열가소성 폴리에스테르이다. 본 명세서에서 유용한 P3HB의 특정 준비(preparation)는 400.000 ~ 600.000 g/mol의 평균 분자량을 특징으로 한다.
본 명세서의 문맥에서 폴리-4-하이드록시부티레이트(poly-4-hydroxybutyrate) 또는 P4HB라는 용어는 4-하이드록시부티릭산(3-hydroxybutyric acid)의 폴리 에스테르에 관한 것으로, 이는 그의 생합성 경로에도 불구하고 비교적 간단한 구조를 갖는 강한 열가소성 폴리에스테르이다. 본 명세서에서 유용한 P4HB의 특정 준비(preparation)는 400.000 ~ 600.000 g/mol의 평균 분자량을 특징으로 한다.
본 명세서의 문맥에서 용어 유리 전이 온도(glass transition temperature) 또는 Tg는 비정질(amorphous) 물질에서 온도가 증가함에 따라 단단하고 비교적 부서지기 쉬운(brittle) "유리" 상태로부터 용융(molten) 또는 고무 상태로의 가역 전이인 유리 전이가 발생하는 온도 범위에 관한 것이다. 본 명세서에서 주어진 Tg 값은 달리 언급되지 않는 한, 시차 주사 열량(differential scanning calorimetry) 방법에 의해 측정된 값에 관한 것이다. 측정 프로토콜에 대해서는 ISO 11357-2; Plastics - Differential scanning calorimetry (DSC) - Part 2: Determination of glass transition temperature (1999)를 참조한다.
본 명세서의 문맥에서 용어 정렬 지수(index of alignment)는 총 섬유 수와 관련하여 현미경으로 계수한(counted) 스트레칭 축에 대해 ±20도의 각도를 갖는 섬유의 백분율에 관한 것이다.
본 명세서의 문맥에서 용어 다공성 물질의 다공성(porosity)은 물질과학에서 알려진 표준 파라미터에 관한 것으로, 이는 1(또는 100%)에서 물질(또는 스캐폴드, sc) 샘플 밀도에 대한 벌크(b)의 비율을 빼서 측정된다: φ = 1 - ρb/ρσχ
<발명의 설명>
본 발명은 포유류 세포의 성장을 허용하기에 충분한 다공성을 특징으로 하는 고도로 정렬된 미세섬유의 스캐폴드 제조 방법에 관한 것이다. 다공성(porosity)의 일반적인 값은 75%, 80%, 85% 또는 심지어 약 90%를 초과하는 범위이다.
제1양태에 따르면, 본 발명은
a. 제1고분자의 필라멘트의 직물(fabric)의 조각(piece)을 제공하는 단계, 여기서 상기 제1고분자는 생분해성 또는 생체 적합성이며, 상기 조각은 종축의 확장(extension)을 특징으로 함;
b. 제2고분자의 코팅을 상기 필라멘트 배열(arrangement)에 도포(applying)하는 단계, 여기서 상기 제2고분자는 상기 제1고분자의 녹는점(melting point)보다 낮은 유리 전이 온도를 특징으로 함; 및 이어서
c. 상기 종축의 확장(extension)을 따라 상기 조각을 신장(stretching)시키는 단계, 따라서 정렬된 미세섬유(microfibrillar) 스캐폴드를 얻는 단계를 포함하는 고분자 스캐폴드를 제조하는 방법에 관한 것이다.
특정 실시 예에서, 상기 제1고분자의 필라멘트 직물 조각은 부직포 메쉬(non-woven fabric mesh)이다. 특정 실시 예에서, 제1고분자의 필라멘트 직물 조각은 펠트 유사 직물(felt-like textile)이다.
니팅(knitting)이나 위빙(weaving) 기술로 직물을 한 축으로 늘릴 수 있다면, 텍스타일(textile)로 직조된 섬유(woven fabric)를 사용할 수도 있다. 직조된 텍스타일에서 새로운 배향을 찾기 위해 섬유(fiber)의 변위는 원하는 섬유 배향을 달성하는 것이 중요하다. 따라서, 모든 편직 기술이 본 발명의 적용에 적합하지는 않지만 당업자는 본원에서 제공된 지침에 따라 본 발명의 공정에 적용될 수 있는 직물을 선택할 수 있을 것이다.
특정 실시 예에서, 상기 직물의 조각은 단계 c에서 종축 연장선을 따라 175% 이상 신장되고, 즉 10cm 길이의 조각은 17.5cm 이상으로 신장된다. 특정 실시 예에서, 상기 직물의 조각은 175% 내지 250% 또는 심지어 300%까지 신장된다. 특정 실시 예에서, 상기 직물의 조각은 약 200%까지 신장된다.
상기 필라멘트에서 요구되는 정렬을 달성하기에 충분한 신장 정도는 상당히 다양하다. 그것은 첫 번째 고분자 섬유의 성질, 처리 및 얽힘 정도에 달려있다. 본 발명의 이점을 유도하는 정렬을 달성하는데 효과적인 신장 정도(Degrees of stretching)는 다양한 재료에서 110% 내지 1000%로 다양하다.
특정 실시 예에서, 상기 신장(stretching) 공정은 단계 c에서 신장 전후에 정렬 측정(measure of alignment)을 적용하여 정량화될 수 있다. 따라서, 상기 공정으로 들어가는 상기 직물 조각은 상기 필라멘트의 제1정렬 지수 iA1를 특징으로 하고, 단계 c에서 상기 정렬된 미세섬유 스캐폴드는 제2정렬 지수 iA2를 특징으로 한다.
상기 제1정렬 지수에 대한 제2 정렬지수의 비 iA2/iA1는 상기 직물(fabric)이 신장된 정도의 척도이다. 특정 실시 예에서, 상기 비는 2보다 크고, 특히 2.5보다 크며, 좀더 특별하게는 3보다 크다.
특정 실시 예에서, 상기 정의된 정렬 지수는 무작위 스캐폴드에 대해 20-25%, 예비-신장 길이(pre-stretch length)(1.5x)의 150%로 신장된 샘플에 대해 55-60%, 예비-신장 길이(pre-stretch length)(2x)의 200%로 신장된 샘플에 대해 75-80%이다.
간단한 미세섬유(microfiber) 스트레칭으로 얻은 스캐폴드는 나노 섬유보다 유리한 세포 침입을 허용하기에 충분한 공극과 높은 다공성을 결합시킨다. 그러나 미세섬유의 정렬은 분해(disintegration)를 초래할 것이다. 제2고분자의 적용은 상기 미세 망(fibre meshwork)의 분해를 방지하고, 이는 미세섬유의 높은 다공성과 세포 이동 및 배양이 가능한 물질에서의 이들의 정렬을 결합시킬 수 있다.
특정 실시 예에서, 제1 및 제2고분자는 각각 유리 전이 온도 Tg 및 녹는 온도 Tm을 특징으로 하고, 단계 c는 제1 및 제2고분자 모두의 Tg보다 높고, 제1 및 제2고분자 모두의 Tm보다 낮은 온도에서 수행된다. 즉, 정렬을 수행하기 위해 고분자는 충분히 플라스틱이 되기 위해 유리 전이 온도 이상으로 가열되어야 하지만 녹지 않아야 한다.
특정 실시 예에서, 제1고분자는 정의된 Tm을 갖지 않을 수 있다. 당업자는 공정 온도의 주요 포인트가 스캐폴드 매트릭스의 녹는점보다 낮은 온도에서, 그러나 두 고분자의 유리 전이 온도보다 높은 온도에서 공정을 수행하는 것이라는 것을 이해한다.
특정 실시 예에서, 단계 c는 50℃ 내지 150℃, 특히 60℃ 내지 80℃의 온도에서 수행된다. 이러한 온도는 PGA (및/또는 폴리-L-락트산(PLLA) 및 PLGA) 기반 스캐폴드에 특히 잘 작용한다.
특정 실시 예에서, 상기 스캐폴드는 인가된 장력을 해제하기 전, 단계 c 이후에 냉각된다.
특정 실시 예에서, 제2고분자는 생분해성 및/또는 생체 적합성 고분자이다.
특정 실시 예에서, 상기 필라멘트에 도포된 제2고분자의 양은 제1고분자의 상기필라멘트의 질량(mass)에 대해 10% 내지 40% (질량%; m/m)의 범위이다. 예를 들어, PGA 필라멘트를 포함하는 직물 10g은 폴리하이드록시부티레이트로 코팅한 후 13g 사이의 질량을 가지며, 이는 제2고분자의 30%의 적용에 해당한다.
하나의 특정 실시 예에서, THF 중 2%(w/v) 폴리하이드록시부티레이트의 용액에 제1고분자 스캐폴드를 딥 코팅함으로써 10% 내지 40% 양의 제2고분자가 도포된다.
특정 실시 예에서, 상기 제1고분자는 폴리에스테르(polyester), 폴리우레탄(polyurethane) 및 폴리아닐린(polyaniline)을 포함하는 군으로부터 선택된다. 특정 실시 예에서, 상기 제1고분자는 폴리글리콜리드(polyglycolide)(PGA), 폴리(락트산)(poly(lactic acid))(PLA), PLGA(polylacticglycolic acid), 폴리(트리메틸렌 카보네이트)(poly(trimethylene carbonate))(PTMC), 또는 글리콜산(glycolic acid) 또는 락트산(lactic acid) 단량체를 포함하는 공중합체를 포함하는 군으로부터 선택된다.
폴리아닐린(Polyaniline)은 바이오 센서 기술에 사용되는 전도성 고분자(PANI)이다. 이것은 생분해성이 아니지만 생체 적합하다. PANI는 척수 손상을 치료하는데 사용하기 위한, 특히 신경 성장을 유도하거나 절단된 신경에 자극을 가하는데 그의 유용성을 위하여 영구 스캐폴드를 제조하는데 적합한 물질로 고려된다.
특정 실시 예에서, 상기 제1고분자는 PEG(polyethylene glycol); PET(polyethylene terephthalate); PMEA(poly(2-methoxyethyl acrylate)); PMPC(poly(2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine)); PTHFA(poly(tetrahydrofurfuryl acrylate)); 및 PST(polystyrene)를 포함하는 군으로부터 선택된다.
제2고분자는 제1고분자의 필라멘트를 코팅하는 역할을 하고 신장력(stretching force)이 해제된 후에 그들을 정렬된 상태로 유지한다. 제2고분자는 제1고분자와 상이하다. 이것은 용액에 딥 코팅에 의해 도포된다; 상기 용매 또는 고분자 그 자체가 제1고분자를 용해시켜서는 안된다는 것이 명백하다. 상기 제2고분자는 제2고분자가 적용된 조건하에 제1고분자를 완전히 용해시키지 않는 용매에서 분산되어야 한다는 단서와 함께 제1고분자에 대해 주어진 목록으로부터 선택될 수 있다.
특정 실시 예에서, 두 고분자를 모두 용해시킬 수 있는 용매가 사용되나, 제1고분자는 제2고분자가 도포되는 조건하에서 매우 천천히 용해된다.
예를 들어, 제2고분자의 고분자 용액은 밤새 용해(overnight dissolution)에 의해 수득될 수 있으며, 이는 용액 중에 플래시 딥핑(flash dipping)에 의해 제1고분자 상에 도포되고, 그 후 상기 스캐폴드는 진공 상태로 건조된다. 고분자량인 제1고분자는 구조를 분해시키는 포인트에 용해되지 않고, 제2고분자의 코팅은 제1고분자 상에 잔류하고 섬유 상호 접합부(fibers interjunction) 내에 형성된다.
특정 실시 예에서, 제2고분자는 폴리하이드록시부티레이트, 특히 P4HB 및 P3HB이다. 하나의 비-제한적인 예로서, P4HB는 PGA, PLA, PLLA 및 PLGA의 섬유를 코팅하기 위하여 THF(테트라하이드로퓨란)에 용해된다.
제1고분자, 제2고분자 및 용매의 추가의 유리한 조합이 [표 1]에서 비-제한적인 실시 예로서 제시된다:
제1고분자 제2고분자 제2고분자용 용매
PGA PLA THF
PGA PLGA THF, 다이옥산(Dioxane)
PGA PTMC THF, 클로로포름(Chloroform)
PGA P4HB THF, 아세톤(Acetone)
PGA P3HB THF, 아세톤(Acetone)
PLA PGA THF, 다이옥산(Dioxane)
PLA PLGA THF, 다이옥산(Dioxane)
PLA PTMC THF, 클로로포름(Chloroform)
PLA P4HB THF, 아세톤(Acetone)
PLA P3HB THF, 아세톤(Acetone)
PTMC PLA THF
PTMC PLGA THF, 다이옥산(Dioxane)
PTMC PGA THF, 다이옥산(Dioxane)
PTMC P4HB THF, 아세톤(Acetone)
PTMC P3HB THF, 아세톤(Acetone)
P4HB PLA THF, 다이옥산(Dioxane)
P4HB PLGA THF, 다이옥산(Dioxane)
P4HB PGA THF, 다이옥산(Dioxane)
P4HB PTMC THF, 클로로포름(Chloroform)
P4HB P3HB THF, 아세톤(Acetone)
P4HB PEG THF, 아세톤(Acetone)
P3HB PLA THF
P3HB PLGA THF, 다이옥산(Dioxane)
P3HB PGA THF, 다이옥산(Dioxane)
P3HB P4HB THF, 아세톤(Acetone)
특정 실시 예에서, 상기 필라멘트는 100nm와 250μm 사이, 특히 1μm와 50μm 사이, 보다 특별하게는 10μm와 20μm 사이의 직경(diameter)으로 특징지어진다.
특정 실시 예에서, 단계 a에서 제공된 직물 조각은 상기 제1고분자의 벌크 밀도(bulk density)에 대하여 5% 내지 15%의 스캐폴드 비밀도(specific density)를 특징으로 한다. 특정 실시 예에서, 단계 c에서 수득된 직물의 조각은 상기 제1고분자의 벌크 밀도에 대하여 10% 내지 20%의 스캐폴드 비밀도를 특징으로 한다. 특정 실시 예에서, 단계 c에서 수득된 직물 조각은 제1고분자의 벌크 밀도에 대하여 측정된 스캐폴드 비밀도가 단계 a에서 제공된 직물 조각의 스캐폴드 비밀도 보다 1.5 내지 3 배, 특히 약 2배 큰 것을 특징으로 한다.
상기 재료의 다공성은 다음 공식을 사용하여 스캐폴드 밀도 및 벌크 밀도 값으로부터 계산할 수 있다;φ = 1 - ρb/ρσχ
여기서 ρb는 상기 벌크 재료의 밀도, ρσχ는 상기 다공성 스캐폴드의 밀도이다.
본 발명의 다른 양태는 인공 조직을 제공하기 위한 생체 외(ex vivo) 방법에 관한 것으로,
a. 본 발명의 제1양태로서 상기 제시된 방법에 따른 정렬된 미세섬유 스캐폴드를 제공하는 단계;
b. 포유동물 세포를 포함하는 세포 배양 배지에 상기 정렬된 스캐폴드를 현탁시키는 단계를 포함한다.
특정 실시 예에서, 상기 포유류 세포는 섬유아세포(fibroblast), 근아세포(myoblast) 및 뉴런(neuron)으로부터 선택된다. 특정 실시 예에서, 상기 세포 배양 배지는 37℃에서 세포 성장 및 분화를 위한 모든 영양소 및 성장 인자를 해결하고(compromise), 상기 세포는 배지에서 20일까지 보관되었다.
또 다른 양태는
a. 스캐폴드의 다공성은 (=) 80%, 특히 = 85%, 보다 특별하게는 90% 이상,
b. 정렬 지수는 (=) 50%, 특히 = 75%, 보다 특별하게는 = 85% 이상, 및/또는
c. 필라멘트의 직경은 100㎚ 내지 250㎛, 특히 5㎛ 내지 50㎛, 보다 특별하게는 10㎛ 내지 20㎛의 범위인 것을 특징으로 하는,
제2 생분해성 또는 생체 적합성 고분자로 코팅된 제1 생분해성 또는 생체 적합성 고분자의 정렬된 필라멘트의 미세섬유 스캐폴드에 관한 것이다.
뼈 재생을 위해 적용된 스캐폴드와 같은 특정 용도는 보다 낮은 다공도 값, 예를 들어 50%로 특징 지어질 수 있다.
특정 실시 예에서, 상기 스캐폴드를 구성하는 섬유 또는 필라멘트는 5㎛ 내지 50㎛까지 범위의 직경을 특징으로 한다.
상기 섬유 또는 필라멘트 직경의 파라미터는 세포 침투(infiltration)에 접근 가능한 공극(pore)을 만드는 것과 관련하여 중요하다. 예를 들어, 나노 미터 범위의 섬유를 사용하면 90%의 다공성을 갖는 정렬된 스캐폴드를 만들 수 있다. 그러나 이러한 나노 미터의 높은 다공성 스캐폴드의 문제는 세포가 침투하기에는 너무 작은(small) 복수의 공극을 특징으로 한다는 것이다. 세포 침투를 위한 우수한 공극 크기를 갖는 마이크로미터 범위의 미세섬유 무작위 스캐폴드는 당업계에 공지되어 있지만, 이들 섬유는 필요한 정렬이 결여되어 있다.
그러므로 고도로 다공성이 있는 스캐폴드의 공극에 대한 접근성은 개별적으로 평가되어야 한다. 발포체(foam) 및 하이드로겔과 같은 비-섬유질 스캐폴드의 다른 예는 모두 95% 이상의 다공성을 가지지만 그 공극은 세포 침투에 용이하게 접근할 수 없다. 따라서, 이러한 스캐폴드는 세포의 존재에서 현장에서(in situ) 만들어야 한다.
본 발명의 이 양태의 특정 실시 예에서, 제1고분자는 폴리에스테르(polyester), 폴리우레탄(polyurethane) 및 폴리아닐린(polyaniline)을 포함하는 군으로부터 선택된다.
특정 실시 예에서, 상기 제1고분자는 생분해성 고분자, 특히 폴리글리콜리드(polyglycolide), 폴리(락트산)(poly(lactic acid)), PLGA, 폴리(트리메틸렌 카보네이트)(poly(trimethylene carbonate)), 폴리(4-하이드록시부티레이트), 폴리(3-하이드록시부티레이트), 폴리(글리콜라이드-코-카프로락톤)(poly(glycolide-co-caprolactone)), 폴리(글리콜라이드-코-트리메틸렌 카보네이트)(poly(glycolide-co-trimethylene carbonate)), 또는 글리콜산(glycolic acid) 또는 락트산(lactic acid) 단량체를 포함하는 공중합체를 포함하는 제1군으로부터 선택된다.
많은 응용 분야에서, 이 제1고분자는, 생분해성으로 선택되는 경우, 전체 스캐폴드를 생분해성으로 만들기 위해 생분해성이 있는 제2(코팅)고분자와 결합될(combined) 것이다.
본 발명의 이 양태의 특정 실시 예에서, 제1고분자는 비-생분해성이지만 생체적합성 고분자, 특히 폴리아닐린, 폴리에틸렌글리콜(PEG); 폴리에틸렌 테레프탈레이트(polyethylene terephthalate); 폴리(2-메톡시에틸 아크릴레이트)(poly(2-methoxyethyl acrylate)); 폴리(2-메타크릴로일옥시에틸 포스포릴콜린)(poly(2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine)); 폴리(테트라하이드로푸르푸릴 아크릴레이트)(poly(tetrahydrofurfuryl acrylate)); 폴리스티렌 또는 제2군에 포함된 2개 또는 3개의 상이한 고분자, 특히 다른 임의의 제2군 비-생분해성 고분자를 갖는 PEG의 공중합체로 구성된 군으로부터 선택되는 고분자를 포함하는 제2군으로부터 선택된다.
본 발명의 이 양태의 특정 실시 예에서, 제2고분자는 폴리하이드록시부티레이트, 특히 P4HB 및 P3HB로부터 선택된다.
본 발명의 이 양태의 특정 실시 예에서, 상기 스캐폴드는 제1고분자의 벌크 밀도에 대하여(in relation to) 10 내지 20%의 스캐폴드 비밀도를 특징으로 한다.
결론을 위해, 본 발명자들은 스캐폴드 다공성 및 섬유 결합(fiber integration)을 유지하면서 미세섬유 고분자 스캐폴드에서 섬유 정렬을 유도하기 위한 신규한 접근법을 보고 한다. 이러한 고분자 스캐폴드는 조직 공학 및 외과적 수술(surgical application)에 자주 사용되며 3D 세포 및 조직 배양에 적합한 플랫폼을 제공한다. 본원에서 제시된 간단한 접근법은 섬유성 스캐폴드(fibrillar scaffold)에서 섬유 정렬을 위한 보편적인 방법을 제공한다. 상기 실시 예에 제공된 세포 연구는 스캐폴드 섬유 방향을 따라 세포 및 매트릭스 정렬을 허용하면서, 밀리미터 크기의 3D 정렬된 조직 구조물(tissue construct) 성장(growing)을 위한 본 발명의 방법의 적합성을 설명한다. 본 발명의 방법은 심장 및 골격근(skeletal muscle), 힘줄, 신경 및 혈관 조직 수술(repair) 및 공학(engineering)을 포함하여 스캐폴드 내의 세포 정렬의 진정한 3D 유도가 요구되는 조직 공학 및 재건(reconstructive) 수술의 많은 영역에서의 적용에 적합하다.
본원에 개시된 방법에 의해 제공되는 스캐폴드는 시험관 내(in-vitro)에서 인공 조직을 제조하기 위해 사용될 수 있거나, 직접 조직 치유 및 수술을 장려하기 위한 수술 패치(surgical patch)로서 직접 사용될 수 있다. (패치로서) 제2양태를 위해 제공되는 스캐폴드는 세포 배양에서 사전 배양(prior incubation)없이 적용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는, 세포 또는 ECM 없이 직접적으로 스캐폴드를 신체에 직접적으로 이식하는 본원에 개시된 스캐폴드의 외과 수술(surgical application) 또는 생체 내(in vivo) 적용에 관한 것으로, 이는 새로운 조직 생성을 유도하여 치유 과정을 개선시킬 것으로 기대된다.
예를 들어, 제1고분자 또는 제2고분자, 다공성 또는 세포 유형과 같은 단일 분리 가능한 특성에 대한 대안이 본 명세서에서 "실시 예"로 제시되는 경우, 이러한 대안들은 본 명세서에 개시된 본 발명의 개별적인 실시 예들을 형성하도록 자유롭게 조합될 수 있음을 이해해야 한다.
본 발명은 다음의 실시 예 및 도면에 의해 더 설명되며, 이로부터 추가적인 실시 예 및 이점이 얻어질 수 있다. 이들 실시 예는 본 발명을 예시하기 위한 것이지, 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.
도. 1은 정렬된 PGA 스캐폴드 및 섬유 정렬 분석의 생산을 나타낸다. (a) Tg 이상 Tm 이하로 상기 스캐폴드를 가열하고, 그 다음 신축 장치를 사용하여 단방향 스트레인(unidirectional strain)을 가하여(b) 무작위 PGA 망(meshwork)에서 정렬을 유도하는 공정의 그림, 사각형 모양의 무작위 PGA 스캐폴드의 폭과 길이는 다른 스트레치(50% 와 100%) 적용시 변경되었다. (c) 다르게 신장된 PGA 스캐폴드의 정렬 분석. (d) P4HB 상호 연결(interconnection)을 사용하여 100% 신장시 고도로 정렬된 PGA 스캐폴드를 가시화하는 상응하는 스캐폴드의 폴스 색 형광(False colour fluorescence) 이미지 및 (e) 전자 현미경 사진. 이중 화살표(Double head arrow)는 적용된 스트레인(strain)의 방향을 나타내고 작은 화살표는 PGA 섬유를 상호 연결하는 P4HB 코팅을 나타낸다. 스케일 바 (a) 5 mm, (d) 200 μm (e) 50 μm.
도. 2는 PGA 스캐폴드의 물리적 특성 변화를 나타낸다. (a) PGA 스캐폴드의 100% 신장 후 비밀도(specific density)[mg/cm3]가 유의하게 증가하였다. (b) PGA 스캐폴드의 스캐폴드 다공성(비밀도에 역비례). (c) 무작위 PGA 스캐폴드 가공시 섬유 직경은 외부 스트레인(strain)에 의해 영향을 받지 않는다. (d) 100% 신장된 PGA 스캐폴드에 대한 곡선의 기울기(Young's modulus)의 강한 증가를 보여주는, 상이하게 신장된 PGA 스캐폴드에 대한 스트레인-스트레스 곡선.
도 3은 상이하게 신장된 PGA 스캐폴드 상에 양(ovine) 혈관 섬유아세포(vascular fibroblast)를 1주일 배양한 후 세포핵 및 F-액틴 정렬 분석을 나타낸 것이다. (a) 상이하게 신장된 PGA 스캐폴드에 접종된 F-액틴(보라색) 및 핵(파란색)에 대해 염색된 혈관 섬유아세포의 다평면 공초점 이미지(multi-plane confocal image)의 최대 Z 투사 강도(projection intensity)는 섬유 스캐폴드 사이 및 위에서 성장하는 세포를 나타내고 및 (b) 각각의 액틴 섬유 정렬 정량화(alignment quantification)는 정렬된 섬유 스캐폴드에 의한 정렬 유도를 나타낸다. ±10도의 스트레인 축 내에서 정렬된 (c) 액틴 섬유 및 (d) 세포핵의 백분율은 무작위로 배향된 PGA 스캐폴드와 비교하여 신장된 샘플에서 개선된 F-액틴 및 세포핵 정렬을 나타낸다. 스케일 바: 200μm (a, 왼쪽) 및 50μm (a, 오른쪽).
도 4는 토끼 힘줄 섬유아세포에 의해 조립된 피브로넥틴 매트릭스와 무작위 및 정렬된 PGA 스캐폴드에서 3주 배양 후 그것의 정렬 정량화(alignment quantification)를 도시한다. (a, b, c) 정렬된 및 (d, e, f) 무작위 PGA 스캐폴드(회색)에서 조립된 피브로넥틴 매트릭스의 다평면 공초점 이미지(multi-plane confocal image)의 최대 Z 투사 강도(projection intensity)는 배양 3주 동안 배양 배지에 표지된 피브로넥틴(녹색)을 첨가함으로써 시각화되었으며, 이는 PGA 섬유 사이 및 그 주위에 피브로넥틴 침착을 나타낸다. (g) 상기 스캐폴드의 섬유 방향을 따른 섬유 피브로넥틴 번들(fibrillar fibronectin bundle)의 정렬의 정량화는 정렬된 PGA 스캐폴드 내의 보다 높은 수준의 이방성(anisotropy)을 나타낸다. (h, k) 배양된 스캐폴드의 단면도는 스캐폴드 유형에 독립적인 스캐폴드를 가로 질러 일어나는 피브로넥틴 매트릭스 형성 및 상기 흐름(flow)에 직면하는 측면에 증착된 바람직하게 높은 피브로넥틴(흰색 화살표)을 보여준다.
실시예
본 발명자는 상업적으로 입수 가능한 생분해성(biodegradable)/재흡수성(resorbable) 고분자, 특히 PGA를 사용하여 센티미터 스케일에서 마이크로 섬유 정렬(microfiber alignment)을 유도하는 간단한 방법을 보고한다. 예시적인 실시 예로서, 발명자들은 부직포 PGA 메쉬(unwoven PGA mesh)를 사용했다. 본 발명의 방법은 기본적으로 임의의 다른 마이크로섬유 스캐폴드에 적용될 수 있다.
먼저, PGA 섬유를 폴리4-하이드록시부티레이트(P4HB)로 코팅한 다음 두 고분자의 유리 전이 온도(Tg) 이상으로 가열하고 PGA-P4HB 망(meshwork)에 단방향 스트레인(unidirectional strain)을 가하여 정렬한다. 적용된 스트레인의 결과로 상기 PGA 섬유는 풀리지 않으며(uncoiled) 개별 섬유는 상기 스트레인 축에 평행하게 정렬된다. 이러한 정렬된 PGA 마이크로 섬유 망은 세포 조직을 가이드하고 세포 정렬(alignment)를 다공성 구조로 유도하기 위한 스캐폴드로 사용되었다. 본 명세서에서 제시된 결과는 이러한 다공성 및 정렬된 스캐폴드가 3D 세포 침투를 제공하고, 3D 조직을 보존하면서 접촉 안내(contact guidance)에 의해 세포를 효율적으로 정렬할 수 있음을 입증한다. 또한, 적절한 스캐폴드 다공성으로 인하여 관류 장치(perfusion device) 및 효율적인 세포 접종을 사용하여, 본 발명자는 정렬된 3D 미세조직을 수득할 수 있었다. 이 접근법은 제시된 예에 국한되지 않고 조직 공학, 재건 수술 및 기본 세포 연구에 사용되는 다른 섬유 스캐폴드에도 적용할 수 있다.
실시예 1: Tg 이상에서 P4HB 코팅된 PGA 스캐폴드의 신장(Stretching)은 망(meshwork)을 풀고 섬유 정렬을 유도한다.
폴리 4-하이드록시부티레이트(P4HB)의 Tg 및 Tm은 각각 5-15℃ 및 168-182℃에서 변화하는 반면, PGA는 35-45℃의 전이 온도(Tg)와 220-230℃의 융점(Tm)을 가지고 있다. PGA 스캐폴드를 P4HB 용액(1.75% 테트라하이드로퓨란(THF))에 담그고 상온에서 밤새 건조시켜 P4HB로 코팅하였다. P4HB의 첨가는 PGA 섬유의 분해(degradation) 시간을 연장 시키며, 조직 공학 응용에 사용되는 경우 상기 스캐폴드 상의 보호층으로 작용하며, 동시에 교차된 섬유를 가교(bridging)함으로써 스캐폴드 무결성(integrity)을 향상시킨다. 두 고분자의 Tg 이상으로 상기 스캐폴드를 80℃까지 가열하면 스캐폴드 섬유와 P4HB가 연화(softening)되어 섬유가 파손되거나 스캐폴드를 손상시키지 않으면서 단방향 스트레인(unidirectional strain)을 적용할 수 있다. PGA의 Tg 이하, 예를 들어 실온으로 온도를 연속적으로 감소시키는 것은 P4HB 구성 요소가 여전히 상기 섬유를 상호 연결하고 스캐폴드 무결성을 유지하면서 새로운 배열로 섬유 망(fibre meshwork)을 응고시키고 설정한다(도 1a). 거시적(macro-scale) 규모에서 단방향 스트레인은 폭을 줄이고 길이를 늘임으로써 고분자 망의 직사각형 모양의 변형을 일으켰다. 플라스틱 필름과는 달리, PGA 망(meshwork)의 형태 변화는 탄성 필름에서 관찰된 것과 거의 같았으며, 중간에서 작은 부분에 축적되기보다는 신장된 스캐폴드의 전체 길이에 걸쳐 폭 감소의 분포를 보였다(도 1a). 이러한 거동은 처음에는 무작위로 배향된 스캐폴드의 넓은 영역에서 정렬된 스캐폴드를 얻기 위해 이 처리 접근 방식을 적합하게 한다(도 1). 거시적(Macroscopic) 측정은 스트레칭에 의한 50% 및 100% 길이 증가와 관련하여 각각 53%와 73%의 폭 감소를 보여준다(도 1b). 스캐폴드 두께는 무변형(unstrained) 상태에서 858 ± 55μm에서 50% 및 100% 신장된 PGA 상태에서 각각 1170 ± 172μm 및 1036 ± 191μm로 증가했다. 섬유 정렬을 정량하기 위해, 우리는 3D 형광 공초점 이미지를 분석했다. 100% 신장된 샘플의 경우, 53%의 섬유가 축 변형(axis strain)에 대해 정렬(± 10도)되고, 50%의 신장된 경우 34%의 섬유 정렬을 나타낸다. 비-신장된 PGA 망은 단지 14%의 섬유가 축 변형에 정렬되어 있었다(도 1c 및 d). 전자 현미경 사진은 또한 PGA 섬유 정렬과 스트레치 적용 후 PGA 섬유에 대한 P4HB 상호 연결의 존재를 확인했다(도 1e, 흰색 화살표).
스캐폴드 밀도 측정은 변형되지 않은(105±6.9mg/cm3) 및 50% 신장된(102±18.3mg/cm3) 스캐폴드에 대해 비밀도(specific density)의 변화를 나타내지 않았지만, 100% 신장된(157.4±28.2mg/cm3) 스캐폴드에서는 유의한 증가가 관찰되었고(도 2 a), 이는 여전히 벌크 PGA 고분자(1530 mg/cm3)의 밀도보다 훨씬 낮다. 상기 스캐폴드에 대한 다공성 측정은 벌크 PGA로 채워진 것과 같은 부피의 스캐폴드로 가정하여 수행되었다. 스캐폴드 다공도의 측정은 0, 50, 100% 신장된 스캐폴드에서 각각 92.9±0.5%, 93.2±0.9% 및 89.6±1.3%을 나타냈으며(도 2b). 이것은 스캐폴드의 약 90% 다공성을 나타내고 비밀도 측정의 경우와 반대의 추세를 나타낸다. 섬유 직경 분석은 다르게 신장된 PGA 스캐폴드에 대한 섬유 직경에서 어떠한 유의미한 변화도 나타내지 않았지만, 이는 스캐폴드에 적용된 변형이 상기 공정에서 직접 개별 섬유에 영향을 미치지 않는다는 것을 의미한다(도 2c). 마지막으로, 다르게 정렬된 섬유 PGA 스캐폴드의 기계적 성질이 측정되었고 원래의 PGA 스캐폴드와 비교되었다(도 2d). 오리지널(original) 스캐폴드(11.3MPa)에 비해 50% 신장된 스캐폴드(12.9MPa)에 대한 영률(young's modulu)이 약간 증가한 반면, PGA 망을 100% 신장시키는 경우 영률은 96.3MPa로 증가했다. 무작위 오리지널 PGA 스캐폴드에 대한 파단시(at break) 변형은 약 40%였으며, 이 유형의 스캐폴드를 100%까지 신장시키려면 Tg 이상으로 스캐폴드를 가열하는 것이 중요한 포인트임을 시사한다.
제1고분자(특히: PGA) 섬유의 무결성(integrity)에서 제2고분자, 특히 P4HB의 역할은 특히 스캐폴드가 세포 현탁액과 함께 직접 접종되거나 이후의 세포 침투를 위해 신체에 이식될 계획이라면 중요하다. 전자 현미경 이미지(도 1c, 작은 화살표)는 P4HB 고분자로 채워진 섬유 간(inter-fiber) 영역을 나타낸다. 이러한 고분자 브릿지(bridge)는 신축시 상기 섬유 네트워크 연결을 유지하고 탄성 접착제 처럼 작동하여 상기 망을 안정화시킨다. 스트레칭 과정 후에, 이러한 상호연결(interconnection)은 상기 스트레인(strain) 하에서 매우 변형되지만 여전히 연결을 유지한다(도 1d, e). 80℃에서의 어닐링 공정과 함께 실온보다 약간 낮은 P4HB의 Tg로부터 유래된 상기 변형은 이 고분자의 변형 및 성형에 도움을 준다. 코팅층 없이 PGA 스캐폴드를 신장시키거나 스트레칭 공정 후에 코팅을 용해시키는 것을 스캐폴드 무결성을 나타내었으며, 이는 2차 고분자 코팅의 중요한 역할을 나타낸다.
실시예 2: 3D 정렬된 다공성 PGA 스캐폴드에 내장된 세포를 상기 PGA 섬유의 방향으로 유도되고 정렬되었다.
상기 스캐폴드에 접종될 때 세포가 성장하고 배지로부터 충분한 영양을 공급받기 위해서, 본 발명자는 세포 배양 기간 동안 상기 조직을 관류시키기 위한 단순한 원형 진탕기(shaker)를 사용하였다. 이러한 생물 반응기는 1mm 두께까지 약간 두꺼운 조직 시트로 세포를 성장시킬 수 있었다. 초기에, 양 혈관 섬유아세포를 PGA-P4HB 스캐폴드를 사용하여 상기 장치에서 일주일 동안 배양하였다. 그 후, 액틴 섬유 및 핵 정렬을 분석 하였다(도 3a 및 b). 상기 분석은 100% 신장된 PGA 스캐폴드에서 대부분 정렬된 액틴 응력 섬유를 보여 주었다(도 3b). 측정된 정렬된 액틴 섬유로부터 100% 신장된 스캐폴드에서 PGA 섬유의 스트레칭 축에 ±10도로 51.1±5.7%, 50% 신장된 스캐폴드에서 37.6±6.5%, 및 무작위 방향성 PGA 스캐폴드에서 6.9%±4.7가 정렬되었다(도 3b, c). 또한, 세포핵 정렬 분석은 100%, 50% 및 비-신장 PGA 스캐폴드에 대하여 상기 PGA 섬유의 스트레칭 축에 대해 ±10도의 정렬된 세포핵의 52.6±10.2%, 36.9±13.6% 및 14.4±3.7%를 나타냈으며(도 3d), 이는 액틴 섬유 정렬 분석에서 얻어진 결과를 뒷받침한다.
상기 스캐폴드를 가로지르는 피브로넥틴 매트릭스의 3차원 증착
비록 정렬에 관한 연구의 대부분이 단시간(수일 내지 며칠) 동안 세포핵 또는 액틴 정렬을 보고 하지만, 본 발명자들은 3주 후에 세포핵 및 액틴 섬유 정렬을 일주일 후에 평가할 뿐만 아니라 주요 ECM 성분으로서 피브로넥틴(fibronectin) 섬유 다발 정렬을 평가하였다. 이를 위해 AlexaFluor®488로 표지된 피브로넥틴을 3주에 걸쳐 토끼 힘줄 섬유아세포의 배지에 첨가했다. 배양 시간 동안, 상기 표지된 피브로넥틴은 ECM으로 관류 및 공동 조립되어 스캐폴드에 가로질러 피브로넥틴 섬유 네트워크의 시각화를 가능하게 하고 피브로넥틴 섬유의 배향(orientation) 각도를 분석하는데 사용되었다(도 4). 섬유소 피브로넥틴 번들 정렬의 정량화는 100% 신장된 샘플(도 4에서 "정렬된 스캐폴드"로 나타냄) 및 무작위 PGA 스캐폴드에서 수행되었다. 이를 위해 먼저 고해상도 이미지를 포함된 물체("임계값")에 대해 분석한 다음 임계 물체의 주축(major axis) 각도를 번들의 배향 각으로 정의했다. 정렬된 PGA 스캐폴드에 조립된 피브로넥틴 매트릭스(fibronectin matrix)는 무작위 PGA 스캐폴드와 비교했을 때보다 높은 정렬을 나타내었다(도 4a-g). 그러나 무작위 PGA 스캐폴드의 약간의 선호적인 정렬(preferential alignment)은 정렬 및/또는 조직 수축의 축에 평행한 흐름 방향으로 인해 나타날 수 있다. 단면 이미지(도 4e, f)는 상기 스캐폴드에 걸쳐 피브로넥틴이 어떻게 축적되었는지 보여주기 위해 사용되었으며, 이는 효율적인 세포 접종 및 침투에 대한 상기 구조의 3차원성 및 상기 스캐폴드의 공극 크기의 적합성을 나타낸다. 피브로넥틴이 상기 스캐폴드를 가로 질러 축적되었지만, 상기 축적은 정면에서 강화된 관류(perfusion)를 나타내는 흐름(이미지 h, k의 화살표)과 마주하는 측면에서 나타났다. ECM이 이 연령대(3주)에서 안정화되고 이전에 그러한 조직이 수확하고 동물에 이식하는데 적합하다는 것이 입증되었기 때문에 3주된 ECM의 평가가 중요할 수 있다. 또한, 탈세포화(decellularization) 및 ECM 스캐폴드의 추가 이식은 최근 주목을 받고 동물 및 인간 임상 연구에서 유망한 결과를 밝혀내는 또 다른 옵션이다. 일반적으로 조작된(engineered) 조직의 탈세포화는 추가 처리를 위해 고품질의 ECM을 수확(harvesting)하기에 적합한 기회(window)로 고려되는 체외 배양 4 ~ 8주 후에 수행할 수 있다. 탈세포화된(decelularized) ECM의 단기 2D 재세포화(recellularization)은 또한 세포가 침착된 피브로넥틴 섬유를 따라 정렬할 수 있고 섬유 방향성을 따를 수 있음을 보여 주었다. 이것을 고려하여, 여기에서 수행된 3주의 피브로넥틴 매트릭스 분석은 최종 세포 정렬 결과를 예측할 수 있으며, 이것은 향후 임상 적용에 대한 관심의 대상이 될 것이다. 더욱이, 3주 후에 정렬을 유지하는 것은 그러한 스캐폴드의 생체 내(in vivo) 이식이 새로운 조직 형성을 유도하기에 충분한 시간을 가질 가능성이 있는 예측 지수(forecasting index)일 수 있다.
탈세포화된 정렬된 ECM은 추가의 세포 정렬, "off-the-shelf" 탈세포화된 공학적 조직을 위한 응용을 유도한다.
PGA 또는 다른 고분자 스캐폴드의 탈세포화(Decellularized) 조직-공학 매트릭스는 혈관 및 심장 판막 조직 공학, 특히 비상사태 및 개발 도상국에서의 제노 (xeno) 및 동종 이식(homograft)에 대해 쉽게 구할 수 있는 "기성품(off-the-shelf)" 대체제(alternatives)로 사용될 수 있다. 이러한 맥락에서, 본 발명자들은 탈세포화 공정 후의 정렬된 ECM이 세포 정렬을 유도할 수 있는지 조사하였다. 이를 위해 PDMS(polydimethylsiloxane) 표면의 나노-패턴 리지(ridge)가 실리콘-SU8 몰드(silicon-SU8 mold)로부터 복제되었다. 상기 몰드는 일반적인 포토리소그래피 방식으로 제작되었으며 Dr. Aldo Ferrari가 아낌없이 제공했다. PDMS 표면은 깊이가 350nm, 폭이 500nm, 리지 폭(ridge width)이 500nm인 홈(groove)을 포함한다. 나노-패턴의 PDMS 표면을 Fibronectin(50μg/ml)으로 코팅한 후, 인간 포피섬유아세포(foreskin fibroblast; HFF)를 상기 코팅된 표면에 접종하였다. 세포 접착 후, AlexaFlour®488로 표지된 피브로넥틴을 세포 배양 배지(5μg/ml)에 첨가하고 세포를 3일 동안 상기 세포 외 기질(extracellular matrix)을 조립하도록 하였다. 3일 후, pH 8.5의 0.5% Triton X100을 사용하여 15분 동안 상기 표면을 탈세포화하여 탈세포화된 ECM 매트릭스를 얻었다. 그 후, 무세포(acellular) ECM 스캐폴드를 HFF와 함께 재접종하고 24시간 동안 배양하였다. 여기서 3D 구조 대신에 2D 표면이 이미징, 탈- 및 재세포화 과정을 쉽게 하기 위해 사용되었다. (상기 배지에 상기 표지된 피브로넥틴을 첨가함으로써) AlexaFlour®488로 표지된 피브로넥틴의 첨가는 평평한 표면에 비해 홈(groove)의 방향을 따라 정렬된 피브로넥틴 섬유 번들(fibronectin fibrillar bundle)이 어떻게 쉽게 시각화되는지를 보여준다. 탈세포와 이후 피브로넥틴 ECM에 섬유아세포의 재접종(reseeding)은 새로 접종된 세포가 조립된 매트릭스(assembled matrix)의 방향을 따라 정렬할 수 있음을 보여 주었으며, 이는 상기 오래된(old) ECM이 세포 정렬(액틴 정렬)을 개시할 수 있고 국소 해부적 안내(topographical guidance) 역할을 할 수 있음을 증명한다. 이 결과는 기성품(off-the-shelf) 적용을 위한 대체 매트릭스로서 미리 정렬된 탈세포화된 매트릭스의 적용을 지원하며, 미리-정렬된 탈세포화된 매트릭스에 의해 추가의 재세포화(recellularization) 및 세포 정렬이 유발될 수 있다.
비교 실시예 3:
PLGA를 클로로포름과 에탄올(75:25 w/w)의 혼합물에 용해시켜 6wt%의 최종 중합체 농도를 갖는 PLGA 고분자 용액을 제조하였다. 상기 고분자를 실온에서 하룻밤 동안 용해시키고, 균질성을 얻기 위해 용액을 사용하기 전에 30분 동안 교반하였다.
전기 방사(electrospun) 스캐폴드의 제조를 위해, 스테인레스 스틸 튜브로 제조된 둔단부(blunt end)를 포함하는 방사 헤드(1mm 내부직경 및 0.3mm 벽 두께, Angst & Pfister AG, Z
Figure 112019052756504-pct00003
rich Switzerland), DC 고전압 공급 장치(Glassman High Voltage Inc., High Bridge, NJ, USA), 수집기(collector)로서 중공 원통형 회전 알루미늄 맨드릴(mandrel) 및 주사기 펌프(AL1000 Aladdin, World Precision Instruments, Inc., Germany)를 포함하는 사내(in-house) 조립된 전기방사 장치가 사용되었다. 상기 고분자 용액을 5mL 주사기(B.Braun Melsungen AG, Germany)에 넣고 0.7 mL/h 유속으로 상기 방사 헤드로 주입하였다. 11kV의 전압을 가했고, 상기 방사 헤드와 수집기 사이의 거리는 15cm로 고정되었다. 상기 생성된 스캐폴드를 알루미늄 호일에 수집하고 진공하에 실온에서 밤새 건조시켰다. 그런 다음 AL 포일에서 직물(fabric)을 수집하고 수동 스트레쳐 장치(stretcher device)에 설치했다. 이후 상기 직물은 섭씨 60도까지 가열되었고 2배(200%) 신장되었다. 이 비교 예에서는 제2고분자가 도포되지 않았다. 신장시 섬유 코일이 열리고 80%의 정렬 지수로 정렬된다. 그러나 상기 직물에 대한 장력(tension)이 해제되면, 제2고분자가 없기 때문에 상기 섬유 무결성(integrity) 및 정렬은 손실되었다. 상기 섬유 직경은 1 내지 2㎛ 범위로 결정되었다. 이 비교 예는 본 발명이 전기 방사와 같은 다른 기술에 의해 제조된 다른 유형의 무작위 직물에 적용될 수 있음 및 직물의 무결성을 보존하기 위한 제2고분자 코팅의 중요성을 예시한다.
재료 및 방법:
스캐폴드 제조
시판되는 부직포 PGA 스캐폴드(두께 1.0mm; 비중 70mg/cm3; Biofelt, Bereldange Luxembourg)는 테트라하이드로퓨란(Sigma-Aldrich, St Louis MO USA)에서 1.75% 폴리-4-하이드록시부티레이트(P4HB; MW: 100000; TEPHA Inc., Lexington MA USA)로 코팅되었다. 망(meshwork) 무결성을 높이고 PGA의 분해 속도를 낮추기 위하여 P4HB를 추가한다. 상기 정렬된 PGA 스캐폴드를 제조하기 위해, PGA 스캐폴드의 조각을 신장 장치(stretching device)에 올려놓고 80℃의 오븐에서 2분간 가열하였다. 상기 오븐에서 시편을 꺼낸 후 수동으로 그리고 원래 길이에서 1.5X 또는 2X로 가능한 한 빨리 신장(stretched)시켰다. 그 후, 스캐폴드를 실온으로 냉각시키고 향후 분석 및 세포 배양 연구에 사용 하였다.
PGA 망(meshwork)의 정렬분석(Alignment analysis)
PGA 섬유를 가시화하기 위해, 405nm 또는 488nm 여기(excitation)에서 PGA 섬유의 자기 형광 특성을 레이저 스캐닝 공초점 현미경(Olympus, FV1000, Japan)으로 영상화하였다. PGA 스캐폴드의 이미지를 얻은 후, ImageJ 소프트웨어를 사용하여 섬유 배향을 결정하였다. 간단히 말해서, 상기 섬유 각도는 ImageJ에서 입자 분석기 옵션을 통해 10도 증가분(degree increment)(0 ~ 90도)에서 스캔된 모든 평면에서 측정하였으며, 각각의 증가분에 대한 섬유의 수를 계수하여 총 섬유 수로부터 평균 백분율(%)로 제시 하였다.
스캐폴드 비밀도(specific density) 및 다공성 분석
PGA 스캐폴드의 비밀도(specific density)를 중량측정법(gravimetrically)으로 결정하였다. 즉, 상기 스캐폴드의 중량을 상기 스캐폴드의 총 부피로 나누었다. 상기 스캐폴드의 길이와 폭은 눈금자에 의해 측정되었으며, 그 두께는 명시야(bright field) 현미경 이미지를 사용하여 단면으로부터 측정되었다. 결과는 mg/cm3 단위로 표시된다. 또한, 상기 스캐폴드 다공성은 PGA (1530mg/cm3)의 벌크 밀도를 상기 스캐폴드 비밀도로 나누어(by dividing the scaffold specific density to bulk density of PGA) 계산하고 백분율로 나타내었다.
기계적 분석(Mechanical analysis)
다르게 신장된(stretched) PGA 스캐폴드의 기계적 성질은 100 N로드 셀이 장착된 일축 하중 시험기(Instron tensile tester, High Wycombe, Buck, UK : model 5864)를 사용하여 측정된 스트레스/스트레인 곡선으로부터 얻어졌다. 직사각형 모양과 10 x 2 mm2의 시험 영역과 800-1200 μm의 두께 범위를 포함하는 샘플이 사용되었다. 실패(failure)까지 20 mm/min의 연신율(Elongation rate)을 적용했다. 모든 조건(n = 3)에 대해 영률[MPa] 및 파단시(at break) 스트레인[%]을 측정하였다.
Mini-bioreactor에서의 PGA 스캐폴드 설치
상기 PGA 스캐폴드의 3D 환경에서 효과적으로 세포 성장을 가능하게 하기 위해 우리는 간단한 맥동 유동(pulsatile flow) 미니 바이오 리액터를 개발했다. 우리의 이전 연구는 이 바이오 리액터가 정적 조건(인용)과 비교할 때 조작된 PGA 스캐폴드에 ECM 축척(deposition)을 향상시킨다는 것을 보여주었다. 간단히 말하면, PGA 스캐폴드를 자외선 광학 접착제(Norland optical adhesive, NJ, USA)를 사용하여 페트리 접시(직경 5cm)의 주변 벽에 고정시켰다. 상기 스캐폴드는 궤도 진탕기의 각 펄스에 의해 앞뒤로 움직이고 있었다. 상기 스캐폴드를 부착한 후, 70% 에탄올 및 10% 과산화수소의 혼합물 및 UV 광을 1시간 동안 멸균하기 위해 사용하였다. 전체 설정은 멸균된 PBS로 적어도 세 번 씻어서 말린 다음, 세포 접종 전에 10% 태아 소 혈청 (FBS, Invitrogen, USA), 1% 페니실린/스트렙토마이신(P/S, Invitrogen, USA) 및 50 μg/ml L-아스코르빈산(Sigma, USA)을 보충한 DMEM-Glutamax(Invitrogen, USA)로 구성된 배지에서 하룻밤 배양하였다.
세포 접종 및 PGA 스캐폴드의 컨디셔닝(conditioning)
사람의 정맥 근섬유아세포(venous myofibroblast)를 대복재정맥(vena saphena magna)에서 채취하여 혈관 공학 및 세포 정렬 분석을 위한 모델로 확장시켰다. 또한, 이전(Evrova et al., Macromolecular Bioscience 2016, 19, 1048)에 기술된 바와 같이 분리되고 배양된 아킬레스 건(Achilles tendon)으로부터의 토끼 섬유아세포(tenocyte)를 조작된(engineered) 힘줄을 재구성하기 위한 모델로 사용하였다. 이전(Moet al., Biomaterials 2005, 26, 3113)에 설명한 바와 같이, 캐리어로 섬유 겔(fibrin gel)을 사용하여 세포 접종을 수행했다. 간략하게 세포를 표준 세포 배양 프로토콜에 대해 해동(defrosted), 확장(expanded) 및 트립신 처리(trypsinized) 하였다. 그 후, 세포를 PBS(10 IU thrombin/ml)에서 멸균 소 트롬빈(Sigma, USA) 용액에 재현탁시켰다. 피브리노겐 용액은 10 mg/ml 활성 피브리노겐과 동등한 14mg의 동결 건조된 소 피브리노겐 분말(Sigma, USA)을 배양 배지에 용해시켜 제조하고 상기 용액을 0.21㎛ 멸균 필터를 사용하여 필터 멸균하였다. 이어서, 트롬빈 용액 중의 세포를 멸균 소 피브리노겐 용액에 같은 부피로 첨가하였다. 짧은 혼합 후, 상기 세포를 함유하는 피브린 용액을 PGA 스캐폴드 상에 피펫팅 하였다. 상기 피브린 젤의 응고 시간은 20에서 40초까지 다양하게 결정되었다. 그러므로 배양 배지를 첨가하기 전에 구조물(construct)을 37℃ 및 10% CO2에서 15분 동안 중합시켰다. 모든 구조물을 처음 24시간 동안 정적 조건하에서 배양한 후, 오비탈 쉐이커(VWR, USA) 및 미니 생물 반응기 플랫폼을 사용하여 재관류를 시작하였다. 상기 쉐이커의 회전 반경은 19mm 였고 연구 기간 동안 모든 샘플에 1Hz(60 rpm)의 회전 속도가 적용되었다. 배양액의 반을 교체함으로써 배양 배지를 3일 마다 교환하였으며 멸균 탈이온수로 증발된 배지를 조정하였다. 연구 중 최적의 DMEM 버퍼링(buffering)을 위해 37℃ 및 10% CO2에서 인큐베이션을 수행했다.
스캐폴드에서 세포 및 세포외 기질의 이미징
특정 배양 기간 후, 샘플은 액틴 및 핵에 대해 면역 염색되었다. 면역 염색을 위해, 샘플을 PBS로 세척한 후 PBS 중 4% 파라포름알데히드에서 30분 동안 고정시켰다. 항체의 비특이적 흡착은 알부민(BSA, 2% w/v, 30분)을 첨가함으로써 방지되었다. 액틴(Actin) 세포 골격은 Alexaflour®488 conjugated phalloidin (Invitrogen, USA)을 사용하여 염색되었다. 세포핵을 DAPI(2μg/ml, 10분)로 염색하였다. 최종적으로 샘플을 PBS로 3회 세척하고 이미지화 하였다.
세포핵, F-액틴 및 피브로넥틴 정렬 분석
세포핵 정렬은 ImageJ의 공초점 이미지 및 입자 분석기 옵션을 사용하여 분석되었다. 405nm 레이저를 사용할 때 PGA 섬유의 자가 형광(autofluorescence)이 간섭함에 따라 핵은 원형도(circularity), 크기에 의해 분할되고 모든 샘플을 수동으로 확인했다. 핵의 방위각(orientation angle)을 정한 후, 섬유의 신장 축에 대해 ±10도의 핵, 즉 바람직한 섬유 방향을 계수하여 정렬된 핵으로 나타내었다.
유사한 접근법이 고해상도 공초점 이미지를 사용하여 액틴 세포 골격과 피브로넥틴 번들의 섬유 네트워크의 정렬을 분석하는데 사용되었다. 먼저 액틴 섬유 또는 피브로넥틴 번들 주변을 정의하기 위해 이미지를 역치(thresholded) 하였다. 그런 다음 ImageJ 입자 분석기를 사용하여 각 입자의 장축(long axis)과 그 방위각을 정의했다. 이 각도는 액틴 섬유 및 피브로넥틴 번들의 방위각으로 정의된다. 액틴 또는 피브로넥틴의 방위각을 5도 빈(bin)으로 분류하여 0도에서 180도 사이의 각도에 대한 히스토그램을 얻었다. PGA 섬유의 신장 축에 대하여 ±10도의 액틴 섬유가 정렬된 액틴 섬유로 가정되었다.
통계
데이터는 post hoc Bonferoni 테스트(PASW statistics 18 software)와 one way ANOVA를 적용하여 비교되었다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. p 값이 0.05 이하인 경우 통계적으로 유의하다고 간주되었다.

Claims (17)

  1. a. 제1고분자의 필라멘트의 직물 조각을 제공하는 단계, 여기서 상기 제1고분자는 생분해성 또는 생체 적합성이며, 상기 필라멘트의 직물 조각은 종축의 확장(extension)을 특징으로 함;
    b. 코팅 단계로 제2고분자의 코팅을 상기 필라멘트의 직물 조각을 종축 확장하여 만들어진 필라멘트 배열(arrangement)에 도포(applying)하는 단계, 여기서 상기 제2고분자는 상기 제1고분자의 녹는점(melting point)보다 낮은 유리 전이 온도를 특징으로 함;
    c. 상기 종축의 확장(extension)을 따라 상기 필라멘트의 직물 조각을 신장(stretching)시키는 단계, 따라서 정렬된 미세섬유 스캐폴드를 얻는 단계를 포함하는 고분자 스캐폴드를 제조하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 단계 c에서, 상기 필라멘트의 직물 조각은 종축의 확장을 따라 175% 내지 300% 신장되는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항 중 어느 한 항에 있어서,
    - 단계 c에서 신장되기 전에, 상기 필라멘트의 직물 조각은 상기 필라멘트의 제1정렬 지수 iA1를 특징으로 하고, 여기서
    - 단계 c에서 신장시킨 후에, 상기 정렬된 미세섬유 스캐폴드는 제2정렬 지수 iA2를 특징으로 하고, 여기서
    - 상기 제1정렬 지수에 대한 제2정렬 지수의 비 iA2/iA1는 2와 동일하거나 그 이상(≥)인 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    - iA1의 값은 ≤ 30% 또는
    - iA2의 값은 ≥ 70% 또는
    - 비율 iA2/iA1의 값은 ≥ 2,3인 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    제1 및 제2고분자는 각각 유리 전이 온도 Tg 및 녹는 온도 Tm을 특징으로 하고, 단계 c는
    - 제1 및 제2고분자 모두의 Tg보다 높고,
    - 제1 및 제2고분자 모두의 Tm보다 낮은 온도에서 수행되고,
    여기서, 단계 c는 50℃ 내지 150℃의 온도에서 수행되는 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    a. 상기 제2고분자는 생분해성 고분자 또는 생체 적합성 고분자이고, 또는
    b. 상기 제2고분자의 상기 필라멘트에의 도포량은 상기 제1고분자의 상기 필라멘트의 질량에 대하여 10 내지 40 질량%인 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    a. 상기 제1고분자는 폴리에스테르(polyester), 폴리우레탄(polyurethane) 및 폴리아닐린(polyaniline)을 포함하는 군으로부터 선택되며,
    b. 제2고분자는 폴리에스테르(polyester), 폴리우레탄(polyurethane) 및 폴리닐린(polyaniline)을 포함하는 군으로부터 선택되지만 제1고분자와는 상이한 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    a. 제1고분자는
    - 폴리글리콜리드(polyglycolide), 폴리(락트산)(poly(lactic acid)), 폴리락틱글리콜릭산(PLGA), 폴리(트리메틸렌 카보네이트)(poly(trimethylene carbonate)), 폴리하이드록시부티레이트(polyhydroxybutyrate), 폴리(4-하이드록시부티레이트), 폴리(3-하이드록시부티레이트), 폴리(글리콜라이드-코-카프로락톤)(poly(glycolide-co-caprolactone)), 폴리(글리콜라이드-코-트리메틸렌 카보네이트)(poly(glycolide-co-trimethylene carbonate)), 또는 글리콜산(glycolic acid) 또는 락트산(lactic acid) 단량체를 포함하는 공중합체를 포함하는 제1군, 또는
    - 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리아닐린(polyaniline), 폴리에틸렌 테레프탈레이트(polyethylene terephthalate), 폴리(2-메톡시에틸 아크릴레이트)(poly(2-methoxyethyl acrylate)), 폴리(2-메타크릴로일옥시에틸 포스포릴콜린)(poly(2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine)), 폴리(테트라하이드로푸르푸릴 아크릴레이트)(poly(tetrahydrofurfuryl acrylate)), 폴리스티렌 또는 상기 고분자를 2개 또는 3개 포함하는 공중합체를 포함하는 제2군으로부터 선택되며,
    또는
    b. 제2고분자는 폴리하이드록시부티레이트인 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 제2고분자는
    a. 제1고분자가 제8항 a에서 언급된 제1군으로부터 선택되는 경우, 제8항 a에서 언급된 제1군, 또는
    b. 제1고분자가 제8항 a에서 언급된 제2군으로부터 선택되는 경우, 제8항 a에서 언급된 제2군으로부터 선택되는 방법.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 코팅 단계에서, 상기 제2고분자는 용매에 용해되어 제1고분자의 상기 필라멘트에 도포되고, 상기 제1고분자 및 제2고분자는 PLA, PLGA, PGA, P4HB 및 P3HB으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 용매는 THF, 다이옥산(Dioxane), 클로로포름(Chloroform) 및 아세톤(Acetone)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 필라멘트는 100nm 내지 250μm 의 직경(diameter)을 특징으로 하는 방법.
  12. 제1항에 있어서,
    a. 제1항의 단계 a에서 제공된 필라멘트의 직물 조각은 상기 제1고분자의 벌크 밀도(bulk density)에 대하여 5% 내지 15%의 스캐폴드 비밀도(specific density)를 특징으로 하며; 또는
    b. 제1항의 단계 c에서 수득된 필라멘트의 직물 조각은 상기 제1고분자의 벌크 밀도에 대하여 10% 내지 20%의 스캐폴드 비밀도를 특징으로 하며; 또는
    c. 제1항의 단계 c에서 수득된 필라멘트의 직물 조각은 상기 제1고분자의 벌크 밀도에 대하여 측정된 스캐폴드 비밀도가 제1항의 단계 a에서 제공된 직물의 조각의 스캐폴드 비밀도 보다 ≥ 30%인 방법.
  13. a. 청구항 제1항의 방법에 따라, 정렬된 미세섬유 스캐폴드를 제조하는 단계;
    b. 포유동물 세포를 포함하는 세포 배양 배지에 상기 정렬된 스캐폴드를 현탁시키는 단계를 포함하는 인공 조직을 제공하기 위한 생체 외(ex-vivo) 방법.
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