CN110331124B - 一种导电聚吡咯/细胞外基质复合薄膜及其制备方法 - Google Patents

一种导电聚吡咯/细胞外基质复合薄膜及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种导电聚吡咯/细胞外基质复合薄膜及其制备方法，该方法如下：通过细胞培养法、反复冻融法和冷冻干燥获得细胞外基质薄膜，然后通过化学法聚合聚吡咯的方式得到一种导电聚吡咯/细胞外基质复合薄膜。本发明方法最终制得的聚吡咯/细胞外基质复合薄膜具有导电性和生物相容性，可应用于生物医用领域。此外本发明的制备方法工艺简单，易于实现，有利于进行推广应用。

Description

一种导电聚吡咯/细胞外基质复合薄膜及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物医用领域，具体涉及一种导电聚吡咯/细胞外基质复合薄膜及其制备方法。
背景技术
在生物医用领域中，聚吡咯由于其拥有良好的导电性、高比表面积、容易制备等特点，常常被用于作为植入材料或涂层，用于构建电信号的生物微环境，从而达到电控细胞活动或药物释放等作用。比如有研究表明聚吡咯涂层电刺激可以促进前成骨细胞的成骨分化，主要表现为电刺激组的碱性磷酸酶、聚氰基丙烯酸正丁酯、牛血清白蛋白等成骨分化指标的上调[Yuan He,Shihui Wang,Jing Mu,et al.Synthesis of Polypyrrole Nanowireswith Positive Effect on MC3T3-E1Cell Functions through ElectricalStimulation.Materials Science and Engineering C,2017,71:43-50]。然而，较高浓度的聚吡咯会产生细胞毒性，引发细胞凋亡或免疫反应。因此，如何提高聚吡咯的生物相容性是一个被广泛关注的问题。细胞外基质是由蛋白质和多糖等组成的一个具有网络结构的生物框架，对细胞生命活动有调控作用，拥有良好的生物相容性，可以起到减缓免疫反应的作用。有研究表明，细胞培养法获得的细胞外基质拥有很好的生物相容性和网络结构，可以用于组织工程中[Hongxu Lu,Takashi Hoshiba,Naoki Kawazoe,et al.Cultured Cell-derived Extracellular Matrix Scaffolds for Tissue Engineering.Biomaterials,2011,32:9658-9666]。所以，将细胞外基质和聚吡咯复合形成一个兼具良好电学性能和良好生物相容性的薄膜，对生物医学领域有很强的实际应用意义和研究价值。
冷冻干燥技术可以在低温低压下完成对物质的干燥，且能较完整的保存物质的原有结构，很适合作为细胞外基质等热敏材料的干燥手段。
化学临场氧化制备聚吡咯由于不需要电极材料作为基板，相比电化学沉积更适合与细胞外基质等有机物进行复合。
发明内容
本发明的目的在于提供一种导电聚吡咯/细胞外基质复合薄膜及其制备方法。所述的导电聚吡咯/细胞外基质复合薄膜可通过控制聚吡咯聚合的浓度、聚合时间、细胞外基质培养的时间来控制最终复合薄膜的聚吡咯和细胞外基质质量比，继而控制电学性能、生物相容性和机械性能。
一种导电聚吡咯/细胞外基质复合薄膜由细胞外基质骨架和聚吡咯组成，其中细胞外基质提供良好的生物相容性，聚吡咯提供导电性。
其制备方法，包括如下步骤：
(1).将事先培养在培养瓶中的细胞进行脱壁处理，离心后，培养获得细胞片层；优选的，用高糖DMEM培养基混悬，并用计数板计数，以5×104个/cm2～1×106个/cm2的细胞密度将细胞接种于多孔板中，并放入37℃恒温、5％CO2的细胞培养箱内培养，2～3天换液一次，培养周期为5～10天，最终获得细胞片层；优选的，所述的细胞为成纤维细胞、成骨细胞或上皮细胞。
(2).用反复冻融法处理细胞片层，并冷冻干燥，获得细胞外基质薄膜；
(3).配制吡咯单体溶液，搅拌均匀；优选的，所述吡咯单体溶液的浓度为0.01～0.5mol·L-1；
(4).以FeCl3·6H2O：吡咯单体摩尔比为20:9～20:19配制FeCl3溶液，加入与吡咯单体摩尔比为1:3～1:10的盐酸溶液，搅拌均匀；
(5).将上述两种溶液混合，搅拌1～10min，形成聚吡咯聚合溶液；
(6).加入制备好的细胞外基质薄膜进行聚合反应，浸泡10min～8h后取出，去离子水清洗并干燥，即可获得导电聚吡咯/细胞外基质复合薄膜。
本发明的导电聚吡咯/细胞外基质复合薄膜具有如下特点：
1)冷冻干燥后获得的细胞外基质拥有良好的三维网络结构，比表面积大，方便聚吡咯的复合。
2)聚吡咯与细胞外基质聚合后构成交织的网络结构。
3)所获取的聚吡咯/细胞外基质复合薄膜不仅保存了细胞外基质的重要组成成分和三维结构，而且还具有良好的导电性能，其电导率为0.001S/cm～1S/cm。
本发明的一种导电聚吡咯/细胞外基质复合薄膜，将拥有良好导电性的聚吡咯用化学法的方式复合到了富含大量生物成分和三维网络结构的细胞外基质上，使薄膜同时具有了导电性和生物相容性。本薄膜可以作为构建组织或细胞电信号微环境的一种材料，可应用于生物医疗领域。此外本发明的制备方法，工艺简单，易于实现，有利于进行推广应用。
附图说明
图1是聚吡咯/细胞外基质复合薄膜的形貌图；
图2是聚吡咯/细胞外基质复合薄膜的扫描电镜照片；
图3是聚吡咯/细胞外基质复合薄膜作为涂层改性ITO电极基板的电化学阻抗测试。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
(1).将事先培养在培养瓶中的成纤维细胞进行脱壁处理，离心后，用高糖DMEM培养基混悬，并用计数板计数，以5×104个/cm2的细胞密度将细胞接种于多孔板中，并放入37℃恒温、5％CO2的细胞培养箱内培养，2天换液一次，培养周期为7天，最终形成完整的细胞片层；
(2).用反复冻融法处理细胞片层，并冷冻干燥，获得细胞外基质薄膜；(3).配制0.02mol·L-1的吡咯单体溶液，搅拌均匀；
(4).以FeCl3·6H2O：吡咯单体摩尔比为20:9配制FeCl3溶液，加入与吡咯单体摩尔比为1:3的盐酸溶液，搅拌均匀；
(5).将上述两种溶液混合，搅拌1min，形成聚吡咯聚合溶液；
(6).加入制备好的细胞外基质薄膜进行聚合反应，浸泡30min后取出，去离子水清洗并干燥，即可获得导电聚吡咯/细胞外基质复合薄膜，获得的复合薄膜聚吡咯与细胞外基质质量比为1:1，电导率为0.005S/cm。
本例制得的聚吡咯/细胞外基质复合薄膜的实物图如图1所示。图2的扫描电镜照片，证明了聚吡咯与细胞外基质成功复合。图3显示以复合薄膜作为涂层的ITO基板的电化学阻抗显著下降。
实施例2
(1).将事先培养在培养瓶中的成骨细胞进行脱壁处理，离心后，用高糖DMEM培养基混悬，并用计数板计数，以1×105个/cm2的细胞密度将细胞接种于多孔板中，并放入37℃恒温、5％CO2的细胞培养箱内培养，2天换液一次，培养周期为5天，最终形成完整的细胞片层；
(2).用反复冻融法处理细胞片层，并冷冻干燥，获得细胞外基质薄膜；
(3).配制0.01mol·L-1的吡咯单体溶液，搅拌均匀；
(4).以FeCl3·6H2O：吡咯单体摩尔比为20:13配制FeCl3溶液，加入与吡咯单体摩尔比为1:5的盐酸溶液，搅拌均匀；
(5).将上述两种溶液混合，搅拌10min，形成聚吡咯聚合溶液；
(6).加入制备好的细胞外基质薄膜进行聚合反应，浸泡10min后取出，去离子水清洗并干燥，即可获得导电聚吡咯/细胞外基质复合薄膜，获得的复合薄膜聚吡咯与细胞外基质质量比为0.5:1，电导率为0.001S/cm。
实施例3
(1).将事先培养在培养瓶中的成纤维细胞进行脱壁处理，离心后，用高糖DMEM培养基混悬，并用计数板计数，以1×106个/cm2的细胞密度将细胞接种于多孔板中，并放入37℃恒温、5％CO2的细胞培养箱内培养，3天换液一次，培养周期为10天，最终形成完整的细胞片层；
(2).用反复冻融法处理细胞片层，并冷冻干燥，获得细胞外基质薄膜；
(3).配制0.2mol·L-1的吡咯单体溶液，搅拌均匀；
(4).以FeCl3·6H2O：吡咯单体摩尔比为20:19配制FeCl3溶液，加入与吡咯单体摩尔比为1:10的盐酸溶液，搅拌均匀；
(5).将上述两种溶液混合，搅拌5min，形成聚吡咯聚合溶液；
(6).加入制备好的细胞外基质薄膜进行聚合反应，浸泡3h后取出，去离子水清洗并干燥，即可获得导电聚吡咯/细胞外基质复合薄膜，获得的复合薄膜聚吡咯与细胞外基质质量比为5:1，电导率为0.1S/cm。
实施例4
(1).将事先培养在培养瓶中的成纤维细胞进行脱壁处理，离心后，用高糖DMEM培养基混悬，并用计数板计数，以5×105个/cm2的细胞密度将细胞接种于多孔板中，并放入37℃恒温、5％CO2的细胞培养箱内培养，3天换液一次，培养周期为6天，最终形成完整的细胞片层；
(2).用反复冻融法处理细胞片层，并冷冻干燥，获得细胞外基质薄膜；
(3).配制0.5mol·L-1的吡咯单体溶液，搅拌均匀；
(4).以FeCl3·6H2O：吡咯单体摩尔比为20:11配制FeCl3溶液，加入与吡咯单体摩尔比为1:7的盐酸溶液，搅拌均匀；
(5).将上述两种溶液混合，搅拌3min，形成聚吡咯聚合溶液；
(6).加入制备好的细胞外基质薄膜进行聚合反应，浸泡1h后取出，去离子水清洗并干燥，即可获得导电聚吡咯/细胞外基质复合薄膜，获得的复合薄膜聚吡咯与细胞外基质质量比为4:1，电导率为0.05S/cm。
实施例5
(1).将事先培养在培养瓶中的上皮细胞进行脱壁处理，离心后，用高糖DMEM培养基混悬，并用计数板计数，以3×105个/cm2的细胞密度将细胞接种于多孔板中，并放入37℃恒温、5％CO2的细胞培养箱内培养，2天换液一次，培养周期为8天，最终形成完整的细胞片层；
(2).用反复冻融法处理细胞片层，并冷冻干燥，获得细胞外基质薄膜；
(3).配制0.3mol·L-1的吡咯单体溶液，搅拌均匀；
(4).以FeCl3·6H2O：吡咯单体摩尔比为20:17配制FeCl3溶液，加入与吡咯单体摩尔比为1:6的盐酸溶液，搅拌均匀；
(5).将上述两种溶液混合，搅拌7min，形成聚吡咯聚合溶液；
(6).加入制备好的细胞外基质薄膜进行聚合反应，浸泡8h后取出，去离子水清洗并干燥，即可获得导电聚吡咯/细胞外基质复合薄膜，获得的复合薄膜聚吡咯与细胞外基质质量比为15:1，电导率为1S/cm。
实施例6
(1).将事先培养在培养瓶中的成纤维细胞进行脱壁处理，离心后，用高糖DMEM培养基混悬，并用计数板计数，以9×105个/cm2的细胞密度将细胞接种于多孔板中，并放入37℃恒温、5％CO2的细胞培养箱内培养，3天换液一次，培养周期为9天，最终形成完整的细胞片层；
(2).用反复冻融法处理细胞片层，并冷冻干燥，获得细胞外基质薄膜；
(3).配制0.4mol·L-1的吡咯单体溶液，搅拌均匀；
(4).以FeCl3·6H2O：吡咯单体摩尔比为20:16配制FeCl3溶液，加入与吡咯单体摩尔比为1:4的盐酸溶液，搅拌均匀；
(5).将上述两种溶液混合，搅拌6min，形成聚吡咯聚合溶液；
(6).加入制备好的细胞外基质薄膜进行聚合反应，浸泡5h后取出，去离子水清洗并干燥，即可获得导电聚吡咯/细胞外基质复合薄膜，获得的复合薄膜聚吡咯与细胞外基质质量比为9:1，电导率为0.7S/cm。
实施例7
(1).将事先培养在培养瓶中的成纤维细胞进行脱壁处理，离心后，用高糖DMEM培养基混悬，并用计数板计数，以1×105个/cm2的细胞密度将细胞接种于多孔板中，并放入37℃恒温、5％CO2的细胞培养箱内培养，3天换液一次，培养周期为7天，最终形成完整的细胞片层；
(2).用反复冻融法处理细胞片层，并冷冻干燥，获得细胞外基质薄膜；
(3).配制0.1mol·L-1的吡咯单体溶液，搅拌均匀；
(4).以FeCl3·6H2O：吡咯单体摩尔比为20:10配制FeCl3溶液，加入与吡咯单体摩尔比为1:8的盐酸溶液，搅拌均匀；
(5).将上述两种溶液混合，搅拌5min，形成聚吡咯聚合溶液；
(6).加入制备好的细胞外基质薄膜进行聚合反应，浸泡2h后取出，去离子水清洗并干燥，即可获得导电聚吡咯/细胞外基质复合薄膜，获得的复合薄膜聚吡咯与细胞外基质质量比为2:1，电导率为0.008S/cm。
实施例8
(1).将事先培养在培养瓶中的成纤维细胞进行脱壁处理，离心后，用高糖DMEM培养基混悬，并用计数板计数，以7×104个/cm2的细胞密度将细胞接种于多孔板中，并放入37℃恒温、5％CO2的细胞培养箱内培养，2天换液一次，培养周期为9天，最终形成完整的细胞片层；
(2).用反复冻融法处理细胞片层，并冷冻干燥，获得细胞外基质薄膜；
(3).配制0.05mol·L-1的吡咯单体溶液，搅拌均匀；
(4).以FeCl3·6H2O：吡咯单体摩尔比为20:9配制FeCl3溶液，加入与吡咯单体摩尔比为1:9的盐酸溶液，搅拌均匀；
(5).将上述两种溶液混合，搅拌2min，形成聚吡咯聚合溶液；
(6).加入制备好的细胞外基质薄膜进行聚合反应，浸泡4h后取出，去离子水清洗并干燥，即可获得导电聚吡咯/细胞外基质复合薄膜，获得的复合薄膜聚吡咯与细胞外基质质量比为3:1，电导率为0.01S/cm。
实施例9
(1).将事先培养在培养瓶中的成骨细胞进行脱壁处理，离心后，用高糖DMEM培养基混悬，并用计数板计数，以9×104个/cm2的细胞密度将细胞接种于多孔板中，并放入37℃恒温、5％CO2的细胞培养箱内培养，3天换液一次，培养周期为5天，最终形成完整的细胞片层；
(2).用反复冻融法处理细胞片层，并冷冻干燥，获得细胞外基质薄膜；
(3).配制0.08mol·L-1的吡咯单体溶液，搅拌均匀；
(4).以FeCl3·6H2O：吡咯单体摩尔比为20:13配制FeCl3溶液，加入与吡咯单体摩尔比为1:7的盐酸溶液，搅拌均匀；
(5).将上述两种溶液混合，搅拌7min，形成聚吡咯聚合溶液；
(6).加入制备好的细胞外基质薄膜进行聚合反应，浸泡6h后取出，去离子水清洗并干燥，即可获得导电聚吡咯/细胞外基质复合薄膜，获得的复合薄膜聚吡咯与细胞外基质质量比为7:1，电导率为0.05S/cm。
实施例10
(1).将事先培养在培养瓶中的上皮细胞进行脱壁处理，离心后，用高糖DMEM培养基混悬，并用计数板计数，以5×104个/cm2的细胞密度将细胞接种于多孔板中，并放入37℃恒温、5％CO2的细胞培养箱内培养，2天换液一次，培养周期为7天，最终形成完整的细胞片层；
(2).用反复冻融法处理细胞片层，并冷冻干燥，获得细胞外基质薄膜；
(3).配制0.3mol·L-1的吡咯单体溶液，搅拌均匀；
(4).以FeCl3·6H2O：吡咯单体摩尔比为20:10配制FeCl3溶液，加入与吡咯单体摩尔比为1:8的盐酸溶液，搅拌均匀；
(5).将上述两种溶液混合，搅拌3min，形成聚吡咯聚合溶液；
(6).加入制备好的细胞外基质薄膜进行聚合反应，浸泡7h后取出，去离子水清洗并干燥，即可获得导电聚吡咯/细胞外基质复合薄膜，获得的复合薄膜聚吡咯与细胞外基质质量比为10:1，电导率为0.7S/cm。
实施例11
(1).将事先培养在培养瓶中的成纤维细胞进行脱壁处理，离心后，用高糖DMEM培养基混悬，并用计数板计数，以5×105个/cm2的细胞密度将细胞接种于多孔板中，并放入37℃恒温、5％CO2的细胞培养箱内培养，3天换液一次，培养周期为6天，最终形成完整的细胞片层；
(2).用反复冻融法处理细胞片层，并冷冻干燥，获得细胞外基质薄膜；
(3).配制0.4mol·L-1的吡咯单体溶液，搅拌均匀；
(4).以FeCl3·6H2O：吡咯单体摩尔比为20:16配制FeCl3溶液，加入与吡咯单体摩尔比为1:5的盐酸溶液，搅拌均匀；
(5).将上述两种溶液混合，搅拌5min，形成聚吡咯聚合溶液；
(6).加入制备好的细胞外基质薄膜进行聚合反应，浸泡15min后取出，去离子水清洗并干燥，即可获得导电聚吡咯/细胞外基质复合薄膜，获得的复合薄膜聚吡咯与细胞外基质质量比为8:1，电导率为0.5S/cm。
实施例12
(1).将事先培养在培养瓶中的成骨细胞进行脱壁处理，离心后，用高糖DMEM培养基混悬，并用计数板计数，以1×106个/cm2的细胞密度将细胞接种于多孔板中，并放入37℃恒温、5％CO2的细胞培养箱内培养，3天换液一次，培养周期为9天，最终形成完整的细胞片层；
(2).用反复冻融法处理细胞片层，并冷冻干燥，获得细胞外基质薄膜；
(3).配制0.09mol·L-1的吡咯单体溶液，搅拌均匀；
(4).以FeCl3·6H2O：吡咯单体摩尔比为20:15配制FeCl3溶液，加入与吡咯单体摩尔比为1:3的盐酸溶液，搅拌均匀；
(5).将上述两种溶液混合，搅拌8min，形成聚吡咯聚合溶液；
(6).加入制备好的细胞外基质薄膜进行聚合反应，浸泡20min后取出，去离子水清洗并干燥，即可获得导电聚吡咯/细胞外基质复合薄膜，获得的复合薄膜聚吡咯与细胞外基质质量比为2.5:1，电导率为0.004S/cm。

Claims (4)

1.一种导电聚吡咯/细胞外基质复合薄膜，其特征在于，薄膜主要成分为聚吡咯和细胞外基质，两者构成交织的网络结构，聚吡咯与细胞外基质质量比为0.5:1~15:1；其制备方法包括如下步骤：
(1).将事先培养在培养瓶中的细胞进行脱壁处理，离心后，培养最终获得细胞片层；
(2).用反复冻融法处理细胞片层，并冷冻干燥，获得细胞外基质薄膜；
(3).配制吡咯单体溶液，搅拌均匀；
(4).以FeCl3·6H2O：吡咯单体摩尔比为20:9~20:19配制FeCl3溶液，加入与吡咯单体摩尔比为1:3~1:10的盐酸溶液，搅拌均匀；
(5).将(3)中的吡咯单体溶液和(4)得到的溶液混合，搅拌1~10min，形成聚吡咯聚合溶液；
(6).加入制备好的细胞外基质薄膜进行聚合反应，浸泡10min~8h后取出，去离子水清洗并干燥，即可获得导电聚吡咯/细胞外基质复合薄膜；
所获得的复合薄膜的电导率为0.001S/cm~1S/cm。
2.根据权利要求1所述的一种导电聚吡咯/细胞外基质复合薄膜的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述的细胞为成纤维细胞、成骨细胞或上皮细胞。
3.根据权利要求1所述的一种导电聚吡咯/细胞外基质复合薄膜的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述的培养是指，将细胞脱壁处理离心后，用高糖DMEM培养基混悬，并用计数板计数，以5×104个/cm2～1×106个/cm2的细胞密度将细胞接种于多孔板中，并放入37℃恒温、5%CO2的细胞培养箱内培养，2～3天换液一次，培养周期为5～10天，最终获得细胞片层。
4.根据权利要求1所述的一种导电聚吡咯/细胞外基质复合薄膜的制备方法，其特征在于，步骤（3）中所述的吡咯单体溶液的浓度为0.01~0.5mol·L-1。
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