CN103131625A

CN103131625A - 用于构建三维微环境的方法及装置

Info

Publication number: CN103131625A
Application number: CN2011103752849A
Authority: CN
Inventors: 杜亚楠; 赵姗
Original assignee: Tsinghua University
Current assignee: Tsinghua University
Priority date: 2011-11-23
Filing date: 2011-11-23
Publication date: 2013-06-05
Anticipated expiration: 2031-11-23
Also published as: CN103131625B; CN104053459B; CN104053459A; WO2013075392A1

Abstract

本发明公开了一种用于构建三维微环境的装置及方法。本发明所提供的方法包括如下步骤：1)将样品液置于构建三维微环境的装置的基底上，形成液体薄层；2)将所述基底覆盖在所述装置的微海绵支架或微海绵支架阵列上，待所述样品液分散进入到所述微海绵支架或所述微海绵支架阵列后，实现所述样品液的三维微尺度装载，完成所述三维微环境的构建。本发明为生物学、药学、医学等领域研究精确可控和高通量的三维微环境提供一个简易、应用广泛的平台；本发明所提供的方法既可单独使用，也可与其他传统装载方式结合使用，以较低的液体用量就可达到高效高通量同步装载，很大程度上降低了对药物、材料和细胞样本量的要求，且对活细胞的损伤降低了。

Description

用于构建三维微环境的方法及装置

技术领域

本发明涉及一种用于构建三维微环境的方法及装置，特别涉及一种基于三维图案化“微海绵支架”的自动装载效应，高效实现药物、材料和细胞的三维微尺度排列的方法及装置，属于三维微尺度芯片技术领域。

背景技术

分子细胞生物学、诊断与临床医学和新药开发等领域的发展需要在体外研究细胞与药物、细胞与细胞外基质(ECM)以及细胞与细胞的相互作用。传统的研究手段基于商业化的培养皿或多孔板的二维微环境。这种简化的两维微环境不能很好的模拟和重现体内的三维环境。因此在体外构建三维微环境实现药物、材料和细胞在三维水平上的相互作用研究对于加速生物医学和药物开发的进一步发展具有重要意义。诞生于半导体工业的微米尺度加工(微加工)技术被越来越广泛的应用于生物医学研究中以实现对于分子、材料和细胞在空间上的精确控制和高通量排列，其在建造图案化高通量的三维微环境领域具有强大功能。例如：空间上精确控制的三维微环境可以被用来重建体外的仿生模型(如模拟血管的多层生理结构，以及肝小叶精细的生理结构)；高通量排列的三维微环境可以被用来构建三维的药物、材料和细胞阵列芯片。常用的实现三维图案化排列的微加工方法包括：影印石版术(photolithography)、微成型技术(micro-molding)、模版图案技术(stencil patterning)、压印光刻技术(Imprintlithography)、流体光刻技术(flow lithography)等等。三维微环境的设计需要涉及多方面因素，例如生物材料的来源(天然的或合成的)、材料的物化性质(化学性质、硬度、降解性、结构性)、材料的生物活性(粘附位点存在与否、诱导信号存在与否)以及药物、材料和细胞封装的方式(在制作支架过程中封装、封装在已成型的支架上)。

如今，微加工技术在建造三维微环境的应用大都只局限于具有工程制造背景的实验室中实现，其在传统生物学、药学和医学实验室的广泛应用尚存在技术上的瓶颈，特别在涉及活细胞和具有生物活性的材料和药物的三维微环境的构建。例如，实验室常用的细胞外基质材料基质胶(matrigel)、明胶(collagen)是商品化的凝胶蛋白，具有良好的生物活性、生物相容性、可降解性，是公认的培养细胞的优良材料，尤其基质胶是培养胚胎干细胞(embryonic stem cell)的标准基底材料。其成胶(gelling)方式一般是温度转变(4℃～37℃)，用常规的方法很难实现三维的图案化排列。借助微加工技术来制备模具，依靠模具的微尺度空间限制可以实现凝胶蛋白和细胞的三维微尺度排列。但一定程度上又增加了研究成本或操作技巧难度。

与此同时，在实现基于细胞的三维微尺度研究过程中，需要特别考虑加工过程对于细胞的损伤问题。目前，细胞三维培养方式主要有两种：水凝胶培养方式和支架培养方式。水凝胶培养方式是将细胞和材料的悬浮液在一定条件下交联成水凝胶，细胞在水凝胶的交联网络体系内实现三维培养。常用的成胶(gelling)方式有：温度转变(collagen、matrigel)、pH转变(chitosan)、添加离子(alginate)、光暴露(hyaluronicacid or dextran-containing vinyl groups)等等。细胞在成胶过程中需要经历铰链过程和环境变化过程，不可避免受到伤害。支架培养方式是指将细胞种植到已经成型的三维支架材料中实现三维培养。目前细胞种植的方法分为两大类：静态种植和动态种植。静态种植一般将细胞悬浮液直接滴加在支架上，此方法简便、使用广泛，但也最低效。动态种植借助外部动力(如旋转种植、表面超声波种植、离心种植、磁场种植等等)使细胞较高效、均匀地渗入支架内部，但具有外部机械力损伤细胞的潜在危险。而且，不管采用哪种方式，都难以避免损失大量细胞。这对于一些来源短缺(如肝细胞)或培养成本高的细胞(如干细胞)非常不适用。

现代生物学、药学、医学的系统研究需要涉及大量信息的获取和分析，高通量(high-throughput)技术因此得到了广泛的应用，大大提高了信息获得的效率并且降低了所需试剂(如抗体、药物)、材料(如基质胶、胶原)和细胞(如干细胞、肝细胞)等的成本。目前常用的高通量平台技术基于微孔板(如96、384孔板)或芯片(如基因、蛋白、材料和细胞芯片)形式，用自动化操作系统(机械手、排枪、芯片点样系统、个人点样仪等)执行试验过程，实现微量样本研究。但是，昂贵的自动化操作系统并没有有效降低研究的总成本，需要开发更高效、更简易的装载(loading)方法来实现药物、材料和细胞的高通量三维微尺度排列芯片。

如上所述，为满足生物学、药学、医学等不同研究领域对于精确可控和高通量的三维微环境日益增强的需求，迫切需要一种简易、可广泛应用的平台技术以快速、无损并且高通量地实现药物、材料和细胞以及其混合物的三维图案化微尺度排列。理想的微加工三维微环境平台应对于熟悉传统两维药物、细胞和材料研究的人员易于操作，无需特别的专业技术和手段(如微加工技术和特殊合成材料)以及昂贵的设备(如自动化、微加工设备)，以实现在传统生物学、药学和医学领域的无障碍广泛应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种构建三维微环境的方法及装置。

本发明所提供的构建三维微环境的方法包括如下步骤：

a1)将样品液置于所述用于构建三维微环境的装置的基底A上，形成液体薄层；

a2)将步骤a1)中形成所述液体薄层的所述基底A覆盖在所述用于构建三维微环境的装置的微海绵支架，或微海绵支架阵列上，待所述样品液分散进入到所述微海绵支架或所述微海绵支架阵列后，实现所述样品液的三维微尺度装载，完成所述三维微环境的构建。

所述液体薄层的厚度一般在10微米-200微米，既可形成细胞薄层，又不会在重力作用下形成聚集，导致分布不均。

所述样品液包括下述a)-d)中任一所述物质：

a)各种分子物质(如小分子化合物、药物、核酸、蛋白等)中的任一种或任几种的混合物；

b)各种天然与合成材料(如细胞外基质，高分子材料、微珠等)中的任一种或任几种的混合物；

c)各种细胞和微生物(如真核/原核细胞、病毒、微生物等)中的任一种或任几种的混合物；

d)a)-c)中任几种的混合物。

本发明所提供的用于构建三维微环境的装置包括下述a1)和a2)的两个器件：a1)微海绵支架或由两个以上所述微海绵支架组成的微海绵支架阵列；a2)用于装载样品液的基底A。

所述微海绵支架用生物材料制成，具有若干小孔；所述小孔的孔径为1μm-999μm，孔间距为1μm-999μm，所述小孔在所述微海绵支架上所形成的孔隙率为80％-99％。

所述生物材料为可交联的人工合成生物材料和/或可交联的天然生物材料；所述人工合成的生物材料为下述至少一种：聚乙二醇、聚乙二醇衍生物、聚丙烯、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚乳酸、聚羟基酸、聚乳酸醇酸共聚物、聚二甲基硅氧烷、聚酸酐、聚酸酯、聚酰胺、聚氨基酸、聚缩醛、聚氰基丙烯酸酯、聚氨基甲酸酯、聚吡咯、聚酯、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯、聚碳酸酯和聚氧化乙烯；所述天然生物材料为下述至少一种：明胶、明胶衍生物、藻酸盐、藻酸盐衍生物、琼脂、基质胶、胶原、蛋白多糖、糖蛋白、透明质酸、层连接蛋白和纤维连接蛋白。

制备所述小孔的制孔技术为下述至少一种：致孔剂(porogen)滤除法、相分离法、乳液冷冻干燥法、溶剂蒸发法、气体泡沫法、纤维粘合法等。

制备所述微海绵支架的图案化技术为下述至少一种：影印石版术(photolithography)、微接触打印技术(microcontact printing)、微流体图案技术(microfluidic patterning)、层流图案技术(laminar flow patterning)、模版图案技术(stencilpatterning)、压印光刻技术(Imprint lithography)、流体光刻技术(flow lithography)等。

所述装载样品液的基底A为亲水性基底或疏水性基底；所述基底的亲水性或疏水性使样品液在所述基底的表面形成液体薄层；所述亲水性基底或疏水性基底由各种改性方法制备，包括化学修饰法、物理改性法以及将其结合使用。所述液体薄层的厚度一般在10微米-200微米，既可形成细胞薄层，又不会在重力作用下形成聚集，导致分布不均。

实际操作中，根据需要，所述装置还包括镶嵌在所述基底A周边的边框，以及支撑所述微海绵支架或所述微海绵支架阵列的基底B。

所述边框用生物材料制成，所述生物材料为可交联的人工合成的生物材料和/或可交联的天然生物材料；所述人工合成的生物材料为下述至少一种：聚乙二醇、聚乙二醇衍生物、聚丙烯、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚乳酸、聚羟基酸、聚乳酸醇酸共聚物、聚二甲基硅氧烷、聚酸酐、聚酸酯、聚酰胺、聚氨基酸、聚缩醛、聚氰基丙烯酸酯、聚氨基甲酸酯、聚吡咯、聚酯、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯、聚碳酸酯和聚氧化乙烯；所述天然生物材料为下述至少一种：明胶、明胶衍生物、藻酸盐、藻酸盐衍生物、琼脂、基质胶、胶原、蛋白多糖、糖蛋白、透明质酸、层连接蛋白和纤维连接蛋白。

在本发明的实施例中，所述基底B具体为固定所述微海绵支架或所述微海绵支架阵列的载玻片。

制备所述边框的图案化技术为下述至少一种：影印石版术(photolithography)、微接触打印技术(microcontact printing)、微流体图案技术(microfluidic patterning)、层流图案技术(laminar flow patterning)、模版图案技术(stencil patterning)、压印光刻技术(Imprint lithography)、流体光刻技术(flow lithography)等。

在本发明的一个实施例中，所述微海绵支架具体按照包括如下步骤的方法制备：

b1)将聚合物单体聚乙二醇二丙烯酸酯和2-羟基-4-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮溶解在饱和NaCl溶液中，得到可光交联的预聚物溶液A，向所述可光交联的预聚物溶液A中加入直径为100-125μm的NaCl颗粒，混匀，得到液体C；

b2)利用紫外光源照射步骤b1)获得的液体C，使所述可光交联的预聚物溶液A发生交联反应，得到微水凝胶；

b3)将步骤b2)获得的所述微水凝胶浸于超纯水中除去未交联的所述聚合物单体聚乙二醇二丙烯酸酯、杂质和所述NaCl颗粒，之后，将其在-20℃条件下冷冻4-5h，再在-50℃，20pa条件下，干燥12小时，得到所述微海绵支架。

所述聚合物单体聚乙二醇二丙烯酸酯在所述可光交联的预聚物溶液A中的含量为每100ml所述可光交联的预聚物溶液A中含有10g所述聚合物单体聚乙二醇二丙烯酸酯；所述2-羟基-4-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮在所述可光交联的预聚物溶液A中的含量为每100ml所述可光交联的预聚物溶液A中含有0.5g所述2-羟基-4-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮；所述NaCl颗粒与所述可光交联的预聚物溶液A的配比为每1ml所述可光交联的预聚物溶液A中含1mg所述NaCl颗粒。

所述饱和NaCl溶液是60℃的饱和NaCl溶液，所述聚乙二醇二丙烯酸酯和所述2-羟基-4-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮是在60℃条件下溶解于所述饱和NaCl溶液。

在本发明的一个实施例中，所述边框具体按照包括如下步骤的方法制备：

c1)将2-羟基-4-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮在60℃条件下溶解于液体聚乙二醇二丙烯酸酯，混匀，得到所述可光交联的预聚物溶液B；所述2-羟基-4-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮在所述可光交联的预聚物溶液B中的含量为每100ml所述可光交联的预聚物溶液B中含有1g所述2-羟基-4-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮；

c2)利用紫外光源照射步骤c1)获得的所述可光交联的预聚物溶液B，使所述可光交联的预聚物溶液B发生交联反应，得到所述边框。

利用本发明装置和方法，可以实现a)-d)中任一所述的三维微环境的构建：a)各种分子物质(如小分子化合物、药物、核酸、蛋白等)中的任一种或任几种的混合物；b)各种天然与合成材料(如细胞外基质，高分子材料、微珠等)中的任一种或任几种的混合物；c)各种细胞和微生物(如真核/原核细胞、病毒、微生物等)中的任一种或任几种的混合物；d)a)-c)中任几种的混合物。

上述三维微环境应用领域广泛，包括但不限于：分子/材料/细胞的芯片用于研究分子/细胞、材料/细胞、细胞/细胞相互作用；药物筛选；体外模型构建等等。

用于构建三维微环境的微海绵支架也属于本发明的保护范围。

本发明与现有研究相比具有如下优点：

1、本发明所提供的构建三维微环境的方法及装置，有效地将工程制造技术与化学、物理、材料等学科知识结合起来，为生物学、药学、医学等领域对于精确可控和高通量的三维微环境的研究提供一个简易、应用广泛的平台，填补了交叉学科在实际应用方面的障碍。

2、本发明装载方法操作简便，无需特别的专业技术和手段以及昂贵的设备就可以实现高通量的三维图案化排列，大大降低了操作过程中对于人员技能、环境空间等各方面的使用要求，具有广泛的应用前景。

3、利用本发明所提供的构建三维微环境的装置，进行药物、材料和细胞的装载，方法应用灵活，能满足单一和高通量、独立和关联体系、重复单元和各异单元等多层次研究目的需求。既可单独使用，也可与其他传统装载方式结合使用。

4、本发明所提供的构建三维微环境的方法及装置，以较低的液体用量就可以达到高效地高通量同步装载，很大程度上降低了对于药物、材料和细胞的样本量要求，且无损、简易的操作步骤对活细胞的处理和损伤影响最低。

附图说明

图1为影印石版术示意图。其中，1为TMP包被的载玻片；2为盖玻片；3为OTS包被的载玻片；4为紫外光；5为图案化的光掩模；6为液体C(可光交联的预聚物溶液A和NaCl固体颗粒)或可光交联的预聚物溶液B。

图2为三维图案化微海绵支架陈列示例和单个微海绵支架的电镜图。其中，A为大小各异的环状微海绵支架陈列；B为统一大小的柱状微海绵支架阵列；C为单个柱状微海绵支架的电镜图。

图3为等离子清洗法改性载玻片基底。其中，A代表清洗前；B代表清洗后。

图4为用于构建三维微环境的装置的自动装载示意图A：过程示意图，1为微海绵支架陈列，2为改性的载玻片基底A，3为密实边框，4为药物、细胞和材料液体薄层；B：自动装载效果放大图。

图5为药物、细胞和材料的三维微尺度排列示例。其中，A为酚红溶液；B为10μm荧光微球；C为荧光微球在单个柱状微海绵支架内部的分布显微镜图片。

具体实施方式

本发明所提供的构建三维微环境的方法及装置，是利用三维图案化“微海绵支架”的吸附作用，简易、高通量的实现药物、材料、细胞及其混合物的三维微尺度排列。

所述构建三维微环境的方法，包括如下步骤：

所述液体薄层的厚度为一般在10微米-200微米，既可形成细胞薄层，又不会在重力作用下形成聚集，导致分布不均。

所述样品液包括下述a)-d)中任一物质：a)各种分子物质(如小分子化合物、药物、核酸、蛋白等)中的任一种或任几种的混合物；b)各种天然与合成材料(如细胞外基质，高分子材料、微珠等)中的任一种或任几种的混合物；c)各种细胞和微生物(如真核/原核细胞、病毒、微生物等)中的任一种或任几种的混合物；d)a)-c)中任几种的混合物。

本发明所提供的用于构建三维微环境的装置，包括下述a1)和a2)的两个器件：a1)微海绵支架或由两个以上所述微海绵支架组成的微海绵支架阵列；a2)用于装载样品液的基底A。

所述微海绵支架制备过程涉及各种制孔技术和图案化技术，得到具有吸附能力的多孔微海绵支架或微海绵支架阵列。所述多孔微海绵支架的孔径从几微米到几百微米不等，一般平均孔径在1μm-999μm；孔间距大于1μm，一般为1μm-999μm；所形成的孔隙率为80％以上，一般为80％-99％；小孔与小孔之间具有良好的连通性。所述微海绵支架或微海绵支架阵列的尺寸、形状可根据需求设计成不同图案，尺寸最小可达10微米，形状包括圆柱、圆环、立方体、不规则体等，体积最小可达3×10^-6mm³。

所述微海绵支架用生物材料制备；所述生物材料为可交联的人工合成的生物材料和/或可交联的天然生物材料。所述天然生物材料如明胶及其衍生物、藻酸盐及其衍生物、琼脂、基质胶、胶原、蛋白多糖、糖蛋白、透明质酸、层连接蛋白、纤维连接蛋白等；所述人工合成生物材料包括聚乙二醇及其衍生物、聚丙烯、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚乳酸、聚羟基酸、聚乳酸醇酸共聚物、聚二甲基硅氧烷、聚酸酐、聚酸酯、聚酰胺、聚氨基酸、聚缩醛、聚氰基丙烯酸酯、聚氨基甲酸酯、聚吡咯、聚酯、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯、聚碳酸酯、聚氧化乙烯等，形成支架的材料可以是上述材料中的一种或几种的混合物。所述微海绵支架材料的选择需要综合考虑材料的物化性质和选用的多孔制备技术及图案制造、微制造技术等因素。

制备所述微海绵支架的过程中所涉及到的多孔制备技术，包括致孔剂(porogen)滤除法、相分离法、乳液冷冻干燥法、溶剂蒸发法、气体泡沫法、纤维粘合法等等。所述“微海绵支架”的制备过程结合上述单种或多种技术可以得到孔径不同、形状各异、分布不等的孔。其中，孔径的大小范围从纳米级到微米级不等；形状有不规则形、长条形、圆/椭圆形等等；分布包括各向同质性和各向异质性等等。所述“微海绵支架”的吸附能力与孔径的大小、分布、连通性、孔隙率各种特性有关。一般孔径越大、孔的连通性越好、孔隙率越高，吸附能力越强，从而实现较快的装载过程。多孔制备技术的选择需要综合考虑材料的物化性质和图案制造、微制造技术等因素。

所述微海绵支架陈列的制备涉及到各种图案(Pattern)制造和微制造(microfabrication)技术包括影印石版术(photolithography)、微接触打印技术(microcontact printing)、微流体图案技术(microfluidic patterning)、层流图案技术(laminar flow patterning)、模版图案技术(stencil patterning)、压印光刻技术(Imprintlithography)、流体光刻技术(flow lithography)等等。上述技术在制作过程中各有优缺点，将其与其他技术结合使用能达到更佳的三维图案化效果。例如，在影印石版术中，用数字微镜装置(digital micromirror device DMD)代替光掩模可以在制作过程中动态变换图案，从而制作出高复杂性、高内部关联性的三维图案。图案制造、微制造技术及结合使用技术的选择需要综合考虑材料的物化性质和多孔制备技术等因素。

所述图案化包含但又不局限于单个三维微支架的图案化和三维图案化的微支架陈列。单个三维微支架的图案化是指将单个三维微支架根据研究需求设计成所需图案。例如，研究肝细胞生物学行为时，可以将三维微支架设计成与体内肝细胞形状相似的正六边体。三维图案化的微支架陈列是指为模拟体内复杂组织构造或实现体外高通量研究目的，将整个微支架陈列设计成所需的三维图案。将上述两种图案化设计结合使用，可以满足不同研究领域的多种需求。

所述装载样品液的基底A为亲水性基底或疏水性基底。利用相似相容原理，将基底改性为(超级)亲水性或(超级)疏水性，易与亲水性或亲脂性液体相互作用。改性方法包括各种化学修饰法、物理改性法(如等离子清洗法)以及将其结合使用。化学修饰法是利用化学反应将基底改性，例如David Zahner etc.将载玻片包被上甲基丙烯酸丁酯和双甲基丙烯酸酸乙二醇酯(BMA-EDMA)的多孔聚合物膜，从而将其改性为疏水性、超级疏水性，并利用表面光嫁接技术将亲水性甲基丙烯酸酯：2-(甲基丙烯酸基氧)乙基三甲基铵氯(META)或2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸(AMPS)嫁接到疏水性聚合物膜上，得到超级亲水性表面。物理改性法是使用特定设备，在特殊条件下形成等离子体，等离子体作用于材料表面，使表面分子的化学键发生重组，形成新的表面特性，例如等离子清洗机。亲水性基底可以吸引水分子，易被水溶性液体湿润，从而易于形成亲水性液体薄层。所述液体薄层的厚度一般为一般在10微米-200微米，既可形成单细胞层，又不会在重力作用下形成聚集，导致分布不均。

根据需要，本发明所提供的装置还可在所述基底A的周边选择性地修饰上尺寸、形状、高度可控的密实边框，以控制液体薄层的面积、接触范围和高度，从而对液体进行区域界限和定量计算。当液体薄层的定量不设为研究参数之一时，可选择不设置边框；当液体薄层的定量或界限设为研究参数时之一时，根据需求设置尺寸、形状、高度一定的边框，利用边框的限定性，选择性的装载不同的药物、细胞和材料到限定范围内的三维“微海绵支架”排列中，从而实现不同液体的同步装载。密实边框的修饰通过各种图案制造技术实现。如上述各种图案制造技术。

本发明所提供装置还包括支撑所述微海绵支架或所述微海绵支架阵列的基底B。

所述基底B为用于固定所述微海绵支架或所述微海绵支架阵列的载玻片。

所述微海绵支架具体可按照包括如下步骤的方法制备：

b3)将步骤b2)获得的所述微水凝胶浸于超纯水中除去未交联的所述聚合物单体聚乙二醇二丙烯酸酯、杂质和所述NaCl颗粒，之后，将其在-20℃条件下冷冻4-5h，再在-50℃，20pa条件下(如使用冷冻干燥机)，干燥12小时，得到所述微海绵支架。

所述边框可以按照包括如下步骤的方法制备：

利用本发明所提供的方法和装置可以实现对a)-d)中任一物质的高效装载。a)各种分子物质(如小分子化合物、药物、核酸、蛋白等)中的任一种或任几种的混合物；b)各种天然与合成材料(如细胞外基质，高分子材料、微珠等)中的任一种或任几种的混合物；c)各种细胞和微生物(如真核/原核细胞、病毒、微生物等)中的任一种或任几种的混合物；d)a)-c)中任几种的混合物。

所述高效装载包括但又不局限于单个三维“微海绵支架”的高效装载和三维图案化的“微海绵支架”排列的高效装载。单个三维“微海绵支架”的装载可以将微海绵的自动吸附作用融合到传统的静态(滴加法)和动态(离心法、表面超声波法、灌注法、磁场法等等)装载方法中以实现高效装载目的。尤其在滴加法中，利用多孔材料的吸附性仅仅使用常规的移液器或移液枪(Pipettor)就可以使药物、材料和细胞自动装载到支架内部。三维图案化的“微海绵支架”排列的装载涉及到可以形成液体薄层的基底。高效装载过程是指将包被上药物、细胞和材料液体薄层的基底和三维图案化的“微海绵支架”排列接触性叠合在一起，利用“微海绵支架”的吸附作用和液体薄层易分离性达到药物、细胞和材料的三维微尺度排列高效装载。与传统自动化操作系统相比，这种简便、无损、快速的装载方式应用在高通量的三维图案化排列中体现了巨大的优势。

本发明所提供的方法和装置尤其适用于样本量小、易受操作影响、有高通量研究需求、有复杂关系研究需求的药物、细胞和材料，同时也适用于其他领域有以上特点的研究对象。

下面结合具体的实施例，进一步阐明本发明。应该理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、用于构建三维微环境的装置的制造

一、结合影印石版术、盐析技术和冷冻干燥法制备微海绵支架陈列

本实施例所提供的制备微海绵支架陈列的生物材料为单体聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA4000)。

本实施例选用的聚乙二醇二丙烯酸酯具有良好的生物相容性、机械性能、不可降解性以及光交联程度可控性等优点，适合作为本实施例制备微海绵支架陈列的生物材料。制备带有支撑基底B的微海绵支架陈列过程中所用到的载玻片和盖玻片为商品化载玻片和盖玻片，其中载玻片尺寸为76.2mm×25.4mm，盖玻片厚度为150μm。

用于构建三维微环境的装置的制造方法如下所述：

(一)光掩模的设计与打印

采用AutoCAD绘图软件设计光掩模(按照图2中的A和B设计两种光掩模)。设计尺寸A：光掩模大小为76.2mm×25.4mm，透光环内径D_内＝1200μm，外径D_外＝2000、2560、3020、3420、3780、4100、4400、4680μm，环间距W＝6000μm；设计尺寸B：光掩模大小为76.2mm×25.4mm，透光孔径D＝1000μm，孔径间距W＝2000μm。在印刷厂打印胶片光掩模。

(二)可光交联的预聚物溶液A的配制

具体配制方法如下：用研钵研磨盐粒，并用不同孔径(100μm和125μm)的全不锈钢标准筛筛选出100-125μm粒径的NaCl固体颗粒。将聚乙二醇二丙烯酸酯和2-羟基-4-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮于60℃条件下溶解于饱和NaCl溶液(60℃的饱和NaCl溶液)，使冷却后以7500rpm转速离心10min，取出上清液，得到可光交联的预聚物溶液A。每100ml所述可光交联的预聚物溶液A中含有10g所述聚合物单体聚乙二醇二丙烯酸酯，同时含有5g所述2-羟基-4-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮。之后向可光交联的预聚物溶液A中加入100-125μm的NaCl颗粒，其用量为1mg的NaCl固体颗粒：1ml可光交联的预聚物溶液A，混匀后得到液体C，将液体C贮存于4℃环境中备用。

(三)载玻片的包被

采用化学修饰法将两个载玻片中的一个包被上十八烷基三氯硅烷(OTS)，另一个包被上甲基丙烯酸3-(三甲氧基硅烷)丙酯(TMP)。OTS暴露端十八烷基将载玻片改性为疏水性，可以使液体聚集成一定高度；TMP暴露端双键可以与聚乙二醇二丙烯酸酯的双键反应使聚合物固定在载玻片上。具体包被方法如下：

1)将载玻片放到染色架上，浸泡于洗洁精水溶液中，100W、40℃超声20分钟；

2)之后浸泡到超纯水中30分钟，并用超纯水冲洗3次；

3)将载玻片染色架浸于质量分数为10％的氢氧化钠溶液，加热到80℃-90℃，维持60分钟；

4)之后再次浸泡到超纯水中30分钟，冲洗3次，在60℃烘箱中烘干；

5)室温下，将载玻片染色架浸于含有体积分数为5％的OTS的正己烷溶液中30分钟，或含有体积分数为1％的TMP的乙醇(含3％乙酸)溶液中3分钟；

6)将包被上OTS的载玻片在甲苯中浸泡清洗10分钟，将包被上TMP的载玻片在无水乙醇中浸泡清洗10分钟；

7)最后将载玻片在60℃烘箱中烘4小时，冷却后密封储存于4℃冰箱中备用。

(四)紫外光交联过程

按照图1(影印石版术示意图，此处图1中的6为液体C)所示构造图，将上述步骤(一)、(二)、(三)制备好的光掩模、液体C(可光交联的预聚物溶液A和NaCl固体颗粒)、包被好的载玻片，以及盖玻片组合起来，将其暴露在紫外光下形成微水凝胶阵列(位于TMP包被载玻片的下表面)，支架高度为2个盖玻片，300μm。紫外光源为加拿大Omnicure S2000紫外交联仪；具体紫外交联参数为：紫外光强度20mW/cm²，光照时间8.5s。其中，TMP包被载玻片被紫外光照射的表面为其上表面。

(五)多孔“微海绵支架”的制备

采用冷冻干燥法将微水凝胶制备成多孔“微海绵支架”。

具体过程如下：将上述步骤(四)光交联后，轻轻拆卸组合，去掉光掩膜、OTS包被的载玻片及盖玻片，得到交联在TMP包被载玻片上的微水凝胶陈列。将有微水凝胶阵列的载玻片(对应步骤(四)中用TMP包被过的载玻片)浸于超纯水中除去未交联的单体、杂质和NaCl固体颗粒，每3h换一次水，于摇床上摇1天。之后，将其在-20℃条件下冷冻4-5h，再转入冷冻干燥机(-50℃，20pa)干燥12小时，得到白色三维图案化“微海绵支架”排列(图2)。

按照上述方法，共制备两种微海绵支架阵列(图2中的A和B)。其中，图2中的A所示微海绵支架阵列含有八种不同大小的微海绵支架，其体积大小分别为0.603μl、1.204μl、1.809μl、2.415μl、3.026μl、3.620μl、4.22μl、4.82μl；图2中的B所示微海绵支架阵列的微海绵支架大小一致，其体积为0.2355μl。A和B所示微海绵支架阵列的微海绵支架的孔径大小均在1μm-150μm；孔间距1μm-999μm，孔径分布百分比率均为：1μm-75μm的小孔占10％，75-100μm的小孔占30％，100-125μm的小孔占30％，孔径大小125-150μm的小孔占30％；孔隙率为91％，连通性良好；吸水量为理论体积的2.76倍。

二、采用影印石版术和等离子清洗法制备用于构建三维微环境的装置中可形成液体薄层的基底A(亲水性基底)

本实施例用于构建三维微环境的装置中可形成液体薄层的基底A周边镶嵌密实边框。制备所述边框的生物材料为商业购得的聚合物单体聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA258)(sigma，产品号475629)。

用于构建三维微环境的装置中可形成液体薄层的基底A的具体制备方法如下：

(一)光掩模的设计与打印

采用AutoCAD绘图软件设计光掩模。设计尺寸：光掩模大小为76.2mm×25.4mm，透光边框D＝1000μm，边框大小40mm×24mm。在印刷厂打印胶片光掩模。

(二)可光交联的预聚物溶液B的配制

具体配制方法如下：

将的2-羟基-4-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮于60℃条件下，溶解于液体聚乙二醇二丙烯酸酯(分子量258)，使2-羟基-4-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮的浓度为0.01g/ml，混匀后得到所述可光交联的预聚物溶液B，贮存于4℃环境中备用。

(三)载玻片的包被

采用化学修饰法将两个载玻片中的一个包被上十八烷基三氯硅烷(OTS)，另一个包被上甲基丙烯酸3-(三甲氧基硅烷)丙酯(TMP)。OTS暴露端十八烷基将载玻片改性为疏水性，可以使液体聚集成一定高度，TMP暴露端双键可以与聚乙二醇二丙烯酸酯的双键反应使聚合物固定在载玻片上。具体包被方法如下：

2)之后浸泡到超纯水中30分钟，并用超纯水冲洗3次；

5)室温下，将载玻片染色架浸于含有体积分数为5％的OTS的正己烷溶液中30分钟，或含有体积分数为1％的TMP的乙醇溶液(含3％乙酸)中3分钟；

(四)紫外光交联过程

按照图1(影印石版术示意图，此处图1中的6为可光交联的预聚物溶液B)所示构造图，将上述步骤(一)、(二)、(三)制备好的光掩模、可光交联的预聚物溶液B、包被好的载玻片，以及盖玻片组合起来，将其暴露在紫外光下形成密实边框(位于TMP包被载玻片的下表面)，边框高度为2个盖玻片，300μm。紫外光源为加拿大Omnicure S2000紫外交联仪；具体紫外交联参数为：紫外光强度20mW/cm²，光照时间30s。其中，TMP包被载玻片被紫外光照射的表面为其上表面。

(五)亲水性基底(基底A)的制备

采用HPDC基础型等离子清洗系统将上述固定有密实边框的载玻片(对应步骤(四)中用TMP包被过的载玻片)改性为亲水性基底。具体过程如下：

1)将上述步骤(四)交联后的组合轻轻拆卸，取固定有密实边框的载玻片(用TMP包被过的载玻片)用75％的乙醇清洗干净，并用N₂吹干；

2)将上述1)中的载玻片放置入清洗机的舱内；

3)打开等离子清洗系统中的真空油泵，抽真空5分钟；

4)开启等离子清洗机前面的开关，选择“高”档的RF频率；

5)待舱内产生紫色辉光时，计时清洗时间，清洗1分钟；

6)1分钟后，把RF关掉，关闭等离子清洗机；

7)关闭真空油泵，完全打开三通阀让空气继续进入卸压；

8)取出载玻片，完成清洗改性。

改性效果见图3，液体可在基底上形成薄层。

实施例2、利用本发明所提供的装置实现样品液的三维微尺度高效装载

利用实施例1制备好的装置(微海绵支架阵列为图2中B所示的微海绵支架阵列，其上微海绵支架体积均为0.2355μl)实现样品液的高效三维微尺度装载，其过程示意图见图4。将液体薄层基底覆盖在微海绵支架陈列上，利用微海绵的吸附作用和液体薄层的易流动分离性，自动将液体吸进微海绵支架内，从而实现样品液的三维微尺度装载。所述样品液可为小分子化合物、药物、核酸、蛋白、细胞外基质成分、高分子材料、微珠、真核细胞、原核细胞、病毒、微生物中的任一种或任几种的混合物。

本实施例选用pH指示剂酚红作为样品液中小分子物质的示例、明胶作为样品液中大分子物质的示例、10μm的荧光微球(Fluorescent microspheres)作为样品液中微生物和细胞的示例，装载到实施例1制备好的三维图案化“微海绵支架”阵列中。配制浓度为0.77mg/ml的酚红水溶液，4℃环境中储存备用。配制0.02g/ml的明胶溶液，4℃环境中储存备用。用超纯水稀释商品化荧光微球母液至5×10⁶个/ml的悬浮液，4℃环境中避光储存备用。

将40μl酚红溶液均匀平铺在载玻片基底A的边框内，形成厚度约为41.7μm的液体薄层，轻轻将基底A覆盖住微海绵支架陈列上，待酚红溶液分散进入微海绵支架内部后，轻轻移去基底A，实现酚红溶液的三维微尺度装载，见图5中A。

将40μl明胶溶液均匀平铺在载玻片基底A的边框内，形成厚度约为41.7μm的液体薄层，轻轻将基底A覆盖住微海绵支架陈列上，待明胶溶液分散进入微海绵支架内部后，轻轻移去基底A，实现明胶溶液的三维微尺度装载。

将荧光微球悬浮液在涡旋器上混匀，取40μl悬浮液均匀平铺在载玻片基底A的边框内，形成厚度约为41.7μm的液体薄层，轻轻将基底A覆盖住微海绵支架陈列，待荧光微球溶液分散进入微海绵支架内部后，轻轻移去基底A，实现荧光微球的三维微尺度装载，见图5中B。荧光微球在单个微海绵支架内部的分布见图5中C。

利用本方法进行样品液的三维微尺度高通量装载，样品液较均匀地装载进入支架。流动性较好的酚红溶液和明胶液体达到100％的装载效率，荧光微球悬浮液的装载效率达92％，并且大部分独立支架之间没有联通，可进行独立研究。装载效率不受支架形状和体积影响，将样品液装载进入图2中A所示的微海绵支架阵列，效果一样。

Claims

1.构建三维微环境的方法，包括如下步骤：

a1)将样品液置于权利要求3-9中任一所述用于构建三维微环境的装置的基底A上，形成液体薄层；

a2)将步骤a1)中形成所述液体薄层的所述基底A覆盖在权利要求3-9中任一所述用于构建三维微环境的装置的微海绵支架或微海绵支架阵列上，待所述样品液分散进入到所述微海绵支架或所述微海绵支架阵列后，实现所述样品液的三维微尺度装载，完成所述三维微环境的构建；

所述液体薄层的厚度为10微米-200微米。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述样品液包括下述a)-d)中任一所述的物质：

a)小分子化合物、药物、核酸、蛋白中的任一种或任几种的混合物；

b)细胞外基质成分、高分子材料、微珠中的任一种或任几种的混合物；

c)真核细胞、原核细胞、病毒、微生物中的任一种或任几种的混合物；

d)a)-c)中任几种的混合物。

3.用于构建三维微环境的装置，包括下述a1)和a2)的两个器件：a1)微海绵支架或由两个以上所述微海绵支架组成的微海绵支架阵列；a2)用于装载样品液的基底A；

所述微海绵支架用生物材料制成，具有若干小孔；所述小孔的孔径为1μm-999μm，孔间距为1μm-999μm，所述小孔在所述微海绵支架上所形成的孔隙率为80％-99％；

所述生物材料为可交联的人工合成的生物材料和/或可交联的天然生物材料；所述人工合成的生物材料为下述至少一种：聚乙二醇、聚乙二醇衍生物、聚丙烯、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚乳酸、聚羟基酸、聚乳酸醇酸共聚物、聚二甲基硅氧烷、聚酸酐、聚酸酯、聚酰胺、聚氨基酸、聚缩醛、聚氰基丙烯酸酯、聚氨基甲酸酯、聚吡咯、聚酯、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯、聚碳酸酯和聚氧化乙烯；所述天然生物材料为下述至少一种：明胶、明胶衍生物、藻酸盐、藻酸盐衍生物、琼脂、基质胶、胶原、蛋白多糖、糖蛋白、透明质酸、层连接蛋白和纤维连接蛋白；

所述装载样品液的基底A为亲水性基底或疏水性基底；所述基底的亲水性或疏水性使样品液在所述基底的表面形成液体薄层；所述液体薄层的厚度为10微米-200微米。

4.根据权利要求3所述装置，其特征在于：所述装置还包括镶嵌在所述基底A周边的边框；

5.根据权利要求3-4所述装置，其特征在于：所述微海绵支架按照包括如下步骤的方法制备：

6.根据权利要求5所述装置，其特征在于：所述聚合物单体聚乙二醇二丙烯酸酯在所述可光交联的预聚物溶液A中的含量为每100ml所述可光交联的预聚物溶液A中含有10g所述聚合物单体聚乙二醇二丙烯酸酯；

所述2-羟基-4-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮在所述可光交联的预聚物溶液A中的含量为每100ml所述可光交联的预聚物溶液A中含有0.5g所述2-羟基-4-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮；

所述NaCl颗粒与所述可光交联的预聚物溶液A的配比为每1ml所述可光交联的预聚物溶液A中含1mg所述NaCl颗粒。

7.根据权利要求5或6所述装置，其特征在于：所述饱和NaCl溶液是60℃的饱和NaCl溶液，所述聚乙二醇二丙烯酸酯和所述2-羟基-4-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮是在60℃条件下溶解于所述饱和NaCl溶液。

8.根据权利要求4所述的装置，其特征在于：所述边框按照包括如下步骤的方法制备：

9.根据权利要求3所述的装置，其特征在于：所述三维微环境为包括下述a)-d)中任一所述的三维微环境：

d)a)-c)中任几种的混合物。

10.用于构建三维微环境的微海绵支架，其特征在于：所述微海绵支架用生物材料制成，具有若干小孔；所述小孔的孔径为1μm-999μm，孔间距为1μm-999μm，所述小孔在所述微海绵支架上所形成的孔隙率为80％-99％；

所述生物材料为可交联的人工合成的生物材料和/或可交联的天然生物材料；所述人工合成的生物材料为下述至少一种：聚乙二醇、聚乙二醇衍生物、聚丙烯、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚乳酸、聚羟基酸、聚乳酸醇酸共聚物、聚二甲基硅氧烷、聚酸酐、聚酸酯、聚酰胺、聚氨基酸、聚缩醛、聚氰基丙烯酸酯、聚氨基甲酸酯、聚吡咯、聚酯、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯、聚碳酸酯和聚氧化乙烯；所述天然生物材料为下述至少一种：明胶、明胶衍生物、藻酸盐、藻酸盐衍生物、琼脂、基质胶、胶原、蛋白多糖、糖蛋白、透明质酸、层连接蛋白和纤维连接蛋白。