CN104053459B - 基于透明海绵支架构建三维细胞微环境的方法及装置 - Google Patents

Abstract

提供一种构建三维细胞微环境的方法及装置。该方法包括如下步骤：1)三维透明海绵支架或三维透明海绵支架阵列的建立；2)含有分子、材料、细胞及其混合物的样品液体薄层的建立；3)将1)中所述透明海绵支架或透明海绵支架阵列与2)中所述液体薄层相结合，完成样品液的装载从而实现三维微环境的构建。该方法和装置为生物医学研究和药物研发等领域对细胞在三维微环境中生长、增殖、无标记观测、功能分析等方面的研究提供简易实用平台，并快速、无损地实现了分子、材料、细胞及其混合物的三维微环境的图案化、高通量同步装载以及无标记实时观测。

Description

基于透明海绵支架构建三维细胞微环境的方法及装置

技术领域

本发明涉及一种构建三维微环境的方法及装置，特别涉及一种与传统两维细胞培养技术同样简易方便操作的方法(easyas2D)实现包括可溶性因子、生物材料和细胞的三维细胞微环境的构建的方法和装置，属于生物医学工程领域。

背景技术

两维细胞培养(基于商业化的培养皿或多孔板)技术发展已有百余年的历史，在生命科学基础研究、制药产业、医学研究等领域具有广泛应用。但在很多情况下，两维细胞培养环境与细胞在体内生长的真实环境相距甚远。因此这种简化的两维微环境不能很好的模拟和重现体内的三维微环境。而依赖于动物体内实验的研究过程复杂且与人体反应具有差异性。因此，三维细胞培养技术在近年来得到了大幅度的发展。

三维细胞培养技术是指将不同种类的细胞种植到具有三维结构的材料载体中，使细胞能够在载体的三维立体空间结构中迁移、生长、行使功能。该技术的目的是模拟体内细胞生长环境，其核心因素是细胞与三维微环境之间的相互作用，即细胞与分子、细胞与细胞外基质(Extracellularmatrix，ECM)以及细胞与细胞的相互作用。三维细胞微环境较真实地在体外模拟和重现体内细胞生长环境与状态(生长、分化、极化、细胞间相互作用等)，细胞在基因表达、基质分泌及细胞功能活动等方面与两维培养均有明显差异，作为生理模型研究细胞对于药物反应有较准确的预测性，同样作为病理模型具有很高的仿生性。因此在体外构建三维细胞微环境实现分子、材料和细胞在三维水平上相互作用的研究对于加速生物、医学和药物开发等领域的发展具有重要意义。

目前，细胞三维培养方式主要有两种：水凝胶(hydrogel)培养方式和支架(scaffold)培养方式。水凝胶培养方式是将细胞和材料的悬浮液在一定条件下交联成水凝胶，细胞在水凝胶的交联网络体系内实现三维培养。常用的成胶(gelling)方式有：温度转变(如collagen、matrigel)、pH转变(如chitosan)、添加离子(如alginate)、光暴露(如hyaluronicacidordextran-containingvinylgroups)等等。支架培养方式是指将细胞或细胞-材料的悬浮液种植到已经成型的三维支架材料中实现三维培养。目前种植的方法分为两大类：静态种植和动态种植。静态种植一般将细胞或细胞-材料的悬浮液直接滴加在支架上；动态种植借助外部动力(如旋转种植、表面超声波种植、离心种植、磁场种植等)使细胞较高效、均匀地渗入支架内部。与传统两维细胞培养方式相比，水凝胶培养体系中，细胞在成胶过程中需要同预聚物一起经历交联过程，不可避免受到伤害；且水凝胶体系中约90％成分为水，机械性能较差，不适合长期换液增殖培养及定量检测。但水凝胶具有良好的光学性能，可以像两维培养方式一样在普通白光显微镜下对细胞生长状态进行实时无标记观测，在血管新生、肿瘤发生学等领域具有广泛应用。支架培养方式中，静态种植法简便、使用广泛，但也最低效，动态种植法具有外部机械力损伤细胞的潜在危险，且支架培养体系光学性能较差，细胞在支架体系内的分布、生长、迁移等变化无法实时观测，必须借助荧光标记、固定染色等手段，无疑增大了实验的复杂性和技术难度。但支架具有良好的机械性能，可以像两维培养方式一样对细胞进行长期换液增殖培养，在组织工程、临床检测等领域具有广泛应用。

近期，三维细胞培养技术发展迅速，市场上逐渐推出十余种三维细胞培养产品(如Alvetex、AlgiMatrix、GEM、Microtissues、RAFT、n3D等)，均产自美国、英国、瑞士等地。产品主要分为两种类型：水凝胶型和支架型。例如qgelbio公司推出的QGel^TM，是一种PEG粉末，将其与细胞悬浮液和QGel^TMbuffer混合，以QGel^TMDiscCaster为模具，制备载有细胞的三维水凝胶薄片；而3Dbioteck公司推出的3DInsert^TM-PS和3DInsert^TM-PCL，是一种基于多孔板的内嵌式多孔支架，细胞悬浮液直接滴加在内部连通的多孔支架上达到三维培养的目的。两种类型产品相比较，水凝胶型三维细胞培养方式前期制备过程较复杂，需要多步操作，细胞和预聚物一起交联成胶有损伤风险，且需要配套模具，价格较高，但由于水凝胶光学性能较好，后续实验中可用显微镜在白光下观察细胞状态；而多孔支架型三维细胞培养方式操作过程简便，技术难度低，但由于多孔支架光学性能差，无法在普通白光显微镜下直接观察细胞状态，实验中需要对细胞进行荧光标记和荧光成像。根据DDW(DrugDiscoveryWorld)调查统计，目前仅有7％科研人员逐渐将两维细胞培养方式转向三维培养方式，7％人员持期望和积极态度，而86％人员拒绝使用，主要原因是他们要求三维细胞研究手段要和传统的两维细胞研究手段在整套实验体系中保持一致：培养方式上无需特殊工具和技巧，检测方式上可依赖于常规设备(off-the-shelfinstruments)和方法进行实时检测。

建立三维细胞培养系统需要考虑实际研究中的多重因素。如材料基质的来源(天然或合成材料)、材料基质的物化性能(化学相容性、机械性能、降解性、结构特性等)、材料基质的生物活性(粘附位点、诱导信号等)，三维培养技术所需的设备、使用条件、适用范围，细胞的封装方式、培养方式、检测方式等等。理想的三维细胞培养系统能够实现在细胞种植、培养、增殖、传代过程中以及后续的成像与定性，同传统两维细胞培养方式同样简便易行(easyas2D)。

再者，现代生物学、药学、医学的系统研究需要涉及大量信息的获取和分析，为了降低研究成本，理想三维细胞培养系统还能满足微尺度(microscale)、高通量(high-throughput)的研究要求。此外，为满足生物学、再生医学、组织工程、病理学等领域不同的研究目的，理想三维细胞培养系统还应具备可图案化(patterning)、微观结构(microstructure)可控性，易于监测(monitoring)等特点，实现具有更为复杂精细结构的仿生体外模型的建立。

随着生物医学、材料学、机械学、工程学等交叉学科的快速发展，越来越多的技术用于在空间上精确控制三维细胞培养微环境。例如诞生于半导体工业的微米尺度加工技术(如3D打印机、激光雕刻机)被越来越广泛的应用于生物医学研究中以实现对于分子、材料和细胞在空间上的精确控制和高通量排列，其在建造图案化、高通量的三维微环境领域具有强大功能。利用此技术可重建体外仿生模型(如模拟血管的多层生理结构，以及肝小叶精细的生理结构)，以及构建三维的分子、材料和细胞阵列芯片。再有，目前常用的高通量平台技术基于微孔板(如96、384孔板)或芯片(如基因、蛋白、材料和细胞芯片)形式，用自动化操作系统(如机械手、排枪、芯片点样系统、个人点样仪等)执行实验过程，降低了所需试剂(如抗体、药物)、材料(如matrigel、collagen)和细胞(如干细胞、肝细胞)的用量来实现微量样本研究。但是，这些技术的应用仅仅局限于具有拥有昂贵仪器并且有交叉学科(生物材料、工程制造、生物医学等)背景的实验室，其在传统生物学、药学和医学实验室的广泛应用尚存在技术上、资金上的瓶颈。因此能在常规生物学、医学或药学实验室实现的高通量图案化三维细胞微环境的建立将对于其广泛应用具有很重要的价值。

综上所述三维细胞微环境构建的复杂性、目前已经商品化三维细胞培养产品的优缺点以及各领域研究需要，亟需一种能够和两维细胞培养方法一样简易，方便操作(easyas2D)的三维细胞培养方法，并同时满足图案化、高通量、实时无标记监测等研究目的。

发明公开

本发明的目的是提供一种构建三维细胞微环境的方法及装置。

本发明所提供的构建三维微环境的装置是基于三维透明海绵支架的装置。所述海绵支架为透明的海绵支架，所述透明的海绵支架为透明度达到50％以上的所述海绵支架。

所述海绵支架用生物材料制成，具有若干小孔；所述小孔的孔径为1nm-999μm，孔间距为1μm-999μm，所述小孔在所述海绵支架上所形成的孔隙率(多孔物体的孔隙体积和物体的总体积之比)为70％-99.9％；所述海绵支架的体积为0.1μm³-1000cm³。

在本发明中，所述小孔的孔径具体可为1μm-150μm、1μm-85μm、10μm-150μm或10μm-125μm；所述孔隙率具体可为82.4％-94.2％、82.4％-93.3％或93.3％-94.2％(如82.4％、93.3％或94.2％)；所述海绵支架的体积具体可为0.2355mm³-37.56mm³、0.2355mm³-4.82mm³、6.26mm³-37.56mm³、0.603mm³-4.82mm³或0.2355mm³-0.603mm³(具体如0.2355mm³、0.603mm³、1.204mm³、1.809mm³、2.415mm³、3.026mm³、3.620mm³、4.22mm³、4.82mm³、6.26mm³、12.52mm³、25.04mm³或37.56mm³)。在本发明中，所述海绵支架的吸水量为理论体积的1-15倍、10-15倍、3.5-5倍或1-2倍。

所述生物材料为可交联的人工合成的生物材料和/或可交联的天然生物材料；所述人工合成的生物材料为下述至少一种：聚乙二醇、聚乙二醇衍生物、聚丙烯、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚乳酸、聚羟基酸、聚乳酸醇酸共聚物、聚二甲基硅氧烷、聚酸酐、聚酸酯、聚酰胺、聚氨基酸、聚缩醛、聚氰基丙烯酸酯、聚氨基甲酸酯、聚吡咯、聚酯、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯、聚碳酸酯和聚氧化乙烯；所述天然生物材料为下述至少一种：明胶、明胶衍生物、藻酸盐、藻酸盐衍生物、琼脂、基质胶、胶原、蛋白多糖、糖蛋白、透明质酸、层连接蛋白和纤维连接蛋白。

本发明所提供的构建三维微环境的装置，包括下述A1)和A2)的两个器件：A1)所述透明的海绵支架或由两个以上所述透明的海绵支架组成的海绵支架阵列；A2)用于装载样品液的基底A；

所述装载样品液的基底A为亲水性基底或疏水性基底；所述亲水性基底或疏水性基底由各种改性方法制备，包括化学修饰法、物理改性法以及将其结合使用。所述基底的亲水性或疏水性使样品液在所述基底的表面形成液体薄层；所述液体薄层的厚度通常为1μm-200μm，既可形成细胞薄层，又不会在重力作用下形成聚集，导致分布不均。所述亲水性或疏水性基底的微加工技术为下述至少一种：影印石版术(photolithography)、微接触打印技术(microcontactprinting)、微流体图案技术(microfluidicpatterning)、层流图案技术(laminarflowpatterning)、模版图案技术(stencilpatterning)、压印光刻技术(Imprintlithography)、流体光刻技术(flowlithography)等。在本发明中，所述液体薄层的厚度具体可为10μm-100μm或10μm-50μm，如10μm或50μm。

所述生物材料的交联方法为下述至少一种：光交联法、化学交联法、物理交联法、辐射交联法、酶催化交联法、活化微珠交联法等。

所述小孔的制孔技术为下述至少一种：致孔剂(porogen)滤除法、相分离法、乳液冷冻干燥法、溶剂蒸发法、气体泡沫法、纤维粘合法等。

在制备所述透明的海绵支架的过程中，需要使用透明剂，改变所述生物材料的光学性能，以达到透明的效果。同时还可以通过使用微加工技术，实现所述海绵支架的图案化，和/或实现所述海绵支架阵列的高通量。所述三维微环境的微加工技术为下述至少一种：影印石版术(photolithography)、微接触打印技术(microcontactprinting)、微流体图案技术(microfluidicpatterning)、层流图案技术(laminarflowpatterning)、模板图案技术(stencilpatterning)、压印光刻技术(Imprintlithography)、流体光刻技术(flowlithography)等。在本发明中，具体通过使用光掩膜，根据需要设计透光部分的图案，进而通过光交联得到图案化的三维海棉支架以及高通量的三维海绵支架阵列。

所述海绵支架阵列由三个以上的所述海绵支架组成，形成所述高通量的三维海绵支架阵列。在本发明中，组成所述海绵支架阵列的所述海绵支架具体可为16-192个，如16、24、64、192个。

本发明中，所述透明的海绵支架的制备有光交联法和化学交联法。

在本发明的一个实施例中，采用光交联法制备所述透明的海绵支架，包括如下步骤：

b1)将聚合物单体聚乙二醇二丙烯酸酯和光引发剂2-羟基-4-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮溶解在所述透明剂与水的混合溶液中，得到可光交联的预聚物溶液A；

b2)利用紫外光源照射步骤b1)获得的可光交联的预聚物溶液A，使所述可光交联的预聚物溶液A发生交联反应，得到水凝胶；

b3)将步骤b2)获得的所述水凝胶浸于超纯水中除去未交联的所述聚合物单体聚乙二醇二丙烯酸酯、所述透明剂和杂质。

在上述方法中，所述聚合物单体聚乙二醇二丙烯酸酯在所述可光交联的预聚物溶液A中的含量为每100ml所述可光交联的预聚物溶液A中含有1-50g所述聚合物单体聚乙二醇二丙烯酸酯；所述光引发剂2-羟基-4-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮在所述可光交联的预聚物溶液A中的含量为每100ml所述可光交联的预聚物溶液A中含有0.1-10g所述2-羟基-4-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮；所述透明剂在所述透明剂与水的混合溶液中的体积百分含量需大于等于0.01％，同时小于100％。

所述透明剂可为1，2，4-丁三醇、乙二醇，1，3-丁二醇，丙三醇，1，2-丙二醇，1，3-丙二醇，季戊四醇，顺-1，2-环戊二醇，丁四醇和戊五醇等多元醇中的至少一种。

在本发明的一个实施例中，所述聚合物单体聚乙二醇二丙烯酸酯在所述可光交联的预聚物溶液A中的含量为每100ml所述可光交联的预聚物溶液A中含有10g所述聚合物单体聚乙二醇二丙烯酸酯；所述光引发剂2-羟基-4-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮在所述可光交联的预聚物溶液A中的含量为每100ml所述可光交联的预聚物溶液A中含有0.5g所述2-羟基-4-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮；所述透明剂具体为1，2，4-丁三醇，所述1，2，4-丁三醇在所述透明剂与水的混合溶液中的体积百分含量具体为60％(即所述1，2，4-丁三醇与所述水的体积比为3∶2)。

在本发明的另一个实施例中，采用化学交联法制备所述透明的海绵支架，包括如下步骤：

c1)将聚合物单体聚乙二醇二丙烯酸酯溶解在所述透明剂与水的混合溶液中，再加入过硫酸铵和N，N，N′，N′-四甲基二乙胺，得到预聚物溶液B；

c2)在步骤c1)得到预聚物溶液B后，将其加到制备海绵支架的模具中，使所述预聚物溶液B发生化学交联反应(室温下进行)，得到水凝胶；

c3)将步骤c2)获得的所述水凝胶浸于超纯水中除去未交联的所述聚合物单体聚乙二醇二丙烯酸酯、所述透明剂和杂质。

在上述方法中，所述聚合物单体聚乙二醇二丙烯酸酯在所述预聚物溶液B中的含量可为每100ml所述预聚物溶液B中含有1-50g所述聚合物单体聚乙二醇二丙烯酸酯；所述过硫酸铵在所述预聚物溶液B中的含量可为每100ml所述预聚物溶液B中含有0.01-1g所述过硫酸铵；所述N，N，N′，N′-四甲基二乙胺在所述预聚物溶液B中的含量可为每100ml所述预聚物溶液B中含有0.01-1g所述N，N，N′，N′-四甲基二乙胺；所述透明剂在所述透明剂与水的混合溶液中的体积百分含量需大于等于0.01％，同时小于100％。

所述透明剂可为1，2，4-丁三醇、乙二醇，1，3-丁二醇，丙三醇，1，2-丙二醇，1，3-丙二醇，季戊四醇，顺-1，2-环戊二醇，丁四醇和戊五醇等多元醇中的至少一种。

在本发明的一个实施例中，所述聚合物单体聚乙二醇二丙烯酸酯在所述预聚物溶液B中的含量可为每100ml所述预聚物溶液B中含有10g所述聚合物单体聚乙二醇二丙烯酸酯；所述过硫酸铵在所述预聚物溶液B中的含量可为每100ml所述预聚物溶液B中含有0.05g所述过硫酸铵；所述N，N，N′，N′-四甲基二乙胺在所述预聚物溶液B中的含量可为每100ml所述预聚物溶液B中含有0.5g所述N，N，N′，N′-四甲基二乙胺。所述透明剂具体为1，2，4-丁三醇，所述1，2，4-丁三醇在所述透明剂与水的混合溶液中的体积百分含量为60％(即所述1，2，4-丁三醇与所述水的体积比为3∶2)。

在上述化学交联方法中，所述制备海绵支架的模具具体可用生物材料制成，所述生物材料为人工合成的生物材料和/或天然生物材料；所述人工合成的生物材料为下述至少一种：聚甲基丙烯酸酯、聚乙二醇、聚乙二醇衍生物、聚丙烯、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚乳酸、聚羟基酸、聚乳酸醇酸共聚物、聚二甲基硅氧烷、聚酸酐、聚酸酯、聚酰胺、聚氨基酸、聚缩醛、聚氰基丙烯酸酯、聚氨基甲酸酯、聚吡咯、聚酯、聚乙烯、聚碳酸酯和聚氧化乙烯；所述天然生物材料为下述至少一种：明胶、明胶衍生物、藻酸盐、藻酸盐衍生物、琼脂、基质胶、胶原、蛋白多糖、糖蛋白、透明质酸、层连接蛋白和纤维连接蛋白。

在上述光交联法和化学交联法制备所述透明的海绵支架的步骤中，在步骤b3)和c3)中所述除去未交联的所述聚合物单体聚乙二醇二丙烯酸酯、所述透明剂和杂质后，还包括将所述水凝胶在-200℃～0℃条件下冷冻1-72h，再干燥1-72h，得到所述海绵支架或所述海绵支架阵列。

在本发明的实施例中，在除去未交联的所述聚合物单体聚乙二醇二丙烯酸酯、所述透明剂和杂质后，将所述水凝胶在-20℃条件下冷冻4-5h，再在-50℃，20pa条件下，干燥12小时，得到所述海绵支架或所述海绵支架阵列。

根据实际需要，本发明所提供的用于构建三维微环境的装置，还包括镶嵌在所述基底A上的边框。

所述边框用生物材料制成，所述生物材料为人工合成的生物材料和/或天然生物材料；所述人工合成的生物材料为下述至少一种：聚乙二醇、聚乙二醇衍生物、聚丙烯、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚乳酸、聚羟基酸、聚乳酸醇酸共聚物、聚二甲基硅氧烷、聚酸酐、聚酸酯、聚酰胺、聚氨基酸、聚缩醛、聚氰基丙烯酸酯、聚氨基甲酸酯、聚吡咯、聚酯、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯、聚碳酸酯和聚氧化乙烯；所述天然生物材料为下述至少一种：明胶、明胶衍生物、藻酸盐、藻酸盐衍生物、琼脂、基质胶、胶原、蛋白多糖、糖蛋白、透明质酸、层连接蛋白和纤维连接蛋白。

在本发明的一个实施例中，所述基底A具体为亲水性基底；所述基底A上的边框具体为用聚甲基丙烯酸甲酯制成的。

实际操作中，根据需要，所述装置还包括支撑所述海绵支架或所述海绵支架阵列的基底B。在本发明的一个实施例中，所述基底B为固定所述海绵支架或所述海绵支架阵列的载玻片。

所述海绵支架或所述装置在构建三维微环境中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明所提供的构建三维微环境的方法是基于所述海绵支架(三维透明海绵支架)，采用与传统两维细胞培养方法一样简便易行的方法，可实现包含可溶性因子、生物材料和细胞的三维细胞微环境的构建，并同时满足图案化、高通量、无标记实时监测等研究目的。(图1)

本发明所述的与传统两维细胞培养方法一样简单易行的种植方法基于传统滴加法和液体薄层法。传统滴加方法是指将样品液体直接滴加在支架表面或旁侧，样品液自动被吸入支架内部。液体薄层法是指将三维海绵支架接触覆盖在分子、材料和细胞的液体薄层上，利用海绵支架的自动吸附作用，使得分子、材料和细胞自动分散进入到所述海绵支架中，以实现高通量同步装载，完成分子、材料和细胞三维微环境的构建。

所述构建三维微环境的液体薄层法具体为用所述装置构建三维微环境，可包括如下步骤：

a1)将样品液置于所述装置的基底A上，形成液体薄层；

a2)将步骤a1)中形成所述液体薄层的所述基底A覆盖在所述装置的海绵支架或海绵支架阵列上，或者将所述海绵支架或所述海绵支架阵列覆盖在步骤a1)中形成所述液体薄层的所述基底A上，待所述样品液分散进入到所述海绵支架或所述海绵支架阵列后，实现所述样品液的三维尺度装载，完成所述三维微环境的构建；

所述液体薄层的厚度为1μm-200μm，既可形成细胞薄层，又不会在重力作用下形成聚集，导致分布不均。在本发明中，所述液体薄层的厚度具体可为10μm-100μm或10μm-50μm，如10μm或50μm。

在上述方法中，所述样品液具体可包括下述a)-d)中任一所述的物质：a)各种分子物质(如小分子化合物、药物、核酸、蛋白等)中的任一种或任几种的混合物；b)各种天然与合成材料(如细胞外基质，高分子材料、微珠等)中的任一种或任几种的混合物；c)各种细胞和微生物(如真核/原核细胞、病毒、微生物等)中的任一种或任几种的混合物；d)a)-c)中任几种的混合物。

在本发明中，上述所有三维微环境均为包括下述a)-d)中任一所述的三维微环境：a)各种分子物质(如小分子化合物、药物、核酸、蛋白等)中的任一种或任几种的混合物；b)各种天然与合成材料(如细胞外基质，高分子材料、微珠等)中的任一种或任几种的混合物；c)各种细胞和微生物(如真核/原核细胞、病毒、微生物等)中的任一种或任几种的混合物；d)a)-c)中任几种的混合物。

上述三维细胞微环境研究应用领域广泛，包括但不限于：分子/材料/细胞的芯片用于研究分子/细胞、材料/细胞、细胞/细胞相互作用；药物筛选；体外模型构建；组织工程；再生医学；病理研究等等。

附图说明

图1为方法设计总图。其中，A-1至A-3为两维细胞培养技术，具体的，A-1为细胞滴加平铺在培养皿中，A-2为显微镜观察培养皿上细胞状态，A-3为传代培养，继A-3之后，可根据需要进行各种细胞研究。B-1至B-5为三维细胞培养技术，具体的，B-1为细胞自动吸附进入透明多孔海绵支架，B-2为显微镜观察透明海绵支架内部细胞状态，B-3为传代培养，B-4为液体薄层法高通量自动装载(1-液体薄层；2-海绵支架阵列；3-疏水性边框)，B-5为微加工技术实现微尺度、图案化设计(1-TMP修饰玻片；2-盖玻片；3-OTS修饰玻片；4-紫外光；5-图案化光掩膜；6-预聚物)，继B-5之后，可根据需要进行各种细胞研究。

图2为透明海绵支架制备及表征。A为化学交联法制备海绵支架模具。B为化学交联法制备海绵支架实物图(正面图和侧面图)及其电镜图。C和D为光交联法制备海绵支架实物图(圆柱形和圆环形)及其电镜图(C大孔径，D小孔径)。E和F为光交联法制备海绵支架孔径分布图(E大孔径，F小孔径)。

图3为透明海绵支架自动装载分子、材料、细胞。A和B为圆柱形海绵支架阵列自动装载分子(酚红溶液)，A为装载前，B为装载后。C和D为正六边形海绵支架阵列自动装载材料(明胶)，C为装载前，D为装载后。E为正六边形和长方形海绵支架阵列自动装载细胞(HeLa)。F-1至F-9为海绵支架自动装载荧光微球动态图(荧光微球直径10μm)。

图4为透明海绵支架光学性能测试。A为透过化学交联法制备的透明海绵支架(0.5mm)观察文字(左侧两个样品为0％1，2，4-丁三醇，右侧两个样品为60％1，2，4-丁三醇)。B为化学交联法制备不同高度的透明海绵支架。C为透过光交联法制备海绵支架观察文字(0％1，2，4-丁三醇)。D为透过光交联法制备透明海绵支架观察文字(60％1，2，4-丁三醇)。E为不同体积比的透明剂1，2，4-丁三醇对透明海绵支架透明度的定量图。F为不同高度对透明海绵支架(60％透明剂1，2，4-丁三醇)透明度的定量图。

图5为HeLa细胞在透明海绵支架中生长形成肿瘤微球。A-1至A-5：显微镜观察HeLa细胞随时间在透明海绵支架中生长形成肿瘤微球。B为显微镜观察HeLa肿瘤微球的荧光图片。C为HeLa肿瘤微球的电镜图。D为激光共聚焦显微镜观察HeLa肿瘤微球的三维荧光图片。

图6为HeLa肿瘤微球传代培养保持高存活率。A为HeLa肿瘤微球在透明支架中的显微镜图片。B为HeLa肿瘤微球被消化洗涤出支架。C和D为肿瘤微球死/活染色荧光图片，C为低倍镜2×，D为高倍镜10×。

图7为液体薄层法自动装载分子、材料进入高通量、图案化海绵支架。A-1和A-2为等离子清洗法形成亲水性基底，A-1为清洗前水的接触角，A-2为清洗后水的接触角。B为微加工技术(影印石版术)制备高通量海绵支架阵列。C为等离子清洗法和微接触打印法形成不同染料液体薄层。D为液体薄层法高通量自动装载不同染料液体进入海绵支架阵列。E为液体薄层法自动装载Doxorubicin药物和荧光微球进入微加工技术(影印石版术)制备的图案化海绵支架(清华大学百年校庆图标)。

图8为液体薄层法自动装载HeLa细胞进入海绵支架阵列。A为液体薄层法自动装载HeLa细胞进入圆环形海绵支架阵列。B-1至B-3为不同细胞浓度液体薄层自动装载效果图。C为不同细胞浓度液体薄层自动装载进入海绵支架内部的激光共聚焦显微镜三维扫描图。D为CellTiter-Blue测试液体薄层法自动装载不同浓度HeLa细胞进入海绵支架的细胞量与液体薄层残余细胞量。E为CellTiter-Blue定量荧光强度-活细胞数量标准曲线。F为根据标准曲线E图，定量液体薄层法自动装载不同浓度HeLa细胞进入海绵支架的比率。

实施发明的最佳方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所涉及的孔隙率均指多孔物体的孔隙体积和物体的总体积之比。

实施例1、分别采用化学交联法和光交联法制备图案化透明三维海绵支架

本实施例所提供的制备透明海绵支架的生物材料为聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA4000)。聚乙二醇二丙烯酸酯具有良好的生物相容性、机械性能、不可降解性以及适用多种交联方法等优点，适合作为本实施例制备透明海绵支架的生物材料。聚乙二醇二丙烯酸酯合成方法：在氮气条件下，将5g聚乙二醇(PEG4000)粉末搅拌溶解于50ml二氯甲烷溶液中，缓慢逐滴加入0.76ml的三乙胺溶液和0.47ml的丙烯酰氯溶液，室温下搅拌反应24h。之后，加入100ml2M的碳酸钾溶液洗涤，并静置分层，收集下层二氯甲烷混合液。将二氯甲烷混合液滴加入500ml无水乙醚溶剂中沉淀，过滤收集白色粉末，并室温干燥，最终得到白色PEGDA固体粉末。

(一)化学交联法制备透明海绵支架

1.激光切割法制备支架模具

采用Rayjet激光雕刻机切割厚度分别为0.5mm、1mm、2mm、3mm的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)平板形成模具。模板设计由软件AutoCAD完成：模板长75mm，宽25mm，均匀分布3×14个直径为4mm的微孔作为支架模型，每个微孔的中心距离为1000μm。激光雕刻机的主要加工参数为：切割能量100％，切割次数2，切割线速度10％。见图2-A。

2.化学交联法制备水凝胶

本发明化学交联法制备水凝胶所配制的预聚物溶液B的一大特点就是透明剂的添加，从而满足生物学、药学、医学等领域对三维微环境实施无标记成像研究的要求。可用的透明剂主要为多元醇类，如乙二醇，1，3-丁二醇，1，2，4-丁三醇，丙三醇，1，2-内二醇，1，3-丙二醇，季戊四醇，顺-1，2-环戊二醇，丁四醇，戊五醇等。所述透明剂多元醇在最终的预聚物溶液B中的体积百分比为0.01％-100％。下述将以1，2，4-丁三醇作为透明剂，阐述所述预聚物溶液B的配制及水凝胶的制备方法：将10％(w/v)聚乙二醇二丙烯酸酯于60℃条件下溶解于1，2，4-丁三醇与水(体积比60/40)的混合溶液中。在冰盒上操作，加入0.05％(w/v)过硫酸铵的和0.5％(w/v)N，N，N′，N′-四甲基二乙胺得到预聚物溶液B(上述各物质的浓度均为在预聚物溶液B中的终浓度)。将此预聚物溶液B滴加到PMMA模具的微孔中，在室温条件下溶液逐渐化学交联为透明的水凝胶。实验中，同时设置不加入透明剂1，2，4-丁三醇的对照。

3.海绵支架的制备

采用冷冻干燥法将上述水凝胶制备成多孔支架。具体过程如下：将上述载有水凝胶的模具浸于超纯水中除去未交联的单体、1，2，4-丁三醇等杂质，换4-5次水。之后，将其在-20℃条件下冷冻4-5h，再转入冷冻干燥机(-50℃，20pa)干燥12小时，得到白色多孔海绵支架。按照上述方法，制备得到海绵支架，其实物图和电镜图见图2-B。所得海绵支架的体积大小为6.26mm³、12.52mm³、25.04mm³、37.56mm³；孔径大小10μm-150μm；孔间距1μm-999μm；孔隙率为94.2％，连通性良好；吸水量为理论体积的10-15倍。

(二)光交联法制备图案化透明海绵支架

1.光掩模的设计与打印

采用AutoCAD绘图软件设计光掩模。设计尺寸：光掩模大小为76.2mm×25.4mm，根据需求自由设计图案。例如，图2中C设计尺寸：透光孔径D＝1mm，孔间距W＝2mm。图2中D设计尺寸：透光环内径D_内＝1200μm，外径D_外＝2000、2560、3020、3420、3780、4100、4400、4680μm，环间距W＝6000μm。在印刷厂(清华大学印刷厂)打印胶片光掩模。

2.可光交联的预聚物溶液A的配制

本发明配制可光交联的预聚物溶液A的一大特点就是透明剂的添加，从而满足生物学、药学、医学等领域对三维微环境实施无标记成像研究的要求。可用的透明剂主要为多元醇类，如乙二醇，1，3-丁二醇，1，2，4-丁三醇，丙三醇，1，2-丙二醇，1，3-丙二醇，季戊四醇，顺-1，2-环戊二醇，丁四醇，戊五醇等。所述透明剂多元醇在最终的可光交联的预聚物溶液A中的体积百分比为0.01％-100％。下述将以1，2，4-丁三醇作为透明剂，阐述所述可光交联的预聚物溶液A的配制方法：将10％(w/v)聚乙二醇二丙烯酸酯和0.5％(w/v)2-羟基-4-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮于60℃条件下溶解于1，2，4-丁三醇与水(体积比60/40)的混合溶液中，冷却后得到可光交联的预聚物溶液A(上述各物质的浓度均为在可光交联的预聚物溶液A中的终浓度)。混匀贮存于4℃环境中备用。实验中，同时设置不加入透明剂1，2，4-丁三醇的对照。

3.载玻片的包被

采用化学修饰法分别将载玻片包被上十八烷基三氯硅烷(OTS)(百灵威科技有限公司)和甲基丙烯酸3-(三甲氧基硅烷)丙酯(TMP)，OTS暴露端十八烷基将载玻片改性为疏水性，可以使液体聚集成一定高度，TMP暴露端双键可以与聚乙二醇二丙烯酸酯的双键反应使聚合物固定在载玻片上。具体包被方法如下：1)将载玻片放到染色架上，浸泡于洗洁精水溶液中，超声20分钟；2)将载玻片染色架浸于10％的氢氧化钠溶液60分钟；3)再浸于超纯水中30分钟，烘干；4)室温下，将载玻片染色架浸于含有5％(V/V)OTS的正己烷溶液中30分钟，或含有1％(V/V)TMP的乙醇(含3％乙酸)中3分钟；5)将包被上OTS的载玻片在甲苯中浸泡10分钟，将包被上TMP的载玻片在无水乙醇中浸泡10分钟；6)最后将载玻片烘干，储存于4℃冰箱中备用。

4.紫外光交联过程

按照图1-B-5(影印石版术示意图)所示构造图，将上述步骤1、2、3制备好的光掩模、可光交联的预聚物溶液A、包被好的载玻片，以及盖玻片组合起来，将其暴露在紫外光下形成图案状水凝胶，支架高度为2个盖玻片，300μm。紫外光源为加拿大OmnicureS2000紫外交联仪；具体紫外交联参数为：紫外光强度20mW/cm²，光照时间8.5s。

5、图案化海绵支架的制备

采用冷冻干燥法将水凝胶制备成多孔支架。具体过程如下：将上述步骤4交联后的组合轻轻拆卸，取固定有水凝胶的载玻片(即支撑所述海绵支架或所述海绵支架阵列的基底B)浸于超纯水中除去未交联的单体、1，2，4-丁三醇和杂质，换4-5次水。之后，将其在-20℃条件下冷冻4-5h，再转入冷冻干燥机(-50℃，20pa)干燥12小时，得到白色三维图案化海绵支架。按照上述方法，制备得到不同大小的海绵支架，其实物图和电镜图见图2中C和D。其中，图2中C的海绵支架体积大小均为0.2355μl。图2中D的海绵支架体积大小分别为0.603μl、1.204μl、1.809μl、2.415μl、3.026μl、3.620μl、4.22μl、4.82μl。图2中C所示的海绵支架的孔径大小均在10μm-125μm；孔间距1μm-999μm，孔径分布百分比率均为(见图2中E)：10μm-30μm的小孔占17.74％，30μm-50μm的小孔占43.55％，50μm-80μm的小孔占32.56％，孔径大小80μm-125μm的小孔占6.45％；孔隙率为93.3％，连通性良好；吸水量为理论体积的3.5-5倍。图2中D所示的海绵支架的孔径大小均在1μm-85μm；孔间距1μm-999μm，孔径分布百分比率均为(见图2中F)：1μm-10μm的小孔占5.33％，10μm-20μm的小孔占27.83％，20μm-30μm的小孔占35.00％，孔径大小30μm-40μm的小孔占20.50％，孔径大小40μm-85μm的小孔占11.33％；孔隙率为82.4％，连通性良好；吸水量为理论体积的1-2倍。

实施例2、海绵支架自动装载分子、材料、细胞

本案例实现分子、材料和细胞的自动装载方法为传统滴加方法(图1中B-1)。传统滴加方法是指将样品液体直接滴加在支架表面或旁侧，样品液自动被吸入支架内部。所述样品液可为小分子化合物、药物、核酸、蛋白、细胞外基质成分、高分子材料、微珠、真核细胞、原核细胞、病毒、微生物中的任一种或任几种的混合物。

本实施例选用pH指示剂酚红作为样品液中分子样品的示例(图3中A和B)、1mg/ml的明胶作为样品液中材料样品的示例(图3中C和D)、5×10⁶个/ml的HeLa细胞(中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心，3111C0001CCC000011)作为细胞样品(图3中E)自动装载进入实施例1光交联制备好的三维图案化“海绵支架”中。其中，图3中A的圆柱形海绵支架是按照实施例1所述光交联法制备而来的，圆柱的直径为1000μm；海绵支架的高度为300μm；其海绵支架的孔径大小1μm-85μm；孔间距1μm-999μm；孔隙率为82.4％，连通性良好；吸水量为理论体积的1-2倍；该海绵支架阵列共由64个海绵支架组成。图3-C和3-E中的正六边形和长方形海绵支架是按照实施例1所述光交联法制备而来的，正六边形的边长为500μm，长方形的长为1000μm，宽为500μm；海绵支架的高度为300μm；海绵支架的孔径大小10μm-125μm；孔间距1μm-999μm；孔隙率为93.3％，连通性良好；吸水量为理论体积的3.5-5倍；这两海绵支架阵列均共由16个海绵支架组成。用荧光显微镜拍摄记录海绵支架自动装载5×10⁶个/ml的荧光微球(直径10μm)液体的动态过程(图3中F)。其中，F-1为1.5秒，F-2为2.5秒，F-3为3.5秒，F-4为4.5秒，F-5为5.5秒，F-6为7秒，F-7为8.5秒，F-8为11秒，F-9为13秒。吸水量为5μl的海绵支架完成自动装载过程耗时13秒。

实施例3、海绵支架透明光学性能测试

本实施例选用文字观察和透明度测量来检测海绵支架的透明光学性能。

将按照实施例1中化学交联法和光交联法制备的海绵支架(图2中B，图3中C)浸入水中，置于37℃培养箱中2-3天，除去支架内部气泡。将其分别置于载玻片上，透过支架观察文字(图4中A，C和D)。通过对比观察，本发明方法制备的海绵支架再次吸水后光学性能良好，可以清晰看到载玻片下的文字。没有加入透明剂的样品光学性能较差，无法清晰看到载玻片下文字。将不同体积比(0％，10％，30％，60％)透明剂1，2，4-丁三醇和不同高度的体积比为60％透明剂1，2，4-丁三醇的样品分别放在载玻片上，用酶标仪检测其透光度(同时以1cm玻璃作为对照)，得到透明海绵支架的透明光学性能定量图(图4中E和F)。根据此定量图，可知：透明海绵支架的透明度随透明剂1，2，4-丁三醇的体积比的增大而增大，随透明海绵支架的高度的增大而减小。

实施例4、观察记录细胞在透明海绵支架中生长

本实施例选用HeLa细胞作为案例观察记录其在透明海绵支架中的生长。将5×10⁶个/ml的HeLa细胞悬浮液滴加在海绵支架上，并培养于37℃、5％CO₂、饱和湿度培养箱中，培养液为添加10％(v/v)FBS和1％(v/v)双抗(青链霉素、链霉素)的DMEM培养液，每两天换液一次。普通白光显微镜观察记录HeLa细胞随时间在透明海绵支架(实施例1中化学交联法制备得到的海绵支架)中逐渐生长形成肿瘤微球(图5中A-1至A-5)。其中，A-1至A-5分别为细胞种植0h、4h、26h、50h、100h后的记录图片。通过观察比较，可清晰观察到HeLa细胞逐渐生长形成肿瘤微球，且肿瘤微球随时间逐渐增大。(见箭头标记)。换液培养六天后，进行PBS洗涤、4％多聚甲醛固定10min、PBS洗涤、0.5％(v/v)triton通透5min、PBS洗涤、100nM罗丹明(Rhodamine)室温染色30min、PBS洗涤、100nMDAPI37℃染色10min、PBS洗涤、覆盖抗荧光猝灭剂等一系列步骤将支架内的肿瘤微球实现荧光染色。图5中B为荧光显微镜观察肿瘤微球图片，图5中C为扫描电镜观察肿瘤微球，图5中D为激光共聚焦显微镜观察肿瘤微球图片(细胞核：蓝色-DAPI，细胞骨架：红色-rhodamine)，进一步证明HeLa细胞在三维环境中的生长状态为三维立体生长，不同于传统两维环境中单细胞层生长。

实施例5、海绵支架中细胞的传代培养

本实施例选用HeLa细胞作为案例进行传代培养。将实施例4透明支架中的HeLa肿瘤微球(图6中A)经过0.25％胰酶消化2min、培养液洗涤3-4次，得到HeLa细胞悬浮液(图6中B)。经过0.2％(w/v)Calcein-AM(sigma，C1359，染色操作参见说明书)和0.3％(w/v)PI染液(死细胞：红色-PI，活细胞：绿色-Calcein-AM)染色15min后，荧光显微镜观察细胞保持接近100％的存活率(图6中C-1和C-2)。其中C-1为低倍镜2×观察图片，C-2为高倍镜10×观察图片。

实施例6、液体薄层法将药物分子、材料自动装载于高通量、图案化海绵支架阵列

本案例实现分子、材料的高通量、图案化自动装载方法为液体薄层法(图1中B-4)。液体薄层法是指将图案化海绵支架阵列覆盖在液体薄层上或将液体薄层覆盖在图案化海绵支架阵列上，利用海绵的吸附作用和液体薄层的易流动分离性，自动将液体吸进海绵支架内，从而实现样品液的三维微尺度装载。下述内容涉及用于构建三维微环境的装置的基底A的制作、所述基底A上疏水边框的制作，以及利用液体薄层法实现分子、材料的高通量、图案化自动装载的操作步骤。具体如下：

1.等离子清洗法修饰亲水性基底载玻片

采用HPDC基础型等离子清洗系统将载玻片改性为亲水性基底，即制作用于构建三维微环境的装置的基底A。具体过程如下：1)将载玻片放置入清洗机的舱内，打开等离子清洗系统中的真空油泵，抽真空5分钟；2)待舱内产生紫色辉光时，计时清洗1分钟；改性效果见图7中A-1和A-2(A-1清洗前水的接触角，A-2清洗后水的接触角)。液体可在基底上形成薄层。

2.化学法修饰疏水性边框

1)按照高通量海绵支架阵列载玻片(图7中B的多边形的海绵支架阵列是按照实施例1所述光交联法制备而来的，多边形的外直径为1000μm；海绵支架的高度为300μm；其海绵支架的孔径大小1μm-85μm；孔间距1μm-999μm；孔隙率为82.4％，连通性良好；吸水量为理论体积的1-2倍；该海绵支架阵列共由192个海绵支架组成。)的设计，用激光雕刻机(Rajet)切割厚度为0.5mm的PMMA平板，得到与海绵支架阵列区域划分(2×6)重合的PMMA边界模具；2)沿PMMA模具的边界均匀涂抹50μl1％(v/v)OTS/正己烷混合溶液，并放在匀胶机(Mycro)上以3000r/min的速度旋匀30s；3)将修饰后的PMMA模具对齐按压在经上述等离子清洗法处理后的亲水性载玻片(基底A)上4s；4)在步骤3载玻片(基底A)上一一对应海绵支架阵列区域滴加10μL不同颜色的染料溶液(葡萄紫，亮蓝，果绿，胭脂红，日落黄，苋菜红)，染料溶液在每个区域自动分散成均匀液体薄层(图7中C)；

3.液体薄层法自动装载分子、材料进入高通量、图案化海绵支架

将高通量的海绵支架阵列载玻片(基底B及固定其上的海绵支架阵列)(图7中B所示海绵支架阵列)按照区域划分平行正对轻轻覆盖在上述载有不同颜色染料液体薄层(液体薄层厚度为10微米)的载玻片(基底A)上，使海绵支架每个阵列区域(2×6)同时接触区域液体薄层，区域液体自动被海绵支架吸收，从而达到高通量并行自动装载的目的(图7中D)。

按照上述三个步骤采用液体薄层法将Doxorubicin药物(红色荧光)和荧光微球(绿色，直径10μm)同时自动装载进入图案化海绵支架中(图7中E)。实现多种液体的简易同步装载。图7中E中的清华百年校庆图标状海绵支架是按照实施例1所述光交联法制备而来的，海绵支架的高度为300μm；海绵支架的孔径大小10μm-125μm；孔间距1μm-999μm；孔隙率为93.3％，连通性良好；吸水量为理论体积的3.5-5倍。

实施例7、液体薄层法自动装载HeLa细胞种植入高通量海绵支架阵列

本实施例先采用Calcein-AM试剂(sigma，C1359)检测高通量海绵支架阵列能否实现对HeLa细胞的自动装载，接着选用CellTiter-Blue试剂(Promega，G8080)研究液体薄层法高通量自动装载HeLa细胞的效率。

首先，将HeLa细胞悬浮液轻轻吹打均匀，并用Calcein-AM(其使用方法参照试剂说明书)处理细胞，取200μl不同浓度的悬浮液分别均匀平铺在不同的亲水性载玻片基底(基底A)上，轻轻将高通量海绵支架陈列载玻片(基底B及固定其上的海绵支架阵列，图8中A的圆环形海绵支架是按照实施例1所述光交联法制备而来的，圆环的内径为2400μm，外径为3400μm；海绵支架的高度为300μm；海绵支架的孔径大小10μm-125μm；孔间距1μm-999μm；孔隙率为93.3％，连通性良好；吸水量为理论体积的3.5-5倍；该海绵支架阵列共由24个海绵支架组成。)覆盖在细胞液体薄层(液体薄层厚度为50微米)上，待细胞溶液分散进入海绵支架内部后，轻轻移去支架阵列载玻片，实现HeLa细胞的高通量三维装载(图8中A，HeLa细胞：绿色-Calcein-AM)。不同细胞浓度液体薄层装载后的效果图见图8中B-1至B-3(B-1：2×10⁶个/ml，B-2：4×10⁵个/ml，B-3：8×10⁴个/ml)。采用激光共聚焦显微镜扫描海绵支架内部的细胞分布，见图8中C-1至C-3(C-1：2×10⁶个/ml，C-2：4×10⁵个/ml，C-3：8×10⁴个/ml)。结果表明，随着细胞浓度的提高，自动装载进入海绵支架的细胞越多，绿色荧光强度越强，细胞三维分布越密集，特别是图8中B-1和C-1。这说明上述高通量海绵支架陈列能够通过液体薄层法实现对HeLa细胞的自动装载。

接着，采用CellTiter-Blue试剂定量液体薄层法自动装载细胞的效率。

1、建立活细胞数量-荧光强度标准曲线；

在96孔板中分别种植4×10⁴个/孔、8×10³个/孔、1.6×10³个/孔、320个/孔的一系列浓度的HeLa细胞，每个浓度重复3个样本，每个孔中加入100μl培养液和20μl的CellTiter-Blue试剂，在37℃、5％CO₂、饱和湿度培养箱中孵育1h。用酶标仪测定荧光强度，建立标准曲线(图8中E)。

2、CellTiter-Blue试剂定量液体薄层法自动装载细胞的效率；

按上述液体薄层法分别将不同细胞浓度的悬浮液自动装载到高通量海绵支架阵列(基底B及固定其上的海绵支架阵列，图8中A所示的圆环形海绵支架)中。在每个液体薄层载玻片(基底A)和海绵支架载玻片(基底B及固定其上的海绵支架阵列)上分别加入1000μl培养液和200μl的CellTiter-Blue试剂混合液，在37℃、5％CO₂、饱和湿度培养箱中孵育1h(图8，D-1：5×10⁶个/ml，D-2：1×10⁶个/ml，D-3：2×10⁵个/ml)。从每个混合液中取30μl到384孔板，用酶标仪测定荧光强度，根据标准曲线(图8中E)，定量液体薄层法自动高通量装载不同浓度HeLa细胞进入海绵支架的效率，见图8中F。结果表明，随着细胞浓度的提高，海绵支架内的细胞与CellTiter-Blue试剂反应，导致其颜色越偏红，说明自动装载进入海绵支架的细胞越多，液体薄层法实现自动装载的效率越高。

工业应用

本发明提出了一种基于透明海绵支架材料实现能够和两维细胞培养方法一样简易，方便操作(easyas2D)的构建三维细胞微环境的方法，并同时满足图案化、高通量、实时无标记监测等研究目的。1)利用三维海绵支架材料的多孔性实现了自动简易的细胞或细胞-材料的装载。采用传统滴加方法，细胞或细胞-材料悬浮液便能自动吸附进入多孔海绵支架内部，形成三维微环境体系；2)种植细胞在三维微环境中可是实现自由三维生长，增殖，并且易于传代；3)利用透明海绵支架材料的优良光学性能，实现应用常规设备(如普通光学显微镜)对细胞进行无标记观测；4)透明海绵支架材料可有效结合三维微加工技术，实现三维微环境的微量化、图案化以形成高通量三维微环境阵列；5)我们还发明了一种简易、可广泛应用的液体薄层法，可以快速、无损地实现分子、材料和细胞以及其混合物的三维微环境的高通量同步装载。

本发明与现有研究相比具有如下优点：1、本发明方法结合工程学、化学、物理学、材料学等学科知识，制备三维透明海绵多孔支架，利用支架的多孔性、光学透明性、机械弹性、交联可控性等特征，为生物学、药学、医学等领域对于精确可控和高通量的三维细胞微环境的研究提供一个简单易行、应用广泛的平台；2、本发明提出的三维微环境构建方法与传统两维细胞培养手段一样简单易行(easyas2D)，使用常规设备(off-the-shelfinstruments)满足细胞在三维体系中快速种植、自由生长、长期增殖、易于传代、实时监测等基本培养要求；3、本发明提出的透明海绵支架概念填补了材料性能领域的空白。本发明提供的制备透明海绵支架的方法有效地改善了传统三维支架光学性能差的问题，可满足生物学、药学、医学等领域对三维微环境进行实时无标记成像研究的要求，极大地降低了对研究手段、方法、设备等方面的要求；4、本发明提出的液体薄层装载方法，无需特别的专业技术和手段以及昂贵的设备就可以实现三维细胞微环境的高通量同步构建，大大降低了操作过程中对于人员技能、环境空间等各方面的使用要求，具有广泛的应用前景，且简易的操作步骤降低了对活细胞的损伤；5、本发明方法可与各种现有研究技术(如三维微加工技术、细胞动态种植技术、自动化操作系统等)结合使用，以实现图案化(patterning)、微观结构(microstructure)可控性，实时监测(monitoring)等目的，来满足不同研究领域、不同研究目的的多重需求；6、本发明最终可应用于开发各种三维细胞应用产品，为三维细胞微环境研究提供现成的(off-the-shelf)平台，以实现三维细胞产品在传统生物学、药学和医学领域的无障碍广泛应用。

此发明方法对于熟悉传统两维细胞培养、研究的人员来说操作简单，无需其他的专业技术和手段(如微加工技术和特殊合成材料)以及昂贵的设备(如自动化、微加工设备)。最终以实现在传统生物学、药学和医学领域的无障碍广泛应用。

Claims (25)

1.用于构建三维微环境的海绵支架，其特征在于：所述海绵支架为透明的海绵支架，所述透明的海绵支架为透明度达到50％以上的所述海绵支架；

所述海绵支架用生物材料制成，具有若干小孔；所述小孔的孔径为1nm-999μm，孔间距为1μm-999μm，所述小孔在所述海绵支架上所形成的孔隙率为70％-99.9％；所述海绵支架的体积为0.1μm³-1000cm³；

所述生物材料为可交联的人工合成的生物材料和/或可交联的天然生物材料；所述人工合成的生物材料为下述至少一种：聚乙二醇、聚乙二醇二丙烯酸酯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚乳酸、聚乳酸醇酸共聚物、聚二甲基硅氧烷、聚酸酐、聚酰胺、聚氨基酸、聚缩醛、聚氰基丙烯酸酯、聚氨基甲酸酯、聚吡咯、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯、聚碳酸酯和聚氧化乙烯；所述天然生物材料为下述至少一种：明胶、藻酸盐、琼脂、胶原、蛋白多糖、层连接蛋白和纤维连接蛋白。

2.根据权利要求1所述的海绵支架，其特征在于：在制备所述透明的海绵支架的过程中，使用透明剂和微加工。

3.根据权利要求2所述的海绵支架，其特征在于：通过所述微加工实现所述海绵支架的图案化。

4.根据权利要求3所述的海绵支架，其特征在于：所述微加工为通过光掩膜的透光部分的图形实现所述海绵支架的图案化。

5.根据权利要求2所述的海绵支架，其特征在于：所述透明的海绵支架按照包括如下步骤的方法制备：

b1)将聚合物单体聚乙二醇二丙烯酸酯和光引发剂2-羟基-4-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮溶解在所述透明剂与水的混合溶液中，得到可光交联的预聚物溶液A；

b2)利用紫外光源照射步骤b1)获得的可光交联的预聚物溶液A，使所述可光交联的预聚物溶液A发生交联反应，得到水凝胶；

b3)将步骤b2)获得的所述水凝胶浸于超纯水中除去未交联的所述聚合物单体聚乙二醇二丙烯酸酯、所述透明剂和杂质。

6.根据权利要求5所述的海绵支架，其特征在于：所述聚合物单体聚乙二醇二丙烯酸酯在所述可光交联的预聚物溶液A中的含量为每100ml所述可光交联的预聚物溶液A中含有1-50g所述聚合物单体聚乙二醇二丙烯酸酯；

所述光引发剂2-羟基-4-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮在所述可光交联的预聚物溶液A中的含量为每100ml所述可光交联的预聚物溶液A中含有0.1-10g所述2-羟基-4-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮。

7.根据权利要求5所述的海绵支架，其特征在于：所述透明剂在所述透明剂与水的混合溶液中的体积百分含量大于等于30％，同时小于100％。

8.根据权利要求5所述的海绵支架，其特征在于：所述透明剂为1,2,4-丁三醇、乙二醇，1,3-丁二醇，丙三醇，1,2-丙二醇，1,3-丙二醇，季戊四醇，顺-1,2-环戊二醇，丁四醇和戊五醇中的至少一种。

9.根据权利要求6所述的海绵支架，其特征在于：所述聚合物单体聚乙二醇二丙烯酸酯在所述可光交联的预聚物溶液A中的含量为每100ml所述可光交联的预聚物溶液A中含有10g所述聚合物单体聚乙二醇二丙烯酸酯；

所述光引发剂2-羟基-4-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮在所述可光交联的预聚物溶液A中的含量为每100ml所述可光交联的预聚物溶液A中含有0.5g所述2-羟基-4-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮；

所述透明剂为1,2,4-丁三醇，所述1,2,4-丁三醇在所述透明剂与水的混合溶液中的体积百分含量为60％。

10.根据权利要求2所述的海绵支架，其特征在于：所述透明的海绵支架按照包括如下步骤的方法制备：

c1)将聚合物单体聚乙二醇二丙烯酸酯溶解在所述透明剂与水的混合溶液中，再加入过硫酸铵和N,N,N',N'-四甲基二乙胺，得到预聚物溶液B；

c2)在步骤c1)得到预聚物溶液B后，将其加到制备海绵支架的模具中，使所述预聚物溶液B发生化学交联反应，得到水凝胶；

c3)将步骤c2)获得的所述水凝胶浸于超纯水中除去未交联的所述聚合物单体聚乙二醇二丙烯酸酯、所述透明剂和杂质。

11.根据权利要求10所述的海绵支架，其特征在于：所述聚合物单体聚乙二醇二丙烯酸酯在所述预聚物溶液B中的含量为每100ml所述预聚物溶液B中含有1-50g所述聚合物单体聚乙二醇二丙烯酸酯；

所述过硫酸铵在所述预聚物溶液B中的含量为每100ml所述预聚物溶液B中含有0.01-1g所述过硫酸铵；

所述N,N,N',N'-四甲基二乙胺在所述预聚物溶液B中的含量为每100ml所述预聚物溶液B中含有0.01-1g所述N,N,N',N'-四甲基二乙胺。

12.根据权利要求10所述的海绵支架，其特征在于：所述透明剂在所述透明剂与水的混合溶液中的体积百分含量大于等于30％，同时小于100％。

13.根据权利要求10所述的海绵支架，其特征在于：所述透明剂为1,2,4-丁三醇、乙二醇，1,3-丁二醇，丙三醇，1,2-丙二醇，1,3-丙二醇，季戊四醇，顺-1,2-环戊二醇，丁四醇和戊五醇中的至少一种。

14.根据权利要求11所述的海绵支架，其特征在于：所述聚合物单体聚乙二醇二丙烯酸酯在所述预聚物溶液B中的含量为每100ml所述预聚物溶液B中含有10g所述聚合物单体聚乙二醇二丙烯酸酯；

所述过硫酸铵在所述预聚物溶液B中的含量为每100ml所述预聚物溶液B中含有0.05g所述过硫酸铵；

所述N,N,N',N'-四甲基二乙胺在所述预聚物溶液B中的含量为每100ml所述预聚物溶液B中含有0.5g所述N,N,N',N'-四甲基二乙胺；

所述透明剂具体为1,2,4-丁三醇，所述1,2,4-丁三醇在所述透明剂与水的混合溶液中的体积百分含量为60％。

15.根据权利要求5或10所述的海绵支架，其特征在于：在除去未交联的所述聚合物单体聚乙二醇二丙烯酸酯、所述透明剂和杂质后，还包括如下步骤：将所述水凝胶在-200℃～0℃条件下冷冻1-72h，再干燥1-72小时，得到所述海绵支架。

16.根据权利要求15所述的海绵支架，其特征在于：在除去未交联的所述聚合物单体聚乙二醇二丙烯酸酯、所述透明剂和杂质后，还包括如下步骤：将所述水凝胶在-20℃条件下冷冻4-5h，再在-50℃，20pa条件下，干燥12小时，得到所述海绵支架。

17.根据权利要求10所述的海绵支架，其特征在于：所述制备海绵支架的模具用生物材料制成，所述生物材料为人工合成的生物材料和/或可交联天然生物材料；所述人工合成的生物材料为下述至少一种：聚甲基丙烯酸酯、聚乙二醇、聚丙烯、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚乳酸、聚乳酸醇酸共聚物、聚二甲基硅氧烷、聚酸酐、聚酰胺、聚氨基酸、聚缩醛、聚氰基丙烯酸酯、聚氨基甲酸酯、聚吡咯、聚乙烯、聚碳酸酯和聚氧化乙烯；所述天然生物材料为下述至少一种：明胶、藻酸盐、琼脂、胶原、蛋白多糖、层连接蛋白和纤维连接蛋白。

18.根据权利要求1所述的海绵支架，其特征在于：所述三维微环境为包括下述a)-d)中任一所述的三维微环境：

a)小分子化合物、药物、核酸、蛋白中的任一种或任几种的混合物；

b)细胞外基质成分；

c)真核细胞、原核细胞、病毒中的任一种或任几种的混合物；

d)a)-c)中任几种的混合物。

19.用于构建三维微环境的装置，包括下述A1)和A2)的两个器件：A1)权利要求1-17中任一所述的海绵支架或由两个以上所述海绵支架组成的海绵支架阵列；A2)用于装载样品液的基底A；

所述装载样品液的基底A为亲水性基底或疏水性基底；所述基底的亲水性或疏水性使样品液在所述基底的表面形成液体薄层；所述液体薄层的厚度为1μm-200μm。

20.根据权利要求19所述的装置，其特征在于：所述海绵支架阵列由3个以上的所述海绵支架组成，形成高通量的海绵支架阵列。

21.根据权利要求19所述的装置，其特征在于：所述装置还包括镶嵌在所述基底A上的边框；

所述边框用生物材料制成，所述生物材料为人工合成的生物材料和/或天然生物材料；所述人工合成的生物材料为下述至少一种：聚乙二醇、聚丙烯、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚乳酸、聚乳酸醇酸共聚物、聚二甲基硅氧烷、聚酸酐、聚酰胺、聚氨基酸、聚缩醛、聚氰基丙烯酸酯、聚氨基甲酸酯、聚吡咯、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯、聚碳酸酯和聚氧化乙烯；所述天然生物材料为下述至少一种：明胶、藻酸盐、琼脂、胶原、蛋白多糖、层连接蛋白和纤维连接蛋白。

22.根据权利要求19所述的装置，其特征在于：所述装置还包括支撑所述海绵支架或所述海绵支架阵列的另一基底B。

23.权利要求1-18中任一所述的海绵支架或权利要求19-22中任一所述的装置在构建三维微环境中的应用。

24.构建三维微环境的方法，其特征在于：所述方法为用权利要求19所述装置构建三维微环境，包括如下步骤：

a1)将样品液置于权利要求19所述装置的基底A上，形成液体薄层；

a2)将步骤a1)中形成所述液体薄层的所述基底A覆盖在权利要求19所述装置的海绵支架或海绵支架阵列上，或者将权利要求19所述海绵支架或所述海绵支架阵列覆盖在步骤a1)中形成所述液体薄层的所述基底A上，待所述样品液分散进入到所述海绵支架或所述海绵支架阵列后，实现所述样品液的三维尺度装载，完成所述三维微环境的构建；

所述液体薄层的厚度为1μm-200μm。

25.根据权利要求24所述的方法，其特征在于：所述样品液包括下述a)-d)中任一所述的物质：

a)小分子化合物、药物、核酸、蛋白中的任一种或任几种的混合物；

b)细胞外基质成分；

c)真核细胞、原核细胞、病毒中的任一种或任几种的混合物；

d)a)-c)中任几种的混合物。