CN110628757B - 一种基于超声体波在毛细管中三维细胞培养的方法 - Google Patents

一种基于超声体波在毛细管中三维细胞培养的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN110628757B
CN110628757B CN201910934669.0A CN201910934669A CN110628757B CN 110628757 B CN110628757 B CN 110628757B CN 201910934669 A CN201910934669 A CN 201910934669A CN 110628757 B CN110628757 B CN 110628757B
Authority
CN
China
Prior art keywords
capillary
cell
culture
blue light
ultrasonic
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201910934669.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110628757A (zh
Inventor
许太林
罗勇
张学记
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of Science and Technology Beijing USTB
Original Assignee
University of Science and Technology Beijing USTB
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of Science and Technology Beijing USTB filed Critical University of Science and Technology Beijing USTB
Priority to CN201910934669.0A priority Critical patent/CN110628757B/zh
Publication of CN110628757A publication Critical patent/CN110628757A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110628757B publication Critical patent/CN110628757B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N13/00—Treatment of microorganisms or enzymes with electrical or wave energy, e.g. magnetism, sonic waves
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0062—General methods for three-dimensional culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0693—Tumour cells; Cancer cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2513/00—3D culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/50—Proteins
    • C12N2533/54—Collagen; Gelatin

Abstract

本发明提供一种基于超声体波在毛细管中三维细胞培养的方法，属于细胞三维培养技术领域。该方法使用市售的毛细管作为细胞培养的载体，将待培养的细胞悬液、甲基丙烯酸酐化水凝胶(GelMA)溶液和LAP蓝光引发剂混合溶液注入毛细管中，通过超声波使细胞聚集为特定的细胞团块，辅以短暂的405nm波段的蓝光激发固化并置于培养箱中进行细胞团块的进一步培养。本发明的方法能够实现在毛细管内对细胞团块的三维模型建立和培养，可以利用超声波对细胞团块的大小间距等进行合理操控，在许多复杂的细胞组织培养、细胞分化及器官成型等领域有巨大应用前景。

Description

一种基于超声体波在毛细管中三维细胞培养的方法
技术领域
本发明涉及细胞三维培养技术领域，特别是指一种基于超声体波在毛细管中三维细胞培养的方法。
背景技术
目前的细胞组织工程领域主要致力于开发一些支架材料并期望依赖细胞的自组装来构建一些功能性组织，从而实现对细胞通信等领域的研究，现在较广泛的三维细胞组织培养主要是将细胞接种在支架材料并让细胞自身沿着支架附着和增殖，但是这些方法都缺乏一些主动操控细胞形成组织形状的策略，在细胞组织培养等领域的可控性有限。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种基于超声体波在毛细管中三维细胞培养的方法，该方法可以利用超声波对细胞团块的大小间距等进行主动操控，在许多复杂的细胞组织培养、细胞分化及器官成型等领域有巨大应用前景。
该方法使用毛细管作为细胞培养的载体，将待培养的细胞悬液、甲基丙烯酸酐化水凝胶溶液和LAP蓝光引发剂混合溶液注入毛细管中，通过超声装置使毛细管中的细胞聚集为特定的细胞团块，辅以短暂的405nm波段的蓝光激发将细胞固定后置于培养箱中进行培养。
该方法具体步骤如下：
(1)制得细胞悬液以及甲基丙烯酸酐化水凝胶溶液和LAP蓝光引发剂混合溶液；
(2)利用毛细作用将步骤(1)中的细胞悬液和混合溶液注入到毛细管中；
(3)将步骤(2)中的毛细管置于搭建的超声驱动装置中，调节超声频率在200kHz～3000kHz范围内，毛细管中的细胞在超声驱动装置的作用下，形成特定的细胞团块；
(4)将步骤(3)中的毛细管置于405nm波段的蓝光激发下使细胞团块固定，然后放置在培养箱中进行培养。
其中，步骤(1)中细胞悬液中细胞的浓度为1*105个/ml～1*107个/ml。
步骤(1)中制备的甲基丙烯酸酐化水凝胶溶液和LAP蓝光引发剂混合溶液浓度在5％～30％(w/v)范围内，甲基丙烯酸酐化水凝胶溶液与LAP蓝光引发剂的质量配比为20：1，细胞悬液与甲基丙烯酸酐化水凝胶溶液和LAP蓝光引发剂的混合溶液的体积比为1：1～3：1。
步骤(2)中毛细管内径为0.05mm～1.0mm。
步骤(3)中的超声驱动装置包括波形发生器、信号放大器和一对声能转换器；一对声能转换器与波形发生器和信号放大器依次连接；一对声能转换器置于毛细管的两端。
声能转换器为超声压电陶瓷或者叉指换能器中的一种。
叉指换能器是在FTO玻璃衬底上通过电磁溅射沉积一层氧化锌层，在氧化锌层上通过化学气相沉积一层铝膜，在沉积铝膜层时用Kapton胶带将氧化锌层中心部分掩盖，通过传统的光刻法和剥离技术在铝膜的四边布线形成叉指换能器。
该方法可以由多根毛细管形成毛细管阵列，实现高通量式的三维细胞培养。
上述的甲基丙烯酸酐化水凝胶溶液和LAP蓝光引发剂用于光固化交联成形，也可用其他的光固化型水凝胶如聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)水凝胶代替。
本发明的上述技术方案的有益效果如下：
(1)本发明所用市面上售卖的毛细管作为细胞培养载体，价格低廉。
(2)本发明可以利用超声驱动装置调节超声波频率，从而改变细胞团块的聚集大小和间距等，能够更加适应未来在复杂的细胞组织培养、细胞分化及器官成型等领域的要求。
(3)本发明的方法所需要的实验材料和处理方法较为简单，在市场上有极大优势。
附图说明
图1为本发明的基于超声体波在毛细管中三维细胞培养的方法示意图；
图2为本发明实施例中超声开闭时细胞在毛细管中分散、聚集以及调整频率的对比示意图，其中(a)为超声关闭状态，(b)为超声打开状态，(c)为改变频率状态；
图3为本发明实施例1中200～300kHz频率下的细胞聚集显微镜图片；
图4为本发明实施例2中500～600kHz频率下的细胞聚集显微镜图片；
图5为本发明实施例3中900～1000kHz频率下的细胞聚集显微镜图片；
图6为本发明实施例4中1900～2500kHz频率下的细胞聚集显微镜图片。
具体实施方式
为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施例进行详细描述。
本发明提供一种基于超声体波在毛细管中三维细胞培养的方法。
该方法具体步骤为：
(1)制得细胞悬液、甲基丙烯酸酐化水凝胶溶液和LAP蓝光引发剂混合溶液；
(2)利用毛细作用将步骤(1)中的细胞悬液、混合溶液注入到毛细管中；
(3)将步骤(2)中的毛细管置于搭建的超声驱动装置中，调节超声频率在200kHz～3000kHz范围内，毛细管中的细胞在超声驱动装置的作用下，形成特定的细胞团块；
(4)将步骤(3)中的毛细管置于405nm波段的蓝光激发下使细胞团块固定，然后放置在培养箱中进行培养。
最终如图1所示。
下面结合具体实施例予以说明。
实施例1
本实施例涉及一种基于超声体波在毛细管中三维细胞培养的方法的具体应用，所述具体方法如下：
步骤1，所需细胞悬液、甲基丙烯酸酐化水凝胶溶液和LAP蓝光引发剂混合溶液的配置：
首先将培养在培养皿中的MCF-7细胞制成细胞悬浮液，其具体步骤如下：吸取培养皿中的培养基，用磷酸盐缓冲液(PBS)淋洗两次，而后加入0.5～1.5ml胰酶并置于培养箱中消化2～4分钟，之后用离心机离心(1000rpm，3min)并吸去上清液，之后加入1mL培养基制得细胞悬液。
之后制得甲基丙烯酸酐化水凝胶溶液和LAP蓝光引发剂混合溶液，甲基丙烯酸酐化水凝胶溶液由甲基丙烯酸酐(MA)与明胶(Gelatin)制备获得，配制溶液浓度在5％-30％(w/v)范围内，水凝胶溶液与LAP蓝光引发剂混合溶液的质量配比为20：1。
步骤2，所需装置的搭建：
所需装置包括一个超声驱动装置以及由3D打印方法制得的固定模型组成，超声驱动装置包括波形发生器，信号放大器和一对声能转换器；所述声能转换器可以为一对超声压电陶瓷或者一对叉指换能器；所述的一对声能转换器与波形发生器和信号放大器依次连接；所述的一对声能转换器分别置于毛细管的两端并预先放在3D打印的模型中固定。
步骤3，细胞团块的聚集和培养：
将制得的细胞悬液、甲基丙烯酸酐化水凝胶溶液和LAP蓝光引发剂混合溶液利用毛细作用注入到毛细管中，再将毛细管置于固定模型装置中，将超声驱动装置的频率调整为200～300kHz，电压调至600～1000mV，毛细管中的细胞在超声驱动装置装置产生的超声驻波作用下，形成特定的细胞团块，然后用405nm波段的蓝光激发1～5秒使细胞团块固化，最后取出毛细管放置在培养箱中进行培养。
所述毛细管内径为0.05mm～1.0mm。
本实施例采用上述步骤在毛细管中进行细胞的三维细胞培养，如图1、图2和图3所示。
本实施例的基于超声体波在毛细管中三维细胞培养的方法具有成本低廉、方法简便、可操控性强等优势，可以利用超声波改变细胞团块的聚集大小和间距等，为以后的复杂细胞组织的培养、细胞分化及器官成型等领域提供了一种可行的方案。
实施例2
本实施例与实施例1的一种基于超声体波在毛细管中三维细胞培养的方法的具体应用基本相同，唯不同的是：
所述超声驱动装置的频率调整为500～600kHz，电压调至300～900mV。
本实施例的细胞团块聚集显微图片如图4所示。
实施例3
本实施例与实施例1的一种基于超声体波在毛细管中三维细胞培养的方法的具体应用基本相同，唯不同的是：
所述超声驱动装置的频率调整为900～1000kHz，电压调至300～600mV。
本实施例的细胞团块聚集显微图片如图5所示。
实施例4
本实施例与实施例1的一种基于超声体波在毛细管中三维细胞培养的方法的具体应用基本相同，唯不同的是：
所述超声驱动装置的频率调整为1900～2500kHz，电压调至200～400mV。
本实施例的细胞团块聚集显微图片如图6所示。
实施例5
本实施例与实施例1的基于超声聚集的毛细管分析检测装置的检测方法基本相同，唯不同的是：
所述声能转换器用一对叉指换能器代替这对超声压电陶瓷。
所述步骤2中信号发生器和信号放大器通过导线依次连接并与这对叉指换能器(IDT)相连。
所述叉指换能器(IDT)用下列方法制得：
在FTO玻璃衬底上通过电磁溅射沉积一层氧化锌层，在氧化锌层上通过化学气相沉积一层铝膜，在沉积铝膜层时用Kapton胶带将氧化锌层中心部分掩盖。通过传统的光刻法和剥离技术在铝膜的四边布线形成叉指换能器(IDT)。
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种基于超声体波在毛细管中三维细胞培养的方法，其特征在于：使用毛细管作为细胞培养的载体，将待培养的细胞悬液、甲基丙烯酸酐化水凝胶溶液和LAP蓝光引发剂混合溶液注入毛细管中，通过超声装置使毛细管中的细胞聚集为特定的细胞团块，辅以短暂的405nm波段的蓝光激发将细胞固定后置于培养箱中进行培养；
具体步骤如下：
(1)制得细胞悬液以及甲基丙烯酸酐化水凝胶溶液和LAP蓝光引发剂的混合溶液；
(2)利用毛细作用将步骤(1)中的细胞悬液和混合溶液注入到毛细管中；
(3)将步骤(2)中的毛细管置于搭建的超声驱动装置中，调节超声频率在200kHz～3000kHz范围内，毛细管中的细胞在超声驱动装置的作用下，形成细胞团块；
(4)将步骤(3)中的毛细管置于405nm波段的蓝光激发下使细胞团块固定，然后放置在培养箱中进行培养；
所述步骤(1)中细胞悬液中细胞的浓度为1*105个/ml～1*107个/ml；
由多根毛细管形成毛细管阵列，实现高通量式的三维细胞培养；
所述步骤(3)中的超声驱动装置包括波形发生器、信号放大器和一对声能转换器；一对声能转换器与波形发生器和信号放大器依次连接；一对声能转换器置于毛细管的两端。
2.根据权利要求1所述的基于超声体波在毛细管中三维细胞培养的方法，其特征在于：所述步骤(1)中制备的甲基丙烯酸酐化水凝胶溶液和LAP蓝光引发剂混合溶液浓度为5％～30％，w/v，甲基丙烯酸酐化水凝胶溶液与LAP蓝光引发剂的质量配比为20：1，细胞悬液与甲基丙烯酸酐化水凝胶溶液和LAP蓝光引发剂混合溶液的体积比为1：1～3：1。
3.根据权利要求1所述的基于超声体波在毛细管中三维细胞培养的方法，其特征在于：所述步骤(2)中毛细管内径为0.05mm～1.0mm。
4.根据权利要求1所述的基于超声体波在毛细管中三维细胞培养的方法，其特征在于：所述声能转换器为超声压电陶瓷或者叉指换能器中的一种。
5.根据权利要求4所述的基于超声体波在毛细管中三维细胞培养的方法，其特征在于：所述叉指换能器是在FTO玻璃衬底上通过电磁溅射沉积一层氧化锌层，在氧化锌层上通过化学气相沉积一层铝膜，在沉积铝膜层时用Kapton胶带将氧化锌层中心部分掩盖，通过传统的光刻法和剥离技术在铝膜的四边布线形成叉指换能器。
CN201910934669.0A 2019-09-29 2019-09-29 一种基于超声体波在毛细管中三维细胞培养的方法 Active CN110628757B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910934669.0A CN110628757B (zh) 2019-09-29 2019-09-29 一种基于超声体波在毛细管中三维细胞培养的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910934669.0A CN110628757B (zh) 2019-09-29 2019-09-29 一种基于超声体波在毛细管中三维细胞培养的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110628757A CN110628757A (zh) 2019-12-31
CN110628757B true CN110628757B (zh) 2022-03-04

Family

ID=68974761

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910934669.0A Active CN110628757B (zh) 2019-09-29 2019-09-29 一种基于超声体波在毛细管中三维细胞培养的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110628757B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112574877B (zh) * 2020-12-02 2023-03-24 武汉大学 基于医用b超机的细胞组装方法及其装置
CN113214991B (zh) * 2021-05-28 2022-12-09 西安交通大学 一种模拟细胞力学微环境的细胞培养装置

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109813692A (zh) * 2019-01-02 2019-05-28 北京科技大学 一种基于超声聚集的毛细管分析检测方法
CN109966557A (zh) * 2018-12-05 2019-07-05 博志生物科技有限公司 局部缓释Abaloparatide或相关多肽的GelMA水凝胶的制备方法及应用

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7108137B2 (en) * 2002-10-02 2006-09-19 Wisconsin Alumni Research Foundation Method and apparatus for separating particles by size
CN103131625B (zh) * 2011-11-23 2015-08-05 清华大学 用于构建三维微环境的方法及装置
CN106725999B (zh) * 2017-01-12 2018-06-29 吉林大学 高精度超声防堵多细胞生物增材制造方法及装置
CN108653810B (zh) * 2018-05-28 2021-11-30 重庆科技学院 一种可实现细胞包裹的丝素蛋白/明胶互穿网络水凝胶及其制备方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109966557A (zh) * 2018-12-05 2019-07-05 博志生物科技有限公司 局部缓释Abaloparatide或相关多肽的GelMA水凝胶的制备方法及应用
CN109813692A (zh) * 2019-01-02 2019-05-28 北京科技大学 一种基于超声聚集的毛细管分析检测方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
《Investigation of enhancement of two processes, sedimentation and conjugation, when bacteria are concentrated in ultrasonic standing waves》;Cousins, CM等;《BIOSEPARATION》;20011231;第9卷(第6期);参见对比文件1摘要、第344页左栏第3-4段、第346页右栏第1段、图3及其注释、第348页左栏最后一段-右栏第1段 *
《The Application of Ultrasound in 3D Bio-Printing》;Zhou, Yufeng;《MOLECULES》;20160531;第21卷(第5期);参见对比文件2摘要 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN110628757A (zh) 2019-12-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110628757B (zh) 一种基于超声体波在毛细管中三维细胞培养的方法
CN104195028B (zh) 用于对特异性细胞进行筛选的微流控芯片及细胞筛选方法
JP4217618B2 (ja) 細胞融合のためのノンリニアーな振幅の誘電泳動用波形
JP2930181B2 (ja) 神経細胞活動測定用２次元センサ及びこれを用いた測定装置
Ozeri et al. Simultaneous backward data transmission and power harvesting in an ultrasonic transcutaneous energy transfer link employing acoustically dependent electric impedance modulation
CN107645694B (zh) 一种用于驱鸟的定向声波发射装置及方法
He et al. MEMS-based ultrasonic transducer as the receiver for wireless power supply of the implantable microdevices
WO2005075656A8 (en) Biochip electroporator and its use in multi-site, single-cell electroporation
Zhao et al. On-chip rapid drug screening of leukemia cells by acoustic streaming
WO2023019431A1 (zh) 一种刺激细胞外泌体分泌的设备、方法及得到的外泌体和其应用
CN106989702A (zh) 脉冲激发式电磁超声检测仪
CN1995361A (zh) 利用介电电泳辅助细胞定位借以提高电穿孔效率的方法
JPH0383999A (ja) 蛋白質配向膜の作成方法、該蛋白質配向膜からなる人工的構造体及びその用途
Yeh et al. Electric field and vibration-assisted nanomolecule desorption and anti-biofouling for biosensor applications
CN110234056A (zh) 换能器及其制备方法、换能装置
TW200918667A (en) Method for biomolecule immobilization
CN110398528B (zh) 一种基于液栅型igzo薄膜晶体管的抗结核类药物筛选装置及方法
CN113418971B (zh) 一种基于微纳超声机器人的电化学传感器
CN100444510C (zh) 磁控微型游动机器人的双谐振频率驱动方法
CN115656520A (zh) 一种柔性铁酸钴薄膜生物传感器及其制备方法
CN206597064U (zh) 一种具有超声能场辅助的三维微结构快速成形装置
CN110933577B (zh) 一种负声压光声换能器装置及其制备方法
CN108339729A (zh) 基于石墨烯掺杂的无铅压电复合薄膜超声换能器的制备方法
CN111510819A (zh) 一种超声波扬声器系统及其工作方法
CN114308151B (zh) 一种用于细胞融合的声微流控系统及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant