JP2930181B2 - 神経細胞活動測定用２次元センサ及びこれを用いた測定装置 - Google Patents

神経細胞活動測定用２次元センサ及びこれを用いた測定装置

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JP2930181B2 JP7153343A JP15334395A JP2930181B2 JP 2930181 B2 JP2930181 B2 JP 2930181B2 JP 7153343 A JP7153343 A JP 7153343A JP 15334395 A JP15334395 A JP 15334395A JP 2930181 B2 JP2930181 B2 JP 2930181B2
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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、神経細胞等の活動に伴
う電位変化を検出することにより、細胞活動を測定する
ための２次元センサと、これを用いた測定装置に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】近年、神経細胞の医学的検討や電気素子
としての応用の可能性の検討などが活発に行われてきて
いる。神経細胞が活動する際には活動電位が発生する。
この活動電位は、神経細胞のイオン透過性の変化に伴っ
て細胞膜内外のイオン濃度が変化し、これに伴って細胞
膜電位が変化することによって生じるものである。そこ
で、試料細胞又は組織の活動状態を観察するに際して、
上記の細胞膜電位の２次元分布を測定することにより活
動部位の特定や活動の程度を観察することができる。
【０００３】このような細胞電位の測定において、いわ
ゆるガラスや刺激を与える電極を細胞に挿入することな
く測定し、しかも、平面上の複数箇所を同時に測定する
ことを可能にする２次元センサとして、本出願人によっ
て先に出願された一体化複合電極がある（特開平６−７
８８８９号公報、特開平６−２９６５９５号公報参
照）。この一体化複合電極は、ガラス基板上に導電性物
質を用いてマトリックス状に配列された複数の微小電極
とその引出しパターンを形成し、この上での細胞培養を
可能にしたものである。これによって、ガラス電極等を
用いる場合に比べて狭い間隔の複数箇所において同時に
電位変化を測定することができ、しかも細胞・組織を培
養しながら長時間にわたって観測することができるよう
になった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】しかし、上記のような
従来の一体化複合電極は、測定電極の位置や大きさが固
定であるので汎用性に欠け、種々の細胞や組織の活動測
定に兼用することが難しかった。実際、測定対象の細胞
に合わせて測定電極の間隔や大きさを実験によって最適
化し、ほぼ専用の一体化複合電極を作成していた。
【０００５】そこで、本発明は、上記従来の一体化複合
電極を改良し、測定電極の位置等を可変とすることによ
り、汎用性に富む細胞活動測定用２次元センサ及びこれ
を用いた測定装置を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明による細胞活動測
定用２次元センサの特徴は、Ｓｉ、ＳｉＯ2、及びＳｉ3
Ｎ4の３層からなるセンサ基板のＳｉ側の裏面に作用電
極用薄膜が蒸着され、Ｓｉ3Ｎ4側の表面に試料である細
胞、培養液、及び参照電極を入れる囲いが設けられ、そ
の囲い内に置かれた細胞の活動によって発生する電位変
化の平面分布のうち、光が照射された部分の電位変化に
主として対応する信号が前記作用電極から取り出される
点にある。
【０００７】また、上記の２次元センサを用いた本発明
による細胞活動測定装置の特徴は、前記２次元センサの
裏面にレーザビームを照射するレーザ光源と、前記２次
元センサの裏面側の作用電極と表面側の囲い内に入れら
れた参照電極との間に直流バイアス電圧を印加する直流
電源と、前記両電極間に得られる信号を処理する処理手
段とを備えている点にある。好ましい具体構成について
は後述する。
【０００８】
【作用】本発明による細胞活動測定用２次元センサは、
米国モレキュラーデバイス社が開発したＬＡＰＳ（Ligh
t-Addressable Ptentiometric sensor，米国特許第4,75
8,786号、第4,963,815号等参照）の原理を細胞電位の測
定に応用したものである。このＬＡＰＳは、図５に示す
ように、半導体シリコン基板１０１の上に酸化膜１０２
及び窒化膜１０３を形成したものであり、例えば、その
上に接触させた溶液（電解液）１０４のｐＨを測定する
センサーとして用いられる。その測定原理について簡単
に触れておく。
【０００９】電解液(Electrolyte)、絶縁膜(Insulato
r)、及び半導体(Semiconductor)からなるＥＩＳ構造に
ポテンショスタット１０５によってバイアス電圧を印加
し、ＥＩＳ構造の裏面からある周波数で変調した光を照
射すると、図６に示すような光交流電流が流れる。この
とき、バイアス電圧Ｖと光交流電流Ｉとの関係を示すＩ
−Ｖ曲線が溶液のｐＨに応じて図に示すように横軸（バ
イアス電圧）方向にシフトする。したがって、所定のバ
イアス電圧を印加している状態で光交流電流Ｉを検出す
ることにより電解液のｐＨを測定することができる。Ｉ
−Ｖ曲線が溶液のｐＨに応じてシフトする理由は次のよ
うに考えられている。
【００１０】ＥＩＳ構造に電圧が印加されると、半導体
と絶縁膜との界面でエネルギーバンドの曲りが生ずる
が、この曲りは、絶縁膜に接している溶液のｐＨにも依
存する。つまり、絶縁膜の表面にはシラノール基（Si-O
H)とアミノ基(Si-NH2)が形成されているが、これらの官
能基がプロトン(H+)と選択的に結合して、溶液中に存在
するプロトンと結合したプロトンとの平衡状態が維持さ
れている。したがって、溶液のｐＨが変われば絶縁膜上
の電荷が変わり、それによってエネルギーバンドの曲り
が変化する。その結果、半導体と絶縁膜との界面の空乏
層の幅、従って空乏層容量が変化するので、流れる光交
流電流も変化するのである。このＬＡＰＳは、光を照射
することにより電気伝導度が高くなる半導体の光伝導現
象をも利用している。
【００１１】本発明による細胞活動測定用２次元センサ
も、上記ＬＡＰＳと同様に、Ｓｉ、ＳｉＯ2、及びＳｉ3
Ｎ4の３層からなるセンサ基板を備え、Ｓｉ側の裏面に
作用電極用薄膜が蒸着されている。しかし、Ｓｉ3Ｎ4側
の表面に試料である細胞、培養液、及び参照電極を入れ
る囲いが設けられ、その囲い内に置かれた細胞の活動に
よって発生する電位変化の平面分布を直接測定する。つ
まり、ＬＡＰＳを用いたｐＨセンサーのように、絶縁膜
表面に形成されたシラノール基及びアミノ基とプロトン
との結合によって絶縁膜表面に電位が発生するのではな
く、絶縁膜表面に接する細胞の活動によって直接的に絶
縁膜表面に電位が発生し、これによって半導体と絶縁膜
との界面の空乏層の幅、従って静電容量が変化する。そ
して、光が照射された部分の電気伝導度が高くなること
により、主としてその部分の電位変化に主として対応す
る信号を作用電極から取り出すことができるのである。
【００１２】従って、このような２次元センサを用いた
細胞活動測定装置の構成として、２次元センサの裏面に
光ビームを照射する光源と、２次元センサの裏面側の作
用電極と表面側の囲い内に入れられた参照電極との間に
直流バイアス電圧を印加する電源と、両電極間に得られ
る信号を処理する処理手段とが必要である。光源として
レーザ光源を用いれば、照射スポットの位置決めが正確
であり、スポット径を絞ることができる点で有利であ
る。また、センサ表面の囲い内に置かれた細胞の培養環
境を維持する培養維持手段を備えることにより、長時間
にわたる測定が可能になる。
【００１３】信号処理のための具体構成として、レーザ
光源を高周波駆動して高周波変調光を照射させる光源駆
動手段が設けられ、上記処理手段が作用電極と参照電極
との間に流れる光交流電流の振幅の変化を検出するもの
であることが好ましい。つまり、前述のように、絶縁膜
表面に接する細胞の活動によって生ずる電位変化による
半導体と絶縁膜との界面の空乏層の幅（容量）の変化を
光交流電流の振幅の変化として検出するのである。
【００１４】また、レーザ光源から照射されるレーザビ
ームを２次元センサの裏面の所定範囲内で（高速に）走
査する手段が備えられていることが好ましく、これによ
って、所定範囲内の複数箇所の細胞活動をほぼ同時に測
定することができる。１本のレーザビームを走査させる
代わりに、２次元センサの裏面に対してほぼ垂直にレー
ザ光を照射する複数のレーザ素子を２次元マトリックス
状に配列したレーザアレイを備え、これらの複数のレー
ザ素子を時分割で駆動させれば、一層高速の走査が可能
になる。あるいは、レーザビームを走査させる代わり
に、２次元センサの水平方向における位置を制御するＸ
Ｙステージを備え、これを制御することによって２次元
センサのレーザ光を照射させる位置を変えるようにして
もよい。
【００１５】
【実施例】以下、図面を参照しながら本発明の実施例を
説明する。
【００１６】図１に本発明による細胞活動測定装置の一
実施例の構成を示す。細胞活動測定用２次元センサ１の
上にサンプルである細胞２及び培養液をセットしたもの
が、インキュベータ部３に収納されている。
【００１７】２次元センサ１は、図２に断面図（ａ）及
び平面図（ｂ）を示すように、Ｓｉ，ＳｉＯ2，及びＳ
ｉ3Ｎ4の３層からなるセンサ基板のＳｉ側の裏面に作用
電極用の金アンチモン薄膜１ａを蒸着し、Ｓｉ3Ｎ側の
表面に細胞及び培養液、そして参照電極を入れる囲い１
ｂを設けたものである。尚、図２（ａ）の断面図は厚さ
方向に誇張して描かれており、実際には全体の厚さが２
００μｍ、そのうち、ＳｉＯ2が５０ｎｍ以下、Ｓｉ3Ｎ
4膜が１００ｎｍ以下である。シリコン（Ｓｉ）基板に
は１０オームｃｍのＮ型、厚さ２００μｍで、裏面も鏡
面研磨したものを用いた。裏面に蒸着した金アンチモン
薄膜１ａは、５００℃でアロイ化してオーミックコンタ
クトを形成した。
【００１８】基板表面に形成したシリコン窒化膜（Ｓｉ
3Ｎ4）は細胞等の生体に対して非侵襲性であるので、細
胞等の培養に適している。細胞等を入れる囲い１ｂは、
内径２６ｍｍのポリカーボネイト製円筒体をＳｉ3Ｎ4膜
の表面に接着したものである。尚、円板状の２次元セン
サ１の周縁部４箇所に、アルミニウム製フレームを取り
付けるための小ねじが固着されている。
【００１９】図１に戻って、インキュベータ部３は二重
構造を採用しており、雑菌による外部からの汚染防止に
万全を期している。インキュベータ部３のサンプル室３
ａは、温度制御ユニット４が温度センサの出力に基づい
てヒータ・ファンユニット５を制御することによって、
３７±０．５℃に維持される。また、空気９５％、二酸
化炭素５％の割合に調整された混合ガスがサンプル室に
導入されている。この混合ガス供給路には流量計６及び
電磁弁７が備えられ、さらに電磁弁７の駆動回路７ａを
オン・オフするタイマー７ｂも備えられている。これら
インキュベータ部、温度制御ユニット４等によって培養
維持手段が構成されている上記２次元センサ１の囲い内
に入れられた参照電極（ＲＥ）と裏面の作用電極との間
にバイアス電圧を印加するためのポテンショスタット８
が設けられ、両電極間に流れる電流信号がアンプ９を介
して処理手段であるコンピュータ１０に入力される。コ
ンピュータ１０には１６ビットＡ／Ｄ変換器が装着され
ている。
【００２０】また、２次元センサ１の囲い内には、培養
液に浸された参照電極（ＲＥ）と同じポテンショスタッ
ト８に接続された対向電極（ＣＥ）が備えられている。
この対向電極（ＣＥ）をサンプルに接触させて参照電極
（ＲＥ）との間にパルス電圧を印加することにより、サ
ンプルに刺激を与えて、その結果生ずる誘発電位を測定
することができる。この刺激電圧（パルス電圧）はコン
ピュータ１０からの指令によってポテンショスタット８
が発生する。もちろん、刺激を与えずに自発電位の測定
をすることもできる。
【００２１】図１には、２次元センサ１の裏面にレーザ
ビームを照射するレーザ光源１１やその駆動装置１２も
示されている。レーザ光源１１から出たレーザビームは
ミラーやレンズ（倒立顕微鏡の対物レンズを使用した）
による光学系で数μｍ程度のビーム径に集光されて２次
元センサ１の裏面に照射される。また、光源駆動装置１
２はレーザビームを数ｋＨｚ〜１０ｋＨｚ程度の高周波
で変調する変調器を含んでいる。
【００２２】また、２次元センサ１の裏面のレーザビー
ムが照射される位置を変更するための手段として、イン
キュベータ部３ごと２次元センサ１を水平方向に変位さ
せるＸＹステージ１３が備えられている。このＸＹステ
ージ１３は、コンピュータ１０からの指令に従ってステ
ップモータが駆動されることにより、２次元センサ１の
レーザビームが照射される位置を１μｍ単位でＸＹ方向
に変位させることができる。
【００２３】本実施例では、このようにレーザビームの
位置を固定して２次元センサ１をＸＹ方向に変位させた
が、高速スキャン（走査）を実現するには、むしろ、２
次元センサ１の位置を固定して、レーザビームを走査さ
せるほうがよい。これは、光学系にＸＹガルバノミラー
を使用することにより実現できる。あるいは、２次元セ
ンサの裏面に対してほぼ垂直にレーザ光を照射する複数
のレーザ素子を２次元マトリックス状に配列したレーザ
アレイを用い、これらの複数のレーザ素子を時分割で駆
動させる方法も考えられる。
【００２４】上記のようにして、２次元センサ１のレー
ザ光が照射された部分には正孔・電子対が発生し、参照
電極と作用電極との間に印加されているバイアス電圧に
よって光電流が流れようとする。２次元センサ１の表面
には絶縁膜（ＳｉＯ2及びＳｉ3Ｎ4）が形成されている
ので直流電流は流れないが、前述のようにレーザビーム
が高周波変調されていることにより交流電流が流れ得
る。絶縁膜の静電容量（以下、単に容量という）をＣ
ｉ、半導体と絶縁膜との界面の空乏層の容量をＣｄ、高
周波変調されたレーザビームによる光励起によって空乏
層に生成される光交流電流をｉPとすれば、外部で検出
可能な参照電極と作用電極との間に流れる光交流電流ｉ
は、図３の等価回路から、次式（数１）のようになる。
【００２５】
【数１】 ｉ＝Ｃｉ・ｉP／（Ｃｉ＋Ｃｄ） 絶縁膜表面に接する細胞の活動によって絶縁膜表面に電
位が発生すると、これによって半導体と絶縁膜との界面
付近におけるエネルギーバンドの曲りが生じ、その結
果、半導体と絶縁膜との界面の空乏層の幅、従って空乏
層容量Ｃｄが変化する。すると、上式（数１）にしたが
って外部に検出される光交流電流ｉも変化する。本実施
例のようにＮ型半導体を用いたセンサの場合、絶縁膜表
面に発生する電位が正であれば空乏層容量Ｃｄが大きく
なって光交流電流ｉは小さくなることがわかっている。
逆に絶縁膜表面に発生する電位が負であれば空乏層容量
Ｃｄが小さくなって光交流電流ｉは大きくなる。
【００２６】以下に、上記のような測定装置を用いてラ
ットの脳切片の神経活動の観察を行った実験例について
説明する。生後２日齢のＳＤラットの脳を摘出し、その
視覚野の部分を約０．５ｍｍ厚の切片に切り取った。こ
の脳切片を上記２次元センサの囲いの中で培養した。切
片の付着製を良くするために、センサ表面のシリコン窒
化膜をポリリジンで処理し、培地にはＤＦ＋ｆを用い
た。ここで、ＤＦはＤＭＥＭとNutrient Mixture(F12培
地）を１対１で混ぜたものであり、ｆはinsulin5μg/m
l,transferrin 100μg/ml,progesterone 20nM,hydrocor
tisone 20nM,putresine 100μM,selenium 20nM、さらに
牛胎児血清５％を加えたものである。
【００２７】このようなサンプル（生後１〜２日齢のラ
ットの脳切片）は培養開始から１週間から１０日程度で
自発発火を起こすようになる。図４に上記の測定装置で
検出されたサンプルの電気的活動を示す。図４（ａ）は
４８ｋＨｚでディジタルサンプリングした光交流電流波
形であり、この光交流電流の振幅を１０ｍｓｅｃごとに
平均化処理した波形を図４（ｂ）に示す。これらの図か
らわかるように、時間軸の約１４４．８秒から１４５．
２秒の間で光交流電流の振幅が約５％小さくなってい
る。
【００２８】このことから、レーザビームが照射された
箇所において、神経細胞の活動によって絶縁膜表面に正
の電位が発生していることが考えられる。レーザビーム
の照射箇所を他に移動させた場合も、神経細胞の自発発
火が生じていると考えられる箇所では同様に光交流電流
の振幅の現象が認められた。
【００２９】
【発明の効果】以上説明したように、本発明によれば、
Ｓｉ、ＳｉＯ2、及びＳｉ3Ｎ4の３層からなるＬＡＰＳ
構造の２次元センサを用い、その上でサンプルの細胞を
培養できるようにして、２次元センサ基板の裏面からレ
ーザビームが照射された箇所の細胞活動による電位変化
を検出できるようにしたので、レーザビームが照射され
る位置、及びそのスポット径を変えることにより、いわ
ば測定電極の位置及び大きさをほぼ任意に調節すること
が可能になった。つまり、サンプルに合わせて測定電極
の位置や大きさを任意に設定できる汎用性のある２次元
センサとそれを用いた測定装置を提供することができ
た。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施例に係る細胞活動測定装置の構成
図
【図２】図１の細胞活動測定装置に用いる２次元センサ
の側面断面図（模式図）及び平面図
【図３】図１の測定装置における光交流電流が流れる回
路の等価回路を示す図
【図４】測定された光交流電流及びその振幅の変化の一
例を示す波形図
【図５】本発明に関連するＬＡＰＳによるｐＨ測定回路
の構成図
【図６】図５の測定回路から得られる光交流電流対バイ
アス電圧特性がｐＨ煮応じてシフトする様子を示すグラ
フ
【符号の説明】
１ ２次元センサ １ａ 作用電極用薄膜 １ｂ 囲い ２ 試料（細胞） ３ インキュベータ部 ４ 温度制御ユニット ５ ヒータ・ファンユニット ６ 流量計 ７ 電磁弁 ８ ポテンショスタット ９ アンプ １０ コンピュータ １１ レーザ光源 １２ 光源駆動装置 １３ ＸＹステージ
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 平４−50648（ＪＰ，Ａ) 特開 平６−313759（ＪＰ，Ａ) 特開 平６−296595（ＪＰ，Ａ) 特開 平６−78889（ＪＰ，Ａ) 特開 平９−5295（ＪＰ，Ａ) 特開 平８−86771（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) G01N 27/416 ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ)

Claims (7)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 Ｓｉ、ＳｉＯ2、及びＳｉ3Ｎ4の３層か
    らなるセンサ基板のＳｉ側の裏面に作用電極用薄膜が蒸
    着され、Ｓｉ3Ｎ4側の表面に試料である細胞、培養液、
    及び参照電極を入れる囲いが設けられ、その囲いの内部
    に置かれた細胞の活動によって発生する電位変化の平面
    分布のうち、光が照射された部分の電位変化に主として
    対応する信号が前記作用電極から取り出されることを特
    徴とする細胞活動測定用２次元センサ。
  2. 【請求項２】 請求項１に記載された細胞活動測定用２
    次元センサと、その裏面にレーザビームを照射するレー
    ザ光源と、前記細胞活動測定用２次元センサの裏面側の
    作用電極と表面側の囲い内に入れられた参照電極との間
    に直流バイアス電圧を印加する直流電源と、前記両電極
    間に得られる信号を処理する処理手段とを備えている細
    胞活動測定装置。
  3. 【請求項３】 前記細胞活動測定用２次元センサの囲い
    内に置かれた細胞の培養環境を維持する培養維持手段が
    備えられている請求項２記載の細胞活動測定装置。
  4. 【請求項４】 前記レーザ光源を高周波駆動して高周波
    変調光を照射させる光源駆動手段が設けられ、前記処理
    手段は、前記両電極間に流れる光交流電流の振幅の変化
    を検出するように構成されている請求項２記載の細胞活
    動測定装置。
  5. 【請求項５】 前記レーザ光源から照射されるレーザビ
    ームを前記細胞活動測定用２次元センサの裏面の所定範
    囲内で走査する手段が備えられている請求項２記載の細
    胞活動測定装置。
  6. 【請求項６】 前記レーザ光源として、前記細胞活動測
    定用２次元センサの裏面に対してほぼ垂直にレーザ光を
    照射する複数のレーザが２次元マトリックス状に配列さ
    れてなるレーザアレイが備えられている請求項２記載の
    細胞活動測定装置。
  7. 【請求項７】 前記細胞活動測定用２次元センサの水平
    方向における位置を制御するＸＹステージが備えられて
    いる請求項２記載の細胞活動測定装置。
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