CN114965622A - 一种热调控电化学发光单细胞显微成像装置及成像方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种热调控电化学发光单细胞显微成像装置及成像方法，所述成像装置包括电化学反应池，置于电化学反应池下方用于调节电化学反应池中工作电极温度的加热板，以及位于电化学反应池上方用于拍摄待测单细胞的电化学发光显微镜；电化学发光显微镜包括沿垂直轴线从下到上依次布置的物镜、成像透镜以及电子倍增相机。本发明将待测单细胞贴壁修饰在ITO玻璃电极上，通过加热板调节ITO玻璃电极的温度，改变ITO表面电化学发光的强度和发光层的厚度，增强对电极表面贴壁细胞粘附区域ECL成像对比度，以及细胞不同高度的轮廓图。本发明增强单细胞成像灵敏度且可观察不同高度细胞轮廓，同时具有良好的可逆性，可对电极表面贴壁细胞成像效果可逆调控。
Description
技术领域
本发明涉及一种成像装置及成像方法，尤其涉及一种热调控电化学发光单细胞显微成像装置及成像方法。
背景技术
电化学发光(Electrogenerated chemiluminescence,Electrochemiluminescence，简写为ECL)是由电化学反应引起的化学发光现象。ECL显微成像技术则是利用显微成像光路来记录电极表面微区的ECL特征。相比于传统使用的单点检测器，ECL显微成像技术具有高时空分辨能力，可以观测单细胞范围内的ECL异质性的发光过程。目前，ECL显微成像技术已经可以用于研究细胞粘附与迁移、细胞内生物分子、细胞器、以及细胞膜等。但是长期以来，ECL显微成像方法的成像信噪比不易调控，因此需要引入更多有效的措施来提高成像信噪比。此外，研究者利用调节发光分子与共反应剂的比例，来调控电极表面ECL的发光层厚度，实现细胞不同高度的成像。但是这种方法并不能灵活可逆调节发光层的厚度，在实际单细胞成像应用层面具有较大困难。
发明内容
发明目的：本发明的目的是提供一种增强单细胞成像灵敏度、且可观察不同高度细胞轮廓的热调控电化学发光单细胞显微成像装置；本发明的另一目的是提供一种热调控电化学发光单细胞显微成像方法。
技术方案：本发明的热调控电化学发光单细胞显微成像装置，包括电化学反应池，置于电化学反应池下方用于调节电化学反应池中工作电极温度的加热板，以及位于电化学反应池上方用于拍摄待测单细胞的电化学发光显微镜；电化学发光显微镜包括沿垂直轴线从下到上依次布置的物镜、成像透镜以及电子倍增相机。
进一步地，电化学反应池包括ITO玻璃电极，置于ITO玻璃电极上的电解液，置于电解液中的辅助电极和参比电极，以及分别与ITO玻璃电极、辅助电极和参比电极通过导线连接的电化学工作站，其中ITO玻璃电极上贴壁修饰有待测的单细胞。
进一步地，电解液为包含三联吡啶钌和三丙胺的磷酸盐缓冲液。
进一步地，辅助电极为铂丝，参比电极为银氯化银。
进一步地，还包括温控器，温控器与加热板通过导线连接，用于控制加热板的温度。
另一方面，利用上述装置热调控电化学发光单细胞显微成像方法，包括以下步骤：
(1)将待测单细胞贴壁修饰在ITO玻璃电极上；
(2)ITO玻璃电极的下方放置加热板，上方加入电解液，将参比电极和辅助电极插入到电解池中，并连通电化学工作站；
(3)调用电化学工作站的循环伏安法向电化学反应池施加电压，同时调节ITO玻璃电极温度，修饰有贴壁细胞的ITO玻璃电极表面发出的光被物镜所采集并放大，通过成像透镜将平行光汇聚在电子倍增相机上，得到细胞的电化学发光成像图。
进一步地，步骤(1)中，将含有待测单细胞的悬浮液停留在ITO玻璃电极的导电面上，静止培养一段时间，使待测单细胞在ITO玻璃电极贴壁，经过冲洗、浸泡、冲洗后得到修饰有贴壁细胞的ITO玻璃电极。
进一步地，步骤(3)中，电化学工作站设定的扫描电压范围为0V-1.3V时，得到细胞的电化学发光成像图为细胞高度轮廓图。
进一步地，步骤(3)中，电化学工作站设定的扫描电压范围为0V-1.0V时，得到细胞的电化学发光成像图为细胞粘附图。
进一步地，步骤(3)中，调节ITO玻璃电极温度为30℃～60℃。
进一步地，ITO玻璃电极的预处理方法为：将ITO玻璃切割成小块，分别在丙酮、乙醇、二次水中各超声5分钟，再用二次水洗涤，最后用氮气吹干ITO玻璃电极，用直径为20mm的硅橡胶贴在ITO玻璃电极的导电面上，露出ITO玻璃电极中部的区域用于细胞培养和ECL成像观察。
本发明将热控电极技术与ECL技术相结合，尤其是将热控电极引入到单细胞ECL显微成像中，通过提高电极温度来增强ECL反应速率和界面物质传质速率，导致检测灵敏度提高。因为升高温度有助于加快电化学反应速率，以及提高界面传质速率，本发明使用调控电极温度来调节细胞粘附ECL成像灵敏度和成像层厚度，观察细胞在不同高度的轮廓，展示出具有可逆调节的特征。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：增强单细胞成像灵敏度且可观察不同高度细胞轮廓，同时具有良好的可逆性，可对电极表面贴壁细胞成像效果可逆调控，通过硅胶加热板加热ITO玻璃电极，引起ITO电极表面ECL发光层强度和厚度的改变，实现单细胞成像的可逆变化。
附图说明
图1为本发明的装置结构示意图。
图2为实施例3中得到的细胞不同高度轮廓图。
图3为实施例4中得到的结果图：(A)为不同温度条件下的细胞粘附成像图，(B)为细胞1-4号的位置标示图，(C)为细胞1-4号的对比度随温度的变化曲线图；
图4为实施例5中反复升降温过程中不同温度条件下的的单细胞ECL成像图。
图中：1、电化学反应池；101、ITO玻璃电极；102、电解液；103、辅助电极；104、参比电极；105、电化学工作站；2、加热板；3、电化学发光显微镜；301、物镜；302、成像透镜；303、电子倍增相机；4、温控器；5、待测单细胞。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。
实施例1
如图1所示，本发明的热调控电化学发光单细胞显微成像装置，包括电化学反应池1、加热板2、电化学发光显微镜3，其中加热板2设于电化学反应池下方，用于控制电化学反应池1中工作电极的温度，通过加热板2加热电化学反应池1中工作电极，引起工作电极表面ECL发光层强度和厚度的改变；电化学发光显微镜3放置于电化学反应池1上方，用于拍摄待测单细胞5的ECL成像图。
所述电化学反应池1包括ITO玻璃电极101，ITO玻璃电极101的导电面上粘有硅橡胶垫圈，硅橡胶垫圈和ITO玻璃电极101构成ITO电解池，电化学池内填充有电解液102；电化学反应池1还包括辅助电极103、参比电极104和电化学工作站105，ITO玻璃电极101、辅助电极103和参比电极104构成三电极体系，ITO玻璃电极101、辅助电极103和参比电极104分别与电化学工作站105的三条导线相连接。
所述加热板2连接有温控器4，温控器4为数显温控器，用于控制并显示当前加热板2的温度。优选的，加热板2为硅胶加热板。
所述电化学发光显微镜3包括从下到上依次布置的物镜301、成像透镜302以及电子倍增相机303，ITO玻璃电极101上贴壁修饰待测单细胞5，其表面发出的光被物镜301所采集并把图像放大，通过成像透镜302将平行光汇聚在电子倍增相机303上，得到细胞的ECL成像图。
实施例2
本实施例的热调控电化学发光单细胞显微成像装置的搭建过程如下：
(1)将硅胶的加热板2与ITO玻璃电极101的非导电面粘贴在一起，放入到电化学发光显微镜3的物镜301下方；
(2)将1.0mL含有三联吡啶钌和三丙胺的磷酸盐缓冲液作为电解液102加入到ITO电解池中，将ITO玻璃电极101作为工作电极，银/氯化银电极作为参比电极104，铂丝作为辅助电极103，将参比电极104和辅助电极103插入到ITO电解池中，触碰到电解液102中。将电化学工作站105的三根引线分别夹到对应的ITO玻璃电极101、参比电极104和辅助电极103上；
(3)利用温控器4控制硅胶加热板2的功率，改变ITO玻璃电极101表面温度；当用电化学工作站105给三电极体系施加电压后，修饰有待测单细胞的ITO玻璃电极101表面发出的光被物镜301所采集并把图像放大，通过成像透镜302将平行光汇聚在电子倍增相机303上，得到细胞的ECL成像图。
实施例3
为了获得细胞高度轮廓图，本实施例的热调控电化学发光单细胞显微成像方法，包括以下步骤：
(1)贴壁细胞修饰的ITO玻璃电极的制备
ITO玻璃电极前处理：将ITO玻璃电极切割成25mm×25mm的小块，分别在丙酮、乙醇、二次水中各超声5分钟，再用二次水洗涤，最后用氮气吹干ITO玻璃电极。
贴壁细胞修饰的ITO玻璃电极：将直径为2cm、高度为2mm的硅橡胶垫圈粘在ITO玻璃电极的导电面上，制备电化学池。将600μL含有HeLa细胞的悬浮液放入到电化学池中，在含有5％二氧化碳浓度的37℃恒温培养箱中静止8个小时，让HeLa细胞在ITO玻璃电极贴壁。随后取出ITO玻璃电极，用磷酸盐缓冲液冲洗电化学池，向电化学池中加入600μL含有4％的多聚甲醛溶液，常温浸泡半小时，然后用磷酸盐缓冲液冲洗电化学池，制备得到贴壁细胞修饰的ITO玻璃电极。
(2)电化学反应池搭建
取一块孵育有贴壁细胞的ITO玻璃电极，用双面胶将ITO的非导电面与硅胶加热板贴合，放入ECL显微镜的水浸物镜下方，并将ITO导电面朝向水浸物镜；向电解池中加入1.0mL含有1mM三联吡啶钌、10mM三丙胺的磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)的电解液，将银/氯化银参比电极和铂丝对电极也一同插入电解液中，将电化学工作站的三根引线分别夹到对应的电极上；
(3)当电化学工作站施加高电压时，热调控电化学发光显微镜在不同温度下得到的细胞不同高度轮廓图。
利用波形发生器同时触发电化学工作站与电子倍增相机，调用电化学工作站的循环伏安方法，设定扫描电压范围为0V至1.3V，扫描速度为0.1V/s，灵敏度为10-3A。电子倍增相机的曝光时间为200ms，增益倍率为50；开启硅胶加热板的电源，利用数显控温器调节ITO玻璃电极表面温度，使电极表面温度不断提升，从30℃上升到60℃，分别记录当电压扫描到1.2V时，在30℃、40℃、50℃、60℃温度条件下，ITO玻璃电极表面单细胞的ECL成像图；
如图2所示，本发明所用热调控电化学发光显微镜获取的在不同温度条件下的单细胞成像图，其中电压都为1.2V，从左往右依次在30℃、40℃、50℃、60℃下，不同ECL发光层厚度下得到的不同高度细胞成像图；从图中可以看出，随着温度升高，成像的区域逐渐从细胞底部变为细胞上部，所以证明可以通过调节硅胶加热板的温度，来灵活调控成像细胞的不同高度轮廓。
实施例4
为了获得细胞粘附成像图，本实施例的热调控电化学发光单细胞显微成像方法与实施例3基本相同，主要区别在于步骤(2)中缓冲溶液配置不同，步骤(3)中电化学工作站中扫描电压范围不同，具体步骤如下：
(1)贴壁细胞修饰的ITO玻璃电极的制备
将直径为2cm、高度为2mm的硅橡胶垫圈粘在ITO玻璃电极的导电面上，制备电化学池。将600μL含有HeLa细胞的悬浮液放入到电化学池中，在含有5％二氧化碳浓度的37℃恒温培养箱中静止8个小时，让HeLa细胞在ITO玻璃电极贴壁。随后取出ITO玻璃电极，用磷酸盐缓冲液冲洗电化学池，向电化学池中加入600μL含有4％的多聚甲醛溶液，常温浸泡半小时，然后用磷酸盐缓冲液冲洗电化学池，制备得到贴壁细胞修饰的ITO玻璃电极。
(2)电化学反应池搭建
取一块孵育有贴壁细胞的ITO玻璃电极，用双面胶将ITO的非导电面与硅胶加热板贴合，放入ECL显微镜的水浸物镜下方，并将ITO导电面朝向水浸物镜；向电解池中加入1.0mL含有1mM三联吡啶钌、100mM三丙胺的磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)的电解液，将银/氯化银参比电极和铂丝对电极也一同插入电解液中，将电化学工作站的三根引线分别夹到对应的电极上；
(3)当电化学工作站施加低电压时，热调控电化学发光显微镜在不同温度下得到细胞粘附成像图。
利用波形发生器同时触发电化学工作站与电子倍增相机，调用电化学工作站的循环伏安方法，设定扫描电压范围为0V至1.0V，扫描速度为0.1V/s，灵敏度为10-3A。电子倍增相机的曝光时间为200ms，增益倍率为50；开启硅胶加热板的电源，利用数显控温器调节ITO玻璃电极表面温度，使电极表面温度不断提升，从30℃上升到60℃，分别记录当电压扫描到0.95V时，在30℃、40℃、50℃、60℃温度条件下，ITO玻璃电极表面单细胞的ECL成像图。
图3为本发明所用热调控电化学发光显微镜获取的在不同温度条件下的单细胞成像图，其中电压都为0.95V。图3(A)为从左往右依次在30℃、40℃、50℃、60℃下，ECL显微镜得到的不同对比度的细胞粘附成像图；图3(B)为细胞1-4号的位置标示图；图3(C)为图3(B)中图中标识的细胞1-4号的对比度随温度的变化曲线图。如图3所示，可以看出随着温度升高，细胞粘附区域的成像对比度逐渐提升，所以证明可以通过调节硅胶加热板的温度，来增强低电压下细胞粘附区域的成像对比度。
实施例5
为了考察热调控电化学发光显微镜在成像单细胞时的温度控制可逆性，本实施例的热调控电化学发光单细胞显微成像方法，包括以下步骤：
(1)贴壁细胞修饰的ITO玻璃电极的制备
将直径为2cm、高度为2mm的硅橡胶垫圈粘在ITO玻璃电极的导电面上，制备电化学池。将600μL含有HeLa细胞的悬浮液放入到电化学池中，在含有5％二氧化碳浓度的37℃恒温培养箱中静止8个小时，让HeLa细胞在ITO玻璃电极上贴壁。随后取出ITO玻璃电极，用磷酸盐缓冲液冲洗电化学池，向电化学池中加入600μL含有4％的多聚甲醛溶液，常温浸泡半小时，然后用磷酸盐缓冲液冲洗电化学池，制备得到贴壁细胞修饰的ITO玻璃电极。
(2)电化学反应池搭建
取一块孵育有贴壁细胞的ITO玻璃电极，用双面胶将ITO的非导电面与硅胶加热板贴合，放入ECL显微镜的水浸物镜下方，并将ITO导电面朝向水浸物镜；向电解池中加入1.0mL含有1mM三联吡啶钌和99mM三丙胺的磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)的电解液，将银/氯化银参比电极和铂丝对电极也一同插入电解液中，将电化学工作站的三根引线分别夹到对应的电极上；
(3)电子倍增相机的曝光时间为200ms，增益倍率为50。用电化学工作站施加循环伏安电压扫描给三电极体系，设定扫描电压范围为0V至1.3V，用硅胶加热板调节ITO玻璃电极的温度在30℃至60℃温度来回不断升温和降温，观察细胞区域的ECL成像图是否随着温度变换而可逆变化。
图4为本发明所用热调控电化学发光显微镜获取的在不同温度条件下的单细胞成像图，证明成像技术的可逆性，其中电压都为1.2V时获得的图像。第一排(从左向右)为第一次升温时的单细胞ECL成像图，第二排(从右向左)为第一次降温时的单细胞ECL成像图，第三排(从左向右)为第二次升温时的单细胞ECL成像图，第四排(从右向左)为第二次降温时的单细胞ECL成像图。如图4所示，可以看出随着电极温度在30℃至60℃温度可逆变换时，细胞区域ECL成像图也随之发生变换，并且这种变化是可逆的。
Claims (10)
1.一种热调控电化学发光单细胞显微成像装置，其特征在于，包括电化学反应池(1)，置于电化学反应池(1)下方用于调节电化学反应池(1)中工作电极温度的加热板(2)，以及位于电化学反应池(1)上方用于拍摄待测单细胞的电化学发光显微镜(3)；电化学发光显微镜(3)包括沿垂直轴线从下到上依次布置的物镜(301)、成像透镜(302)以及电子倍增相机(303)。
2.根据权利要求1所述的热调控电化学发光单细胞显微成像装置，其特征在于，电化学反应池(1)包括ITO玻璃电极(101)，置于ITO玻璃电极(101)上的电解液(102)，置于电解液(102)中的辅助电极(103)和参比电极(104)，以及分别与ITO玻璃电极(101)、辅助电极(103)和参比电极(104)通过导线连接的电化学工作站(105)，其中ITO玻璃电极(101)上贴壁修饰有待测的单细胞。
3.根据权利要求1所述的热调控电化学发光单细胞显微成像装置，其特征在于，电解液(102)为包含三联吡啶钌和三丙胺的磷酸盐缓冲液。
4.根据权利要求1所述的热调控电化学发光单细胞显微成像装置，其特征在于，辅助电极(103)为铂丝，参比电极(104)为银氯化银。
5.根据权利要求1所述的热调控电化学发光单细胞显微成像装置，其特征在于，还包括温控器(4)，温控器(4)与加热板(2)通过导线连接，用于控制加热板(2)的温度。
6.一种利用根据权利要求1-4任一所述的装置热调控电化学发光单细胞显微成像方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将待测单细胞贴壁修饰在ITO玻璃电极上；
(2)ITO玻璃电极的下方放置加热板，上方加入电解液，将参比电极和辅助电极插入到电解池中，并连通电化学工作站；
(3)调用电化学工作站的循环伏安法向电化学反应池施加电压，同时调节ITO玻璃电极温度，修饰有贴壁细胞的ITO玻璃电极表面发出的光被物镜所采集并放大，通过成像透镜将平行光汇聚在电子倍增相机上，得到细胞的电化学发光成像图。
7.根据权利要求6所述的热调控电化学发光单细胞显微成像方法，其特征在于，步骤(1)中，将含有待测单细胞的悬浮液停留在ITO玻璃电极的导电面上，静止培养一段时间，使待测单细胞在ITO玻璃电极贴壁，经过冲洗、浸泡、冲洗后得到修饰有贴壁细胞的ITO玻璃电极。
8.根据权利要求6所述的热调控电化学发光单细胞显微成像方法，其特征在于，步骤(3)中，电化学工作站设定的扫描电压范围为0V-1.3V时，得到细胞的电化学发光成像图为细胞高度轮廓图。
9.根据权利要求6所述的热调控电化学发光单细胞显微成像方法，其特征在于，步骤(3)中，电化学工作站设定的扫描电压范围为0V-1.0V时，得到细胞的电化学发光成像图为细胞粘附图。
10.根据权利要求6所述的热调控电化学发光单细胞显微成像方法，其特征在于，步骤(3)中，调节ITO玻璃电极温度为30℃～60℃。
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Citations (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101162199A (zh) * | 2007-11-19 | 2008-04-16 | 福州大学 | 热控电极电致化学发光检测装置及检测池制备方法 |
| CN101672816A (zh) * | 2009-09-23 | 2010-03-17 | 东南大学 | 用于生物、化学分析中的多功能可控温电解池 |
| US20110042583A1 (en) * | 2009-08-19 | 2011-02-24 | National Tsing Hua University | Observation chamber for studying temperature-dependent events and method thereof |
| WO2011097851A1 (zh) * | 2010-02-11 | 2011-08-18 | 华南师范大学 | 细胞光声显微成像方法及其装置 |
| CN103913447A (zh) * | 2014-03-31 | 2014-07-09 | 南京医科大学 | 一种电致化学发光成像装置及其应用 |
| CN104407036A (zh) * | 2014-11-06 | 2015-03-11 | 上海慧观贸易有限公司 | 用于核酸等温扩增的电化学微流控器件的制备及其应用 |
| CN209460190U (zh) * | 2019-01-21 | 2019-10-01 | 广州声华科技有限公司 | 一种三电极体系电化学测试装置 |
| CN111122552A (zh) * | 2019-12-11 | 2020-05-08 | 南京大学 | 一种单颗粒电化学发光成像技术监测细胞分泌铜离子的方法 |
| CN212059633U (zh) * | 2020-04-30 | 2020-12-01 | 南京医科大学 | 一种温控暗场显微镜用电化学槽和温控系统 |
| CN113533787A (zh) * | 2021-06-23 | 2021-10-22 | 浙江大学 | 一种基于原子力显微镜的电化学反应过程原位监测装置及其监测方法 |
| CN114354718A (zh) * | 2022-03-18 | 2022-04-15 | 南京邮电大学 | 纳米酶在催化增强电化学发光信号及单细胞表面膜蛋白成像中的应用 |
-
2022
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Patent Citations (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101162199A (zh) * | 2007-11-19 | 2008-04-16 | 福州大学 | 热控电极电致化学发光检测装置及检测池制备方法 |
| US20110042583A1 (en) * | 2009-08-19 | 2011-02-24 | National Tsing Hua University | Observation chamber for studying temperature-dependent events and method thereof |
| CN101672816A (zh) * | 2009-09-23 | 2010-03-17 | 东南大学 | 用于生物、化学分析中的多功能可控温电解池 |
| WO2011097851A1 (zh) * | 2010-02-11 | 2011-08-18 | 华南师范大学 | 细胞光声显微成像方法及其装置 |
| CN103913447A (zh) * | 2014-03-31 | 2014-07-09 | 南京医科大学 | 一种电致化学发光成像装置及其应用 |
| CN104407036A (zh) * | 2014-11-06 | 2015-03-11 | 上海慧观贸易有限公司 | 用于核酸等温扩增的电化学微流控器件的制备及其应用 |
| CN209460190U (zh) * | 2019-01-21 | 2019-10-01 | 广州声华科技有限公司 | 一种三电极体系电化学测试装置 |
| CN111122552A (zh) * | 2019-12-11 | 2020-05-08 | 南京大学 | 一种单颗粒电化学发光成像技术监测细胞分泌铜离子的方法 |
| CN212059633U (zh) * | 2020-04-30 | 2020-12-01 | 南京医科大学 | 一种温控暗场显微镜用电化学槽和温控系统 |
| CN113533787A (zh) * | 2021-06-23 | 2021-10-22 | 浙江大学 | 一种基于原子力显微镜的电化学反应过程原位监测装置及其监测方法 |
| CN114354718A (zh) * | 2022-03-18 | 2022-04-15 | 南京邮电大学 | 纳米酶在催化增强电化学发光信号及单细胞表面膜蛋白成像中的应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| GEN LIU ET AL.: "Direct Electrochemiluminescence Imaging of a Single Cell on a Chitosan Film Modified Electrode", ANALYTICAL CHEMISTRY, vol. 90, no. 7, pages 4801 * |
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