CN114354718A - 纳米酶在催化增强电化学发光信号及单细胞表面膜蛋白成像中的应用 - Google Patents

纳米酶在催化增强电化学发光信号及单细胞表面膜蛋白成像中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了纳米酶在催化增强电化学发光信号及单细胞表面膜蛋白成像中的应用，所述的纳米酶为Co3O4纳米酶，所述的电化学发光体系为鲁米诺类似物L012‑H2O2，所述的膜蛋白为癌胚抗原CEA。本发明首次获得Co3O4催化增强ECL可视化，通过在鲁米诺类似物L012‑H2O2体系中施加电压，过氧化氢在纳米酶催化作用下分解产生活性氧自由基，增强L012产生发光信号，从而在纳米酶上产生局部增强的可视化ECL信号，并用于单细胞表面膜蛋白高灵敏成像分析。将CEA抗体通过共价结合修饰在Co3O4上制备功能化探针。利用免疫结合，细胞会特异性捕获探针。过氧化氢在Co3O4催化下生成活性氧自由基。

Description

纳米酶在催化增强电化学发光信号及单细胞表面膜蛋白成像 中的应用
技术领域
本发明属于化学分析领域，具体涉及纳米酶在催化增强电化学发光信号及单细胞表面膜蛋白成像中的应用。
背景技术
电化学发光是化学分子经历电化学反应过程而产生的一种光辐射现象。由于电化学发光过程中依赖外加电压驱动发光过程。与荧光技术相比，电化学发光无需额外的激发光源，有效避免了光散射对于检测的干扰，提高了检测灵敏度。现已成为一种强大的分析技术，广泛应用于生化分析、药物分析、生命科学分析、环境分析等领域。为了进一步提高该技术的分析通量和空间分辨率，电化学发光与显微成像结合，产生了电化学发光成像技术。这项新型的成像技术不仅可以实现生物分子的高通量和可视化检测，还被应用于单细胞的时空分辨成像研究中。但是，由于电化学发光分子产生的发光信号不强，导致电化学发光成像技术存在时间分辨率不足的技术局限。进一步发展电化学发光成像检测原理及方法，增强电化学发光强度，从而提升该技术的灵敏度和时间分辨率，是该技术在生命科学研究中的一大挑战。
单细胞分析是生命科学进行微观探索的一个重要标志，对于生命科学基础研究及重大疾病的早期诊断等均有重大意义。细胞表面存在多种低丰度蛋白质，尽管含量稀少，却常常带有重要的信息。在疾病治疗方面，低丰度蛋白质往往充当早期诊断、预后和治疗效果的标记物，或者治疗的靶点。已有文献报道了单细胞表面蛋白质ECL成像分析，通过对细胞表面蛋白进行生物素化，利用生物素与链霉亲和素的结合能力实现了细胞表面所有蛋白质的可视化（Single Cell Electrochemiluminescence Imaging: From the Proof-of-Concept to Disposable Device-Based Analysis. J. Am. Chem. Soc. 2017, 139,16830−16837），然而该方法无法获取细胞表面某种特定蛋白的相关信息。另外，制备RuDSN-AuNPs纳米材料作为信号探针对细胞膜表面蛋白进行成像，然而，共反应剂TPrA具有细胞毒性，影响细胞的生理功能（Single Biomolecule Imaging by Electrochemiluminescence.J. Am. Chem. Soc. 2021, 143, 43, 17910–17914）。
发明内容
本发明的目的是提供纳米酶在催化增强电化学发光信号及单细胞表面膜蛋白成像中的应用，将Co3O4纳米酶增强电化学发光成像技术，用于生物小分子H2O2以及单细胞表面膜蛋白的高灵敏成像分析，解决现有电化学发光成像存在发光分子信号弱以及灵敏度低等问题。
纳米酶是一类既有纳米材料的独特性能，又有催化功能的新一代人工模拟酶。它如同天然酶一样，能够在温和条件下高效催化酶的底物，呈现出类似天然酶的催化效率和酶促反应动力学。如将纳米酶与鲁米诺电化学发光成像相结合，借助纳米酶优良的催化性能，有望显著提高电化学发光强度，提升成像技术的灵敏度和时间分辨率，实现快速的单细胞电化学发光成像分析。
为实现上述发明目的，本发明提出了纳米酶在催化增强电化学发光信号及单细胞表面膜蛋白成像中的应用，其中所述的纳米酶为Co3O4纳米酶，所述的电化学发光体系为鲁米诺类似物L012-H2O2，所述的膜蛋白为癌胚抗原CEA，所述的Co3O4纳米酶通过催化增强L012-H2O2体系的电化学发光信号，可视化检测H2O2和单细胞表面膜蛋白CEA，实现单细胞表面膜蛋白成像。
进一步地，所述成像过程中，以氧化铟锡电极作为工作电极，Ag/AgCl电极作为参比电极，Pt丝作为辅助电极，采用转换模式电压使ECL体系在纳米酶上产生局部增强的可视化ECL信号。
进一步地，当检测目标为H2O2时，成像过程如下，将Co3O4纳米酶均匀分散在ITO电极上，所述的ITO电极作为工作电极，将工作电极、Ag/AgCl 参比电极和Pt辅助电极置于含有L012和H2O2的PBS中，利用成像系统，在施加转换模式电压下，进行成像并记录图片。
进一步地，当检测目标为细胞表面膜蛋白癌胚抗原CEA时，成像过程如下，将细胞培养在ITO电极上至贴壁状态，用多聚甲醛固定将细胞进行固定；通过共价结合将CEA抗体修饰在Co3O4纳米酶上，制备功能化探针；用所述功能化探针对所述细胞进行孵育；以所述ITO电极作为工作电极，Ag/AgCl电极作为参比电极，Pt丝作为辅助电极，将电极置于含有L012和H2O2的PBS溶液中，利用成像系统，在施加转换模式电压下，进行成像并记录图片。
进一步地，所述施加转换模式电压的方式如下：利用电压发射器施加1.0V 2s和-1.0V 0.5s转换模式电压产生ECL信号。
进一步地，所述的Co3O4纳米酶为表面氨基化的Co3O4，其制备方法如下：取Co(NO3)2·6H2O，溶于超纯水中，加入过氧化氢溶液，用氨水将溶液pH调至9.0，随后，将溶液转移到反应釜中，180℃反应12h，反应结束后，将产物进行离心，水洗3次，烘干得到Co3O4纳米粒子；将Co3O4分散在一定量的超纯水中，静置3h，离心得到表面含有羟基的Co3O4纳米粒子；将其分散在无水乙醇和水的混合溶液中，超声混匀，加入3-氨丙基三乙氧基硅烷；50℃搅拌过夜，经离心，洗涤，烘干得到表面氨基化的Co3O4。
本发明具有如下技术效果：
1）本发明首次获得Co3O4催化增强ECL可视化，通过在鲁米诺类似物L012- H2O2体系中施加电压，过氧化氢在纳米酶催化作用下分解产生活性氧自由基，增强L012产生发光信号，从而在纳米酶上产生局部增强的可视化ECL信号，并用于单细胞表面膜蛋白高灵敏成像分析，如图1所示。将CEA抗体通过共价结合修饰在Co3O4上制备功能化探针。利用免疫结合，细胞会特异性捕获探针。过氧化氢在Co3O4催化下生成活性氧自由基。在施加合适电压条件下，L012发生电化学反应产生中间体，进而与活性氧自由基发生反应产生ECL信号。
2）本发明首次提出了具有纳米酶活性的Co3O4作为增强ECL成像探针用于过氧化氢和细胞表面膜蛋白的高灵敏成像检测。L012 - H2O2体系在Co3O4纳米酶上的发光强度相对标准偏差小于4.4%，表明Co3O4纳米酶具有良好的稳定性。通过在Co3O4纳米酶上修饰不同的抗体，可以实现细胞表面多种蛋白的成像分析。此外，Co3O4纳米酶增强电化学发光成像技术的实现为生物小分子以及蛋白质的高灵敏成像分析提供了特定的平台。
附图说明
图1为Co3O4纳米酶催化增强ECL用于单细胞表面膜蛋白成像过程。
图2中：A为Co3O4纳米粒子TEM图；B为纳米酶存在前后，鲁米诺类似物L012-过氧化氢体系在ITO电极上的ECL光谱图；C为明场；D为纳米酶在显微镜下的ECL成像图。
图3为不同施加电压下，纳米酶催化鲁米诺类似物L012- H2O2体系的ECL成像图。
图4为不同曝光时间时，纳米酶催化鲁米诺类似物L012- H2O2体系的ECL成像图。
图5为最佳实验条件下，纳米酶催化检测H2O2。
图6中，A为纳米酶催化鲁米诺类似物L012- H2O2体系的ECL成像图；B为A中所选3个颗粒连续成像30张图片信号波动曲线。
图7中，A为功能化探针原位修饰前后，乳腺癌细胞MCF-7的ECL成像图；B为功能化探针原位修饰前后，宫颈癌细胞Hela的ECL成像图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清晰明了，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
本发明中，涉及的试验材料及试验设备说明如下：
氧化铟锡导电玻璃（ITO，方阻< 17 ohm/sq，10 × 10 cm2，ITO厚度100 ± 20nm）购于珠海凯为光电科技有限公司。
高糖培养基（DMEM），胎牛血清白蛋白（FBS），青霉素/链霉素（PS）购于LifeTechnologies。
8-氨基-5-氯-7-苯基吡啶并[3,4-d]哒嗪-1,4(2H, 3H)-二酮（L012）购于WAKO公司。
过氧化氢H2O2（30%）溶液购于上海生工。
CEA抗体购自艾博抗(上海)贸易有限公司。
电化学发光分析仪MPI-A购于西安瑞迈公司。
电化学发光成像装置由EMCCD（Evolve，Photometrics，Tuson，AZ）、显微镜（Olypus，Japan）和电压发射器（DG1021，北京普源精电科技有限公司）组成。
MCF-7及Hela细胞购于中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所（中国上海）。细胞在加有10 %（v/v）胎牛血清白蛋白（FBS）和1 %（v/v）抗菌素（青霉素/链霉素）的DMEM培养基，在37 °C恒温，含5 % CO2的培养箱中进行培养。实验中，利用0.25 %的胰酶消化液将细胞从培养瓶壁上消化到溶液中；然后将得到的细胞溶液离心分散，取适量铺在事先处理过的电极上，贴壁后用于成像分析。
实施例1 Co3O4纳米粒子的合成及表面功能化
称量1g Co(NO3)2·6H2O，溶解在40mL的超纯水中。加入0.8 mL 30% 的过氧化氢溶液。用氨水将溶液pH调至9.0。随后，将溶液转移到反应釜中，180 ℃反应12h。反应结束后，将产物进行离心，水洗3次，烘干得到Co3O4纳米粒子。将Co3O4分散在一定量的超纯水中，静置3h，离心得到表面含有羟基的Co3O4纳米粒子。将其分散在无水乙醇和水的混合溶液中，超声混匀，加入3-氨丙基三乙氧基硅烷。50 ℃搅拌过夜，经离心，洗涤，烘干得到表面氨基化的Co3O4。
对Co3O4纳米粒子进行TEM表征，如图2中的A所示，Co3O4纳米粒子的粒径大约30nm。
实施例2 Co3O4纳米酶电化学发光性能分析
用O型圈在ITO电极上固定一定大小的导电面积作为工作电极。将实施例1制备的表面氨基化的Co3O4分散在氧化铟锡电极上，80℃烘干使颗粒均匀牢固的铺在电极表面。将铺有Co3O4酶的ITO电极作为工作电极，Ag/AgCl电极作为参比电极，Pt丝作为辅助电极，L012-H2O2作为发光体系，在0-1 V（vs. Ag/AgCl）范围以0.1 V/s的扫速进行循环伏安扫描，在ECL分析仪器上检测并记录ECL曲线；对比没有Co3O4时，ITO电极的ECL信号（图2中的B），可以看出Co3O4存在时，L012-H2O2的ECL信号得到了显著增强，表明了Co3O4具有优良的纳米酶催化性能。
研究Co3O4纳米酶的电化学发光成像性能。用O型圈在ITO电极上固定一定大小的导电面积作为工作电极。Ag/AgCl电极作为参比电极，Pt丝作为辅助电极，L012-H2O2作为发光体系。将实施例1制备的表面氨基化的Co3O4分散在氧化铟锡电极上，80℃烘干使颗粒均匀牢固的铺在电极表面。将电极置于含有200 μM L012和20 μM H2O2的PBS中，利用电压发射器施加1.0V 2s和-1.0V 0.5s转换模式电压产生ECL信号。图2中的C为显微镜下的明场图片，由于Co3O4纳米酶颗粒太小，明场下看不到。通过对电极施加电压，利用EMCCD连续采集图片，对所得到的图片使用Image J软件进行分析，可知（图2中的D），可以清晰看到电极上所产生的发光信号，这是由于Co3O4纳米酶可以催化L012-H2O2发光体系在纳米酶上产生局部增强的光信号。分别施加不同的电压（图3），对L012在Co3O4/ITO电极上的ECL成像性能进行研究。电化学发光成像装置由40X物镜、光通路管、EMCCD、电压发射器组装成。成像系统使化学发光损失最小化，光路传输最短。如图3所示。当施加电压小于0.7V时，电极表面几乎没有颗粒产生发光信号。当施加电压达到0.7V时，电极表面少量颗粒产生发光信号。当施加电压达到0.8V时，电极表面大部分颗粒都产生了发光信号施加电压为0.9V时，所有颗粒都产生了发光信号，表明了Co3O4具有优良的纳米酶催化活性。对曝光时间进行考察，结果如图4所示，曝光时间在500 ms时，电极界面所有的颗粒都产生了可区分的发光信号，与以往的成像分析相比，Co3O4纳米酶的存在显著降低了曝光时间，表明了纳米酶的催化活性有效增强了发光信号。
实施例3 Co3O4纳米酶在电化学传感分析中的应用
H2O2是生物体系中存在的重要的小分子，对H2O2进行高灵敏检测有助于理解生物系统中的一些应激反应。因此，对不同浓度的H2O2进行检测。
将Co3O4纳米酶均匀分散在ITO电极上作为工作电极，将工作电极、Ag/AgCl 参比电极和Pt辅助电极置于含有200 μM L012的PBS溶液中，向溶液中加入不同浓度的H2O2（50 pM-20 μM），利用ECL成像系统，在施加1.0V 2s和-1.0V 0.5s转换模式电压下，记录信号的变化情况，并利用ImageJ软件对成像图片进行分析。
结果如图5所示，发光强度与H2O2浓度在50 pM-20 μM之间呈现良好的相关性，检测限低至50 pM。对ECL成像的稳定性进行了考察，连续拍照30张，对图6中的A中所选取的3个颗粒的ECL强度进行分析（图6中的B），其发光强度相对标准偏差小于4.4%，表明Co3O4纳米酶具有良好的稳定性。
细胞表面低丰度蛋白质的成像分析对于阐明生命科学的分子机制和疾病发展的相关研究至关重要。
选择细胞表面表达CEA抗原的MCF-7细胞作为模型，将细胞培养在ITO电极上至贴壁状态，用4%多聚甲醛将细胞进行固定以确保抗原和抗体的相互作用（细胞培养方法参考：Electrochemiluminescence-Based Capacitance Microscopy for Label-Free Imagingof Antigens on the Cellular Plasmembrane J. Am. Chem. Soc. 2019, 141, 26,10294–10299）。通过共价结合将CEA抗体修饰在Co3O4纳米酶上，制备功能化探针（制备功能化探针的方法参考：CdZnTeS quantum dots based electrochemiluminescent imageimmunoanalysis. Biosensors and Bioelectronics 117 (2018) 145-152），用所制备的探针对细胞进行孵育。Ag/AgCl电极作为参比电极，Pt丝作为辅助电极。将电极置于含有200μM L012和1 μM H2O2的PBS溶液中利用成像系统，在施加1.0V 2s和-1.0V 0.5s转换模式电压下，记录成像图片。结果如图7中的A所示。MCF-7细胞在修饰功能化探针后，细胞表明产生了明显的发光信号。
为了评估该方法的可靠性，发明人设计了对照试验。选用细胞表面不表达CEA抗原的Hela细胞作为细胞模型。图7中的B所示为相同条件下Hela细胞的成像图，正如预期，细胞区域没有明显的信号产生。这是因为该方法的检测依赖于抗原-抗体的特异性识别。该结果证实MCF-7细胞上观察到的增强的发光信号是由于功能化探针与细胞表面上的抗原连接。
本发明实现了Co3O4纳米酶增强电化学发光成像技术，从而达到了高灵敏电化学传感分析的目的。所获得的纳米酶颗粒上增强的发光信号归因于，纳米酶优良的催化性能可有效促进H2O2分解成活性氧自由基，从而在纳米酶颗粒上获得更强的发光信号。纳米酶颗粒上的发光强度与H2O2浓度之间的良好的正相关性为利用纳米酶用于ECL定量分析提供了可行性依据。进一步将抗体修饰在纳米酶颗粒上制备功能化探针，通过免疫结合，可以对单细胞表明蛋白进行成像，这一结果表明了利用纳米酶功能化探针的通用性，可以进一步应用于其他蛋白分子的检测。本发明成功实现Co3O4纳米酶增强电化学发光成像技术为生物小分子以及蛋白质检测提供了一种新策略。
以上仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (6)

1.纳米酶在催化增强电化学发光信号及单细胞表面膜蛋白成像中的应用，其特征在于，所述的纳米酶为Co3O4纳米酶，所述的电化学发光体系为鲁米诺类似物L012-H2O2，所述的膜蛋白为癌胚抗原CEA，所述的Co3O4纳米酶通过催化增强L012-H2O2体系的电化学发光信号，可视化检测H2O2和单细胞表面膜蛋白CEA，实现单细胞表面膜蛋白成像。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述成像过程中，以氧化铟锡电极作为工作电极，Ag/AgCl电极作为参比电极，Pt丝作为辅助电极，采用转换模式电压使ECL体系在纳米酶上产生局部增强的可视化ECL信号。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，当检测目标为H2O2时，成像过程如下，将Co3O4纳米酶均匀分散在ITO电极上，所述的ITO电极作为工作电极，将工作电极、Ag/AgCl 参比电极和Pt辅助电极置于含有L012和H2O2的PBS中，利用成像系统，在施加转换模式电压下，进行成像并记录图片。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，当检测目标为细胞表面膜蛋白癌胚抗原CEA时，成像过程如下，将细胞培养在ITO电极上至贴壁状态，用多聚甲醛固定将细胞进行固定；通过共价结合将CEA抗体修饰在Co3O4纳米酶上，制备功能化探针；用所述功能化探针对所述细胞进行孵育；以所述ITO电极作为工作电极，Ag/AgCl电极作为参比电极，Pt丝作为辅助电极，将电极置于含有L012和H2O2的PBS溶液中，利用成像系统，在施加转换模式电压下，进行成像并记录图片。
5.根据权利要求2或3或4所述的应用，其特征在于，所述施加转换模式电压的方式如下：利用电压发射器施加1.0V 2s和-1.0V 0.5s转换模式电压产生ECL信号。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的Co3O4纳米酶为表面氨基化的Co3O4，其制备方法如下：取Co(NO3)2·6H2O，溶于超纯水中，加入过氧化氢溶液，用氨水将溶液pH调至9.0，随后，将溶液转移到反应釜中，180℃反应12h，反应结束后，将产物进行离心，水洗3次，烘干得到Co3O4纳米粒子；将Co3O4分散在一定量的超纯水中，静置3h，离心得到表面含有羟基的Co3O4纳米粒子；将其分散在无水乙醇和水的混合溶液中，超声混匀，加入3-氨丙基三乙氧基硅烷；50℃搅拌过夜，经离心，洗涤，烘干得到表面氨基化的Co3O4。
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