WO2012026531A1 - ハイドロゲル乾燥体、ビトリゲル膜乾燥体およびこれらの製造方法 - Google Patents

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WO2012026531A1
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dried
hydrogel
collagen
vitrigel membrane
producing
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PCT/JP2011/069191
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俊明 竹澤
歩 押方
浩之 黒山
智哉 澤口
宏之 山口
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独立行政法人農業生物資源研究所
関東化学株式会社
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    • B29D7/01—Films or sheets
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B29—WORKING OF PLASTICS; WORKING OF SUBSTANCES IN A PLASTIC STATE IN GENERAL
    • B29C—SHAPING OR JOINING OF PLASTICS; SHAPING OF MATERIAL IN A PLASTIC STATE, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; AFTER-TREATMENT OF THE SHAPED PRODUCTS, e.g. REPAIRING
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    • B29C39/02—Shaping by casting, i.e. introducing the moulding material into a mould or between confining surfaces without significant moulding pressure; Apparatus therefor for making articles of definite length, i.e. discrete articles
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
    • C12M25/14—Scaffolds; Matrices

Definitions

  • the present invention relates to a dried hydrogel having no irregular outer peripheral edge, a dried vitrigel membrane, and methods for producing them.
  • the present inventor injected a collagen sol imparted with a salt concentration and a hydrogen ion concentration (pH) optimal for gelation at low temperature into a culture dish, After the collagen sol is gelled by keeping it at the optimum temperature, it is vitrified by gradually removing free water as well as bound water by sufficiently drying at low temperature, and then rehydrated (Rehydration) has established a technique for converting the physical properties of collagen gel into a thin film excellent in strength and transparency with good reproducibility (Patent Document 1).
  • vitrigel a gel having a new physical property state
  • the collagen vitrigel thin film that has been developed so far is a transparent thin membrane with a thickness of several tens of micrometers in which high-density collagen fibers comparable to connective tissues in the living body are intertwined with each other, and has excellent protein permeability. And has a characteristic of having strength.
  • the characteristics of the added substance can be reflected in the collagen vitrigel thin film.
  • a collagen vitrigel thin film in which a cyclic nylon membrane support is embedded can be easily handled with tweezers.
  • the present inventor further develops the technology related to the collagen vitrigel thin film to improve the transparency and production reproducibility of the collagen vitrigel thin film (Patent Document 2).
  • Patent Document 3 a technique for producing a thread-like or tubular shape is also proposed.
  • a predetermined amount of collagen sol is injected into a plastic culture dish so that the collagen vitrigel thin film has an arbitrary thickness. It was produced by gelation, vitrification by drying and rehydration.
  • the collagen vitrigel thin film embedded with a cyclic nylon membrane support used as a three-dimensional culture carrier for cells has a collagen vitrigel thin film attached only to the bottom surface of the culture vessel. It was necessary to finely process the shape so that it could be peeled off from the bottom surface of the culture vessel, that is, the outer periphery of the cyclic nylon membrane support so that the collagen vitrigel thin film did not protrude excessively.
  • the collagen content and thickness of the collagen vitrigel thin film are controlled by injecting 0.04-0.4ml of 0.25% collagen sol per unit area (1.0 cm 2 ) of the culture dish.
  • a collagen vitrigel thin film containing 100 ⁇ g to 1.0 mg of collagen per unit area (1.0 cm 2 ), and further by adjusting the period of vitrification
  • the thickness of the vitrigel thin film could be adjusted to about several ⁇ m to several hundred ⁇ m.
  • the thickness is about 15 ⁇ m.
  • 0.4 ml was injected for gelation and then vitrified for about one week and rehydrated, a collagen vitrigel thin film having a thickness of about 120 ⁇ m could be produced (Non-patent Document 2).
  • the present invention has been made in view of the circumstances as described above, and has a desired shape and is excellent in properties such as practicality and handleability, and a pre-stage of the dried vitrigel membrane. It is an object of the present invention to provide a dried hydrogel and a method for rapidly and mass producing the dried vitrigel membrane and dried hydrogel.
  • the present invention provides the following dried vitrigel membrane, dried hydrogel, and methods for producing them.
  • ⁇ 1> A dried vitrigel membrane having no irregular outer peripheral edge.
  • ⁇ 2> The dried vitrigel film according to ⁇ 1>, which is attached to a substrate.
  • ⁇ 3> The dried vitrigel membrane according to ⁇ 1>, wherein the dried vitrigel membrane is laminated with a peelable film.
  • ⁇ 4> The dried vitrigel membrane according to ⁇ 3>, wherein the film is a parafilm.
  • ⁇ 5> A dried hydrogel having no irregular outer peripheral edge.
  • ⁇ 6> The dried hydrogel according to ⁇ 5>, which is attached to a substrate.
  • a method for producing a dried vitrigel membrane having a desired shape comprising the following steps: (1) A step of holding a hydrogel inside a wall surface mold having the same shape as the desired shape disposed on the substrate and allowing a portion of free water in the hydrogel to flow out from the gap between the substrate and the wall surface mold; (2) removing the wall surface mold from the substrate; (3) A step of drying the hydrogel to remove residual free water and producing a vitrified hydrogel dried body; (4) rehydrating the dried hydrogel to produce a vitrigel membrane; and (5) redrying the vitrigel membrane to remove free water to produce a vitrified dried vitrigel membrane.
  • a method for producing a dried vitrigel membrane ⁇ 10> The method for producing a dried vitrigel membrane according to ⁇ 9>, wherein in the step (1), a support is introduced into the hydrogel inside the wall surface mold. ⁇ 11> The method for producing a dried vitrigel membrane according to ⁇ 9>, wherein in the step (1), free water in the hydrogel is reduced to about 1/4 to 3/4. ⁇ 12> The method for producing a dried vitrigel membrane according to ⁇ 9>, wherein in the step (5), the vitrigel membrane is vitrified on a film from which the dried vitrigel membrane can be peeled. ⁇ 13> The method for producing a dried vitrigel membrane according to ⁇ 12>, wherein the film is a parafilm.
  • a method for producing a dried vitrigel membrane that can be molded into a desired shape comprising the following steps: (1) A hydrogel is held inside a wall mold having an arbitrary shape and placed on a substrate on which a peelable film of a vitrigel membrane is peeled, and a part of free water in the hydrogel is placed on the substrate.
  • ⁇ 16> The method for producing a dried vitrigel membrane according to ⁇ 15>, further comprising a step of peeling the dried vitrigel membrane from the film after the step (6).
  • ⁇ 17> The method for producing a dried vitrigel membrane according to ⁇ 14>, wherein the film is a parafilm.
  • ⁇ 18> The method for producing a dried vitrigel membrane according to ⁇ 14>, wherein in the step (1), a support is introduced into the hydrogel inside the wall surface mold.
  • ⁇ 19> The method for producing a dried vitrigel membrane according to ⁇ 14>, wherein in the step (1), free water in the hydrogel is reduced to about 1/4 to 3/4.
  • a method for producing a dried hydrogel having a desired shape comprising the following steps: (1) A step of holding a hydrogel inside a wall surface mold having the same shape as the desired shape disposed on the substrate and allowing a portion of free water in the hydrogel to flow out from the gap between the substrate and the wall surface mold; (2) removing the wall surface mold from the substrate; (3) A step of drying the hydrogel to remove residual free water and producing a vitrified hydrogel dried body; The manufacturing method of the hydrogel dry body characterized by including this.
  • ⁇ 21> The method for producing a dried hydrogel according to ⁇ 20>, wherein in the step (1), a support is introduced into the hydrogel inside the wall surface mold.
  • ⁇ 22> The method for producing a dried hydrogel according to ⁇ 20>, wherein in the step (1), the free water in the hydrogel is reduced to about 1/4 to 3/4.
  • ⁇ 23> The method for producing a dried hydrogel according to ⁇ 20>, wherein in the step (3), the dried hydrogel is vitrified on a peelable film.
  • ⁇ 24> The method for producing a dried hydrogel according to ⁇ 23>, wherein the film is a parafilm.
  • a method for producing a dried hydrogel that can be molded into a desired shape comprising the following steps: (1) A hydrogel is held inside a wall mold of an arbitrary shape placed on a substrate on which a film from which a dried hydrogel can be peeled is laid, and a part of free water in the hydrogel is placed on the substrate. Flowing out of the gap between the film and the wall mold; (2) removing the wall surface mold from the substrate; (3) A method for producing a dried hydrogel comprising the steps of drying the hydrogel to remove residual free water and producing a vitrified hydrogel dried.
  • ⁇ 30> The method for producing a dried hydrogel according to ⁇ 25>, wherein the film is a parafilm.
  • the dried vitrigel membrane according to the above ⁇ 1> uses collagen as a raw material, and mainly comprises a substantial cornea using a laminate obtained by stacking a plurality of vitrigel membranes obtained by rehydrating the dried vitrigel membrane. Mimicking collagen.
  • the dried vitrigel membrane according to the above ⁇ 1> uses collagen as a raw material.
  • the dried vitrigel membrane is layered, and a corneal membrane using a vitrigel membrane obtained by rehydrating an integrated laminate is obtained. Collagen mimics that mainly make up the substance.
  • the dried vitrigel membrane or dried hydrogel can be peeled from the film and freely handled in the membrane state. Furthermore, in addition to the shape of the wall surface mold, the vitrified dried vitrigel membrane or dried hydrogel can be cut into any shape.
  • FIG. 9 is a view showing a state in which the adhesion between the collagen gel and the wall surface mold is released by slightly moving the wall surface mold up and down in the form of FIG. 8. In the form of FIG. 8, it is the figure which illustrated the form which removed the wall surface mold from the board
  • FIG. 9 is a vertical sectional view of a vitrigel membrane showing the localization of FITC-labeled goat anti-mouse antibody in the vitrigel membrane produced in Example 8. It is the figure which the laminated body of the dried vitrigel membrane containing the agarose produced in Example 9 was rehydrated with PBS and observed with a fluorescence microscope.
  • Embodiment of the manufacturing method of the dried hydrogel of this invention is a manufacturing method of the hydrogel dried body of desired shape, Comprising: The following processes: (1) A step of holding a hydrogel inside a wall surface mold having the same shape as the desired shape disposed on the substrate and allowing a portion of free water in the hydrogel to flow out from the gap between the substrate and the wall surface mold; (2) a step of removing the wall surface mold from the substrate; and (3) a step of drying the hydrogel to remove residual free water and producing a vitrified hydrogel dried body.
  • 1st Embodiment of the manufacturing method of the dried vitrigel membrane of this invention is a manufacturing method of the desired shape vitrigel membrane dried body, Comprising: The said process (3), (4) including a step of rehydrating the dried hydrogel to produce a vitrigel membrane, and (5) redrying the vitrigel membrane to remove free water and producing a vitrified dried vitrigel membrane. .
  • hydrogel refers to a substance in which a polymer has a network structure formed by chemical bonds and has a large amount of water in its network. This refers to a gel made by introducing a crosslink into a polymeric artificial material.
  • hydrogel dry product means a product obtained by removing free water from a hydrogel and vitrifying it.
  • vitrigel membrane refers to a rehydrated body of this hydrogel.
  • the “dried vitrigel membrane” refers to a vitrigel obtained by vitrification again. The dried vitrigel membrane can be rehydrated when necessary to obtain a vitrigel membrane.
  • FIG. 1 is a flowchart illustrating an embodiment of a method for producing a vitrigel film of the present invention.
  • Step (1) The hydrogel is held inside the wall surface mold having the same shape as the desired shape arranged on the substrate, and a part of free water in the hydrogel is caused to flow out from the gap between the substrate and the wall surface mold.
  • the substrate and the wall surface mold materials that can withstand sterilization with 70% ethanol or autoclave can be used as appropriate.
  • specific examples include plastics such as polystyrene and acrylic, glass, stainless steel, and the like.
  • the wall surface mold can be a cylindrical frame that does not have an upper surface and a bottom surface, and the shape of the wall surface mold is designed to be the same as the shape of the desired vitrigel film. Can do. Specifically, for example, when producing a circular vitrigel film, as illustrated in FIG. 2, a wall surface (frame) having an annular shape (cylindrical shape) can be used. Moreover, when producing a rectangular vitrigel film
  • a plurality of wall surface molds can be arranged on a substrate according to a desired number of vitrigel films.
  • the natural product-derived polymer as a raw material used for the production of hydrogel is, for example, collagen, a basement membrane component (trade name: Matrigel) reconstituted from mouse EHS tumor extract, gelatin, agar, agarose , Fibrin, glycosaminoglycan, hyaluronic acid, proteoglycan and the like. It is possible to prepare a hydrogel by selecting components such as salt, concentration, pH and the like that are optimal for each gelation.
  • examples of the synthetic polymer used for producing the hydrogel include polyacrylamide, polyvinyl alcohol, methyl cellulose, polyethylene oxide, poly (2-hydroxyethyl methacrylate) / polycaprolactone, and the like. It is also possible to produce a hydrogel using two or more of these polymers. The amount of hydrogel can be adjusted in consideration of the thickness of the vitrigel film to be produced.
  • the raw material of the hydrogel is preferably collagen, and when the collagen gel is used, a collagen sol can be injected into a wall mold placed on the substrate and gelled with an incubator.
  • collagen sol is illustrated as a raw material for the hydrogel.
  • Collagen sol has physiological salt solution, PBS (Phosphate Buffered Saline), HBSS (Hank's Balanced Salt Solution), basal culture solution. It can be prepared in a serum-free culture solution or a serum-containing culture solution.
  • the pH of the solution during collagen gelation is preferably about 6 to 8.
  • the heat retention during gelation should be lower than the collagen denaturation temperature depending on the animal species of the collagen to be used, but generally it can be gelled at a temperature of 37 ° C. or less for several minutes to several tens of minutes. It can be carried out while keeping the temperature.
  • the collagen sol is too dilute and weakly gelled when the collagen concentration is 0.2% or less, and is too thick and difficult to homogenize when it is 0.3% or more. Therefore, the collagen concentration in the collagen sol is preferably 0.2 to 0.3%, more preferably about 0.25%.
  • the formed collagen gel adheres closely to the substrate and the wall mold, but by leaving it for a predetermined time, as time passes, a part of free water in the collagen gel passes through the gap between the substrate and the wall mold. Out to the outside.
  • the free water in the gelled collagen gel is reduced to about 1/4 to 2/3.
  • the collagen concentration of the gel becomes about 0.375 to 1.0%, so that it is possible to obtain a gel strength that does not distort the gel shape even if the wall surface mold is removed.
  • the free water remaining in the gel with free water flowing out on the substrate can be naturally dried to be removed and vitrified.
  • the time for reducing the free water in the collagen gel to about 1/4 to 2/3 is desirably 2 to 8 hours. Further, the time for free drying and complete removal of the free water remaining in the gel is preferably within 48 hours.
  • the amount of 0.25% collagen sol injected per unit area (1.0 cm 2 ) is preferably 0.1 to 2.4 ml. As a result, collagen containing 250 ⁇ g to 6 mg of collagen per unit area (1.0 cm 2 ) Vitrigel membranes can be made.
  • the first method is a method in which a collagen sol is layered on a collagen vitrigel membrane that has already been prepared or a dried body thereof to gel, vitrify, and rehydrate. By repeating this method, a laminated body in which the collagen vitrigel membrane is layered is obtained, and a collagen vitrigel membrane (laminated body) having an arbitrary thickness can be produced.
  • the second method is a method of embedding a collagen vitrigel membrane already prepared in a collagen sol or a dried product thereof, gelling, vitrifying and rehydrating.
  • a laminated body in which an arbitrary number of collagen vitrigel membranes are embedded can be obtained, and a collagen vitrigel membrane having an arbitrary thickness can be produced. It is also possible to produce a vitrigel film having different components on the front and back sides or in layers by using components other than collagen in the sol used for the multilayer in the first method and the sol used for embedding in the second method.
  • a support can be introduced into the hydrosol inside the wall mold.
  • the support can be exemplified by nylon membrane, wire, cotton gauze, silk thread, other woven materials, bioabsorbable material, etc., and those corresponding to the shape inside the wall surface mold can be used.
  • the support may be an annular nylon membrane having an outer diameter substantially equal to the inner diameter of the wall surface mold illustrated in FIG.
  • Step (2) The wall surface mold is removed from the substrate.
  • Step (3) The hydrogel is dried to remove residual free water, and a vitrified dried hydrogel is produced.
  • the free water in the hydrogel is completely removed and vitrified by drying.
  • the produced hydrogel dried body can be peeled from the film by moving the hydrogel onto a film from which the dried hydrogel dried.
  • the dried hydrogel can also be formed into a desired shape on the film.
  • the film include non-water-absorbing films such as parafilm, saran wrap, and vinyl, and parafilm is particularly preferable.
  • vitrigel film obtained by rehydration after vitrification for a short period of time can be washed with PBS or the like and then vitrified again.
  • drying method for example, various methods such as air drying, drying in a sealed container (circulating air in the container and always supplying dry air), drying in an environment where silica gel is placed, and the like can be used.
  • air drying method include a method of drying in an incubator kept sterile at 10 ° C. and 40% humidity for 2 days, or a method of drying at room temperature all day and night in a sterile clean bench.
  • the dried hydrogel can be rehydrated when necessary to produce a vitrigel membrane, it can be effectively used industrially.
  • the vitrigel membrane obtained by rehydrating the dried hydrogel of the present invention is not accompanied by an unnecessary vitrigel membrane derived from the wall surface (referred to as “indeterminate outer peripheral edge” in the present invention), as will be described later. Is also excellent.
  • Step (4) The dried hydrogel is rehydrated to produce a vitrigel membrane.
  • a vitrigel membrane can be prepared by rehydrating a dried hydrogel with PBS or a culture medium to be used.
  • the liquid to be rehydrated may contain various components such as a physiologically active substance.
  • the physiologically active substance include various pharmaceuticals including antibiotics, cell growth factors, and differentiation induction.
  • factors such as factors, cell adhesion factors, antibodies, enzymes, cytokines, hormones, lectins, or extracellular matrix components that do not gel include fibronectin, vitronectin, entactin, and osteopoietin. It is also possible to contain a plurality of these.
  • drying methods such as air drying, drying in a sealed container (circulating air in the container and always supplying dry air), drying in an environment where silica gel is placed, and the like. Can be used.
  • vitrified dried vitrigel membrane By drying the vitrigel membrane again, a vitrified dried vitrigel membrane can be produced. This dried vitrigel membrane can be converted again to a vitrigel membrane by rehydration when necessary.
  • the vitrigel membrane can be vitrified on a film from which a dried vitrigel membrane such as parafilm can be peeled off.
  • Parafilm is a thermoplastic film that uses paraffin as a raw material, and has the characteristics that it has stretchability and adhesiveness, and is excellent in airtightness and waterproofness.
  • the dried collagen vitrigel membrane By layering the dried vitrigel membrane on a peelable film, the dried collagen vitrigel membrane can be peeled from the film and handled freely in the membrane state. In addition to the shape of the wall surface mold, the vitrified dried vitrigel membrane can be cut into an arbitrary shape.
  • hydrogel dried product contains components of hydrogel
  • Vitrigel membrane dried product contains components remaining in the vitrigel membrane equilibrated with an aqueous solution when the hydrogel dried product is rehydrated. Contains.
  • the vitrigel membrane obtained by rehydrating the dried vitrigel membrane in the step (5) has a longer vitrification period than the vitrigel membrane obtained in the step (4), the strength and transparency. Is excellent.
  • the period of vitrification can be prolonged in the state of “hydrogel dry body”, but “hydrogel dry body” is a state in which all components at the time of hydrogel preparation coexist.
  • “hydrogel dry body” is a state in which all components at the time of hydrogel preparation coexist.
  • unnecessary components are also mixed.
  • the vitrigel membrane after the “hydrogel dried product” is rehydrated to remove unnecessary mixed components, unnecessary components are also removed from the dried product. Therefore, when it is necessary to maintain the vitrification period for a long time, it is preferable to keep the dried vitrigel membrane in this state, which is unnecessary for the vitrigel membrane obtained by rehydrating the dried vitrigel membrane. The point that a component does not mix is excellent.
  • the shape of the wall surface mold is designed to be the same as the shape of the desired vitrigel film, and free water is discharged from the gap between the substrate and the wall surface mold to 1/4 to 3 / After about 4 outflows, the wall surface mold is removed and vitrification is performed by drying, so that a vitrigel film having a desired shape reflecting the shape of the wall surface mold can be obtained. That is, as described above, the conventional method using a culture dish was accompanied by an unnecessary vitrigel thin film derived from the wall of the culture dish (in the present invention, referred to as “amorphous outer peripheral edge”). Can obtain a dried hydrogel or dried vitrigel film that does not have an irregular outer peripheral edge and reflects the shape of the wall surface mold on the substrate.
  • the thickness of the vitrigel film was produced as a thin film (vitrigel thin film) having a maximum thickness of about 120 ⁇ m (Non-patent Document 2).
  • the vitrigel membrane of the present invention can reduce the drying time for removing free water to about 1/2 to 1/4, so that the drying time can be kept within a practical range.
  • the amount of hydrogel injected can be increased as compared with the prior art.
  • a vitrigel film having a thickness of about 1 mm can be easily produced with a practical drying time of about 2 to 3 days.
  • vitrigel membrane and the dried vitrigel membrane are produced, for example, by mixing a physiologically active substance to be contained in a sol solution before gelation and then producing a vitrigel membrane such as gelation and vitrification. You can also.
  • vitrigel membrane and the dried vitrigel membrane containing a physiologically active substance can supply factors necessary for cell adhesion, proliferation, differentiation and the like from the vitrigel membrane side, a better culture environment can be realized. Moreover, it is very useful for conducting a test for examining the effect of the contained physiologically active substance on cells.
  • a vitrigel membrane containing a physiologically active substance can also function as a drug delivery system by being implanted into the body (Non-patent Document 3).
  • the vitrigel membrane produced by the method of the present invention can permeate a physiologically active substance having a large molecular weight, so that between each cell seeded on two different surfaces of the vitrigel membrane. Can greatly contribute to the testing and research of the interaction through the physiologically active substances (Non-patent Document 3).
  • the vitrigel membrane produced by the method of the present invention can be used as a cell culture carrier for culturing animal cells by inserting it into a culture vessel.
  • animal cells to be cultured include primary cultured cells, established cells, fertilized eggs, and cells obtained by introducing a foreign gene into these cells.
  • these cells may be undifferentiated stem cells, cells in the process of differentiation, terminally differentiated cells, and dedifferentiated cells.
  • cell suspension, shredded tissue pieces, fertilized eggs, or seeding of three-dimensionally reconstructed gel cultures or multicellular aggregates (spheroids) can be mentioned. . That is, adherent cells that can be cultured by existing methods can be cultured on the present Vitrigel membrane.
  • one or more types of cells can be cultured on both sides of the above-mentioned cell as well as one side of the vitrigel membrane.
  • double-sided culture it is possible to culture different types of cells on each side.
  • epithelial cells on one side of the vitrigel membrane and mesenchymal cells on the other side such as percutaneous absorption model and intestinal absorption model with epithelial-mesenchymal interaction
  • cell function assays such as an angiogenesis model and a cancer invasion model are made possible.
  • a plurality of collagen vitrigel membranes are stacked to improve transparency, and for example, by culturing cells derived from the cornea on the collagen vitrigel membrane, it can be used as a mimic of the cornea.
  • This corneal mimic can be transplanted into a living body, and can be used as a cornea model in various pharmacological tests.
  • an integrated laminate can be produced by injecting a collagen sol onto the already produced collagen vitrigel membrane dried body, and repeating gelation, vitrification and rehydration.
  • the insertion method a plurality of pre-prepared collagen vitrigel membranes or dried collagen vitrigel membranes are inserted into the collagen sol and then vitrified and rehydrated to produce an integrated laminate. be able to.
  • 2nd Embodiment of the manufacturing method of the hydrogel dry body of this invention is a manufacturing method of the hydrogel dry body which can be shape
  • the wall surface mold can be a cylindrical frame body that does not have an upper surface and a bottom surface, but the shape thereof is arbitrary and is the same shape as the desired hydrogel dry body. There is no need.
  • the film which can peel a hydrogel dry body beforehand is spread
  • the film from which the dried hydrogel can be peeled include non-water-absorbing films such as parafilm, saran wrap, and vinyl. Parafilm is particularly preferable.
  • the hydrogel is dried on the film to remove the remaining free water, and a vitrified hydrogel dried body can be produced.
  • a dried hydrogel layered with the film is obtained.
  • the dried hydrogel Since the dried hydrogel is adsorbed on the film and layered, it has high stability and can be easily cut into a desired shape. It can be cut into a desired shape other than the shape of the wall surface mold. Therefore, in this embodiment, following the step (3), a step of cutting the dried hydrogel layered with the film into a desired shape can be included.
  • disconnected to the desired shape from a film can be included.
  • disconnected to the desired shape from a film can be included.
  • a vitrigel membrane having a desired shape can be obtained.
  • 2nd Embodiment of the manufacturing method of the dry vitrigel membrane of this invention is a manufacturing method of the dry vitrigel membrane which can be shape
  • the dried vitrigel membrane produced according to this embodiment also does not have an irregular outer peripheral edge, it is unnecessary to remove the irregular outer peripheral edge, which was necessary in the past, and the vitrigel membrane can be rapidly and in large quantities. It becomes possible to produce.
  • the conventional vitrigel membrane has been difficult to cut into a desired shape.
  • the dried vitrigel membrane adsorbed on the film and layered has a desired shape even if it has a complicated shape. Can be accurately cut into a shape. Therefore, in this embodiment, the process of cut
  • the dried vitrigel membrane formed into a desired shape can be rehydrated when necessary to obtain a vitrigel membrane having a desired shape. Since it is possible to produce a vitrigel film having a desired shape according to the application, convenience is further improved.
  • stacked on the film is shape
  • the dried vitrigel membrane layered on the film can be easily peeled off from the film. Accordingly, the dried vitrigel membrane formed into a desired shape can be peeled from the film and handled in the membrane state. Therefore, it is expected that the dried vitrigel membrane is excellent in handleability and effectively used for medical materials utilizing characteristics such as moisture absorption.
  • Example 1 Preparation of a dried collagen vitrigel membrane with a cyclic nylon membrane support using a substrate and a wall surface mold (collagen amount: 0.55 to 2.2 mg / cm 2 )
  • a 0.25% sol of bovine dermis-derived type I collagen is By mixing an equal volume of 0.5% type I collagen acidic solution (KOKEN # IAC-50; 5mg / ml) and cell culture medium in a 50ml sterile conical tube (Falcon # 35-2070) cooled on ice. Prepared.
  • the cell culture medium used here was 10% non-immobilized fetal bovine serum (SIGMA # F2442), 20 mM HEPES (GIBCO BRL # 15630-080), and 100 units / ml penicillin and 100 ⁇ g / ml streptomycin (GIBCO BRL # 15140-148) containing Dulbecco's modified Eagle medium (GIBCO BRL # 11885-084).
  • the substrate As the substrate, the bottom surface of a hydrophobic petri dish made of hydrophobic polystyrene having a diameter of 60 mm (Falcon® # 35-1007) was used.
  • the wall mold acrylic having an outer circle diameter of 38 mm, an inner circle diameter of 34 mm, and a height of 10.0 mm was used.
  • the wall surface mold was used after being sterilized by spraying with 70% ethanol. Specifically, one container that can separate the substrate and the wall surface mold was manufactured by installing one wall surface mold on one substrate.
  • the collagen gel is inserted into this container with a single circular nylon membrane support, and immediately after that 2.0 ml, 4.0 ml, 6.0 ml, or 8.0 ml of 0.25% collagen sol is injected and the petri dish lid is placed on the substrate. And then gelled in a 37.0 ° C. moisturizing incubator in the presence of 5.0% CO 2 /95% air. At this time, the injected collagen sol was gelled without flowing out of the gap between the substrate and the wall surface mold. At the 2nd, 4th, 6th, and 8th hours after transfer into the moisturizing incubator at 37.0 ° C, free water in the collagen gel moves from the gap between the substrate and the wall mold to the outside of the wall mold. The amount of spilled water was quantified, and free water spilled at each time was removed. The adhesion between the collagen gel and the wall surface mold was released by slightly moving the wall surface mold up and down at 2 hours.
  • the wall surface mold was removed from the substrate at 8 hours. At this time, the wall surface mold was not adhered to the collagen gel, and the adhesion of the collagen gel around the inner wall of the wall surface mold removed from the substrate was completely absent. There wasn't. In the 8th hour, transfer to a clean bench under the condition of 10.0 ° C -40% humidity from a moisturizing incubator at 37.0 ° C ⁇ . After that, free water that flows out with the petri dish lid removed will flow into the collagen gel. Free water remaining in the glass was completely removed by natural drying to obtain a dried collagen gel that was vitrified. Here, vitrification starts from the stage where the free water remaining in the collagen gel is completely removed. Therefore, the approximate time required for natural drying until this vitrification started was measured.
  • the time required for vitrification to start (until the free water remaining in the collagen gel is completely removed to become a dried collagen gel) is 2.0 ml and 4.0 ml of 0.25% collagen collagen gel.
  • the time required for vitrification to start is 2.0 ml and 4.0 ml of 0.25% collagen collagen gel.
  • FIG. 4 The collagen vitrigel membrane with a cyclic nylon membrane support is shown in FIG. 4 from the left, with 5.0 mg collagen (derived from collagen sol 2.0 ml), 10.0 mg (derived from collagen sol 4.0 ml), 15.0 mg (collagen sol 6.0 ml). Origin), and 20.0 mg (derived from collagen sol 8.0 ml).
  • the collagen vitrigel membrane with a circular nylon membrane support was coated with a hydrophilic polystyrene culture dish (Falconal # 35-3001) with a diameter of 35 mm and a parafilm (Pechiney Plastic Packaging) with a diameter of 60 mm. It was transferred to a culture petri dish made of water-soluble polystyrene (Falcon # 35-1007) and left for about 1-2 days in a clean bench under a condition of 10.0 ° C 40% humidity to dry completely. Then, transfer to a clean bench at room temperature, cover each petri dish, store and aseptically store at room temperature, and proceed to vitrification to dry the collagen vitrigel membrane with each cyclic nylon membrane support The body was made.
  • the dried collagen vitrigel membrane with cyclic nylon membrane support produced on the latter parafilm the dried collagen vitrigel membrane with cyclic nylon membrane support is in a state of being adsorbed on the parafilm, and It could be easily peeled off from the parafilm in a dry state. Therefore, the dried collagen vitrigel membrane with the cyclic nylon membrane support adsorbed on the parafilm or the dried collagen vitrigel membrane with the cyclic nylon membrane support peeled off from the parafilm is excellent in handleability as a biomaterial and useful. .
  • the dried collagen vitrigel membrane with a cyclic nylon membrane support is 0.55 mg collagen (derived from collagen sol 2.0 ml), 1.1 mg (derived from collagen sol 4.0 ml), 1.6 mg per unit area (1.0 cm 2 ) Collagen sol 6.0ml) or 2.2mg (collagen sol 8.0ml).
  • a dried collagen vitrigel membrane without a cyclic nylon membrane support can be produced.
  • the collagen vitrigel membrane dry body which has arbitrary shapes and thickness is producible by changing the bottom plane shape and height of a wall surface casting_mold
  • a conventional hydrophobic polystyrene made of 35 mm in diameter Experiments were performed in the same manner as in Example 1 using a culture dish (Falcon # 35-1008).
  • one cyclic nylon membrane support is inserted into this culture dish, and immediately after that, 2.0 ml, 4.0 ml, 6.0 ml, or 8.0 ml of 0.25% collagen sol is injected.
  • the lid of the Petri dish was prepared by gelling at a humidified incubator at 37.0 ° C. in 5.0% CO 2/95% air presence.
  • the amount of free water that exudes to the upper surface of the collagen gel was quantified, and each time The free water that exudes was removed. As a result, it was found that only 10% or less of free water exuded from the upper surface of any collagen gel by 8 hours (Table 3).
  • vitrification starts from the stage where the free water remaining in the collagen gel is completely removed. Therefore, the approximate time required for natural drying until this vitrification started (until the free water remaining in the collagen gel was completely removed to form a dried collagen gel) was measured. As a result, since 90% or more of free water remains in any collagen gel, the time required for vitrification to start is 21 hours or more and 41 hours in the case of 2.0 ml of 0.25% collagen collagen gel. Within 4.0 hours of 0.25% collagen collagen gel, 41 hours or more within 48 hours, 6.0 ml of 0.25% collagen collagen gel within 48 hours (2 days) or more within 3 days, or 8.0 ml of 0.25% collagen collagen was from 3 days to 4 days (Table 4).
  • a collagen vitrigel membrane with a membrane support was prepared. Then, a collagen vitrigel membrane with a cyclic nylon membrane support equilibrated in PBS was prepared by rinsing with 2.0 ml of PBS several times. The collagen vitrigel membrane with the cyclic nylon membrane support was accompanied by an extra collagen vitrigel membrane (indefinite outer peripheral edge) derived from the petri dish wall around the outer circle with a diameter of 33 mm of the cyclic nylon membrane support. (FIG. 5).
  • this collagen vitrigel membrane with a cyclic nylon membrane support is shown in FIG. 5, from the left side of collagen, 5.0 mg (derived from collagen sol 2.0ml), 10.0 mg (derived from collagen sol 4.0ml), 15.0 mg (collagen sol 6.0ml Origin) or 20.0 mg mg (derived from collagen sol 8.0 ml), but if the excessive collagen vitrigel membrane derived from the wall surface is cut off, the accurate collagen content cannot be calculated.
  • Example 2 Preparation of dried collagen vitrigel membrane (collagen amount: 0.52 to 2.1 mg / cm 2 ) adsorbed to parafilm using parafilm laid on substrate and wall surface mold
  • the bottom surface of a hydrophobic polystyrene culture dish (Falcon # 35-1007) was used.
  • As the wall mold acrylic having an outer circle diameter of 39 mm, an inner circle diameter of 35 mm, and a height of 10.0 mm was used.
  • Parafilm (Pechiney Plastic Packaging) was cut into a circle with a diameter of 50 mm. Both the wall mold and parafilm were used after being sterilized by spraying with 70% ethanol.
  • a single parafilm cut into a circle with a diameter of 50 mm is laid on the bottom surface of a hydrophobic petri dish made of hydrophobic polystyrene with a diameter of 60 mm, and a single wall mold is placed on the parafilm.
  • a single container that can separate the parafilm and the wall mold placed on the wall was prepared.
  • Collagen gel is poured into this container with 2.0ml, 4.0ml, 6.0ml, or 8.0ml of 0.25% collagen sol and covered with a petri dish, then 37.0 ° C in the presence of 5.0% CO 2 /95% air. It was prepared by gelling in a moisturizing incubator. At this time, the injected collagen sol was gelled without flowing out of the gap between the parafilm laid on the substrate and the wall surface mold.
  • collagen gels derived from collagen sol 6.0 ml and 8.0 ml are more than 1/3 by 4 hours
  • collagen gels derived from collagen sol 4.0 ml are about 1/3 by 6 hours
  • collagen sol 2.0 ml It was found that about 1 ⁇ 4 of free water had flowed out of the wall mold by 8 hours (Table 5).
  • the wall surface mold was removed from the substrate at 8 hours. At this time, the wall surface mold was not adhered to the collagen gel, and the collagen gel was removed around the inner wall of the wall surface mold removed from the parafilm laid on the substrate. There was no adhesion. In the 8th hour, transfer to a clean bench under the condition of 10.0 ° C -40% humidity from a moisturizing incubator at 37.0 ° C ⁇ . After that, free water that flows out with the petri dish lid removed will flow into the collagen gel. The free water remaining in was completely removed by natural drying to obtain a dried collagen gel.
  • vitrification starts from the stage where the free water remaining in the collagen gel is completely removed. Therefore, the approximate time required for natural drying until this vitrification started (until the free water remaining in the collagen gel was completely removed to form a dried collagen gel) was measured. As a result, the time required for vitrification to start was within 20 hours for 2.0 ml of 0.25% collagen collagen gel, and more than 20 hours for 4.0 ml, 6.0 ml and 8.0 ml 0.25% collagen gel. Within time (Table 6).
  • the collagen vitrigel membrane adsorbed on the parafilm is transferred to a hydrophobic polystyrene culture dish (Falcon # 735-1007) with a diameter of 60 mm, and the lid is placed in a clean bench under the condition of 10.0 ° C 40% humidity. After leaving it to stand for about 1 to 2 days and completely drying, transfer it to a clean bench at room temperature, cover the petri dish, store it aseptically at room temperature, and proceed with vitrification.
  • a dried collagen vitrigel membrane adsorbed on parafilm was prepared.
  • the dried collagen vitrigel membrane adsorbed on the parafilm could be easily cut into a desired fine shape with scissors or a scalpel. Further, the dried collagen vitrigel membrane could be easily peeled off from the parafilm (FIG. 6).
  • Collagen vitrigel membrane prepared in this step has a collagen content of 5.0 mg (derived from collagen sol 2.0 ml), 10.0 mg (derived from collagen sol 4.0 ml), 15.0 mg (derived from collagen sol 6.0 ml), or 20.0 mg (collagen sol 8.0). Contained from ml).
  • the dried collagen vitrigel membrane produced in this step is 0.52 mg (derived from collagen sol 2.0 ml) and 1.0 mg (derived from collagen sol 4.0 ml) per unit area (1.0 cm 2 ) from the left in FIG. ), 1.6 mg (derived from collagen sol 6.0 ml), or 2.1 mg (derived from collagen sol 8.0 ml).
  • the dried collagen vitrigel membrane with a cyclic nylon membrane support can be produced while adsorbed on the parafilm (FIG. 7).
  • the collagen vitrigel membrane dried body having an arbitrary shape and thickness can be produced while adsorbed on the parafilm.
  • Example 3 Rapid mass production method of a dried collagen vitrigel membrane with a cyclic nylon membrane support using a substrate and a wall surface mold
  • a substrate the bottom of a 100 mm x 100 mm hydrophobic polystyrene culture petri dish (Falcon # 35-1112) The surface was used.
  • the wall mold four acrylics having an outer circle diameter of 38 mm, an inner circle diameter of 34 mm, an outer circle and a height of 10.0 mm were used.
  • the wall surface mold was used after being sterilized by spraying with 70% ethanol.
  • four containers that can separate the substrate and the wall surface mold were prepared by installing four wall surface molds on one substrate. Insert one cyclic nylon membrane support into each container, inject 2.0 ml of 0.25% collagen sol, cover the substrate with a petri dish, and then moisturize at 37.0 ° C in the presence of 5.0% CO 2 /95% air
  • Four collagen gels were produced on one substrate by gelling in an incubator. At this time, the injected collagen sol was gelled without flowing out of the gap between the substrate and the wall surface mold (FIG. 8).
  • vitrification starts from the stage where the free water remaining in the collagen gel is completely removed. Natural drying was completed within one day until this vitrification started (until the free water remaining in the collagen gel was completely removed to obtain a dried collagen gel).
  • One or two days after vitrification transfer to a clean bench at room temperature, add 20 ml of PBS into the petri dish of the substrate, rehydrate and peel off the substrate, collagen vitrigel with a cyclic nylon membrane support Four membranes were made simultaneously. Thereafter, the same operations as in Example 1 were performed to simultaneously produce four dried collagen vitrigel membranes with a cyclic nylon membrane support containing 0.55 mg of collagen per unit area (1.0 cm 2 ).
  • Example 4 Production of a dried collagen vitrigel membrane with a cyclic nylon membrane support using a substrate and a wall surface mold (collagen amount: 2.7 to 11.0 mg / cm 2 )
  • a container capable of separating the substrate and the wall surface mold of Example 1 In order to be able to inject 0.25% collagen sol from 10.0 ml to 40.0 ml, a wall surface mold having a height higher than that of the wall surface mold used in Example 1 was prepared, and the same experiment as in Example 1 was performed. went.
  • a wall surface mold made of acrylic having an outer circle diameter of 38 mm, an inner circle diameter of 34 mm, and heights of 30.0 mm and 60.0 mm was prepared.
  • the substrate As the substrate, the bottom surface of a hydrophobic polystyrene culture petri dish (Falcon # 35-1007) with a diameter of 60 mm for a wall mold with a height of 30.0 mm, and a hydrophobic polystyrene with a size of 100 mm x 100 mm for a wall mold with a height of 60.0 mm
  • the bottom surface of a culture dish (Falcon # 35-1112) was used.
  • one wall mold was placed on one substrate to produce one container capable of separating the substrate and the wall mold, and one annular nylon membrane support was inserted into each container.
  • a collagen gel was prepared by gelation in a moisturizing incubator at 37.0 ° C. At this time, the injected collagen sol was gelled without flowing out of the gap between the substrate and the wall surface mold. At the 2nd, 4th, 6th, and 8th hours after transfer into the moisturizing incubator at 37.0 ° C, free water in the collagen gel moves from the gap between the substrate and the wall mold to the outside of the wall mold. The amount of spilled water was quantified, and free water spilled at each time was removed. The adhesion between the collagen gel and the wall surface mold was released by slightly moving the wall surface mold up and down at 2 hours.
  • the wall surface mold was removed from the substrate at 8 hours. At this time, the wall surface mold was not adhered to the collagen gel, and the adhesion of the collagen gel around the inner wall of the wall surface mold removed from the substrate was completely absent. There wasn't. At 8 hours, the sample was transferred from a moisturizing incubator at 37.0 ° C to a clean bench under conditions of 10.0 ° C and 40% humidity, and then the free water that flowed out with the petri dish lid removed.
  • a hydrophobic petri dish made of hydrophobic polystyrene with a diameter of 60 mm in which a 0.25% collagen collagen sol from 10.0 ml to 20.0 ml was injected into a wall mold having a height of 30.0 mm free water remaining in the collagen gel was removed by natural drying. Completely removed and a vitrified collagen gel was obtained.
  • a 100 mm x 100 mm hydrophobic polystyrene culture dish in which a 0.25% collagen collagen sol ranging from 24.0 ml to 40.0 ml is injected into a 60.0 mm high wall mold has a large amount of free water flowing out, resulting in a high temperature of 10.0 ° C and 40% humidity.
  • vitrification starts from the stage where the free water remaining in the collagen gel is completely removed. Therefore, the approximate time required for natural drying until this vitrification started was measured. As a result, the time required for vitrification to start (until the free water remaining in the collagen gel is completely removed to become a dried collagen gel) is 21 hours or more for 10.0 ml of 0.25% collagen gel. Within 37 hours, in the case of 12.0 ml of 0.25% wrinkle collagen gel, it was 40 hours or more and within 43 hours, and in the case of 16.0 ml and 20.0 ml of 0.25% wrinkle collagen gel, it was within 37 hours or more and within 40 hours (Table 9).
  • the time required for natural drying is 62 hours at the longest for 0.25% collagen collagen gel from 10.0 ml to 40.0 ml, and vitrification occurs within 3 days after injecting collagen sol into the container consisting of the substrate and the wall mold. It was found that a dried collagen gel was obtained.
  • This collagen vitrigel membrane with a circular nylon membrane support reflects the shape of the inner circle (area: 9.1 cm 2 ) of the wall mold with a diameter of 34 mm, with a slight clearance around the outer circle with a diameter of 33 mm of the cyclic nylon membrane support. It was embedded.
  • Collagen vitrigel membrane prepared in this process is 25.0 mg (derived from collagen sol 10.0ml), 30.0 mg (derived from collagen sol 12.0ml), 40.0 mg (derived from collagen sol 16.0ml), 50.0 mg (20.0ml collagen sol) Origin), 60.0 mg (derived from collagen sol 24.0ml), 70.0 mg (derived from collagen sol 28.0ml), 80.0 mg (derived from collagen sol 32.0ml), 90.0 mg (derived from collagen sol 36.0ml), or 100.0 mg (collagen sol 40.0ml) Contained from ml).
  • the collagen vitrigel membrane with a circular nylon membrane support was coated with a hydrophilic polystyrene culture dish (Falconal # 35-3001) with a diameter of 35 mm and a parafilm (Pechiney Plastic Packaging) with a diameter of 60 mm. It was transferred to a culture petri dish made of water-soluble polystyrene (Falcon # 35-1007) and left for about 1-2 days in a clean bench under a condition of 10.0 ° C 40% humidity to dry completely. Then, transfer to a clean bench at room temperature, cover each petri dish, store and aseptically store at room temperature, and proceed to vitrification to dry the collagen vitrigel membrane with each cyclic nylon membrane support The body was made.
  • the dried collagen vitrigel membrane produced in this process has 2.7 mg (derived from collagen sol 10.0 ml), 3.3 mg (derived from collagen sol 12.0 ml), 4.4 mg (collagen sol 16.0) per unit area (1.0 cm 2 ). ml), 5.5 mg (derived from collagen sol 20.0 ml), 6.6 mg (derived from collagen sol 24.0 ml), 7.7 mg (derived from collagen sol 28.0 ml), 8.8 mg (derived from collagen sol 32.0 ml), 9.9 mg (collagen sol 36.0) 11.0 mg (derived from collagen sol 40.0 ml).
  • one circular nylon membrane support was inserted into this culture dish, and immediately after that, an attempt was made to inject 0.25% collagen sol from 10.0 ml to 40.0 ml, but 10.0 ml 0.25% collagen sol
  • collagen sol injected from the height of the petri dish rises in a dome shape and cannot be capped, and if more than 12.0 ml of 0.25% collagen collagen sol is injected, it may overflow beyond the allowable amount of the petri dish I understood.
  • a collagen gel of 10.0 ml or more cannot be produced with a conventional hydrophobic polystyrene culture dish having a diameter of 35 mm.
  • Example 5 Measurement of the thickness of a collagen vitrigel membrane without a cyclic nylon membrane support produced using a substrate and a wall surface mold
  • the diameter of the outer circle is 39 mm and the diameter of the inner circle is 35 mm.
  • each collagen gel was completely removed by natural drying over 3 days to obtain a dried collagen gel that was vitrified.
  • Transfer each collagen gel dry body on the first day after vitrification to a clean bench at room temperature add 20.0 ml of PBS to the petri dish of the substrate, rehydrate and peel off the collagen vitrigel membrane from the substrate. Produced. Then, a collagen vitrigel membrane equilibrated with PBS was prepared by rinsing with PBS several times.
  • Each collagen vitrigel film reflected the shape of an inner circle (area: 9.6 cm 2 ) having a diameter of 35 mm of the wall surface mold and did not have an irregular outer peripheral edge.
  • each collagen vitrigel membrane without the cyclic nylon membrane support thus prepared was measured. Specifically, it is mounted on a micrometer (Mitutoyo Digimatic Micrometer # MDC-25M) with one collagen vitrigel membrane sandwiched between two slide glasses (Matsunami # S-0317). did.
  • collagen vitrigel membrane containing 50.0 mg of collagen (derived from collagen sol 20.0ml) is 428 ⁇ 148.1 ⁇ m (measured three times)
  • collagen vitrigel membrane containing 60.0 mg (derived from collagen sol 24.0ml) is 635 ⁇ 21.4
  • Collagen vitrigel membrane containing ⁇ m (measured 3 times) and 70.0 mg (derived from collagen sol 28.0ml) is 714 ⁇ 34.6 ⁇ m (measured 3 times)
  • collagen vitrigel membrane containing 80.0 mg (derived from 32.0ml collagen sol) is 774
  • Example 6 Production of a laminate in which dried collagen vitrigel membranes were layered As a substrate, the bottom surface of a 100 mm x 100 mm hydrophobic polystyrene culture petri dish, as a wall mold, the outer circle had a diameter of 38 mm and an inner circle Four acrylics with a diameter of 34 mm and a height of 30 mm were used. By installing four wall surface molds on one substrate, four containers capable of separating the substrate and the wall surface mold were produced.
  • the adhesion between the collagen gel and the wall surface mold was released by slightly moving the wall surface mold up and down. Thereafter, about 1/4 of the free water flowed out of the wall mold by 4-6 hours, and the wall mold was removed from the substrate. After removing the free water that has flowed out, it is transferred to a clean bench under the condition of 10.0 ° C and 40% humidity. After that, the free water remaining in the collagen gel is removed by natural drying for 2 days with the petri dish lid removed. It was completely removed to obtain a dried collagen gel.
  • This vitrified collagen gel dried body is rehydrated by adding 10 ml of cell culture solution (same composition as in Example 1) into the petri dish of the substrate, and then peeled off from the substrate. Four regel films were prepared.
  • the layered product in which the collagen vitrigel membrane was layered contained 15.0 mg of collagen, reflecting the shape of the inner circle of the wall mold with a diameter of 34 mm.
  • the thickness of the laminate (derived from 0.25% collagen sol 2.0 ml x 3 layers) with a layered collagen vitrigel membrane was measured on a micrometer and found to be 65 ⁇ 2 ⁇ m (average of 3 measurements). It was.
  • this collagen vitrigel membrane laminate was transferred to a 100 mm x 100 mm hydrophobic polystyrene culture dish with parafilm on the bottom, and the lid was removed in a clean bench at 10.0 ° C and 40% humidity. In this state, it was left in the collagen gel for about 1 day and dried completely. After that, the petri dish was capped and aseptically stored and maintained at room temperature to advance vitrification, thereby preparing a laminate in which the dried collagen vitrigel membrane was layered.
  • the laminate of the dried collagen vitrigel membrane produced in this step contained 1.65 mg of collagen per unit area (1.0 cm 2 ).
  • Example 7 Production of a laminate in which individually produced dried collagen vitrigel membranes were layered As a substrate, the bottom of a 100 mm x 100 mm hydrophobic polystyrene culture petri dish, as a wall mold, the diameter of the outer circle 4 acrylics with an inner circle diameter of 34 mm and a height of 30 mm were used. By installing four wall surface molds on one substrate, four containers capable of separating the substrate and the wall surface mold were produced. After injecting 2.0 ml of 0.25% collagen sol into each container, insert the dried Vitrigel membrane prepared from Example 4 (derived from 10.0 ml of 0.25% collagen sol) and inject 2.0 ml of 0.25% collagen sol again.
  • the adhesion between the collagen gel and the wall surface mold was released by slightly moving the wall surface mold up and down. After that, about 1/3 of the free water flowed out of the wall mold by the third hour, so the wall mold was removed from the substrate. After removing the free water that has flowed out, it is transferred to a clean bench under the condition of 10.0 ° C and 40% humidity. After that, the free water remaining in the collagen gel is removed by natural drying for 2 days with the petri dish lid removed. Completely removed to obtain a laminate in which the dried collagen gel was layered.
  • collagen vitrigel membranes Four layers of collagen vitrigel membranes were prepared by adding 20 ml of PBS in the petri dish of the glass and rehydrating the laminated layer of the vitrified collagen gel dried body and separating from the substrate. Then, by rinsing with PBS several times, four laminates of collagen vitrigel membrane equilibrated with PBS were prepared.
  • This collagen vitrigel membrane laminate contained 65.0 mg of collagen, reflecting the shape of the inner circle of the wall surface mold with a diameter of 34 mm.
  • this collagen vitrigel membrane laminate was transferred to a 100 mm x 100 mm hydrophobic polystyrene culture dish with a parafilm on the bottom, and the lid was removed in a clean bench at 10.0 ° C and 40% humidity. In this state, it was left in the collagen gel for about 1 day and dried completely. Thereafter, the petri dish was capped and stored and maintained at room temperature aseptically to advance vitrification, thereby preparing a laminate of dried collagen vitrigel membranes.
  • the laminate of the dried collagen vitrigel membrane produced in this step contains 7.15 mg of collagen per unit area (1.0 cm 2 ).
  • Example 8 Production of dried Vitrigel membrane containing FITC-labeled goat anti-mouse antibody
  • Four acrylics with a circle diameter of 34 mm and a height of 30 mm were used.
  • four wall surface molds By installing four wall surface molds on one substrate, four containers capable of separating the substrate and the wall surface mold were produced.
  • the adhesion between the collagen gel and the wall mold was released by slightly moving the wall mold up and down. Thereafter, about 1/3 of the free water flowed out of the wall mold by 4-6 hours, and the wall mold was removed from the substrate. After removing the free water that has flowed out, it is transferred to a clean bench under the condition of 10.0 ° C and 40% humidity. After that, the free water remaining in the collagen gel is removed by natural drying for 2 days with the petri dish lid removed. It was completely removed to obtain a dried collagen gel.
  • This vitrified collagen gel dried body is rehydrated by adding 10 ml of cell culture solution (same composition as in Example 1) into the petri dish of the substrate, and then peeled off from the substrate.
  • cell culture solution standard composition as in Example 1
  • Four regel films were prepared. After removing the cell culture medium, four wall molds are placed on one substrate so that one collagen vitrigel membrane with a cyclic nylon membrane support is inserted into each container. Four containers that could be separated were made again.
  • each container was injected with 0.25% collagen sol containing 2.0 ml of 1% FITC-labeled goat anti-mouse IgG antibody solution, gelled, free water in the collagen gel, 10.0 ° C, 40% humidity A series of operations of complete removal of free water under conditions and rehydration with 10 ml of cell culture medium was performed.
  • a collagen vitrigel membrane with a cyclic nylon membrane support and a collagen vitrigel membrane containing FITC-labeled goat anti-mouse IgG antibody were layered.
  • the thickness of the thus prepared collagen vitrigel membrane laminate (0.25% collagen sol 2.0 ml + 2.0 ml + 2.0 ml (total 6 ml)) was measured according to the method of Example 6. As a result, 60 ⁇ 3 ⁇ m (three times) Measurement average).
  • this collagen vitrigel membrane laminate was transferred to a 100 mm x 100 mm hydrophobic polystyrene culture dish with parafilm on the bottom, and the lid was removed in a clean bench at 10.0 ° C and 40% humidity. In this state, it was left in the collagen gel for about 1 day and dried completely. Then, cover the petri dish and store it aseptically at room temperature and proceed to vitrification, so that collagen vito containing FITC-labeled goat anti-mouse IgG antibody is present between the two collagen vitrigel membranes.
  • a layered product of dried collagen vitrigel membranes was prepared, with the dried rigerized material sandwiched therebetween.
  • the laminate of the dried collagen vitrigel membrane produced in this step contained 1.65 mg of collagen per unit area (1.0 cm 2 ).
  • the laminate of the dried collagen vitrigel membrane was rehydrated with PBS and observed with a fluorescence microscope (Nikon). As a result, the fluorescence (green) peculiar to FITC could be observed (FIG. 11 (A)). In addition, the laminate produced by the method of Example 6 could not observe the fluorescence specific to FITC (FIG. 11 (B) magnification 10 times).
  • the FITC-labeled goat anti-mouse antibody was localized in the vitrigel membrane of the prepared collagen vitrigel membrane laminate.
  • the collagen vitrigel membrane laminate was embedded in Tissue-Tek® O.C.T. compound and frozen.
  • FITC-specific fluorescence remained in the intermediate layer of the collagen vitrigel membrane having a three-layer structure and could be observed (FIG. 12, (40x magnification).
  • the FITC-labeled goat anti-mouse antibody was gradually released from the laminate of the prepared collagen vitrigel membrane dried body. Specifically, a laminate of the dried collagen vitrigel membrane was placed in a container, 5 ml of PBS was injected, and then held in a 37.0 ° C. moisturizing incubator. PBS was collected on the 3rd day and 5 ml of PBS was newly injected, and then kept in the same manner. The PBS was again collected on the 6th day, and each PBS was measured with a fluorescent plate reader (Molecular Devices).
  • FITC-labeled goat anti-mouse antibody (FITC-labeled goat anti-mouse antibody used for preparation) (When the amount was 100%) was detected in PBS.
  • 8.33% FITC-labeled goat anti-mouse antibody was also detected in the step of preparing a laminate of dried collagen vitrigel membrane (in rehydrated PBS). From the above, it is clear that the FITC-labeled goat anti-mouse antibody remaining in the intermediate layer of the prepared layered collagen vitrigel membrane is slowly released into PBS via the outer layer of the layered body. became.
  • Example 9 Preparation of a dried body of collagen vitrigel membrane having an agarose vitrigel membrane as an intermediate layer
  • a substrate the bottom of a 100 mm x 100 mm hydrophobic polystyrene culture dish, and as a wall mold, the diameter of the outer circle is Four acrylics with an inner circle diameter of 34 mm and a height of 30 mm were used.
  • four wall surface molds By installing four wall surface molds on one substrate, four containers capable of separating the substrate and the wall surface mold were produced.
  • the adhesion between the collagen gel and the wall mold was released by slightly moving the wall mold up and down. Thereafter, about 1/3 of the free water flowed out of the wall mold by 4-6 hours, and the wall mold was removed from the substrate. After removing the free water that has flowed out, it is transferred to a clean bench under the condition of 10.0 ° C and 40% humidity. After that, the free water remaining in the collagen gel is removed by natural drying for 2 days with the petri dish lid removed. It was completely removed to obtain a dried collagen gel.
  • This vitrified collagen gel dried body is rehydrated by adding 10 ml of cell culture solution (same composition as in Example 1) into the petri dish of the substrate, and then peeled off from the substrate. Four regel films were prepared.
  • a single wall mold was placed on the substrate (hydrophobic polystyrene petri dish with a diameter of 60 mm) to produce a container that can separate the substrate and the wall mold, and a collagen vitrigel membrane with a cyclic nylon membrane support was placed in this container. 1 was inserted.
  • 2% agarose containing 1 ml of 1% FITC-labeled goat anti-mouse IgG antibody was injected into this container.
  • 2% agarose containing 1% FITC-labeled goat anti-mouse IgG antibody was prepared by adding 0.2 g of agarose (Nippon Gene) to 9.9 ml of PBS and dissolving it by heating to about 37 ° C. It was prepared by cooling and further adding 0.1 ml FITC-labeled goat anti-mouse IgG antibody solution and mixing well.
  • this laminate was transferred to a 100 mm x 100 mm hydrophobic polystyrene culture dish with a parafilm on the bottom, and the collagen gel was removed in a clean bench under a condition of 10.0 ° C and 40% humidity. And left to dry for about 1 day. Agarose bitum containing FITC-labeled goat anti-mouse IgG antibody between the two dried collagen vitrigel membranes is then kept aseptically kept at room temperature and kept vitrified after the petri dish is capped.
  • a laminate dry collagen-agarose vitrigel membrane with a cyclic nylon membrane support
  • the laminate of the dried vitrigel membrane produced in this step contained 1.1 mg collagen and 4.4 mg agarose per unit area (1.0 cm 2 ).
  • the laminate of the prepared dried vitrigel membrane was rehydrated with PBS and observed with a fluorescence microscope (Nikon). As a result, FITC-specific fluorescence (green) could be observed (FIG. 13, magnification 10 times).
  • Example 10 Study on improvement of transparency of thick vitrigel film
  • a vitrigel film having a thicker thickness than the conventional one could be produced.
  • We studied to improve transparency which is one of the above.
  • Ten dried vitrigel membranes (derived from 2 ml of 0.25% collagen sol) having a long vitrification period (3 months or more) prepared according to the method of Example 1 were prepared and rehydrated with 3 ml of PBS each. After rehydration, the sheets were stacked one by one so that air did not enter.
  • the transparency of the Vitrigel film was measured for absorbance (measurement wavelength: 400 nm) using a spectrophotometer (JASCO). As a result, the absorbance of each was 0.148 for 1 sheet, 0.208 for 2 sheets, 0.415 for 5 sheets, and 0.803 for 10 sheets (FIG. 14).
  • a thick vitrigel membrane dried body (derived from 20 ml of 0.25% collagen sol) having a long vitrification period (over 3 months) prepared according to the method of Example 4 was rehydrated with PBS, and similarly Absorbance was measured. As a result, the absorbance was 1.67.
  • the absorbance increases and the transparency decreases, but the absorbance when 10 layers are stacked is 1 of the absorbance of one thick vitrigel membrane dried body (derived from 20 ml of 0.25% collagen sol). / 2, more transparent. Transparency at the time of rehydration could be improved by superimposing non-integrated vitrigel films with advanced vitrification (FIG. 15). Therefore, by stacking a plurality of vitrigel membranes to a desired thickness, the cornea having excellent transparency can be used as a mimic of collagen that mainly constitutes the substance.
  • Example 11 Production of a thick vitrigel film excellent in transparency
  • a bottom surface of a 100 mm x 100 mm hydrophobic polystyrene culture petri dish, and a wall mold the outer circle diameter is 38 mm and the inner circle diameter is 34 mm.
  • An acrylic container with a height of 18 mm was used.
  • nine vitrigel membrane dried bodies derived from 2 ml of 0.25% collagen sol
  • a long vitrification period over 3 months
  • the thick Vitrigel membrane dried body (derived from 20 ml of 0.25% collagen sol) prepared according to Example 4 was rehydrated with PBS, and the absorbance was measured in the same manner. As a result, the absorbance was 2.12 (average of 3 times).
  • the transparency of the thick vitrigel film was improved by the fabrication method by the multilayer integration compared to the single fabrication method (FIG. 16). Therefore, by integrating a plurality of vitrigel membranes to obtain a desired thickness, it can be used as a mimic of collagen that mainly constitutes the substance of the cornea having excellent transparency.

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Abstract

以下の工程：（１）基板上に配置された、前記所望形状と同形状の壁面鋳型内部にハイドロゲルを保持して、ハイドロゲル内の自由水の一部を基板と壁面鋳型の間隙から流出させる工程；（２）壁面鋳型を基板上から除去する工程；（３）ハイドロゲルを乾燥させて残留する自由水を除去し、ガラス化したハイドロゲル乾燥体を作製する工程；（４）ハイドロゲル乾燥体を再水和してビトリゲル膜を作製する工程、および（５）ビトリゲル膜を再乾燥させて自由水を除去し、ガラス化したビトリゲル膜乾燥体を作製する工程を含む方法によってビトリゲル膜乾燥体を製造する。

Description

ハイドロゲル乾燥体、ビトリゲル膜乾燥体およびこれらの製造方法
　本発明は、不定形外周縁部をもたないハイドロゲル乾燥体、ビトリゲル膜乾燥体およびこれらの製造方法に関する。
　創薬の研究には、様々な機能細胞を用いて生体を反映した３次元培養モデルを簡便に構築できる培養システムの開発が長く求められてきた。特にコラーゲンゲルを細胞の培養担体に用いる３次元培養技術は、血管新生モデル、がん湿潤モデル、上皮間充織モデルなどを再構築するのに有用であるが、幅広く普及するには至っていなかった。
　その理由としては、従来のコラーゲンゲルは、低密度の線維で構成されるため柔らかく取り扱いが困難であること、また、不透明であるため培養細胞の位相差顕微鏡観察は必ずしも容易でないこと等が考えられてきた。
　このような問題を解決するため、本発明者は、低温でゲル化（gelation）に至適な塩濃度と水素イオン濃度（pH）を付与したコラーゲンのゾルを培養シャーレ内に注入して、さらに至適な温度に保温することでコラーゲンのゾルをゲル化した後、低温で十分に乾燥させることで自由水のみならず結合水も徐々に除去してガラス化（vitrification）し、さらに再水和（rehydration）することで、コラーゲンゲルの物性を、強度と透明性に優れた薄膜に再現性良く変換する技術を確立している（特許文献１）。
　そして、ハイドロゲルであればコラーゲン以外の成分のゲルでも、ガラス化した後に再水和することで、ゲルを安定した新しい物性状態に変換することができるので、このガラス化工程を経て作製された新しい物性状態のゲルをビトリゲル（vitrigel）と命名している（非特許文献１）。
　特に、これまでに開発してきたコラーゲンビトリゲル薄膜は、生体内の結合組織に匹敵する高密度のコラーゲン線維が互いに絡み合った厚さ数十マイクロメートルの透明な薄い膜であり、優れたタンパク質透過性及び強度を有しているという特徴がある。また、作製工程のコラーゲンゾルには様々な物質を添加できるので、添加した物質の特性をコラーゲンビトリゲル薄膜に反映することができる。さらに、例えば、環状ナイロン膜支持体を包埋したコラーゲンビトリゲル薄膜は、ピンセットで容易に取り扱うことができる。
　そして、本発明者は、このコラーゲンビトリゲル薄膜に関する技術をさらに発展させ、コラーゲンビトリゲル薄膜の透明性、作製再現性を向上させるための技術（特許文献２）や、コラーゲンビトリゲルを膜形状ではなく糸状あるいは管状の形状に作製する技術（特許文献３）なども提案している。
特開平８－２２８７６８号公報 ＷＯ２００５／０１４７７４ 特開２００７－２０４８８１号公報
Takezawa T, et al., Cell Transplant. 13: 463-473, 2004 Takezawa T, et al., Cells Tissues Organs 185: 237-241, 2007 Takezawa T, et al., J. Biotechnol. 131: 76-83, 2007
　しかしながら、従来のコラーゲンビトリゲル薄膜の製造方法においては、例えば図３に例示したように、コラーゲンビトリゲル薄膜が任意の厚さとなるように、プラスチック製の培養シャーレにコラーゲンゾルを所定量注入してゲル化し、乾燥によるガラス化および再水和することで製造していた。
　このため、乾燥によりガラス化したコラーゲンゲル乾燥体は、培養シャーレの底面と壁面に付着した状態でしか作製できていなかった。それゆえ、再水和した際に、壁面由来のコラーゲンビトリゲル薄膜を伴ってしまうという問題があった。壁面由来のコラーゲンビトリゲル薄膜を伴う場合には、コラーゲンビトリゲル薄膜の取り扱いが難しく、細胞の３次元培養担体として利用するためには、不必要な壁面由来のコラーゲンビトリゲル薄膜部分を除去するための作業が必要であるが、コラーゲンビトリゲル薄膜は水分を含有するため、この切断加工作業は容易ではなかった。また、コラーゲンゾルを注入する容器の形状を変えることで、出来上がるコラーゲンビトリゲル薄膜の形状をある程度制御することは可能であったが、壁面由来のコラーゲンビトリゲル薄膜を伴うため、正確に微細形状を加工するには水分を含んだコラーゲンビトリゲル薄膜を切断加工する必要があり容易ではなかった。そして、任意の形状のコラーゲンビトリゲル薄膜を製品として迅速かつ大量生産するためには、このような煩雑な作業を克服することは大きな課題であった。特に、細胞の３次元培養担体として利用する環状ナイロン膜支持体を包埋したコラーゲンビトリゲル薄膜については、培養容器の底面にのみコラーゲンビトリゲル薄膜が付着しており、必要時にはピンセット等で容易に培養容器の底面より剥離できる形状、すなわち環状ナイロン膜支持体の外周部にはコラーゲンビトリゲル薄膜が余分にはみ出さない形状に微細加工する必要があった。
　また、従来のコラーゲンビトリゲル薄膜の製造方法では、ガラス化の第１工程であるゲル内の自由水の除去は風乾による自然乾燥で行っていたため、通常２日以上の時間を要していた。
　そして、これまでの技術では、コラーゲンビトリゲル薄膜の含有コラーゲン量と厚さの制御については、0.25% コラーゲンゾルを培養シャーレの単位面積（1.0 cm2）当たりに0.04～0.4ml注入してゲル化、ガラス化および再水和することで、単位面積（1.0 cm2）当たりにコラーゲンを100μg～1.0mg含有するコラーゲンビトリゲル薄膜の作製が可能であり、さらにガラス化の期間を調節することでコラーゲンビトリゲル薄膜の厚さは数μm～数百μm程度に調製可能であった。例えば、0.25% コラーゲンゾルを培養シャーレの単位面積（1.0 cm2）当たりに0.2ml注入してゲル化した後に２週間以上ガラス化して再水和した場合には厚さ約15μm、また、同様に0.4ml注入してゲル化した後に１週間程度ガラス化して再水和した場合には厚さ約120μmのコラーゲンビトリゲル薄膜の作製が可能であった（非特許文献２）。
　しかしながら、薄膜状ではなく、例えば、厚さ1mm以上のコラーゲンビトリゲル膜を調製するためには、0.25% コラーゲンゾルを単位面積（1.0 cm2）当たりに少なくとも3.3ml以上注入する必要があると考えられた。しかし、この量は既存の培養シャーレでは溢れ出てしまうため、特殊な容器を準備しなければならない。さらに、ゲル化した後に、ゲル内の自由水を自然乾燥させるためには10日間以上かかる。このため、コラーゲンビトリゲル膜を迅速かつ大量に生産するためには、ゲル内の大量の自由水を除去する時間を短縮することは重要な課題であった。
　さらに、従来の製造方法では、コラーゲンビトリゲル薄膜の乾燥体を培養シャーレから剥離させることは不可能であるため、コラーゲンビトリゲル薄膜の乾燥体は培養シャーレの底面と壁面に付着した状態で作製されていた。このため、コラーゲンビトリゲル薄膜の乾燥体を膜状態で自由に取り扱うことはできなかった。したがって、コラーゲンビトリゲル薄膜の乾燥体を任意の微細形状に切断することも不可能であった。
　本発明は、以上のような事情に鑑みてなされたものであり、所望の形状を有し、実用性、取り扱い性などの特性に優れたビトリゲル膜乾燥体およびこのビトリゲル膜乾燥体の前段階のハイドロゲル乾燥体、そして、このビトリゲル膜乾燥体およびハイドロゲル乾燥体を迅速かつ大量生産するための方法を提供することを課題としている。
　本発明は、上記の課題を解決するため、以下のビトリゲル膜乾燥体、ハイドロゲル乾燥体およびこれらの製造方法を提供する。
＜１＞不定形外周縁部をもたないことを特徴とするビトリゲル膜乾燥体。
＜２＞基板に付着していることを特徴とする前記＜１＞のビトリゲル膜乾燥体。
＜３＞ビトリゲル膜乾燥体が、剥離可能なフィルムと重層化されていることを特徴とする前記＜１＞のビトリゲル膜乾燥体。
＜４＞フィルムがパラフィルムであることを特徴とする前記＜３＞のビトリゲル膜乾燥体。
＜５＞不定形外周縁部をもたないことを特徴とするハイドロゲル乾燥体。
＜６＞基板に付着していることを特徴とする前記＜５＞のハイドロゲル乾燥体。
＜７＞ハイドロゲル乾燥体が、剥離可能なフィルムと重層化されていることを特徴とする前記＜５＞のハイドロゲル乾燥体。
＜８＞フィルムがパラフィルムであることを特徴とする前記＜７＞のハイドロゲル乾燥体。
＜９＞所望形状のビトリゲル膜乾燥体の製造方法であって、以下の工程：
（１）基板上に配置された、前記所望形状と同形状の壁面鋳型内部にハイドロゲルを保持して、ハイドロゲル内の自由水の一部を基板と壁面鋳型の間隙から流出させる工程；
（２）壁面鋳型を基板上から除去する工程；
（３）ハイドロゲルを乾燥させて残留する自由水を除去し、ガラス化したハイドロゲル乾燥体を作製する工程；
（４）ハイドロゲル乾燥体を再水和してビトリゲル膜を作製する工程；および
（５）ビトリゲル膜を再乾燥させて自由水を除去し、ガラス化したビトリゲル膜乾燥体を作製する工程
を含むことを特徴とするビトリゲル膜乾燥体の製造方法。
＜１０＞前記工程（１）において、壁面鋳型内部のハイドロゲルに、支持体を導入することを特徴とする前記＜９＞のビトリゲル膜乾燥体の製造方法。
＜１１＞前記工程（１）において、ハイドロゲル内の自由水を１／４～３／４程度に減じることを特徴とする前記＜９＞のビトリゲル膜乾燥体の製造方法。
＜１２＞前記工程（５）において、ビトリゲル膜を、ビトリゲル膜乾燥体が剥離可能なフィルム上でガラス化することを特徴とする前記＜９＞のビトリゲル膜乾燥体の製造方法。
＜１３＞フィルムがパラフィルムであることを特徴とする前記＜１２＞のビトリゲル膜乾燥体の製造方法。
＜１４＞所望形状に成形可能なビトリゲル膜乾燥体の製造方法であって、以下の工程：
（１）ビトリゲル膜乾燥体が剥離可能なフィルムが敷かれた基板上に配置された、任意形状の壁面鋳型内部にハイドロゲルを保持して、ハイドロゲル内の自由水の一部を基板上のフィルムと壁面鋳型の間隙から流出させる工程；
（２）壁面鋳型を基板上から除去する工程；
（３）ハイドロゲルを乾燥させて残留する自由水を除去し、ガラス化したハイドロゲル乾燥体を作製する工程；
（４）ハイドロゲル乾燥体を再水和してビトリゲル膜を作製する工程；
（５）ビトリゲル膜を再乾燥させて自由水を除去し、ガラス化したビトリゲル膜乾燥体を作製する工程
を含むことを特徴とするビトリゲル膜乾燥体の製造方法。
＜１５＞前記工程（５）の後、
（６）フィルムと重層化されているビトリゲル膜乾燥体を所望形状に切断する工程を含むことを特徴とする前記＜１４＞のビトリゲル膜乾燥体の製造方法。
＜１６＞前記工程（６）の後、ビトリゲル膜乾燥体をフィルムから剥離させる工程を含むことを特徴とする前記＜１５＞のビトリゲル膜乾燥体の製造方法。
＜１７＞フィルムがパラフィルムであることを特徴とする前記＜１４＞のビトリゲル膜乾燥体の製造方法。
＜１８＞前記工程（１）において、壁面鋳型内部のハイドロゲルに、支持体を導入することを特徴とする前記＜１４＞のビトリゲル膜乾燥体の製造方法。
＜１９＞前記工程（１）において、ハイドロゲル内の自由水を１／４～３／４程度に減じることを特徴とする前記＜１４＞のビトリゲル膜乾燥体の製造方法。
＜２０＞所望形状のハイドロゲル乾燥体の製造方法であって、以下の工程：
（１）基板上に配置された、前記所望形状と同形状の壁面鋳型内部にハイドロゲルを保持して、ハイドロゲル内の自由水の一部を基板と壁面鋳型の間隙から流出させる工程；
（２）壁面鋳型を基板上から除去する工程；
（３）ハイドロゲルを乾燥させて残留する自由水を除去し、ガラス化したハイドロゲル乾燥体を作製する工程；
を含むことを特徴とするハイドロゲル乾燥体の製造方法。
＜２１＞前記工程（１）において、壁面鋳型内部のハイドロゲルに、支持体を導入することを特徴とする前記＜２０＞のハイドロゲル乾燥体の製造方法。
＜２２＞前記工程（１）において、ハイドロゲル内の自由水を１／４～３／４程度に減じることを特徴とする前記＜２０＞のハイドロゲル乾燥体の製造方法。
＜２３＞前記工程（３）において、ハイドロゲル乾燥体が剥離可能なフィルム上でガラス化することを特徴とする前記＜２０＞のハイドロゲル乾燥体の製造方法。
＜２４＞フィルムがパラフィルムであることを特徴とする前記＜２３＞のハイドロゲル乾燥体の製造方法。
＜２５＞所望形状に成形可能なハイドロゲル乾燥体の製造方法であって、以下の工程：
（１）ハイドロゲル乾燥体が剥離可能なフィルムが敷かれた基板上に配置された、任意形状の壁面鋳型内部にハイドロゲルを保持して、ハイドロゲル内の自由水の一部を基板上のフィルムと壁面鋳型の間隙から流出させる工程；
（２）壁面鋳型を基板上から除去する工程；
（３）ハイドロゲルを乾燥させて残留する自由水を除去し、ガラス化したハイドロゲル乾燥体を作製する工程
　を含むことを特徴とするハイドロゲル乾燥体の製造方法。
＜２６＞前記工程（３）の後、
（４）フィルムと重層化されているハイドロゲル乾燥体を所望形状に切断する工程、を含むことを特徴とする前記＜２５＞のハイドロゲル乾燥体の製造方法。
＜２７＞前記工程（４）の後、ハイドロゲル乾燥体をフィルムから剥離させる工程を含むことを特徴とする前記＜２６＞のハイドロゲル乾燥体の製造方法。
＜２８＞前記工程（１）において、壁面鋳型内部のハイドロゲルに、支持体を導入することを特徴とする前記＜２５＞のハイドロゲル乾燥体の製造方法。
＜２９＞前記工程（１）において、ハイドロゲル内の自由水を１／４～３／４程度に減じることを特徴とする前記＜２５＞のハイドロゲル乾燥体の製造方法。
＜３０＞フィルムがパラフィルムであることを特徴とする前記＜２５＞のハイドロゲル乾燥体の製造方法。
＜３１＞前記＜１＞のビトリゲル膜乾燥体が重層化し、一体化していることを特徴とする積層体。
＜３２＞前記＜１＞のビトリゲル膜乾燥体はコラーゲンを原料としており、このビトリゲル膜乾燥体を再水和したビトリゲル膜を複数枚重ねて得られる積層体を用いた角膜の主に実質を構成しているコラーゲンの模倣物。
＜３３＞前記＜１＞のビトリゲル膜乾燥体はコラーゲンを原料としており、このビトリゲル膜乾燥体が重層化し、一体化している積層体を再水和して得られたビトリゲル膜を用いた角膜の主に実質を構成しているコラーゲンの模倣物。
　本発明によれば、壁面由来の不定形外周縁部をもたない所望形状のハイドロゲル乾燥体およびビトリゲル膜乾燥体を迅速に大量生産することができる。
　また、ビトリゲル膜乾燥体あるいはハイドロゲル乾燥体を剥離可能なフィルムに重層化させることで、ビトリゲル膜乾燥体あるいはハイドロゲル乾燥体をフィルムから剥離させ、膜状態で自由に取り扱うことができる。さらに、壁面鋳型の形状以外にも、ガラス化したビトリゲル膜乾燥体あるいはハイドロゲル乾燥体を任意の形に切断加工することが可能である。
本発明のビトリゲル膜の製造方法の一実施形態を例示したフローチャートである。 本発明のビトリゲル膜の製造方法に使用される壁面鋳型を例示した斜視図である。 従来のビトリゲル薄膜の製造方法の一実施形態を例示したフローチャートである。 不定形外周縁部をもたないコラーゲンビトリゲル膜を例示した図である。 不定形外周縁部が付随したコラーゲンビトリゲル膜を例示した図である。 パラフィルムに吸着してあるコラーゲンビトリゲル膜乾燥体の一部分を、パラフィルムより容易に剥離した状態を例示した図である。 パラフィルムに吸着してある環状ナイロン膜支持体付きコラーゲンビトリゲル膜乾燥体の一部分を、パラフィルムより容易に剥離した状態を例示した図である。 １つの基板上に４つの壁面鋳型を設置し、壁面鋳型内部にコラーゲンゾルを注入した状態を例示した図である。 図８の形態において、壁面鋳型を上下に僅かに動かすことでコラーゲンゲルと壁面鋳型間の接着を解除した状態の図である。 図８の形態において、壁面鋳型を基板上から除去した形態を例示した図である。 （Ａ）は、実施例８で作製したFITC標識ヤギ抗マウス抗体を含有したビトリゲル膜乾燥体の積層体をPBSで再水和し、蛍光顕微鏡（Nikon）で観察した図である。（Ｂ）は、実施例６の方法で作製した積層体を観察した図である。 実施例８で作製したビトリゲル膜におけるFITC標識ヤギ抗マウス抗体の局在を示すビトリゲル膜の垂直断面図である。 実施例９で作製したアガロースを含有したビトリゲル膜乾燥体の積層体をPBSで再水和し、蛍光顕微鏡で観察した図である。 重ねるビトリゲル膜の枚数を増やした場合に、一体化されてない積層体について吸光度の変化を示した図である。 １０枚重ねたビトリゲル膜の一体化されてない積層体に関して、透明性を示す図である。 ９枚のビトリゲル膜を挿入することで一体化した積層体（0.25%コラーゲンゾル 1.0ml + 0.25%コラーゲンゾル 2.0ml×9層 + 0.25%コラーゲンゾル 1.0ml由来）の透明性を示す図である。
　本発明のハイドロゲル乾燥体の製造方法の第１の実施形態は、所望形状のハイドロゲル乾燥体の製造方法であって、以下の工程：
（１）基板上に配置された、前記所望形状と同形状の壁面鋳型内部にハイドロゲルを保持して、ハイドロゲル内の自由水の一部を基板と壁面鋳型の間隙から流出させる工程；
（２）壁面鋳型を基板上から除去する工程；および
（３）ハイドロゲルを乾燥させて残留する自由水を除去し、ガラス化したハイドロゲル乾燥体を作製する工程
を含む。さらに、本発明のビトリゲル膜乾燥体の製造方法の第１の実施形態は、所望形状のビトリゲル膜乾燥体の製造方法であって、前記工程（３）に続いて、
（４）ハイドロゲル乾燥体を再水和してビトリゲル膜を作製する工程、および
（５）ビトリゲル膜を再乾燥させて自由水を除去し、ガラス化したビトリゲル膜乾燥体を作製する工程
を含む。
　本発明において、「ハイドロゲル」とは、高分子が化学結合によって網目状構造をとり、その網目に多量の水を保有した物質を指し、より具体的には、天然物由来の高分子や合成高分子の人工素材に架橋を導入してゲル化させたものをいう。
　また、「ハイドロゲル乾燥体」とは、ハイドロゲルから自由水を除去してガラス化させたものをいう。さらに、「ビトリゲル膜」とは、このハイドロゲル乾燥体を再水和させたものをいう。なお、上記の通り、「ガラス化（vitrification）の工程を経て作製できる新しい安定状態のゲル」は、本発明者によって「ビトリゲル（vitrigel）」と命名されている。そして、「ビトリゲル膜乾燥体」とは、このビトリゲルを再びガラス化したものをいう。ビトリゲル膜乾燥体は、必要なときに再水和することで、ビトリゲル膜を得ることができる。
　以下、各工程について説明する。図１は、本発明のビトリゲル膜の製造方法の一実施形態を例示したフローチャートである。
　工程（１）：基板上に配置された、前記所望形状と同形状の壁面鋳型内部にハイドロゲルを保持して、ハイドロゲル内の自由水の一部を基板と壁面鋳型の間隙から流出させる。
　基板と壁面鋳型は、７０％エタノールあるいはオートクレーブ等による滅菌に耐えられる材料を適宜使用することができる。具体的には、ポリスチレンやアクリル等のプラスチック、ガラス、あるいはステンレス等を例示することができる。
　第１の実施形態においては、壁面鋳型は、上面、底面を有していない筒状の枠体とすることができ、壁面鋳型の形状は、所望のビトリゲル膜の形状と同形状に設計することができる。具体的には、例えば、円形のビトリゲル膜を作製する場合には、図２に例示したように、壁面（枠）が環状のもの（円筒状）を使用することができる。また、矩形のビトリゲル膜を作製する場合には、壁面（枠）が矩形状のもの（角筒状）とすることができる。
　そして、基板上に壁面鋳型が配置されると、両者は当接状態となるが、物理的には基板と壁面鋳型の表面の凹凸により自由水を流出させることができる程度のわずかな間隙が形成されることになる。本発明においては、所望の数のビトリゲル膜に応じて、基板上に壁面鋳型を複数配置することができる。
　本発明において、ハイドロゲルの作製に用いられる原料としての天然物由来高分子は、例えば、コラーゲン、マウスＥＨＳ腫瘍抽出物より再構成された基底膜成分（商品名：マトリゲル）、ゼラチン、寒天、アガロース、フィブリン、グリコサミノグリカン、ヒアルロン酸、プロテオグリカンなどを例示することができる。それぞれのゲル化に至適な塩等の成分、その濃度、ｐＨなどを選択しハイドロゲルを作製することが可能である。
　また、ハイドロゲルの作製に用いられる合成高分子としては、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、メチルセルロース、ポリエチレンオキシド、ｐｏｌｙ（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ）／ｐｏｌｙｃａｐｒｏｌａｃｔｏｎｅなどが挙げられる。また、これらの高分子を２種以上用いてハイドロゲルを作製することも可能である。ハイドロゲルの量は、作製するビトリゲル膜の厚さを考慮して調節することができる。
　なかでも、ハイドロゲルの原料はコラーゲンが好ましく、コラーゲンゲルを用いる場合には、コラーゲンゾルを、基板上に配置された壁面鋳型に注入し、インキュベーターでゲル化させたものを使用することができる。図１では、ハイドロゲルの原料としてコラーゲンゾルを例示している。
　コラーゲンゾルを使用する場合を例に説明すると、コラーゲンゾルは、至適な塩濃度を有するものとして、生理食塩水、ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）、ＨＢＳＳ（Ｈａｎｋ’ｓ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、基礎培養液、無血清培養液、あるいは血清含有培養液などで調製することができる。また、コラーゲンゲル化の際の溶液のｐＨは、６から８程度が好ましい。
　ここで、コラーゲンゾルの調製は４℃で行うのが望ましい。その後、ゲル化する際の保温は、用いるコラーゲンの動物種に依存したコラーゲンの変性温度より低い温度でなければならないが、一般的には37℃以下の温度で数分から数十分でゲル化できる温度に保温して行うことができる。
　また、コラーゲンゾルはコラーゲンの濃度が0.2%以下になると希薄すぎてゲル化が弱く、0.3%以上になると濃厚すぎて均一化が困難になる。したがって、コラーゲンゾルのコラーゲンの濃度は0.2～0.3%が好ましく、より好ましくは0.25%程度である。
　このように調整されたコラーゲンゾルを壁面鋳型内部に注入する。前記濃度のコラーゲンゾルは粘性を有しているため、コラーゲンゾルを壁面鋳型内部に注入して迅速に保温すれば、コラーゲンゾルは基板と壁面鋳型との間隙から流出することなく数分以内にゲル化することができる。
　そして、形成されたコラーゲンゲルは基板と壁面鋳型に密着するが、所定の時間放置することで、時間の経過とともに、コラーゲンゲル内の自由水の一部が、基板と壁面鋳型の間隙から壁面鋳型の外側へ流出する。
　ここで、壁面鋳型を上下等に僅かに動かすことで、ゲルと壁面鋳型間の接着が解除されて僅かな間隙が生じるので、自由水の流出を促進することができる。
　さらに、例えば、単位面積（1.0 cm2）当たりに注入する0.25%コラーゲンゾルの量が0.4ml以上の場合には、ゲル化したコラーゲンゲル内の自由水を１／４～２／３程度に減じるまでは、基板と壁面鋳型の間隙から流出する自由水を経時的に除去することが望ましい。これによって、ゲルのコラーゲン濃度は0.375～1.0%程度になるため、壁面鋳型を除去してもゲル形状が歪まないゲル強度にすることができる。なお、その後は基板上に流出する自由水も伴った状態でゲル内に残留する自由水を自然乾燥させて除去してガラス化することができる。ここで、迅速大量生産の観点からは、コラーゲンゲル内の自由水を１／４～２／３程度に減じさせる時間は２～８時間が望ましい。さらに、その後、ゲル内に残留する自由水を自然乾燥させ完全に除去させる時間は４８時間以内が望ましい。そのためには、単位面積（1.0 cm2）当たりに注入する0.25%コラーゲンゾルの量は0.1～2.4mlが望ましく、その結果、単位面積（1.0 cm2）当たりに250μｇ～6ｍｇのコラーゲンを含有するコラーゲンビトリゲル膜を作製することができる。
　なお、さらに単位面積当たりに多くのコラーゲンを含有するコラーゲンビトリゲル膜を作製する方法としては、以下の２通りの方法が可能である。第１の方法は、既に作製したコラーゲンビトリゲル膜あるいはその乾燥体の上にコラーゲンゾルを重層してゲル化、ガラス化および再水和する方法である。この方法を繰り返すことで、コラーゲンビトリゲル膜が重層化した積層体が得られ、任意の厚さのコラーゲンビトリゲル膜（積層体）を作製することが可能となる。また、第２の方法は、コラーゲンゾル内に既に作製したコラーゲンビトリゲル膜あるいはその乾燥体を包埋してゲル化、ガラス化および再水和する方法である。この方法においても、任意の枚数のコラーゲンビトリゲル膜が包埋された状態で重層化した積層体が得られ、任意の厚さのコラーゲンビトリゲル膜を作製することが可能となる。なお、第１の方法で重層に用いるゾルおよび第２の方法で包埋に用いるゾルにコラーゲン以外の成分を使用して、表裏あるいは層状に成分の異なるビトリゲル膜を作製することも可能となる。
　また、壁面鋳型の内部のハイドロゾルには、支持体を導入することができる。例えば、支持体は、ナイロン膜、ワイヤ、綿製ガーゼ、繭糸、その他の織成体、生体吸収性材料等を例示することができ、壁面鋳型の内部の形状に対応したものを使用することができる。好ましくは、壁面鋳型が環状の場合には、支持体は、図１に例示したような壁面鋳型の内径と略等しい外径を有する環状ナイロン膜とすることができる。ゾルに支持体を導入することで、ビトリゲル膜の強度や形状保持能が高まり、取り扱い性、利便性が向上する。例えば、円形の壁面鋳型の直径より1.0 mm程短い外円直径の環状ナイロン膜支持体を導入することで、ピンセットで容易に取り扱えるビトリゲル膜を作製することができる。
　工程（２）壁面鋳型を基板上から除去する。
　基板上にハイドロゲルを残して、壁面鋳型を取り除く。ハイドロゲルは、自由水が流出しているため、基板上で変形等することなく、壁面鋳型に保持された形状を維持することができる。
　工程（３）ハイドロゲルを乾燥させて残留する自由水を除去し、ガラス化したハイドロゲル乾燥体を作製する。
　必要に応じて、最終的にガラス化させたい容器内へハイドロゲルを移動させた後、乾燥により、完全にハイドロゲル内の自由水を除去しガラス化する。例えば、ハイドロゲル乾燥体を剥離可能なフィルム上にハイドロゲルを移動させることで、作製されたハイドロゲル乾燥体をフィルムから剥離することができる。また、この場合、フィルム上でハイドロゲル乾燥体を所望の形状に成形することもできる。フィルムとしては、パラフィルム、サランラップ、ビニール等の非吸水性フィルムを例示することができ、特にパラフィルムが好ましい。
　このガラス化工程の期間を長くするほど、再水和した際には透明度、強度に優れたビトリゲル膜を得ることができる。なお、必要に応じて短期間のガラス化後に再水和して得たビトリゲル膜をPBS等で洗浄し、再度ガラス化することもできる。
　乾燥方法としては、例えば、風乾、密閉容器内で乾燥（容器内の空気を循環させ、常に乾燥空気を供給する）、シリカゲルを置いた環境下で乾燥する等、種々の方法を用いることができる。例えば、風乾の方法としては、１０℃４０％湿度で無菌に保たれたインキュベーターで２日間乾燥させる、もしくは無菌状態のクリーンベンチ内で一昼夜、室温で乾燥する等の方法を例示することができる。
　ハイドロゲル乾燥体は、必要なときに再水和することでビトリゲル膜を作製することができるため、産業上有効に利用することができる。また、本発明のハイドロゲル乾燥体を再水和したビトリゲル膜は、後述するように、壁面由来の不必要なビトリゲル膜（本発明において、「不定形外周縁部」という）を伴わない点においても優れている。
　さらに、本発明のビトリゲル膜乾燥体の製造方法では、
工程（４）ハイドロゲル乾燥体を再水和してビトリゲル膜を作製する。
　ハイドロゲル乾燥体をＰＢＳや使用する培養液などで再水和することでビトリゲル膜を作製することができる。ここで、再水和する液体には、生理活性物質などの各種の成分が含まれていてもよく、例えば、生理活性物質としては、抗生物質をはじめとする各種医薬品、細胞増殖因子、分化誘導因子、細胞接着因子、抗体、酵素、サイトカイン、ホルモン、レクチン、またはゲル化しない細胞外マトリックス成分としてファイブロネクチン、ビトロネクチン、エンタクチン、オステオポエチン等が挙げられる。また、これらを複数含有させることも可能である。
　工程（５）ビトリゲル膜を再乾燥させて自由水を除去し、ガラス化したビトリゲル膜乾燥体を作製する。
　乾燥方法は、工程（３）と同様に、風乾、密閉容器内で乾燥（容器内の空気を循環させ、常に乾燥空気を供給する）、シリカゲルを置いた環境下で乾燥する等、種々の方法を用いることができる。
　ビトリゲル膜を再乾燥させることで、ガラス化したビトリゲル膜乾燥体を作製することができる。このビトリゲル膜乾燥体は、必要な時に再水和することで、再度ビトリゲル膜に変換することができる。
　また、ビトリゲル膜を、例えば、パラフィルムのようなビトリゲル膜乾燥体が剥離可能なフィルム上でガラス化することもできる。パラフィルムは、パラフィンを原料とした熱可塑性フィルムであり、伸縮性・粘着性をもち、気密性、防水性にも優れているという特徴がある。
　ビトリゲル膜乾燥体を剥離可能なフィルムに重層化させることで、コラーゲンビトリゲル膜の乾燥体をフィルムから剥離させ、膜状態で自由に取り扱うことができる。さらに、壁面鋳型の形状以外にも、ガラス化したビトリゲル膜乾燥体を任意の形に切断加工することが可能である。
　なお、「ハイドロゲル乾燥体」と「ビトリゲル膜乾燥体」に含まれる成分は必ずしも同じではない。「ハイドロゲル乾燥体」は、ハイドロゲルの成分を含んでいるが、「ビトリゲル膜乾燥体」は、ハイドロゲル乾燥体を再水和した際の水溶液で平衡化されたビトリゲル膜に残存する成分を含んでいる。
　また、工程（５）のビトリゲル膜乾燥体を再水和することで得られるビトリゲル膜は、工程（４）で得られるビトリゲル膜と比較して、ガラス化の期間が長いため、強度および透明性に優れている。
　さらに、ガラス化の期間は「ハイドロゲル乾燥体」の状態で長くすることも可能であるが、「ハイドロゲル乾燥体」はハイドロゲル作製時の成分が全て共存している状態であり、ハイドロゲル乾燥体を維持し続ける際あるいはビトリゲル膜を利用する際には不必要となる成分も混在している。一方、「ハイドロゲル乾燥体」を再水和して不必要な混在成分を除去した後のビトリゲル膜については、その乾燥体においても不必要な成分は除去されている。したがって、ガラス化の期間を長く維持する必要がある時は、このビトリゲル膜乾燥体の状態で維持し続けることが好ましく、ビトリゲル膜乾燥体を再水和して得られるビトリゲル膜には不必要な成分が混在しない点が優れている。
　本発明の第１の実施形態においては、壁面鋳型の形状は、所望のビトリゲル膜の形状と同形状に設計されており、さらに、基板と壁面鋳型の間隙から自由水を１／４～３／４程度流出させた後、壁面鋳型を除去し、乾燥によるガラス化を行うため、壁面鋳型の形状を反映させた所望形状のビトリゲル膜を得ることができる。すなわち、上記の通り、従来の培養シャーレを用いた方法では、培養シャーレの壁面由来の不必要なビトリゲル薄膜（本発明において、「不定形外周縁部」という）を伴っていたが、本発明においては、不定形外周縁部をもたない、基板上に壁面鋳型の形状を反映させたハイドロゲル乾燥体あるいはビトリゲル膜乾燥体を得ることができる。したがって、従来必要であった不定形外周縁部の除去作業が不要であり、ビトリゲル膜を迅速、かつ大量に生産することが可能になる。さらに、壁面鋳型の利用によって、自由水の量を１／４～３／４程度にまで減じるため、従来は、通常２日以上を要していた自由水除去のための乾燥時間を、１／２～１／４程度の時間に短縮することができる。このような乾燥時間の短縮も、ビトリゲル膜乾燥体の迅速かつ大量生産に大きく寄与する。
　また、従来は、乾燥時間に２日以上を要していたため、乾燥時間を実用的な範囲に抑えるため、ハイドロゲルの注入量が制限されていた。したがって、ビトリゲル膜の厚さは、最大でも約120μm程度の薄膜状（ビトリゲル薄膜）として作製されていた（非特許文献２）。これに対し、本発明のビトリゲル膜は、自由水除去のための乾燥時間を、１／２～１／４程度の時間に短縮することができるため、乾燥時間を実用的な範囲に抑えても、従来よりもハイドロゲルの注入量を増加させることができる。具体的には、本発明では、２～３日程度の実用的な乾燥時間で、厚さ約１ｍｍのビトリゲル膜を容易に作製することができる。
　さらに、ビトリゲル膜およびビトリゲル膜乾燥体は、例えば、ゲル化する前のゾル溶液に、含有させたい生理活性物質を混合し、その後、ゲル化・ガラス化等のビトリゲル膜の作製工程を経て作製することもできる。
　生理活性物質を含有するビトリゲル膜およびビトリゲル膜乾燥体は、細胞の接着・増殖・分化などに必要な因子をビトリゲル膜側から供給することができるので、より良い培養環境を実現することができる。また、含有させた生理活性物質の細胞に対する影響を調べる試験を行うのに非常に有用である。また、生理活性物質を含んだビトリゲル膜は、体内へ移植することで薬物送達システムとしても機能し得る（非特許文献３）。
　さらに、本発明の方法で作製されたビトリゲル膜は、分子量の大きな生理活性物質を透過することが可能であり、それにより、このビトリゲル膜の異なる２つの面に播種された各々の細胞の間での生理活性物質を介した相互作用の試験・研究に大きく貢献できる（非特許文献３）。
　また、本発明の方法で作製されたビトリゲル膜は、培養容器に挿入して動物細胞を培養する細胞培養担体として用いることができる。培養する動物細胞としては、初代培養細胞、株化細胞、受精卵、およびそれらの細胞に外来遺伝子を導入した細胞が挙げられる。さらにそれらの細胞が、未分化な幹細胞、分化過程にある細胞、終末分化した細胞、および脱分化した細胞であっても良い。また、それらの細胞の培養を開始する手段としては、細胞懸濁液、細切組織片、受精卵、または三次元再構築したゲル培養体あるいは多細胞性凝集塊（スフェロイド）の播種が挙げられる。つまり、既存の方法で培養できる接着性の細胞は本ビトリゲル膜上で培養することが可能である。
　さらに、例えば上記の細胞を、ビトリゲル膜の片面はもちろんのこと、両面に１種類以上の細胞を培養することが可能である。両面培養においては、各々の面に異種の細胞を培養することが可能である。特に、ビトリゲル膜の一方の面には上皮系細胞、他方の面には間充織細胞を培養することで、上皮間充織相互作用を有した経皮吸収モデルや腸管吸収モデルなど、また、一方の面には血管内皮細胞、他方の面にはガン細胞を培養することで、血管新生モデルやガン浸潤モデルなどの細胞機能アッセイを可能とする。
　さらに、１枚のビトリゲル膜の厚さを高めた場合、ビトリゲル膜の透明性は、厚さに比例して低下するが、ビトリゲル膜を複数枚重ねて同程度の厚さとした場合には、１枚のビトリゲル膜に比べて透明性が高い。したがって、コラーゲンビトリゲル膜を複数枚重ねて透明性を向上させ、例えば、このコラーゲンビトリゲル膜上で角膜由来の細胞などを培養することで、角膜の模倣物として利用することができる。この角膜の模倣物は、生体に移植することもできるし、角膜モデルとして各種の薬理試験に利用することもできる。
　なお、コラーゲンビトリゲル膜を複数枚重ねることで一体化した積層体を作製する方法としては、次の2通り（反復法と挿入法）が可能である。反復法では、すでに作製したコラーゲンビトリゲル膜乾燥体の上にコラーゲンゾルを注入し、ゲル化、ガラス化および再水和することを繰り返すことで一体化した積層体を作製できる。一方、挿入法では、コラーゲンゾルの中に予め作製した複数枚のコラーゲンビトリゲル膜あるいはコラーゲンビトリゲル膜乾燥体を挿入した後にガラス化および再水和することで、一体化した積層体を作製することができる。
　次に、本発明のハイドロゲル乾燥体およびビトリゲル膜乾燥体の製造方法の第２の実施形態について説明する。第１の実施形態と共通する点については、以下では説明を一部省略する。
　本発明のハイドロゲル乾燥体の製造方法の第２の実施形態は、所望形状に成形可能なハイドロゲル乾燥体の製造方法であって、以下の工程：
（１）ハイドロゲル乾燥体が剥離可能なフィルムが敷かれた基板上に配置された、任意形状の壁面鋳型内部にハイドロゲルを保持して、ハイドロゲル内の自由水の一部を基板上のフィルムと壁面鋳型の間隙から流出させる工程；
（２）壁面鋳型を基板上から除去する工程；
（３）ハイドロゲルを乾燥させて残留する自由水を除去し、ガラス化したハイドロゲル乾燥体を作製する工程；
を含む。
　この実施形態においても、壁面鋳型は、上面、底面を有していない筒状の枠体とすることができるが、その形状は任意であり、所望のハイドロゲル乾燥体の形状と同形状である必要はない。
　そして、第２の実施形態では、予め基板上にハイドロゲル乾燥体が剥離可能なフィルムを敷いて、このフィルム上にゾルを注入し、ゲル化、乾燥によるガラス化を行う。ハイドロゲル乾燥体が剥離可能なフィルムとしては、パラフィルム、サランラップ、ビニール等の非吸水性フィルムを例示することができ、特にパラフィルムが好ましい。
　第２の実施形態では、フィルム上で、ハイドロゲルを乾燥させて残留する自由水を除去し、ガラス化したハイドロゲル乾燥体を作製することができる。この場合、フィルムと重層化されているハイドロゲル乾燥体が得られる。
　ハイドロゲル乾燥体は、フィルムに吸着し重層化しているため、安定性が高く、所望の形状に容易に切断することができる。壁面鋳型の形状以外の所望形状に切断加工することができる。したがって、この実施形態では、前記工程（３）に続いて、フィルムと重層化されているハイドロゲル乾燥体を所望形状に切断する工程を含むことができる。
　さらに、この実施形態では、所望形状に切断したハイドロゲル乾燥体をフィルムから剥離させる工程を含むことができる。ハイドロゲル乾燥体をフィルムから剥離させることで、膜状態で自由に取り扱うことができる。さらに、このハイドロゲル乾燥体も、不定形外周縁部を有していない。なお、フィルムから剥離させたハイドロゲル乾燥体を切断加工することも可能である。
　そして、所望形状に成形したハイドロゲル乾燥体を再水和することで、所望形状のビトリゲル膜を得ることができる。
　さらに、本発明のビトリゲル膜乾燥体の製造方法の第２の実施形態は、所望形状に成形可能なビトリゲル膜乾燥体の製造方法であって、
（１）ハイドロゲル乾燥体が剥離可能なフィルムが敷かれた基板上に配置された、任意形状の壁面鋳型内部にハイドロゲルを保持して、ハイドロゲル内の自由水の一部を基板上のフィルムと壁面鋳型の間隙から流出させる工程；
（２）壁面鋳型を基板上から除去する工程；
（３）ハイドロゲルを乾燥させて残留する自由水を除去し、ガラス化したハイドロゲル乾燥体を作製する工程；
（４）ハイドロゲル乾燥体を再水和してビトリゲル膜を作製する工程；および
（５）ビトリゲル膜を再乾燥させて自由水を除去し、ガラス化したビトリゲル膜乾燥体を作製する工程；
　を含む。前記工程（３）で得られた、フィルムと重層化したハイドロゲル乾燥体を再水和することで、フィルムと重層化したビトリゲル膜を得ることができる（工程（４））。このフィルムと重層化した状態のビトリゲル膜を再度、乾燥してガラス化することで、フィルムに重層化したビトリゲル膜乾燥体を得ることができる（工程（５））。
　この実施形態によって作製されるビトリゲル膜乾燥体も、不定形外周縁部をもたないため、従来必要であった不定形外周縁部の除去作業が不要であり、ビトリゲル膜を迅速、かつ大量に生産することが可能になる。
　さらに、従来、ビトリゲル膜は、所望の形状に切断加工することが難しいという問題があったが、フィルムに吸着し、重層化した状態のビトリゲル膜乾燥体は、複雑な形状であっても、所望の形状に正確に切断加工することができる。したがって、この実施形態では、フィルムと重層化されているビトリゲル膜乾燥体を所望形状に切断する工程を含むことができる。所望の形状に成形したビトリゲル膜乾燥体は、必要な時に再水和することで、所望の形状のビトリゲル膜を得ることができる。用途に応じて所望形状のビトリゲル膜を製造することが可能であるため、さらに利便性が向上する。
　なお、ハイドロゲル乾燥体の製造方法の第２の実施形態で説明したように、この実施形態では、上記工程（３）の後に、フィルムに重層化したハイドロゲル乾燥体を所望の形状に成形することも可能である。この場合にも、続いて上記工程（４）（５）を経ることで、所望の形状のビトリゲル膜乾燥体を作製することができる。
　また、フィルムに重層化したビトリゲル膜乾燥体は、容易にフィルムから剥離することが可能である。したがって、所望の形状に成形したビトリゲル膜乾燥体をフィルムから剥離させ、膜状態で取り扱うことができる。したがって、ビトリゲル膜乾燥体の取り扱い性に優れるとともに、その水分吸収性等の特性を利用した医療素材等への有効活用が期待される。
　以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。
　＜実施例１＞基板と壁面鋳型を利用した環状ナイロン膜支持体付きコラーゲンビトリゲル膜乾燥体（コラーゲン量：0.55～2.2 mg/cm2）の作製
　ウシ真皮由来Ｉ型コラーゲンの0.25% ゾルは、氷上で冷却した50ml容量の滅菌コニカルチューブ（Falcon # 35-2070）内で0.5%Ｉ型コラーゲン酸性溶液（KOKEN # IAC-50；5mg/ml）と細胞培養液を均一に等量混合することで調製した。なお、ここで用いた細胞培養液は、10% 非動化ウシ胎仔血清（SIGMA # F2442）、20mM HEPES（GIBCO BRL # 15630-080）、および100 units/ml ペニシリンと100μg/ml ストレプトマイシン（GIBCO BRL # 15140-148）を含有するダルベッコ改変イーグル培養液（GIBCO BRL # 11885-084）である。
　環状ナイロン膜支持体は、外円の直径が33mmで内円の直径が24mmになるようにナイロン膜（GEヘルスケア # RPN1732B；Hybond-N+ 核酸ブロッティング用メンブレン）を切り抜いた後、70% エタノールで10分間滅菌処理、滅菌PBSで10分間３回洗浄、さらに上述の細胞培養液で10分間平衡化することで作製した（特許文献２の図１参照）。
　基板としては、直径60mmの疎水性ポリスチレン製培養シャーレ（Falcon # 35-1007）の底表面を用いた。また、壁面鋳型としては、外円の直径が38mmで内円の直径が34mmで高さが10.0mmのアクリルを用いた。また、壁面鋳型は70% エタノールを噴霧して拭き取る滅菌処理を施してから使用した。具体的には、１つの基板上に１つの壁面鋳型を設置することで、基板と壁面鋳型を分離できる１つの容器を作製した。
　コラーゲンゲルは、この容器内に１枚の環状ナイロン膜支持体を挿入し、その直後に2.0ml、4.0ml、6.0ml、あるいは8.0ml の0.25% コラーゲンゾルを注入して基板にシャーレの蓋をした後、5.0% CO2/95%空気存在下の37.0 ℃ の保湿インキュベーター内でゲル化することで作製した。この際、注入したコラーゲンゾルは基板と壁面鋳型との間隙から流出することなくゲル化した。37.0 ℃の保湿インキュベーター内に移し入れてから２時間目、４時間目、６時間目、および８時間目には、コラーゲンゲル内の自由水が基板と壁面鋳型との間隙から壁面鋳型の外側へ流出した量を定量すると共に、各時間で流出した自由水は除去した。なお、２時間目に壁面鋳型を上下に僅かに動かすことで、コラーゲンゲルと壁面鋳型間の接着を解除した。
　その結果、いずれのコラーゲンゲルも４時間目までに１／３以上、また、８時間目までに２／３程度の自由水を壁面鋳型の外側へ流出したことが分かった（表１）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　なお、壁面鋳型は８時間目に基板上から除去したが、この際、壁面鋳型はコラーゲンゲルと非接着状態にあり、基板上から除去した壁面鋳型の内壁等周囲へのコラーゲンゲルの付着は全くなかった。また、８時間目には37.0 ℃ の保湿インキュベーターより10.0 ℃ 40％湿度の条件下のクリーンベンチ内に移し入れ、その後はシャーレの蓋をはずした状態で流出する自由水は流出させながらコラーゲンゲル内に残留する自由水を自然乾燥により完全に除去し、ガラス化したコラーゲンゲル乾燥体を得た。ここで、コラーゲンゲル内に残留する自由水が完全に除去された段階からはガラス化が始まることになる。そこで、このガラス化が始まるまでの自然乾燥に要したおよその時間を計測した。その結果、ガラス化が始まるまで（コラーゲンゲル内に残留する自由水が完全に除去されてコラーゲンゲル乾燥体となるまで）に要した時間は、2.0mlおよび4.0mlの0.25% コラーゲンゲルの場合は21時間以内、また、6.0mlおよび8.0mlの0.25% コラーゲンゲルの場合は21時間以上41時間以内であった（表２）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　自然乾燥に要した時間は、従来の方法（以下の比較例１）と比べて大幅に短縮された。
　ガラス化後１日ないしは２日目のコラーゲンゲル乾燥体を室温下のクリーンベンチに移し入れ、基板のシャーレ内に5.0ml のPBSを加えて再水和して基板より剥離することで環状ナイロン膜支持体付きコラーゲンビトリゲル膜を作製した。そして、数回5.0ml のPBSでリンスすることで、PBSに平衡化した環状ナイロン膜支持体付きコラーゲンビトリゲル膜を作製した。この環状ナイロン膜支持体付きコラーゲンビトリゲル膜は壁面鋳型の直径34mmの内円（面積：9.1 cm2）形状を反映して、環状ナイロン膜支持体の直径33mmの外円周囲を僅かなゆとりで包埋していた（図４）
　なお、この環状ナイロン膜支持体付きコラーゲンビトリゲル膜は、図４の左から、コラーゲンを5.0 mg （コラーゲンゾル2.0ml由来）、10.0 mg （コラーゲンゾル4.0ml由来）、15.0 mg （コラーゲンゾル6.0ml由来）、および20.0 mg （コラーゲンゾル8.0ml由来）含有している。
　さらに、この環状ナイロン膜支持体付きコラーゲンビトリゲル膜を直径35mmの親水性ポリスチレン製培養シャーレ（Falcon # 35-3001）および底表面にパラフィルム（Pechiney Plastic Packaging社製）を敷いた直径60mmの疎水性ポリスチレン製培養シャーレ（Falcon # 35-1007）に移し入れ、10.0 ℃ 40％湿度の条件下のクリーンベンチ内で蓋をはずした状態で１～２日間程度放置し完全に乾燥させた。その後、室温下のクリーンベンチに移し入れて各々のシャーレに蓋をしてから室温で無菌的に保管維持してガラス化を進行させることで、各々の環状ナイロン膜支持体付きコラーゲンビトリゲル膜乾燥体を作製した。
　その結果、前者の直径35mmの親水性ポリスチレン製培養シャーレ内に作製した環状ナイロン膜支持体付きコラーゲンビトリゲル膜乾燥体に於いては、乾燥した状態ではシャーレ底面に密着しており剥離できないが、再水和した際にはシャーレの内壁を周囲に沿って先の鋭敏なピンセットでなぞる操作を必要とせず、また、環状ナイロン膜の外周に余分なビトリゲル膜（不定形外周縁部）を伴わない状態で容易にシャーレ底面よりピンセットで剥離できた。したがって、細胞を両面に３次元培養する担体として取扱い性に優れており有用である。
　後者のパラフィルム上に作製した環状ナイロン膜支持体付きコラーゲンビトリゲル膜乾燥体に於いては、環状ナイロン膜支持体付きコラーゲンビトリゲル膜乾燥体はパラフィルムに吸着した状態を呈しており、また乾燥したままの状態で容易にパラフィルムより剥離できた。したがって、パラフィルムに吸着した環状ナイロン膜支持体付きコラーゲンビトリゲル膜乾燥体あるいはパラフィルムより剥離した環状ナイロン膜支持体付きコラーゲンビトリゲル膜乾燥体はバイオマテリアルとして取扱い性に優れており有用である。
　なお、この環状ナイロン膜支持体付きコラーゲンビトリゲル膜乾燥体は単位面積（1.0 cm2）当たりにコラーゲンを0.55 mg （コラーゲンゾル2.0ml由来）、1.1 mg （コラーゲンゾル4.0ml由来）、1.6 mg （コラーゲンゾル6.0ml由来）、あるいは2.2 mg （コラーゲンゾル8.0ml由来）含有している。
　なお、上述の工程で環状ナイロン膜を挿入しなければ、環状ナイロン膜の支持体が無いコラーゲンビトリゲル膜乾燥体を作製できる。また、壁面鋳型の底平面形状および高さを改変することで、任意の形状と厚みを有するコラーゲンビトリゲル膜乾燥体を作製できる。

　＜比較例１＞従来の培養シャーレを利用した環状ナイロン膜支持体付きコラーゲンビトリゲル膜乾燥体の作製
　実施例１で基板と分離できる壁面鋳型を利用した代わりに従来の直径35mmの疎水性ポリスチレン製培養シャーレ（Falcon # 35-1008）を使用して、実施例１と同様に実験を行った。
　具体的には、コラーゲンゲルは、この培養シャーレ内に１枚の環状ナイロン膜支持体を挿入し、その直後に2.0ml、4.0ml、6.0ml、あるいは8.0ml の0.25% コラーゲンゾルを注入してシャーレの蓋をした後、5.0% CO2/95%空気存在下の37.0 ℃ の保湿インキュベーター内でゲル化することで作製した。37.0 ℃ の保湿インキュベーター内に移し入れてから２時間目、４時間目、６時間目、および８時間目には、コラーゲンゲルの上面側に滲出てくる自由水の量を定量すると共に、各時間で滲出した自由水は除去した。その結果、いずれのコラーゲンゲルからも８時間目までに10%以下の自由水しか上面側には滲出しないことが分かった（表３）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　また、８時間目には37.0 ℃ の保湿インキュベーターより10.0 ℃ 40％湿度の条件下のクリーンベンチ内に移し入れ、その後はシャーレの蓋をはずした状態でコラーゲンゲル内に残留する自由水を自然乾燥により完全に除去し、ガラス化したコラーゲンゲル乾燥体を得た。
　ここで、コラーゲンゲル内に残留する自由水が完全に除去された段階からはガラス化が始まることになる。そこで、このガラス化が始まるまで（コラーゲンゲル内に残留する自由水が完全に除去されてコラーゲンゲル乾燥体となるまで）の自然乾燥に要したおよその時間を計測した。その結果、いずれのコラーゲンゲルも90%以上の自由水をゲル内に残留しているため、ガラス化が始まるまでに要した時間は、2.0mlの0.25% コラーゲンゲルの場合は21時間以上41時間以内、4.0mlの0.25% コラーゲンゲルの場合は41時間以上48時間以内、6.0mlの0.25% コラーゲンゲルの場合は48時間（２日）以上３日以内、また、8.0ml の0.25% コラーゲンの場合は３日以上４日以内であった（表４）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　ガラス化後１日ないしは２日目のコラーゲンゲル乾燥体を室温下のクリーンベンチに移し入れ、シャーレ内に2.0ml のPBSを加えて再水和してシャーレ底面および壁面より剥離することで環状ナイロン膜支持体付きコラーゲンビトリゲル膜を作製した。そして、数回2.0ml のPBSでリンスすることで、PBSに平衡化した環状ナイロン膜支持体付きコラーゲンビトリゲル膜を作製した。この環状ナイロン膜支持体付きコラーゲンビトリゲル膜には、環状ナイロン膜支持体の直径33mmの外円周囲にシャーレの壁面由来の余分なコラーゲンビトリゲル膜（不定形外周縁部）が付随していた（図５）。なお、この環状ナイロン膜支持体の外円周囲の余分なコラーゲンビトリゲル膜を切り落とすことは、再水和した際にシャーレの内壁に沿って先の鋭敏なピンセットでなぞる操作をしても、環状ナイロン膜支持体の直径33mmの外円周囲よりはみ出してしまうので不可能であった。したがって、環状ナイロン膜支持体の外円周囲に見合ったコラーゲンビトリゲル膜を切り出す作業は極めて困難である。
　また、この環状ナイロン膜支持体付きコラーゲンビトリゲル膜は、図５の左から、コラーゲンを5.0 mg （コラーゲンゾル2.0ml由来）、10.0 mg （コラーゲンゾル4.0ml由来）、15.0 mg （コラーゲンゾル6.0ml由来）、あるいは20.0 mg （コラーゲンゾル8.0ml由来）含有しているが、壁面由来の余分なコラーゲンビトリゲル膜を切り落とした場合には、正確なコラーゲン含有量を算出できなくなる。
　比較例１においても、環状ナイロン膜支持体付きコラーゲンビトリゲル膜乾燥体を作製することは可能であったが、作製に伴う作業の困難性、正確なコラーゲン含有量を算出できないこと、およびガラス化に至るまでコラーゲンゲル内自由水の乾燥時間が長いことを考慮すると実用的ではないことが確認された。
　＜実施例２＞基板上に敷いたパラフィルムと壁面鋳型を利用したパラフィルムに吸着したコラーゲンビトリゲル膜乾燥体（コラーゲン量：0.52～2.1 mg/cm2）の作製
　基板としては、直径60mmの疎水性ポリスチレン製培養シャーレ（Falcon # 35-1007）の底表面を用いた。また、壁面鋳型としては、外円の直径が39mmで内円の直径が35mmで高さが10.0mmのアクリルを用いた。パラフィルム（Pechiney Plastic Packaging社製）は、直径50mmの円形に切断して用いた。なお、壁面鋳型およびパラフィルムともに70% エタノールを噴霧して拭き取る滅菌処理を施してから使用した。具体的には、直径60mmの疎水性ポリスチレン製培養シャーレの底表面上に直径50mmの円形に切断した１枚のパラフィルムを敷いて、その上に１つの壁面鋳型を設置することで、基板上に敷いたパラフィルムと壁面鋳型を分離できる１つの容器を作製した。
　コラーゲンゲルは、この容器内に2.0ml、4.0ml、6.0ml、あるいは8.0ml の0.25% コラーゲンゾルを注入してシャーレの蓋をした後、5.0% CO2/95%空気存在下の37.0 ℃ の保湿インキュベーター内でゲル化することで作製した。この際、注入したコラーゲンゾルは基板上に敷いたパラフィルムと壁面鋳型との間隙から流出することなくゲル化した。
　37.0 ℃の保湿インキュベーター内に移し入れてから４時間目、６時間目、および８時間目には、コラーゲンゲル内の自由水が基板上に敷いたパラフィルムと壁面鋳型との間隙から壁面鋳型の外側へ流出した量を定量すると共に、各時間で流出した自由水は除去した。なお、２時間目に壁面鋳型を上下に僅かに動かすことで、コラーゲンゲルと壁面鋳型間の接着を解除した。その結果、コラーゲンゾル6.0mlおよび8.0ml由来のコラーゲンゲルは４時間目までに１／３以上、コラーゲンゾル4.0ml由来のコラーゲンゲルは６時間目までに約１／３、またコラーゲンゾル2.0ml由来のコラーゲンゲルは８時間目までに約１／４の自由水が壁面鋳型の外側へ流出したことが分かった（表５）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　壁面鋳型は８時間目に基板上から除去したが、この際、壁面鋳型はコラーゲンゲルと非接着状態にあり、基板上に敷いたパラフィルムから除去した壁面鋳型の内壁等周囲へのコラーゲンゲルの付着は全くなかった。また、８時間目には37.0 ℃ の保湿インキュベーターより10.0 ℃ 40％湿度の条件下のクリーンベンチ内に移し入れ、その後はシャーレの蓋をはずした状態で流出する自由水は流出させながらコラーゲンゲル内に残留する自由水を自然乾燥により完全に除去し、コラーゲンゲル乾燥体を得た。
　ここで、コラーゲンゲル内に残留する自由水が完全に除去された段階からはガラス化が始まることになる。そこで、このガラス化が始まるまで（コラーゲンゲル内に残留する自由水が完全に除去されてコラーゲンゲル乾燥体となるまで）の自然乾燥に要したおよその時間を計測した。その結果、ガラス化が始まるまでに要した時間は、2.0mlの0.25% コラーゲンゲルの場合は20時間以内、また、4.0ml、6.0mlおよび8.0mlの0.25% コラーゲンゲルの場合は20時間以上41時間以内であった（表６）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　ガラス化後１日ないしは２日目のコラーゲンゲル乾燥体を室温下のクリーンベンチに移し入れ、基板のシャーレ内に5.0ml のPBSを加えて再水和して基板上に敷いてあるパラフィルムに吸着した状態でコラーゲンビトリゲル膜を作製した。そして、数回5.0ml のPBSでリンスすることで、PBSに平衡化したコラーゲンビトリゲル膜をパラフィルムに吸着した状態で作製した。このコラーゲンビトリゲル膜は壁面鋳型の直径35mmの内円（面積：9.6 cm2）形状を反映しており、不定形外周縁部をもたないものであった。
　さらに、このパラフィルムに吸着した状態のコラーゲンビトリゲル膜を直径60mmの疎水性ポリスチレン製培養シャーレ（Falcon # 35-1007）に移し入れ、10.0 ℃ 40％湿度の条件下のクリーンベンチ内で蓋をはずした状態で１～２日間程度放置し完全に乾燥させた後、室温下のクリーンベンチに移し入れてシャーレに蓋をしてから室温で無菌的に保管維持してガラス化を進行させることで、パラフィルムに吸着した状態のコラーゲンビトリゲル膜乾燥体を作製した。このパラフィルムに吸着した状態のコラーゲンビトリゲル膜乾燥体は、所望の微細形状にハサミやメス等で容易に切断できた。また、コラーゲンビトリゲル膜乾燥体は、パラフィルムより容易に剥離することも可能であった（図６）。
　この工程で作製したコラーゲンビトリゲル膜は、コラーゲンを5.0 mg （コラーゲンゾル2.0ml由来）、10.0 mg （コラーゲンゾル4.0ml由来）、15.0 mg （コラーゲンゾル6.0ml由来）、あるいは20.0 mg （コラーゲンゾル8.0ml由来）含有している。また、この工程で作製したコラーゲンビトリゲル膜乾燥体は、図６の左から、単位面積（1.0 cm2）当たりにコラーゲンを0.52 mg （コラーゲンゾル2.0ml由来）、1.0 mg （コラーゲンゾル4.0ml由来）、1.6 mg （コラーゲンゾル6.0ml由来）、あるいは2.1 mg （コラーゲンゾル8.0ml由来）含有している。
　なお、上述の工程でコラーゲンゾルに環状ナイロン膜を挿入すれば、環状ナイロン膜支持体付きコラーゲンビトリゲル膜乾燥体をパラフィルムに吸着した状態で作製できる（図７）。また、壁面鋳型の底平面形状および高さを改変することで、任意の形状と厚みを有するコラーゲンビトリゲル膜乾燥体をパラフィルムに吸着した状態で作製できる。
　＜実施例３＞基板と壁面鋳型を利用した環状ナイロン膜支持体付きコラーゲンビトリゲル膜乾燥体の迅速大量生産法
　基板としては、100mmx100mmの疎水性ポリスチレン製培養シャーレ（Falcon # 35-1112）の底表面を用いた。また、壁面鋳型としては、外円の直径が38mmで内円の直径が34mm外円で高さが10.0mmのアクリルを４つ用いた。また、壁面鋳型は70% エタノールを噴霧して拭き取る滅菌処理を施してから使用した。
　具体的には、１つの基板上に４つの壁面鋳型を設置することで、基板と壁面鋳型を分離できる４つの容器を作製した。各容器内に１枚の環状ナイロン膜支持体を挿入し2.0mlの0.25% コラーゲンゾルを注入して基板にシャーレの蓋をした後、5.0% CO2/95%空気存在下の37.0 ℃ の保湿インキュベーター内でゲル化することで、１つの基板上に４つのコラーゲンゲルを作製した。この際、注入したコラーゲンゾルは基板と壁面鋳型との間隙から流出することなくゲル化した（図８）。
　また、37.0 ℃ の保湿インキュベーター内に移し入れてから２時間目には、壁面鋳型を上下に僅かに動かすことでコラーゲンゲルと壁面鋳型間の接着を解除した（図９）。その後、４時間目までに１／３程度の自由水が壁面鋳型の外側へ流出したので、壁面鋳型を基板上から除去した（図１０）。流出した自由水を除去した後、10.0 ℃ 40％湿度の条件下のクリーンベンチ内に移し入れ、その後はシャーレの蓋をはずした状態で流出する自由水は流出させながらコラーゲンゲル内に残留する自由水を自然乾燥により完全に除去し、コラーゲンゲル乾燥体を得た。
　ここで、コラーゲンゲル内に残留する自由水が完全に除去された段階からはガラス化が始まることになる。このガラス化が始まるまで（コラーゲンゲル内に残留する自由水が完全に除去されてコラーゲンゲル乾燥体となるまで）の自然乾燥は１日以内に完了した。ガラス化後１日ないしは２日目に室温下のクリーンベンチに移し入れ、基板のシャーレ内に20ml のPBSを加えて再水和して基板より剥離することで環状ナイロン膜支持体付きコラーゲンビトリゲル膜を４つ同時に作製した。以下、実施例１と同様の操作を施すことで、単位面積（1.0 cm2）当たりにコラーゲンを0.55 mg含有する環状ナイロン膜支持体付きコラーゲンビトリゲル膜乾燥体を４つ同時に作製した。
　なお、上述の工程で環状ナイロン膜を挿入しなければ、環状ナイロン膜の支持体が無いコラーゲンビトリゲル膜乾燥体を４つ同時に作製できる。また、上述の工程で実施例２と同様に基板上にパラフィルム敷いて用いれば、パラフィルムに吸着したコラーゲンビトリゲル膜乾燥体を４つ同時に作製できる。
　＜実施例４＞基板と壁面鋳型を利用した環状ナイロン膜支持体付きコラーゲンビトリゲル膜乾燥体（コラーゲン量：2.7～11.0 mg/cm2）の作製
　実施例１の基板と壁面鋳型を分離できる容器において、10.0mlから40.0ml までの0.25% コラーゲンゾルを注入できるようにするために、実施例１で使用した壁面鋳型より高さが高い壁面鋳型を作製して、実施例１と同様の実験を行った。
　具体的には、外円の直径が38mmで内円の直径が34mmで高さが30.0mmおよび60.0mmのアクリルからなる壁面鋳型を作製した。基板としては、高さが30.0mmの壁面鋳型には直径60mmの疎水性ポリスチレン製培養シャーレ（Falcon # 35-1007）の底表面、また高さが60.0mmの壁面鋳型には100mmx100mmの疎水性ポリスチレン製培養シャーレ（Falcon # 35-1112）の底表面を用いた。それぞれ、１つの基板上に１つの壁面鋳型を設置することで基板と壁面鋳型を分離できる１つの容器を作製し、各容器内に１枚の環状ナイロン膜支持体を挿入した。その直後に、高さが30.0mmの壁面鋳型を有する容器には10.0ml、12.0ml、16.0ml、あるいは20.0ml の0.25% コラーゲンゾルを注入して、また高さが60.0mmの壁面鋳型を有する容器には24.0ml、28.0ml、32.0ml、36.0ml、あるいは40.0ml の0.25% コラーゲンゾルを注入して、基板に各々のシャーレの蓋をした後、5.0% CO2/95%空気存在下の37.0 ℃ の保湿インキュベーター内でゲル化することでコラーゲンゲルを作製した。この際、注入したコラーゲンゾルは基板と壁面鋳型との間隙から流出することなくゲル化した。37.0 ℃の保湿インキュベーター内に移し入れてから２時間目、４時間目、６時間目、および８時間目には、コラーゲンゲル内の自由水が基板と壁面鋳型との間隙から壁面鋳型の外側へ流出した量を定量すると共に、各時間で流出した自由水は除去した。なお、２時間目に壁面鋳型を上下に僅かに動かすことで、コラーゲンゲルと壁面鋳型間の接着を解除した。
　なお、壁面鋳型は８時間目に基板上から除去したが、この際、壁面鋳型はコラーゲンゲルと非接着状態にあり、基板上から除去した壁面鋳型の内壁等周囲へのコラーゲンゲルの付着は全くなかった。また、８時間目には37.0 ℃ の保湿インキュベーターより10.0 ℃ 40％湿度の条件下のクリーンベンチ内に移し入れ、その後はシャーレの蓋をはずした状態で流出する自由水は流出させた。ここで、10.0mlから20.0ml までの0.25% コラーゲンゾルを高さ30.0mmの壁面鋳型内に注入した直径60mmの疎水性ポリスチレン製培養シャーレについては、コラーゲンゲル内に残留する自由水を自然乾燥により完全に除去し、ガラス化したコラーゲンゲル乾燥体を得た。また、24.0mlから40.0ml までの0.25% コラーゲンゾルを高さ60.0mmの壁面鋳型内に注入した100mmx100mmの疎水性ポリスチレン製培養シャーレについては、流出する自由水の量が多いため10.0 ℃ 40％湿度の条件下のクリーンベンチ内に移し入れてから１時間半後（ゲル作製後の９時間半目）にもコラーゲンゲルの外側へ流出した自由水の量を定量して、その自由水を除去した後、コラーゲンゲル内に残留する自由水を自然乾燥により完全に除去し、ガラス化したコラーゲンゲル乾燥体を得た。
　その結果、10.0mlおよび12.0mlのコラーゲンゲルについては８時間目までに１／２程度、また、16.0mlおよび20.0mlのコラーゲンゲルについては８時間目までに２／３以上の自由水を壁面鋳型の外側へ流出したことが分かった（表７）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　さらに、24.0mlから40.0ml までのコラーゲンゲルについては８時間目までに１／２以上、また、９時間半目までに２／３程度の自由水を壁面鋳型の外側へ流出したことが分かった（表８）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　なお、コラーゲンゲル内に残留する自由水が完全に除去された段階からはガラス化が始まることになる。そこで、このガラス化が始まるまでの自然乾燥に要したおよその時間を計測した。その結果、ガラス化が始まるまで（コラーゲンゲル内に残留する自由水が完全に除去されてコラーゲンゲル乾燥体となるまで）に要した時間は、10.0mlの0.25% コラーゲンゲルの場合は21時間以上37時間以内、12.0mlの0.25% コラーゲンゲルの場合は40時間以上43時間以内、また、16.0mlおよび20.0mlの0.25% コラーゲンゲルの場合は37時間以上40時間以内であった（表９）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　さらに、24.0mlおよび32.0mlの0.25% コラーゲンゲルの場合は47時間以内、28.0mlの0.25% コラーゲンゲルの場合は47時間以上51時間以内、36.0mlの0.25% コラーゲンゲルの場合は51時間以上62時間以内、また、40.0mlの0.25% コラーゲンゲルの場合は47時間以上51時間以内であった（表１０）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　つまり、自然乾燥に要した時間は、10.0mlから40.0ml までの0.25% コラーゲンゲルでは最長でも62時間以内であり、基板と壁面鋳型からなる容器にコラーゲンゾルを注入後３日間以内にはガラス化したコラーゲンゲル乾燥体を得られることが分かった。
　ガラス化後１日ないしは２日目のコラーゲンゲル乾燥体を室温下のクリーンベンチに移し入れ、基板のシャーレが直径60mmの疎水性ポリスチレン製培養シャーレの場合はシャーレ内に5.0ml、また基板のシャーレが100mmx100mmの疎水性ポリスチレン製培養シャーレの場合はシャーレ内に20.0mlのPBSを加えて再水和して基板より剥離することで環状ナイロン膜支持体付きコラーゲンビトリゲル膜を作製した。そして、数回PBSでリンスすることで、PBSに平衡化した環状ナイロン膜支持体付きコラーゲンビトリゲル膜を作製した。この環状ナイロン膜支持体付きコラーゲンビトリゲル膜は壁面鋳型の直径34mmの内円（面積：9.1 cm2）形状を反映して、環状ナイロン膜支持体の直径33mmの外円周囲を僅かなゆとりで包埋していた。
　この工程で作製したコラーゲンビトリゲル膜は、コラーゲンを25.0 mg （コラーゲンゾル10.0ml由来）、30.0 mg （コラーゲンゾル12.0ml由来）、40.0 mg （コラーゲンゾル16.0ml由来）、50.0 mg （コラーゲンゾル20.0ml由来）、60.0 mg （コラーゲンゾル24.0ml由来）、70.0 mg （コラーゲンゾル28.0ml由来）、80.0 mg （コラーゲンゾル32.0ml由来）、90.0 mg （コラーゲンゾル36.0ml由来）、あるいは100.0 mg （コラーゲンゾル40.0ml由来）含有している。
　さらに、この環状ナイロン膜支持体付きコラーゲンビトリゲル膜を直径35mmの親水性ポリスチレン製培養シャーレ（Falcon # 35-3001）および底表面にパラフィルム（Pechiney Plastic Packaging社製）を敷いた直径60mmの疎水性ポリスチレン製培養シャーレ（Falcon # 35-1007）に移し入れ、10.0 ℃ 40％湿度の条件下のクリーンベンチ内で蓋をはずした状態で１～２日間程度放置し完全に乾燥させた。その後、室温下のクリーンベンチに移し入れて各々のシャーレに蓋をしてから室温で無菌的に保管維持してガラス化を進行させることで、各々の環状ナイロン膜支持体付きコラーゲンビトリゲル膜乾燥体を作製した。
　この工程で作製したコラーゲンビトリゲル膜乾燥体は、単位面積（1.0 cm2）当たりにコラーゲンを2.7 mg （コラーゲンゾル10.0ml由来）、3.3 mg （コラーゲンゾル12.0ml由来）、4.4 mg （コラーゲンゾル16.0ml由来）、5.5 mg （コラーゲンゾル20.0ml由来）、6.6 mg （コラーゲンゾル24.0ml由来）、7.7 mg （コラーゲンゾル28.0ml由来）、8.8 mg （コラーゲンゾル32.0ml由来）、9.9 mg （コラーゲンゾル36.0ml由来）、あるいは11.0 mg （コラーゲンゾル40.0ml由来）含有している。
　＜比較例２＞従来の培養シャーレを利用した環状ナイロン膜支持体付きコラーゲンビトリゲル膜乾燥体の作製
　実施例４で基板と分離できる壁面鋳型を利用した代わりに従来の直径35mmの疎水性ポリスチレン製培養シャーレ（Falcon # 35-1008）を使用して、実施例４と同様に実験を行った。
　具体的には、この培養シャーレ内に１枚の環状ナイロン膜支持体を挿入し、その直後に10.0mlから40.0ml までの0.25% コラーゲンゾルを注入しようとしたが、10.0mlの0.25% コラーゲンゾルを注入するとシャーレの高さより注入したコラーゲンゾルがドーム状に盛り上がってしまい蓋をすることができず、また、12.0ml以上の0.25% コラーゲンゾルを注入するとシャーレの許容量を超えて溢れ出ることが分かった。つまり、従来の直径35mmの疎水性ポリスチレン製培養シャーレでは、10.0ml以上のコラーゲンゲルは作製できないことが分かった。
　＜実施例５＞基板と壁面鋳型を利用して作製した環状ナイロン膜支持体の無いコラーゲンビトリゲル膜の厚さの測定
　実施例４において、外円の直径が39mmで内円の直径が35mmで高さが60.0mmのアクリルからなる壁面鋳型、および基板として100mmx100mmの疎水性ポリスチレン製培養シャーレ（Falcon # 35-1112）の底表面を用いて、１つの基板上に１つの壁面鋳型を設置することで基板と壁面鋳型を分離できる１つの容器を作製した。各容器内には環状ナイロン膜を挿入せずに、20.0ml、24.0ml、28.0ml、32.0ml、36.0ml、あるいは40.0ml の0.25% コラーゲンゾルを注入して、5.0% CO2/95%空気存在下の37.0 ℃ の保湿インキュベーター内でゲル化すると共に、８時間にわたりコラーゲンゲル内の自由水を基板と壁面鋳型との間隙から壁面鋳型の外側へ流出させ除去した。その後、10.0 ℃ 40％湿度の条件下のクリーンベンチ内に移し入れて１時間半後（ゲル作製後の９時間半目）には、各コラーゲンゲルについて外側へ流出した自由水を除去した。さらに、３日間かけて各コラーゲンゲル内に残留する自由水を自然乾燥により完全に除去し、ガラス化したコラーゲンゲル乾燥体を得た。ガラス化後１日目の各コラーゲンゲル乾燥体を室温下のクリーンベンチに移し入れ、基板のシャーレ内に20.0mlのPBSを加えて再水和して基板より剥離することでコラーゲンビトリゲル膜を作製した。そして、数回PBSでリンスすることで、PBSに平衡化したコラーゲンビトリゲル膜を作製した。各コラーゲンビトリゲル膜は壁面鋳型の直径35mmの内円（面積：9.6 cm2）形状を反映しており、不定形外周縁部をもたないものであった。
　このように作製した環状ナイロン膜支持体の無い各コラーゲンビトリゲル膜について、厚さを計測した。具体的には、２枚のスライドガラス（Matsunami # S-0317）の間に１枚のコラーゲンビトリゲル膜を挟んだ状態でマイクロメータ（Mitutoyo　デジマチックマイクロメータ # MDC-25M）に装着して計測した。その結果、コラーゲンを50.0 mg 含有するコラーゲンビトリゲル膜（コラーゲンゾル20.0ml由来）は 428±148.1 μm （3回測定）、60.0 mg 含有するコラーゲンビトリゲル膜（コラーゲンゾル24.0ml由来）は 635±21.4 μm（3回測定）、70.0 mg 含有するコラーゲンビトリゲル膜（コラーゲンゾル28.0ml由来）は 714±34.6 μm（3回測定）、80.0 mg 含有するコラーゲンビトリゲル膜（コラーゲンゾル32.0ml由来）は 774±29.9 μm（3回測定）、90.0 mg 含有するコラーゲンビトリゲル膜（コラーゲンゾル36.0ml由来）は 934±22.2 μm（3回測定）、および100.0 mg 含有するコラーゲンビトリゲル膜（コラーゲンゾル40.0ml由来）は 1,073±58.5 μm（3回測定）であった。
　＜実施例６＞コラーゲンビトリゲル膜乾燥体が重層化した積層体の作製
　基板としては、100mm×100mmの疎水性ポリスチレン製培養シャーレの底面、壁面鋳型としては、外円の直径が38mmで内円の直径が34mmで高さが30mmのアクリルを4つ用いた。１つの基板上に４つの壁面鋳型を設置することで、基板と壁面鋳型を分離できる４つの容器を作製した。各容器に１枚の環状ナイロン膜支持体を挿入し、2.0mlの0.25%コラーゲンゾルを注入して基板にシャーレの蓋をした後、5.0％　CO2/95%空気存在下の37.0℃の保湿インキュベーター内でゲル化することで、1つの基板上に4つのコラーゲンゲルを作製した。
　37.0℃の保湿インキュベーター内に移し入れてから2時間目には、壁面鋳型を上下に僅かに動かすことでコラーゲンゲルと壁面鋳型間の接着を解除した。その後、4-6時間目までに1/4程度の自由水が壁面鋳型の外側に流出したので、壁面鋳型を基板から除去した。流出した自由水を除去した後、10.0℃　40％湿度の条件下のクリーンベンチ内に移し入れ、その後はシャーレの蓋をはずした状態でコラーゲンゲル内に残留する自由水を2日間の自然乾燥により完全に除去し、コラーゲンゲル乾燥体を得た。
　このガラス化したコラーゲンゲル乾燥体を基板のシャーレ内に10mlの細胞培養液（実施例1と同様の組成）を加えて再水和して基板より剥離することで環状ナイロン膜支持体付きコラーゲンビトリゲル膜を4つ作製した。
　さらに、１つの基板上に４つの壁面鋳型を設置し、基板と壁面鋳型を分離できる４つの容器を再度、作製した。そして、上記の方法で作製した環状ナイロン膜支持体付きコラーゲンビトリゲル膜の細胞培養液を除去後、この環状ナイロン膜支持体付きコラーゲンビトリゲル膜を各容器に1枚ずつ挿入した。
以下、先と同様に各容器に2.0mlの0.25%コラーゲンゾルを注入して、ゲル化、コラーゲンゲル内の自由水の流出、10.0℃　40％湿度の条件下での自由水の完全に除去、10mlの細胞培養液による再水和の一連の操作を2回繰り返した（最後の再水和は10mlの細胞培養液の代わりに20mlのPBSで行った)後、数回PBSでリンスすることで、PBSで平衡化した。これによって、環状ナイロン膜支持体を有しコラーゲンビトリゲル膜が重層化した積層体（0.25％コラーゲンゾル2.0ml×3層由来）を4つ作製することができた。
　このコラーゲンビトリゲル膜が重層化した積層体は、コラーゲンを15.0mg含有しており、壁面鋳型の直径34mmの内円の形状を反映していた。
　また、コラーゲンビトリゲル膜が重層化した積層体（0.25％コラーゲンゾル2.0ml×3層由来）について、マイクロメータに装着して厚さを計測した結果、65±2μm（3回測定平均）であった。実施例３の方法で作製したコラーゲンビトリゲル（0.25％コラーゲンゾル6.0ml由来）の厚さ69±5μm（3回測定平均）と同等であった。
　さらに、このコラーゲンビトリゲル膜の積層体を、底面にパラフィルムを敷いた100mm×100mmの疎水性ポリスチレン製培養シャーレに移し入れ、10.0℃　40％湿度の条件下のクリーンベンチ内で蓋をはずした状態でコラーゲンゲル内に1日程度放置し完全に乾燥させた。その後、シャーレの蓋をしてから室温で無菌的に保管維持してガラス化を進行させることで、コラーゲンビトリゲル膜乾燥体が重層化した積層体を作製した。
　そして、この工程で作製した、コラーゲンビトリゲル膜乾燥体の積層体は、単位面積（1.0cm2）当たりコラーゲンを1.65mg含有していた。
　＜実施例7＞個別に作製したコラーゲンビトリゲル膜乾燥体を重層化させた積層体の作製
　基板としては、100mm×100mmの疎水性ポリスチレン製培養シャーレの底面、壁面鋳型としては、外円の直径が38mmで内円の直径が34mmで高さが30mmのアクリルを４つ用いた。１つの基板上に４つの壁面鋳型を設置することで、基板と壁面鋳型を分離できる４つの容器を作製した。各容器に2.0mlの0.25%コラーゲンゾルを注入した後、実施例4に従い作製したビトリゲル膜乾燥体（0.25％コラーゲンゾル10.0ml由来）を挿入し、そこに再度2.0mlの0.25%コラーゲンゾルを注入した後、さらに実施例4に従い作製したビトリゲル膜乾燥体（0.25％コラーゲンゾル10.0ml由来）を挿入して、最後に2.0mlの0.25%コラーゲンゾルを注入して、基板にシャーレの蓋をした後、5.0％　CO2/95%空気存在下の37.0℃の保湿インキュベーター内でゲル化することで、1つの基板上に4つのコラーゲンゲルを作製した。
　37.0℃の保湿インキュベーター内に移し入れてから2時間目には、壁面鋳型を上下に僅かに動かすことでコラーゲンゲルと壁面鋳型間の接着を解除した。その後、3時間目までに1/3程度の自由水が壁面鋳型の外側に流出したので、壁面鋳型を基板から除去した。流出した自由水を除去した後、10.0℃　40％湿度の条件下のクリーンベンチ内に移し入れ、その後はシャーレの蓋をはずした状態でコラーゲンゲル内に残留する自由水を2日間の自然乾燥により完全に除去し、コラーゲンゲル乾燥体が重層化した積層体を得た。このガラス化したコラーゲンゲル乾燥体の積層体を基板のシャーレ内に20mlのPBSを加えて再水和して基板より剥離することでコラーゲンビトリゲル膜の積層体を4つ作製した。そして、数回PBSでリンスすることで、PBSで平衡化したコラーゲンビトリゲル膜の積層体を4つ作製した。このコラーゲンビトリゲル膜の積層体は、コラーゲンを65.0mg含有しており、壁面鋳型の直径34mmの内円の形状を反映していた。
　また、このように作製したコラーゲンビトリゲル膜の積層体（0.25％コラーゲンゾル2.0ml＋10.0ml＋2.0ml＋10.0ml＋2.0ml（合計26ml）由来）について、実施例６の方法に従って厚さを計測した結果、336±20μm（3回測定平均）であった。
　さらに、このコラーゲンビトリゲル膜の積層体を、底面にパラフィルムをしいた100mm×100mmの疎水性ポリスチレン製培養シャーレに移し入れ、10.0℃　40％湿度の条件下のクリーンベンチ内で蓋をはずした状態でコラーゲンゲル内に1日程度放置し完全に乾燥させた。その後、シャーレの蓋をしてから室温で無菌的に保管維持してガラス化を進行させることで、コラーゲンビトリゲル膜乾燥体の積層体を作製した。
　この工程で作製したコラーゲンビトリゲル膜乾燥体の積層体は、単位面積（1.0cm2）当たりコラーゲンを7.15mg含有している。
　＜実施例８＞FITC標識ヤギ抗マウス抗体を含有したビトリゲル膜乾燥体の作製
　基板としては、100mm×100mmの疎水性ポリスチレン製培養シャーレの底面、壁面鋳型としては、外円の直径が38mmで内円の直径が34mmで高さが30mmのアクリルを４つ用いた。１つの基板上に４つの壁面鋳型を設置することで、基板と壁面鋳型を分離できる４つの容器を作製した。各容器に１枚の環状ナイロン膜支持体を挿入し、2.0mlの0.25%コラーゲンゾルを注入して基板にシャーレの蓋をした後、5.0％　CO2/95%空気存在下の37.0℃の保湿インキュベーター内でゲル化することで、1つの基板上に4つのコラーゲンゲルを作製した。
　37.0℃の保湿インキュベーター内に移しいれてから2時間目には、壁面鋳型を上下に僅かに動かすことでコラーゲンゲルと壁面鋳型間の接着を解除した。その後、4-6時間目までに1/3程度の自由水が壁面鋳型の外側に流出したので、壁面鋳型を基板から除去した。流出した自由水を除去した後、10.0℃　40％湿度の条件下のクリーンベンチ内に移し入れ、その後はシャーレの蓋をはずした状態でコラーゲンゲル内に残留する自由水を2日間の自然乾燥により完全に除去し、コラーゲンゲル乾燥体を得た。
　このガラス化したコラーゲンゲル乾燥体を基板のシャーレ内に10mlの細胞培養液（実施例1と同様の組成）を加えて再水和して基板より剥離することで環状ナイロン膜支持体付きコラーゲンビトリゲル膜を4つ作製した。細胞培養液を除去後、この環状ナイロン膜支持体付きコラーゲンビトリゲル膜が各容器に1枚挿入されるように、１つの基板上に４つの壁面鋳型を設置することで、基板と壁面鋳型を分離できる４つの容器を再度、作製した。
　さらに、各容器に2.0mlの1%のFITC標識したヤギ抗マウスIgG抗体溶液を含有した0.25%コラーゲンゾルを注入して、ゲル化、コラーゲンゲル内の自由水の流出、10.0℃　40％湿度の条件下での自由水の完全に除去、10mlの細胞培養液による再水和の一連の操作を行った。これによって、環状ナイロン膜支持体付きコラーゲンビトリゲル膜とFITC標識ヤギ抗マウスIgG抗体を含有したコラーゲンビトリゲル膜と重層化させた。
　さらに、１つの基板上に４つの壁面鋳型を設置することで、基板と壁面鋳型を分離できる４つの容器を再度作製し、重層化したコラーゲンビトリゲル膜の細胞培養液を除去後、各容器に1枚挿入した。
　そして、各容器に2.0mlの0.25%コラーゲンゾルを注入して、ゲル化、コラーゲンゲル内の自由水の流出、10.0℃　40％湿度の条件下での自由水の完全に除去、20mlのPBSによる再水和の一連の操作を行い、その後、数回PBSでリンスすることで、PBSで平衡化した。
　これによって、2枚のコラーゲンビトリゲル膜の間にFITC標識ヤギ抗マウスIgG抗体を含有したコラーゲンビトリゲル膜が挟持された状態で３層に重層化された積層体を作製することができた。この積層体は、コラーゲンを15.0mg含有しており、壁面鋳型の直径34mmの内円の形状を反映していた。
　このように作製したコラーゲンビトリゲル膜の積層体（0.25％コラーゲンゾル2.0ml＋2.0ml＋2.0ml（合計6ml）について、実施例６の方法に従って厚さを計測した。その結果、60±3μm（3回測定平均）であった。
　また、このコラーゲンビトリゲル膜の積層体を、底面にパラフィルムを敷いた100mm×100mmの疎水性ポリスチレン製培養シャーレに移し入れ、10.0℃　40％湿度の条件下のクリーンベンチ内で蓋をはずした状態でコラーゲンゲル内に1日程度放置し完全に乾燥させた。その後、シャーレの蓋をしてから室温で無菌的に保管維持してガラス化を進行させることで、2枚のコラーゲンビトリゲル膜乾燥体の間にFITC標識ヤギ抗マウスIgG抗体を含有したコラーゲンビトリゲル乾燥体が挟持された状態で重層化された、コラーゲンビトリゲル膜乾燥体の積層体を作製した。この工程で作製したコラーゲンビトリゲル膜乾燥体の積層体は、単位面積（1.0cm2）当たりコラーゲンを1.65mg含有していた。
　また、このコラーゲンビトリゲル膜乾燥体の積層体をPBSで再水和し、蛍光顕微鏡（Nikon）で観察した。その結果、FITC特有の蛍光（緑色）を観察することができた（図１１（Ａ））。なお、実施例６の方法で作製した積層体はFITC特有の蛍光を観察できなかった（図１１（Ｂ）倍率10倍）。
　そして、作製したコラーゲンビトリゲル膜の積層体についてFITC標識ヤギ抗マウス抗体がビトリゲル膜中にどのように局在しているか観察した。具体的には、このコラーゲンビトリゲル膜の積層体を、Tissue-Tek O.C.T.コンパウンド中に包埋して凍結した。凍結した試料をクライオスタット内で厚さ 5μmに薄切したところ、3層構造をしたコラーゲンビトリゲル膜の中間層にはFITC特有の蛍光が残存しており、観察することができた(図１２、倍率40倍)。
　さらに、作製したコラーゲンビトリゲル膜乾燥体の積層体からFITC標識ヤギ抗マウス抗体が徐放されるか確認した。具体的にはコラーゲンビトリゲル膜乾燥体の積層体を容器に入れ、5mlのPBSを注入した後、37.0℃の保湿インキュベーターに保持した。3日目にPBSを回収して新たに5mlのPBSを注入した後、同様に保持して、6日目に再度PBSを回収し、各PBSを蛍光プレートリーダー（Molecular Devices）で測定した。その結果、3日目に5.53±0.21%（3回測定平均）、6日目に1.62±0.08%（3回測定平均）のFITC標識ヤギ抗マウス抗体（作製に使用したFITC標識ヤギ抗マウス抗体量を100%とした場合）がPBS中に検出された。なお、コラーゲンビトリゲル膜乾燥体の積層体の作製工程（再水和のPBS中）でも、8.33%のFITC標識ヤギ抗マウス抗体が検出された。以上のことから、作製したコラーゲンビトリゲル膜乾燥体の積層体における中間層に残存しているFITC標識ヤギ抗マウス抗体は、積層体の外層を介してPBS中に徐放されることが明らかになった。
　＜実施例９＞アガロースビトリゲル膜を中間層に有するコラーゲンビトリゲル膜の乾燥体の作製
　基板としては、100mm×100mmの疎水性ポリスチレン製培養シャーレの底面、壁面鋳型としては、外円の直径が38mmで内円の直径が34mmで高さが30mmのアクリルを４つ用いた。１つの基板上に４つの壁面鋳型を設置することで、基板と壁面鋳型を分離できる４つの容器を作製した。各容器に１枚の環状ナイロン膜支持体を挿入し、2.0mlの0.25%コラーゲンゾルを注入して基板にシャーレの蓋をした後、5.0％　CO2/95%空気存在下の37.0℃の保湿インキュベーター内でゲル化することで、1つの基板上に4つのコラーゲンゲルを作製した。
　37.0℃の保湿インキュベーター内に移しいれてから2時間目には、壁面鋳型を上下に僅かに動かすことでコラーゲンゲルと壁面鋳型間の接着を解除した。その後、4-6時間目までに1/3程度の自由水が壁面鋳型の外側に流出したので、壁面鋳型を基板から除去した。流出した自由水を除去した後、10.0℃　40％湿度の条件下のクリーンベンチ内に移し入れ、その後はシャーレの蓋をはずした状態でコラーゲンゲル内に残留する自由水を2日間の自然乾燥により完全に除去し、コラーゲンゲル乾燥体を得た。
　このガラス化したコラーゲンゲル乾燥体を基板のシャーレ内に10mlの細胞培養液（実施例1と同様の組成）を加えて再水和して基板より剥離することで環状ナイロン膜支持体付きコラーゲンビトリゲル膜を4つ作製した。
　さらに、基板上（直径60mm疎水性ポリスチレンシャーレ）に1つの壁面鋳型を設置して、基板と壁面鋳型を分離できる１つの容器を作製し、この容器に、環状ナイロン膜支持体付きコラーゲンビトリゲル膜を1枚挿入した。
　そして、この容器に2.0mlの1%のFITC標識したヤギ抗マウスIgG抗体を含有した2%アガロースを注入した。1%のFITC標識したヤギ抗マウスIgG抗体を含有した2%アガロースは、9.9 mlのPBSに0.2 gのアガロース（ニッポンジーン）を添加し、加熱により溶解して調製した2%アガロースを37℃程度まで冷却し、0.1 mlのFITC標識したヤギ抗マウスIgG抗体溶液をさらに添加してよく混和することで調製した。
室温でゲル化後、10.0℃　40％湿度の条件下での自由水の完全に除去、10mlの細胞培養液による再水和の一連の操作を行い、コラーゲンビトリゲル膜とFITC標識ヤギ抗マウスIgG抗体を含有したアガロースゲル膜が重層化された積層体（環状ナイロン膜支持体付きコラーゲン－アガロースビトリゲル膜）を作製した。
　さらに、細胞培養液を除去後、１つの基板上に１つの壁面鋳型を設置することで、基板と壁面鋳型を分離できる容器を再度、作製し、この容器に、この積層体（環状ナイロン膜支持体付きコラーゲン－アガロースビトリゲル膜）を1枚挿入した。
　これまでと同様に各容器に2.0mlの0.25%コラーゲンゾルを注入して、ゲル化、コラーゲンゲル内の自由水の流出、10.0℃　40％湿度の条件下での自由水の完全に除去、20mlのPBSによる再水和の一連の操作を行い、2枚のコラーゲンビトリゲル膜の間にFITC標識ヤギ抗マウスIgG抗体を含有したアガロースビトリゲル膜が挟持されて３層に重層化したビトリゲル膜の積層体（環状ナイロン膜支持体付きコラーゲン－アガロースビトリゲル膜）を作製した。そして、この積層体を数回PBSでリンスすることで、PBSで平衡化したビトリゲル膜の積層体を１つ作製した。このビトリゲル膜の積層体は、コラーゲンを10.0mgとアガロース40.0mgを含有しており、壁面鋳型の直径34mmの内円の形状を反映していた。
　また、このように作製したビトリゲル膜の積層体（0.25％コラーゲンゾル2.0ml＋2％アガロースゾル2.0ml＋0.25％コラーゲンゾル2.0ml（合計6ml）について、実施例６の方法に従って厚さを計測した結果、556±13μm（3回測定平均）であった。
　さらに、この積層体を、底面にパラフィルムを敷いた100mm×100mmの疎水性ポリスチレン製培養シャーレに移し入れ、10.0℃　40％湿度の条件下のクリーンベンチ内で蓋をはずした状態でコラーゲンゲル内に1日程度放置し完全に乾燥させた。その後、シャーレの蓋をしてから室温で無菌的に保管維持してガラス化を進行させることで、2枚のコラーゲンビトリゲル膜乾燥体の間にFITC標識ヤギ抗マウスIgG抗体を含有したアガロースビトリゲル膜乾燥体が挟持されて３層に重層化した積層体（環状ナイロン膜支持体付きコラーゲン－アガロースビトリゲル膜乾燥体）を作製した。
　この工程で作製したビトリゲル膜乾燥体の積層体は、単位面積（1.0cm2）当たりコラーゲンを1.1mg、アガロースを4.4mg含有していた。
　さらに、作製したビトリゲル膜乾燥体の積層体をPBSで再水和し、蛍光顕微鏡（Nikon）で観察した。その結果、FITC特有の蛍光（緑色）を観察することができた（図１３、倍率10倍）。
　＜実施例１０＞厚いビトリゲル膜の透明性の改善に関する検討
　実施例４において、従来よりも厚さの厚いビトリゲル膜を作製することができたことから、より実用性を高めるため、ビトリゲル膜の特性の一つである透明性を改善することを検討した。
　実施例１の方法に従って作製したガラス化期間の長い（3ヶ月間以上）ビトリゲル膜乾燥体（0.25％コラーゲンゾル2ｍl由来）を10枚用意し、それぞれ3mlのPBSで再水和した。再水和後、空気が入らないように１枚ずつ上へ重ねた。
　重層していく過程においてビトリゲル膜の透明度は、分光光度計（日本分光）を用いて吸光度（測定波長400ｎｍ）の測定を行った。その結果、各々の吸光度は、１枚の時0.148、２枚の時0.208、５枚の時0.415、10枚の時、0.803だった（図１４）。
　また、この時、実施例４の方法に従って作製したガラス化期間が長く（3ヶ月間以上）厚さの厚いビトリゲル膜乾燥体（0.25％コラーゲンゾル20ml由来）をPBSで再水和後、同様に吸光度の測定を行った。その結果、吸光度は1.67であった。
　ビトリゲル膜を重ねる枚数が増えるほど、吸光度は増加し、透明性は低下するものの、10枚重ねした時の吸光度は、１枚の厚いビトリゲル膜乾燥体（0.25％コラーゲンゾル20ml由来）の吸光度の1/2であり、より透明であった。ガラス化が進んだ一体化されていないビトリゲル膜を重ねることによって、再水和時の透明性を改善することができた（図１５）。したがって、ビトリゲル膜を複数枚重ねて、所望の厚さにすることで、透明性に優れた角膜の主に実質を構成しているコラーゲンの模倣物として利用することができる。
　＜実施例１１＞透明性に優れた厚いビトリゲル膜の作製
  基板として、100mm×100mmの疎水性ポリスチレン製培養シャーレの底面、壁面鋳型としては、外円の直径が38mmで内円の直径が34mmで高さが18mmのアクリル容器を用いた。容器に、1.0mlの0.25％コラーゲンゾルを注入した後、実施例1に従い作製したガラス化期間の長い（3ヶ月間以上）ビトリゲル膜乾燥体（0.25 ％コラーゲンゾル2ml由来)9枚を挿入した。挿入後、1.0mlの0.25%コラーゲンゾルを注入し、基板にシャーレの蓋をした後、5.0％・CO2/95％空気存在下の37℃の保温インキュベーター内で2時間ゲル化した。
　ゲル化2時間後、壁面鋳型を上下に僅かに動かすことで、コラーゲンゾルと壁面鋳型間の接着を解除した。2時間目までに、1/2程度の自由水が壁面鋳型の外側に流出したので、壁面鋳型を基板から除去した。流出した自由水を除去後、10℃・40％湿度の条件下のクリーンベンチ内に移し入れ、シャーレの蓋を外した状態でコラーゲンゾル内に残留する自由水を2日間で完全に除去した。自由水の除去後、PBSをシャーレに10ml入れ、数回リンスした。リンス後、再び、10℃・40％湿度の条件下のクリーンベンチ内に移し入れ、シャーレの蓋を外した状態でコラーゲンゾル内に残留する自由水を除去することで、重層化により一体化したコラーゲンビトリゲル膜乾燥体の積層体を得た。
　このビトリゲル膜乾燥体の積層体（9枚挿入：0.25 ％コラーゲンゾル1.0ml+0.25 ％コラーゲンゾル2.0ml×9層+0.25 ％コラーゲンゾル1.0ml由来）を再水和したビトリゲル膜の透明度を、分光光度計（日本分光）を用いて吸光度（測定波長400ｎｍ）の測定を行った。その結果、吸光度は、1.06(3回の平均値）であった。
　また、この時、実施例4に従い作製した厚さの厚いビトリゲル膜乾燥体（0.25％コラーゲンゾル20ml由来）をPBSで再水和後、同様に吸光度の測定を行った。その結果、吸光度は2.12(3回の平均値）であった。
　このことより、厚さの厚いビトリゲル膜の透明性は、単回作製法に比較して重層一体化による作製法の方が改善されることがわかった（図１６）。したがって、ビトリゲル膜を複数枚重ね一体化して、所望の厚さにすることで、透明性に優れた角膜の主に実質を構成しているコラーゲンの模倣物として利用することができる。

Claims (33)

  1. 　不定形外周縁部をもたないことを特徴とするビトリゲル膜乾燥体。
  2. 　基板に付着していることを特徴とする請求項１のビトリゲル膜乾燥体。
  3. 　ビトリゲル膜乾燥体が、剥離可能なフィルムと重層化されていることを特徴とする請求項１のビトリゲル膜乾燥体。
  4. 　フィルムがパラフィルムであることを特徴とする請求項３のビトリゲル膜乾燥体。
  5. 　不定形外周縁部をもたないことを特徴とするハイドロゲル乾燥体。
  6. 　基板に付着していることを特徴とする請求項５のハイドロゲル乾燥体。
  7. 　ハイドロゲル乾燥体が、剥離可能なフィルムと重層化されていることを特徴とする請求項５のハイドロゲル乾燥体。
  8. 　フィルムがパラフィルムであることを特徴とする請求項７のハイドロゲル乾燥体。
  9. 　所望形状のビトリゲル膜乾燥体の製造方法であって、以下の工程：
    （１）基板上に配置された、前記所望形状と同形状の壁面鋳型内部にハイドロゲルを保持して、ハイドロゲル内の自由水の一部を基板と壁面鋳型の間隙から流出させる工程；
    （２）壁面鋳型を基板上から除去する工程；
    （３）ハイドロゲルを乾燥させて残留する自由水を除去し、ガラス化したハイドロゲル乾燥体を作製する工程；
    （４）ハイドロゲル乾燥体を再水和してビトリゲル膜を作製する工程；および
    （５）ビトリゲル膜を再乾燥させて自由水を除去し、ガラス化したビトリゲル膜乾燥体を作製する工程
    を含むことを特徴とするビトリゲル膜乾燥体の製造方法。
  10. 　前記工程（１）において、壁面鋳型内部のハイドロゲルに、支持体を導入することを特徴とする請求項９のビトリゲル膜乾燥体の製造方法。
  11. 　前記工程（１）において、ハイドロゲル内の自由水を１／４～３／４程度に減じることを特徴とする請求項９のビトリゲル膜乾燥体の製造方法。
  12. 　前記工程（５）において、ビトリゲル膜を、ビトリゲル膜乾燥体が剥離可能なフィルム上でガラス化することを特徴とする請求項９のビトリゲル膜乾燥体の製造方法。
  13. 　フィルムがパラフィルムであることを特徴とする請求項１２のビトリゲル膜乾燥体の製造方法。
  14. 　所望形状に成形可能なビトリゲル膜乾燥体の製造方法であって、以下の工程：
    （１）ビトリゲル膜乾燥体が剥離可能なフィルムが敷かれた基板上に配置された、任意形状の壁面鋳型内部にハイドロゲルを保持して、ハイドロゲル内の自由水の一部を基板上のフィルムと壁面鋳型の間隙から流出させる工程；
    （２）壁面鋳型を基板上から除去する工程；
    （３）ハイドロゲルを乾燥させて残留する自由水を除去し、ガラス化したハイドロゲル乾燥体を作製する工程；
    （４）ハイドロゲル乾燥体を再水和してビトリゲル膜を作製する工程；
    （５）ビトリゲル膜を再乾燥させて自由水を除去し、ガラス化したビトリゲル膜乾燥体を作製する工程
    を含むことを特徴とするビトリゲル膜乾燥体の製造方法。
  15. 　前記工程（５）の後、
    （６）フィルムと重層化されているビトリゲル膜乾燥体を所望形状に切断する工程を含むことを特徴とする請求項１４のビトリゲル膜乾燥体の製造方法。
  16. 　前記工程（６）の後、ビトリゲル膜乾燥体をフィルムから剥離させる工程を含むことを特徴とする請求項１５のビトリゲル膜乾燥体の製造方法。
  17. 　フィルムがパラフィルムであることを特徴とする請求項１４のビトリゲル膜乾燥体の製造方法。
  18. 　前記工程（１）において、壁面鋳型内部のハイドロゲルに、支持体を導入することを特徴とする請求項１４のビトリゲル膜乾燥体の製造方法。
  19. 　前記工程（１）において、ハイドロゲル内の自由水を１／４～３／４程度に減じることを特徴とする請求項１４のビトリゲル膜乾燥体の製造方法。
  20. 　所望形状のハイドロゲル乾燥体の製造方法であって、以下の工程：
    （１）基板上に配置された、前記所望形状と同形状の壁面鋳型内部にハイドロゲルを保持して、ハイドロゲル内の自由水の一部を基板と壁面鋳型の間隙から流出させる工程；
    （２）壁面鋳型を基板上から除去する工程；
    （３）ハイドロゲルを乾燥させて残留する自由水を除去し、ガラス化したハイドロゲル乾燥体を作製する工程；
    を含むことを特徴とするハイドロゲル乾燥体の製造方法。
  21. 　前記工程（１）において、壁面鋳型内部のハイドロゲルに、支持体を導入することを特徴とする請求項２０のハイドロゲル乾燥体の製造方法。
  22. 　前記工程（１）において、ハイドロゲル内の自由水を１／４～３／４程度に減じることを特徴とする請求項２０のハイドロゲル乾燥体の製造方法。
  23. 　前記工程（３）において、ハイドロゲル乾燥体が剥離可能なフィルム上でガラス化することを特徴とする請求項２０のハイドロゲル乾燥体の製造方法。
  24. 　フィルムがパラフィルムであることを特徴とする請求項２３のハイドロゲル乾燥体の製造方法。
  25. 　所望形状に成形可能なハイドロゲル乾燥体の製造方法であって、以下の工程：
    （１）ハイドロゲル乾燥体が剥離可能なフィルムが敷かれた基板上に配置された、任意形状の壁面鋳型内部にハイドロゲルを保持して、ハイドロゲル内の自由水の一部を基板上のフィルムと壁面鋳型の間隙から流出させる工程；
    （２）壁面鋳型を基板上から除去する工程；
    （３）ハイドロゲルを乾燥させて残留する自由水を除去し、ガラス化したハイドロゲル乾燥体を作製する工程
    　を含むことを特徴とするハイドロゲル乾燥体の製造方法。
  26. 　前記工程（３）の後、
    （４）フィルムと重層化されているハイドロゲル乾燥体を所望形状に切断する工程、を含むことを特徴とする請求項２５のハイドロゲル乾燥体の製造方法。
  27. 　前記工程（４）の後、ハイドロゲル乾燥体をフィルムから剥離させる工程を含むことを特徴とする請求項２６のハイドロゲル乾燥体の製造方法。
  28. 　前記工程（１）において、壁面鋳型内部のハイドロゲルに、支持体を導入することを特徴とする請求項２５のハイドロゲル乾燥体の製造方法。
  29. 　前記工程（１）において、ハイドロゲル内の自由水を１／４～３／４程度に減じることを特徴とする請求項２５のハイドロゲル乾燥体の製造方法。
  30. 　フィルムがパラフィルムであることを特徴とする請求項２５のハイドロゲル乾燥体の製造方法。
  31. 　請求項１のビトリゲル膜乾燥体が重層化し、一体化していることを特徴とする積層体。
  32. 　請求項１のビトリゲル膜乾燥体はコラーゲンを原料としており、このビトリゲル膜乾燥体を再水和したビトリゲル膜を複数枚重ねて得られる積層体を用いた角膜の主に実質を構成しているコラーゲンの模倣物。
  33. 　請求項１のビトリゲル膜乾燥体はコラーゲンを原料としており、このビトリゲル膜乾燥体が重層化し、一体化している積層体を再水和して得られたビトリゲル膜を用いた角膜の主に実質を構成しているコラーゲンの模倣物。
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