KR20200079540A - 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스 및 그 사용 - Google Patents

흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스 및 그 사용 Download PDF

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Abstract

흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스는, 상면 및 바닥면 중 적어도 어느 하나에 다공질막을 구비하고, 측면에 프레임 부재를 구비하고, 세포를 배양하여 이루어지는 다세포 구조체를 구축하기 위한 세포 봉입용 디바이스; 및 제1 관상 부재 및 제2 관상 부재를 가지는 흡인관;을 구비하고, 상기 프레임 부재의 외주면에, 상기 제1 관상 부재의 일방의 단부 및 상기 제2 관상 부재의 일방의 단부와 각각 연통된 제1 관통공 및 제2 관통공이 형성되어 있고, 상기 제1 관상 부재는 그 타방의 단부에 흡인 수단과의 연결 기구를 가지며, 상기 제2 관상 부재는 그 타방의 단부가 외부에 개구되어 있다.

Description

흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스 및 그 사용
본 발명은 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스 및 그 사용에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스, 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스 세트 및 세포의 봉입 방법에 관한 것이다.
본원은 2017년 12월 12일에 일본에 출원된 특허출원 제2017-238105호에 기초하여 우선권을 주장하고, 그 내용을 여기에 원용한다.
신약 개발이나 동물 실험 대체법에 관련된 기업에서는, 세포 은행 등으로부터 동결 세포를 구입한 후, 계대 배양하여 증식한 세포를 동결 보존함과 함께, 일부의 세포로 배양 모델을 제작하여 개발에 필요한 시험을 실시하고 있다. 즉, 개발에 필요한 시험을 실시하기까지 막대한 비용과 시간을 소비하고 있다. 또한, 단층 배양 세포가 아니라, 생체에 보다 가까운 「조직형 배양 모델」이 요구되고 있다.
「조직형 배양 모델」에 관련된 기술로서는, 예를 들면, 각종 겔 포매 배양 기술, 스페로이드 배양 기술(예를 들면, 특허문헌 1 참조) 및 각종 챔버 배양 기술(예를 들면, 특허문헌 2 참조) 등을 들 수 있다.
일본 특허 공개 제2012-65555호 공보 국제 공개 제2008/130025호 일본 특허 공개 제2001-149763호 공보 국제 공개 제2012/026531호 일본 특허 공개 제2012-115262호 공보 일본 특허 공개 제2015-035978호 공보
특허문헌 1 및 2에 기재된 「조직형 배양 모델」에 관련된 종래 기술은 모두 배양 조작이 번잡하고, 조직형 배양 모델의 구축에 비용과 시간을 요한다. 그 뿐만 아니라, 생산 재현성이 좋지 않기 때문에 로트 간의 차이도 있었다. 또한, 스페로이드 배양 기술 등, 세포가 노출된 상태에 있는 배양 기술은 3차원 조직을 구성하고 있는 개개의 세포의 보호 성능이 좋지 않았다.
또한, 본 발명자는 지금까지, 조직형 배양 모델을 구축하기 위한 세포 봉입용 디바이스를 개발해왔다. 유치 바늘을 구비한 카테터 등을 이용하여 이와 같은 디바이스 내에 세포를 봉입하였지만, 이 조작은 번잡하여 숙련을 요하기 때문에 새로운 개량이 요구되고 있었다.
본 발명은, 상기 사정을 감안한 것으로, 세포의 현탁액을 흡인함으로써 간편하게 세포를 봉입할 수 있으며, 세포 보호 성능이 뛰어나고 취급도 용이하며, 세포를 장기간에 걸쳐 배양이 가능한 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스를 제공한다.
즉, 본 발명은 이하의 형태를 포함한다.
본 발명의 제1 형태에 따른 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스는, 상면 및 바닥면 중 적어도 어느 하나에 다공질막을 구비하고, 측면에 프레임 부재를 구비하고, 세포를 배양하여 이루어지는 다세포 구조체를 구축하기 위한 세포 봉입용 디바이스; 및 제1 관상 부재 및 제2 관상 부재를 가지는 흡인관;를 구비하고, 상기 프레임 부재의 외주면에, 상기 제1 관상 부재의 일방의 단부 및 상기 제2 관상 부재의 일방의 단부와 각각 연통된 제1 관통공 및 제2 관통공이 형성되어 있고, 상기 제1 관상 부재는 그 타방의 단부에 흡인 수단과의 연결 기구를 가지며, 상기 제2 관상 부재는 그 타방의 단부가 외부에 개구되어 있다.
상기 제1 형태에 따른 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스에 있어서, 상기 제1 관상 부재와 상기 제2 관상 부재가 상기 세포 봉입용 디바이스를 개재하여 서로 대향하도록 배치되어 있을 수 있다.
상기 제1 형태에 따른 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스는, 배양액에 현탁시킨 다세포를 주입할 수 있으며, 내부 용적이 10mL 이하일 수 있다.
상기 제1 형태에 따른 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스에 있어서, 상기 다공질막이 기상중에서 액밀성을 가지고, 액상중에서 반투성을 가지는 반투막일 수 있다.
상기 제1 형태에 따른 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스에 있어서, 상기 반투막이 생체 적합성을 가지는 재료를 포함할 수 있다.
상기 제1 형태에 따른 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스에 있어서, 상기 생체 적합성을 가지는 재료가 겔화되는 세포외 매트릭스 유래 성분일 수 있다.
상기 제1 형태에 따른 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스에 있어서, 상기 겔화되는 세포외 매트릭스 유래 성분이 네이티브 콜라겐 또는 아테로 콜라겐일 수 있다.
상기 제1 형태에 따른 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스에 있어서, 기밀성을 가지는 필름이 상기 다공질막의 외면에 대하여 착탈 가능하게 이루어져 있을 수 있다.
상기 제1 형태에 따른 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스에 있어서, 상기 연결 기구가 필터를 가지고 있을 수 있다.
본 발명의 제2 형태에 따른 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스 세트는, 상기 제1 형태에 따른 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스 및 상기 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스를 수납하는 랙을 구비한다.
상기 제2 형태에 따른 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스 세트에 있어서, 상기 랙이 U자형 걸림부를 가지고 있을 수 있다.
본 발명의 제3 형태에 따른 세포의 봉입 방법은, 상기 제1 형태에 따른 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스를 이용하는 방법이다.
상기 형태의 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스에 의하면, 세포의 현탁액을 흡인함으로써 간편하게 세포를 봉입할 수 있으며, 세포 보호 성능이 뛰어나고 취급도 용이하며, 세포를 장기간에 걸쳐 배양할 수 있다. 상기 형태의 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스 세트에 의하면, 연속적인 세포 봉입용 디바이스의 제작을 효율적으로 행할 수 있다. 상기 형태의 세포의 봉입 방법에 의하면, 간편하게 세포를 디바이스 내에 봉입할 수 있다.
도 1은 본 실시 형태의 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스의 일례를 나타내는 정면도이다.
도 2a는 본 발명의 제1 실시 형태에 따른 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스를 나타내는 단면도이다.
도 2b는 본 발명의 제2 실시 형태에 따른 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스를 나타내는 단면도이다.
도 2c는 본 발명의 제3 실시 형태에 따른 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스를 나타내는 단면도이다.
도 3은 본 실시 형태의 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스 세트의 일례를 나타내는 사시도 및 측면도이다.
도 4a는 제조예 1에서의 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스(비트리겔(등록상표)-실리콘 링-비트리겔(등록상표))에서의 배양액을 흡인하는 모습을 나타내는 사진이다.
도 4b는 제조예 1에서의 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스(비트리겔(등록상표)-실리콘 링-비트리겔(등록상표))에서의 겔 로딩 팁을 떼어내는 모습을 나타내는 사진이다.
도 4c는 제조예 1에서의 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스(비트리겔(등록상표)-실리콘 링-비트리겔(등록상표))를 24-웰 플레이트에 침지하는 모습을 나타내는 사진이다.
도 5a는 제조예 2에서의 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스(비트리겔(등록상표)-실리콘 링-필터)에서의 배양액을 흡인하는 모습을 나타내는 사진이다.
도 5b는 제조예 2에서의 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스(비트리겔(등록상표)-실리콘 링-필터)에서의 PET 필름 및 겔 로딩 팁을 떼어내는 모습을 나타내는 사진이다.
도 5c는 제조예 2에서의 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스(비트리겔(등록상표)-실리콘 링-필터)를 24-웰 플레이트에 침지하는 모습을 나타내는 사진이다.
도 6a는 제조예 3에서의 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스(필터-실리콘 링-필터)에서의 배양액을 흡인하는 모습을 나타내는 사진이다.
도 6b는 제조예 3에서의 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스(필터-실리콘 링-필터)에서의 PET 필름 및 겔 로딩 팁을 떼어내는 모습을 나타내는 사진이다.
도 6c는 제조예 3에서의 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스(필터-실리콘 링-필터)를 24-웰 플레이트에 침지하는 모습을 나타내는 사진이다.
도 7은 실시예 1에서의 제조예 4에서 얻어진 세포 봉입용 디바이스(플라스틱제 링-필터)를 이용하여 제작된 스페로이드를 나타내는 사진이다. 스케일 바는 100μm를 나타낸다.
≪흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스≫
이하, 본 실시 형태의 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스에 대하여 도면을 참조하면서 상세히 설명한다.
도 1은 본 실시 형태의 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스의 일례를 나타내는 정면도이다.
도 1에 나타내는 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스(100)는 세포 봉입용 디바이스(10) 및 흡인관(20)을 구비한다.
세포 봉입용 디바이스(10)는 상면 및 바닥면 중 적어도 어느 하나에 다공질막(10a)을 구비하며, 측면에 프레임 부재(10b)를 구비한다. 또한, 세포 봉입용 디바이스(10)는 세포를 배양하여 이루어지는 다세포 구조체를 구축하기 위한 것이다.
흡인관(20)은 제1 관상 부재(20a) 및 제2 관상 부재(20b)를 갖는다.
세포 봉입용 디바이스(10)의 프레임 부재(10b)의 외주면에는 제1 관상 부재(20a)의 일방의 단부(1a) 및 상기 제2 관상 부재(20b)의 일방의 단부(2a)와 각각 연통된 제1 관통공 및 제2 관통공이 형성되어 있다.
제1 관상 부재(20a)는 그 타방의 단부(1b)에 흡인 수단과의 연결 기구(3)를 갖는다.
제2 관상 부재(20b)는 그 타방의 단부(2b)가 외부에 개구되어 있다.
프레임 부재(10b)에서의 제1 관상 부재(20a) 및 제2 관상 부재(20b)의 위치는 특별히 한정되지 않지만, 도 1에 나타낸 바와 같이 제1 관상 부재(20a) 및 제2 관상 부재(20b)는 세포 봉입용 디바이스(10)를 개재하여 서로 대향하도록 배치되어 있는 것이 바람직하다. 이에 따라, 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스와 흡인 기구를 연결했을 때, 흡인 기구의 흡인력에 의해 간편하게 세포 현탁액을 흡인하고, 세포 봉입용 디바이스 내에 봉입할 수 있다.
또한, 제1 관상 부재(20a) 및 제2 관상 부재(20b)는 세포 봉입용 디바이스(10) 내에 세포를 봉입한 후, 프레임 부재(10b)의 외주면의 제1 관통공 및 제2 관통공으로부터 용이하게 뽑아내어 관통공을 폐색하도록 프레임 부재(10b)에 삽입되어 있다.
본 실시 형태의 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스는, 상기 구성을 구비함으로써 간편하게 세포를 봉입할 수 있다. 또한, 본 실시 형태의 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스는, 세포 보호 성능이 뛰어나고 취급도 용이하여, 세포를 장기간에 걸쳐 배양할 수 있다.
＜제1 실시 형태＞
도 2a는 본 발명의 제1 실시 형태에 따른 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스를 나타내는 단면도이다. 이하, 도 2a를 참조하면서, 주로 세포 봉입용 디바이스(10)의 구조에 대하여 상세히 설명한다. 한편, 도 2a 이후의 도면에서, 이미 설명한 도면에 나타내는 것과 동일한 구성 요소에는 그 설명한 도면의 경우와 동일한 부호를 붙이고, 그 상세한 설명은 생략한다. 또한, 도 2a에서 세포 봉입용 디바이스(10)의 구조를 상세히 설명하기 위해 제1 관상 부재(20a)의 타방 단부(1b)의 구조를 생략하였다.
도 2a에 나타내는 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스(200)에 포함되는 세포 봉입용 디바이스(10)는, 프레임 부재(10b)의 상면 상에 제1 접착제층(11a)이 적층되고, 제1 접착제층(11a) 위에 상면측의 다공질막(10a-1)이 적층되어 있다. 프레임 부재(10b)의 바닥면에 대해서도 마찬가지로 프레임 부재(10b)의 바닥면 아래에 제2 접착제층(11b)이 적층되고, 제2 접착제층(11b) 아래에 바닥면측의 다공질막(10a-2)이 적층되어 있다. 즉, 도 2a에 나타내는 세포 봉입용 디바이스(10)에서는 바닥면측의 다공질막(10a-2), 제2 접착제층(11b), 프레임 부재(10b), 제1 접착제층(11a) 및 상면측의 다공질막(10a-1)이 이 순서대로 적층되어 있다.
흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스(200)에서, 상면측의 다공질막(10a-1) 및 바닥면측의 다공질막(10a-2)은 서로 동일한 재료로 이루어질 수 있으며, 다른 재료로 이루어질 수도 있다. 다공질막의 재료에 대해서는, 후술하는 「다공질막」에 기재된 바와 같다.
제1 접착제층(11a) 및 제2 접착제층(11b)의 재료는 접착 대상인 상면측의 다공질막(10a-1), 바닥면측의 다공질막(10a-2) 및 프레임 부재(10b)의 각 재료에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 또한, 제1 접착제층(11a) 및 제2 접착제층(11b)의 재료는 서로 동일한 재료로 이루어질 수 있으며, 다른 재료로 이루어질 수도 있다. 제1 접착제층(11a) 및 제2 접착제층(11b)의 재료에 대해서는, 후술하는 「접착제층」에 기재된 바와 같다.
제1 접착제층(11a) 및 제2 접착제층(11b)은 프레임 부재(10b)의 형상에 맞추어 형성할 수 있다. 예를 들면, 프레임 부재(10b)가 링 형상인 경우, 제1 접착제층(11a) 및 제2 접착제층(11b)은 프레임 부재(10b) 상에서 동심원상이며 링 형상으로, 상면측의 다공질막(10a-1) 또는 바닥면측의 다공질막(10a-2)과 프레임 부재(10b)에 접촉하는 크기로 형성된다.
＜제2 실시 형태＞
도 2b는 본 발명의 제2 실시 형태에 따른 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스를 나타내는 단면도이다.
도 2b에 나타내는 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스(300)에 포함되는 세포 봉입용 디바이스(10)는, 상술한 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스(200)에 더하여, 제3 접착제층(11c) 및 기밀성을 가지는 필름(12a)을 구비하는 점 이외에는, 도 2a에 나타내는 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스(200)와 동일한 구성이다. 즉, 도 2b에 나타내는 세포 봉입용 디바이스(10)에서는, 바닥면측의 다공질막(10a-2), 제2 접착제층(11b), 프레임 부재(10b), 제1 접착제층(11a), 상면측의 다공질막(10a-1), 제3 접착제층(11c) 및 기밀성을 가지는 필름(12a)이 이 순서대로 적층되어 있다. 또한, 기밀성을 가지는 필름(12a)은 제3 접착제층(11c)을 개재하여, 상면측의 다공질막(10a-1)의 외면에 대하여 착탈 가능하게 되어 있다.
흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스(300)에서, 상면측의 다공질막(10a-1) 및 바닥면측의 다공질막(10a-2)의 재료는, 도 2a에 나타내는 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스(200)와 동일하다.
제1 접착제층(11a), 제2 접착제층(11b) 및 제3 접착제층(11c)의 재료는, 접착 대상인 상면측의 다공질막(10a-1), 바닥면측의 다공질막(10a-2), 프레임 부재(10b) 및 기밀성을 가지는 필름(12a)의 각 재료에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 또한, 제1 접착제층(11a), 제2 접착제층(11b) 및 제3 접착제층(11c)의 재료는, 서로 동일한 재료로 이루어질 수 있으며, 다른 재료로 이루어질 수도 있다. 제1 접착제층(11a), 제2 접착제층(11b) 및 제3 접착제층(11c)의 재료에 대해서는, 후술하는 「접착제층」에 기재된 바와 같다.
제1 접착제층(11a) 및 제2 접착제층(11b)의 형상은, 도 2a에 나타내는 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스(200)와 동일하다.
제3 접착제층(11c)은 기밀성을 가지는 필름(12a)의 형상에 맞추어 형성할 수 있다. 예를 들면, 기밀성을 가지는 필름(12a)이 원 형상인 경우, 제3 접착제층(11c)은 기밀성을 가지는 필름(12a) 상에서 동심원상이며 원 형상 또는 링 형상으로, 상면측의 다공질막(10a-1)과 기밀성을 가지는 필름(12a)에 접촉하는 크기로 형성된다.
＜제3 실시 형태＞
도 2c는 본 발명의 제3 실시 형태에 따른 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스를 나타내는 단면도이다.
도 2c에 나타내는 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스(400)에 포함되는 세포 봉입용 디바이스(10은)는, 상술한 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스(300)에 더하여, 제4 접착제층(11d) 및 기밀성을 가지는 필름(12b)을 구비하는 점 이외에는, 도 2b에 나타내는 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스(300)와 동일한 구성이다. 즉, 도 2c에 나타내는 세포 봉입용 디바이스(10)에서는, 기밀성을 가지는 필름(12b), 제4 접착제층(11d), 바닥면측의 다공질막(10a-2), 제2 접착제층(11b), 프레임 부재(10b), 제1 접착제층(11a), 상면측의 다공질막(10a-1), 제3 접착제층(11c) 및 기밀성을 가지는 필름(12a)이 이 순서대로 적층되어 있다. 또한, 기밀성을 가지는 필름(12a) 및 기밀성을 가지는 필름(12b)은 각각 제3 접착제층(11c) 및 제4 접착제층(11d)을 개재하여, 상면측의 다공질막(10a-1)의 외면 및 바닥면측의 다공질막(10a-2)의 외면에 대하여 착탈 가능하게 되어 있다.
흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스(400)에서, 상면측의 다공질막(10a-1) 및 바닥면측의 다공질막(10a-2)은, 도 2a에 나타내는 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스(200)와 동일하다.
제1 접착제층(11a), 제2 접착제층(11b), 제3 접착제층(11c) 및 제4 접착제층(11d)의 재료는, 접착 대상인 상면측의 다공질막(10a-1), 바닥면측의 다공질막(10a-2), 프레임 부재(10b), 기밀성을 가지는 필름(12a) 및 기밀성을 가지는 필름(12b)의 각 재료에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 또한, 제1 접착제층(11a), 제2 접착제층(11b), 제3 접착제층(11c) 및 제4 접착제층(11d)의 재료는, 서로 동일한 재료로 이루어질 수 있으며, 다른 재료로 이루어질 수도 있다. 제1 접착제층(11a), 제2 접착제층(11b), 제3 접착제층(11c) 및 제4 접착제층(11d)의 재료에 대해서는, 후술하는 「접착제층」에 기재된 바와 같다.
제1 접착제층(11a) 및 제2 접착제층(11b)의 형상은, 도 2a에 나타내는 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스(200)과 동일하다.
제3 접착제층(11c)의 형상은, 도 2b에 나타내는 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스(300)와 동일하다.
제4 접착제층(11d)은 기밀성을 가지는 필름(12b)의 형상에 맞추어 형성할 수 있다. 예를 들면, 기밀성을 가지는 필름(12b)이 원 형상인 경우, 제4 접착제층(11d)은 기밀성을 가지는 필름(12b) 상에서 동심원상이며 원 형상 또는 링 형상으로, 바닥면측의 다공질막(10a-2)과 기밀성을 가지는 필름(12b)에 접촉하는 크기로 형성된다.
본 실시 형태의 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스는, 도 1 및 도 2a 내지 2c에 나타내는 것에 한정되지 않으며, 본 실시 형태의 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스의 효과를 해치지 않는 범위 내에서, 도 1 및 도 2a 내지 2c에 나타낸 것의 일부 구성이 변경 또는 삭제된 것이거나, 지금까지 설명한 것에 다른 구성이 추가된 것이어도 무방하다.
예를 들면, 도 1 및 도 2a 내지 2c에 나타내는 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스에서, 다공질막을 상면 및 바닥면에 구비하는 것을 예시했지만, 다공질막을 상면 및 바닥면 중 적어도 어느 하나에 구비하는 것으로 할 수도 있다. 즉, 다공질막을 상면에만 구비하는 것일 수 있으며, 바닥면에만 구비하는 것일 수도 있다. 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스가 다공질막을 상면 또는 바닥면의 어느 하나에만 구비하는 경우, 그 이외의 부분은 프레임 부재와 동일한 재료로 이루어질 수 있으며, 다른 재료로 이루어질 수도 있다.
예를 들면, 도 1 및 도 2a 내지 2c에 나타내는 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스에서, 세포 봉입용 디바이스(10)의 형상이 원기둥인 것을 나타내었지만, 그 외의 형상으로 할 수도 있다. 세포 봉입용 디바이스(10)의 형상은, 세포를 봉입할 수 있고, 세포에 균일하게 산소 및 배양액에 용해되어 있는 영양분이 고루 미치는 형상이면 무방하다. 또한, 세포 봉입용 디바이스(10)는 배양액을 디바이스 내부에 채우고 있을 수 있으며, 배양액을 채우지 않고 기체 부분을 남기고 있을 수도 있다. 링 형상의 원기둥 이외의 세포 봉입용 디바이스(10)의 형상으로서 구체적으로는, 예를 들면, 중공사(中空絲) 형상 등의 원기둥, 원뿔, 원뿔대, 각뿔, 각뿔대, 구, 다면체(예를 들면, 4면체, 5면체, 6면체(입방체 포함), 8면체, 12면체, 20면체, 24면체, 케플러·푸아송 입체 등) 등을 들 수 있으며, 이들에 한정되지 않는다.
도 1 및 도 2a 내지 2c에 나타낸 바와 같이 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스에서의 세포 봉입용 디바이스(10)의 형상이 링 형상의 원기둥인 경우, 세포 봉입용 디바이스의 내경은 1mm 이상 60mm 이하인 것이 바람직하고, 3mm 이상 35mm 이하인 것이 보다 바람직하며, 5mm 이상 26mm 이하인 것이 더욱 바람직하다.
또한, 세포 봉입용 디바이스(10)의 외경은 3mm 이상 68mm 이하인 것이 바람직하고, 5mm 이상 43mm 이하인 것이 보다 바람직하며, 7mm 이상 32mm 이하인 것이 더욱 바람직하다.
또한, 세포 봉입용 디바이스(10)의 두께(원기둥의 높이)는 5μm 이상이며, 50μm 이상 15mm 이하인 것이 바람직하고, 100μm 이상 10mm 이하인 것이 더 바람직하며, 200μm 이상 2.5mm 이하인 것이 더욱 바람직하다.
한편, 본 명세서에서, 「세포 봉입용 디바이스의 두께(원기둥의 높이)」는 세포 봉입용 디바이스의 상면 외측의 가장자리로부터, 바닥면의 외측 가장자리까지의 거리를 의미한다.
예를 들면, 도 1 및 도 2a 내지 2c에 나타내는 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스에서, 세포 봉입용 디바이스의 상면 및 바닥면이 평면인 것을 나타내었지만, 상면 및 바닥면이 오목부 구조 또는 볼록부 구조일 수도 있다. 특히, 상면 및 바닥면이 오목부 구조일 때, 상면 내측의 오목부의 중심부(상면 내측의 가장 오목한 부분)와 바닥면 내측의 오목부의 중심부(바닥면 내측의 가장 오목한 부분)가 접촉하지 않고, 일정한 거리(예를 들면, 5μm 이상)를 유지하고 있는 것이 바람직하다. 이에 따라, 세포 봉입용 디바이스의 두께(원기둥의 높이), 즉 세포 봉입용 디바이스의 상면 외측의 가장자리로부터 바닥면 외측의 가장자리까지의 거리가, 상면 외측의 오목부의 중심부(상면 외측의 가장 오목한 부분)에서 바닥면 외측의 오목부의 중심부(바닥면 외측의 가장 오목한 부분)까지의 거리보다 길어진다. 이에 따라, 예를 들면, 상면으로부터 약제를 첨가한 경우, 첨가한 약제의 방향성을 유지할 수 있다. 또한, 상면 및 바닥면이 오목부 구조이기 때문에, 상면 및 바닥면의 외측에 새로이 세포를 파종하여 배양하는 것이 가능해진다.
예를 들면, 도 1 및 도 2a 내지 2c에 나타내는 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스에서, 프레임 부재의 외주면에 있는 제1 관통공 및 제2 관통공의 형상이 원형인 것을 예시하였지만, 제1 관상 부재 및 제2 관상 부재를 관통공으로부터 용이하게 뽑아 내어 관통공을 폐색하는 형상이면, 원형 이외의 형상이어도 무방하다.
원형 이외의 제1 관통공 및 제2 관통공의 형상으로서는 예를 들면, 다각형(정다각형 등도 포함), 타원형 등을 들 수 있다.
제1 관통공 및 제2 관통공의 직경은 세포 배양용 디바이스의 두께(즉, 프레임 부재의 높이)에 따라 적절히 조정할 수 있으며, 예를 들면 10μm 이상 1000μm 이하로 할 수 있다.
예를 들면, 도 1 및 도 2a 내지 2c에 나타내는 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스에서, 접착제층을 개재하여 다공질막 및 프레임 부재를 접착하는 방법을 예시하였지만, 다공질막 및 프레임 부재는 그 외의 접합 방법에 의해 접합될 수도 있다.
접착제층을 개재한 접착 방법 이외의 다공질막 및 프레임 부재의 접합 방법으로서 구체적으로는, 예를 들면, 히트 실러나 열판, 초음파, 레이저 등을 이용하여 열융착에 의해 접합하는 방법, 구멍을 제작함으로써 접합하는 장부 맞춤에 의한 방법 등을 들 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 장부 맞춤에 의한 방법으로서는, 예를 들면, 반턱 장부 맞춤, 이방 장부 맞춤, 삼방 장부 맞춤, 사방 장부 맞춤, 턱 장부 맞춤, 허리 맞춤, 쌍장부 맞춤, 2단 장부 맞춤 등을 들 수 있다.
또한, 이러한 접합 방법 중 한 종류를 이용해도 되고, 두 종류 이상을 조합하여 이용해도 된다.
예를 들면, 도 1 및 도 2a 내지 2c에 나타내는 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스에서, 프레임 부재(10b)는 지지체를 가질 수 있다. 프레임 부재(10b)는 지지체를 가짐에 따라, 예를 들면, 세포가 봉입된 세포 봉입용 디바이스(10)를 한 단계 더 큰 용기에 고정함으로써, 세포를 기상에서 배양할 수 있다. 또한, 프레임 부재(10b)는 지지체를 가짐으로써, 예를 들면 세포가 봉입된 세포 봉입용 디바이스(10)는 배양액 중에서 부력에 의해 뜰 수 있다. 또한, 도 2a 내지 2c에 나타내는 세포 봉입용 디바이스(10)와 같이 상면측의 다공질막(10a-1) 및 바닥면측의 다공질막(10a-2)를 구비하는 경우, 상면은 공기에 접촉하고 바닥면은 배양액에 접촉하도록 설치할 수도 있기 때문에, 세포를 기상 및 액상에서 배양할 수 있다.
또한, 지지체는 프레임 부재(10b)에 고정되어 있을 수 있으며, 분리 가능할 수도 있다.
또한, 본 실시 형태의 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스에 있어서, 각 구성(다공질막, 프레임 부재, 흡인관 등)의 크기나 형상은 목적에 따라 임의로 조절할 수 있다.
이하, 본 실시 형태의 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스에 포함되는 각 구성에 대해 상세하게 설명한다.
＜세포 봉입용 디바이스＞
세포 봉입용 디바이스는 상면 및 바닥면 중 적어도 어느 하나에 다공질막을 구비하고, 측면에 프레임 부재를 구비한다.
세포 봉입용 디바이스의 내부 용적은, 배양액에 현탁시킨 다세포를 주입할 수 있고, 세포의 활성을 검사(assay)하는 시험 등의 인비트로 시험계에서 사용되는 다세포 구조체를 구축할 수 있을 정도의 작은 스케일이면 된다. 구체적으로는, 예를 들면, 10mL 이하인 것이 바람직하고, 10μL 이상 5mL 이하인 것이 보다 바람직하고, 15μL 이상 2mL 이하인 것이 더 바람직하고, 20μL 이상 1mL 이하인 것이 특히 바람직하다. 내부 용적이 상기 상한값 이하인 것으로 인해, 산소 및 배양액의 영양분이 충분히 공급되어 세포를 효율적으로 장기간에 걸쳐 배양할 수 있다. 또한, 내부 용적이 상기 하한값 이상인 것으로 인해, 인비트로 시험계에서 사용하는데 충분한 세포수 및 세포 밀도의 세포를 얻을 수 있다.
［다공질막］
본 명세서에서, 「다공질막」이란 세공을 다수 가지는 막을 의미하며, 공극을 가지는 막, 세공과 공극을 둘 다 가지는 막도 포함한다.
본 실시 형태의 세포 봉입용 디바이스에 이용되는 다공질막으로서는, 내부에 봉입된 세포가 외부에 투과되지 않을 정도의 구멍을 가지는 막이면 무방하며, 특별히 한정되지 않는다. 다공질막으로서는, 예를 들면, 여과지, 반투막(예를 들면, 한외 여과막 등), 부직포, 거즈형 메쉬, 각종 멤브레인 필터 등을 들 수 있으며, 이들에 한정되지 않는다.
또한, 다공질막의 세공의 크기로서는, 예를 들면 0.01μm 이상 1,500μm 이하로 할 수 있고, 예를 들면 0. 01μm 이상 1.0μm 이하로 할 수 있으며, 예를 들면 0.01μm 이상 0.45μm 이하로 할 수 있다. 상기 구멍의 크기는, 내부에 봉입되는 세포 또는 후술하는 작은 생명 개체의 크기에 따라 적절하게 선택할 수 있다.
다공질막의 두께는 특별히 제한되지 않지만, 1μm 이상 1,000μm 이하인 것이 바람직하고, 1μm 이상 500μm 이하인 것이 보다 바람직하고, 5μm 이상 300μm 이하인 것이 더 바람직하고, 10μm 이상 200μm 이하인 것이 특히 바람직하다. 다공질막의 두께가 상기 범위인 것으로 인해, 세포를 세포 봉입용 디바이스 내에 주입하고 배양할 수 있는 강도로 만들 수 있다. 또한, 다공질막이 반투막인 경우, 그 두께가 상기 범위인 것으로 인해, 본 실시 형태의 세포 봉입용 디바이스를 의료용 세포 이식 디바이스로서 매우 적합하게 이용할 수 있다.
여기서, 「다공질막의 두께」란, 다공질막 전체의 두께를 의미하고, 예를 들면, 복수층으로 이루어지는 다공질막의 두께란, 다공질막을 구성하는 모든 층의 합계의 두께를 의미한다.
그 중에서, 본 실시 형태에서의 다공질막은, 각종 멤브레인 필터인 것이 바람직하다. 멤브레인 필터는 세공의 크기가 비교적 크기 때문에 액밀성은 가지지 않지만, 산소 투과량이 많아 내부에 봉입된 세포를 고효율로 증식시킬 수 있다.
상면 및 바닥면 어느 하나의 다공질막이 멤브레인 필터 등의 0.1μm 정도 이상의 세공인 경우, 도 2b 및 도 2c에 나타내는 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스(300, 400)와 같이, 후술하는 기밀성을 가지는 필름을 가지는 구성인 것이 바람직하다. 이는, 다공질막의 세공이 0.1μm 정도 이상으로 큰 것으로 인해 세포 봉입용 디바이스 내부가 기밀성뿐만 아니라 액밀성도 유지되지 않을 수 있어, 세포 현탁액의 흡인이 어려워지는 것을 방지하기 위함이다. 상면 및 바닥면의 어느 하나의 다공질막이 멤브레인 필터 등의 0.1μm 정도 이상의 세공인 경우, 기밀성을 가지는 필름을 가짐으로써 세포 봉입용 디바이스 내부의 기밀성이 어느 정도 확보되어, 세포 현탁액을 용이하게 흡인할 수 있다.
예를 들면, 다공질막이 멤브레인 필터 등의 0.45μm 정도 이하의 세공이며 세포가 봉입된 본 실시 형태의 세포 봉입용 디바이스를, 배양액을 포함하는 용기 내에 넣은 경우에는, 세포 봉입용 디바이스 내의 세포는 디바이스의 외부에 투과시키지 않는다. 한편, 배양액에 용해되어 있는 영양분을 세포 봉입용 디바이스의 내부에 투과시킴과 함께, 배양액에 용해된 노폐물을 포함하는 세포 생산물을 세포 봉입용 디바이스의 외부에 투과시킬 수 있다. 이 때문에, 본 실시 형태의 세포 봉입용 디바이스는 세포의 장기간 배양에 이용할 수 있다.
또는, 그 중에서, 본 실시 형태에서의 다공질막은, 기상중에서 액밀성을 가지며 액상중에서 반투성을 가지는 반투막인 것이 바람직하다. 반투막은, 기상중에서 액밀성을 가지기 때문에, 예를 들면, 세포 봉입용 디바이스의 내부에 배양액 등의 액체를 포함하고 있는 경우, 기상중에서 액체가 새지 않아 내부에 유지할 수 있다. 이 액밀성은 반투막 상의 표면 장력에 의한 것이다. 한편, 기체가 통과할 수 있기 때문에, 내부에 액체를 포함하는 경우, 내부의 액체는 경시적으로 증발된다.
다공질막이 반투막이며 액밀성을 가지는 경우, 도 2a에 나타내는 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스(200)와 같이, 후술하는 기밀성을 가지는 필름을 가지지 않는 구성이라도, 세포 봉입용 디바이스 내부가 어느 정도의 기밀성을 가지기 때문에, 세포 현탁액을 용이하게 흡인할 수 있다.
또한, 세포 봉입용 디바이스에 이용되는 반투막은, 액상중에서 반투성을 가지기 때문에, 예를 들면, 세포가 봉입된 본 실시 형태의 세포 봉입용 디바이스를, 배양액을 포함하는 용기 내에 넣은 경우, 세포 봉입용 디바이스 내의 세포는 디바이스의 외부에 투과시키지 않는 한편, 배양액에 용해되어 있는 영양분을 세포 봉입용 디바이스의 내부에 투과시킴과 함께, 배양액에 용해된 노폐물을 포함하는 세포 생산물을 세포 봉입용 디바이스의 외부에 투과시킬 수 있다. 이 때문에, 본 실시 형태의 세포 봉입용 디바이스는 세포의 장기간 배양에 이용할 수 있다.
보다 구체적으로는, 본 실시 형태의 세포 봉입용 디바이스에 이용되는 반투막은, 예를 들면, 분자량 약 1,000,000 이하의 고분자 화합물을 투과할 수 있는 것일 수 있으며, 예를 들면, 분자량 약 200,000 이하의 분자 화합물을 투과할 수 있는 것일 수 있다.
본 명세서에서 「액밀성」이란, 액체가 새지 않는 상태를 의미한다.
또한, 본 명세서에서 「반투성」이란, 일정한 분자량 이하의 분자 또는 이온만을 투과 가능한 성질을 의미하며, 「반투막」이란, 그 성질을 가지는 막이다.
상기 다공질막의 재료로서는 세포 독성이 없는 것이면 무방하며, 천연 고분자 화합물이어도 되고, 합성 고분자 화합물이어도 된다. 또한, 상기 다공질막이 반투막인 경우, 그 재료로서는 생체 적합성을 가지는 재료를 포함하는 것이 바람직하고, 생체 흡수성을 가지는 재료를 포함하는 것이 보다 바람직하다. 본 실시 형태의 세포 봉입용 디바이스의 전체가 생체 적합성 또는 생체 흡수성을 가지는 반투막으로 이루어지는 것인 경우, 의료용 세포 이식 디바이스로서 활용할 수 있다.
한편, 본 명세서에서 「생체 적합성」이란, 생체 조직과 재료의 적합성을 나타내는 평가 기준을 의미한다. 또한, 「생체 적합성을 갖는다」는 것은, 재료 그 자체가 독성을 가지지 않고, 내부 독소 등의 미생물 유래의 성분을 가지지 않으며, 생체 조직을 물리적으로 자극하지 않고, 생체 조직을 구성하는 단백질이나 세포 등과 상호 작용해도 거부되지 않는 상태를 의미한다. 또한, 본 명세서에서, 「생체 흡수성」이란, 생체 내에 일정 기간, 재료가 그 형상 또는 물성을 유지하고, 그 후 분해 및 흡수됨으로써 생체 내로의 도입 부분으로부터 소실될 수 있는 성질을 의미한다.
상기 천연 고분자 화합물로서는, 예를 들면, 겔화되는 세포외 매트릭스 유래 성분, 다당류, 키틴, 폴리(3-히드록시알카노에이트)(특히, 폴리(β-히드록시부틸레이트) 및 폴리(3-히드록시옥타노에이트)), 폴리(3-히드록시 지방산), 피브린, 한천, 아가로오스 등을 들 수 있으며, 이들에 한정되지 않는다. 다당류로서는, 예를 들면, 아르기네이트, 셀룰로오스, 덱스트란, 풀루란(pullulane), 폴리히알루론산 및 이들의 유도체 등을 들 수 있다.
상기 셀룰로오스에는 합성에 의해 개질된 것도 포함되며, 예를 들면, 셀룰로오스 유도체 등을 들 수 있다. 셀룰로오스 유도체로서 구체적으로는, 예를 들면, 알킬셀룰로오스, 히드록시알킬셀룰로오스, 셀룰로오스에테르, 셀룰로오스에스테르, 니트로셀룰로오스, 키토산 등을 들 수 있다. 보다 구체적인 셀룰로오스 유도체로서는, 예를 들면, 메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 히드록시부틸메틸셀룰로오스, 셀룰로오스아세테이트, 셀룰로오스프로피오네이트, 셀룰로오스아세테이트부틸레이트, 셀룰로오스아세테이트프탈레이트, 카복시메틸셀룰로오스, 셀룰로오스트리아세테이트, 셀룰로오스설페이트나트륨염 등을 들 수 있다.
그 중에서, 상기 천연 고분자 화합물로서는 뛰어난 보수성을 가지는 점에서, 겔화되는 세포외 매트릭스 유래 성분, 피브린, 한천 또는 아가로오스인 것이 바람직하다.
겔화되는 세포외 매트릭스 유래 성분으로서는, 예를 들면, 콜라겐(I형, II형, III형, V형, XI형 등), 마우스 EHS 종양 추출물(IV형 콜라겐, 라미닌, 헤파란황산프로테오글리칸 등을 포함한다)로부터 재구성된 기저막 성분(상품명：마트리겔), 글리코사미노글리칸, 히알루론산, 프로테오글리칸, 젤라틴 등을 들 수 있으며, 이들에 한정되지 않는다. 각각의 겔화에 적합한 염 등의 성분, 그 농도, pH 등을 선택하여 다공질막(특히, 반투막)을 제작하는 것이 가능하다. 또한, 원료를 조합함으로써 여러 가지 생체 내 조직을 모방한 다공질막(특히, 반투막)을 얻을 수 있다.
상기 합성 고분자 화합물로서는, 예를 들면, 폴리포스파젠, 폴리(비닐알코올), 폴리아미드(예를 들면, 나일론 등), 폴리에스테르아미드, 폴리(아미노산), 폴리무수물, 폴리술폰, 폴리카보네이트, 폴리아크릴레이트(아크릴 수지), 폴리알킬렌(예를 들면, 폴리에틸렌 등), 폴리아크릴아미드, 폴리알킬렌글리콜(예를 들면, 폴리에틸렌글리콜 등), 폴리알킬렌옥사이드(예를 들면, 폴리에틸렌옥사이드 등), 폴리알킬렌테레프탈레이트(예를 들면, 폴리에틸렌테레프탈레이트 등), 폴리오르소에스테르, 폴리비닐에테르, 폴리비닐에스테르, 폴리비닐할라이드, 폴리비닐피롤리돈, 폴리에스테르, 폴리실록산, 폴리우레탄, 폴리히드록시산(예를 들면, 폴리락타이드, 폴리글리콜라이드 등), 폴리(히드록시부티르산), 폴리(히드록시발레르산), 폴리［락타이드-co-(ε-카프로락톤)］, 폴리［글리콜라이드-co-(ε-카프로락톤)］등), 폴리(히드록시알카노에이트) 및 이들의 코폴리머 등을 들 수 있으며, 이들에 한정되지 않는다.
상기 폴리아크릴레이트(아크릴 수지)로서 보다 구체적으로는, 예를 들면, 폴리(메타크릴산 메틸), 폴리(메타크릴산 에틸), 폴리(메타크릴산 부틸), 폴리(메타크릴산 이소부틸), 폴리(메타크릴산 헥실), 폴리(메타크릴산 이소데실), 폴리(메타크릴산 라우릴), 폴리(메타크릴산 페닐), 폴리(아크릴산 메틸), 폴리(아크릴산 이소프로필), 폴리(아크릴산 이소부틸), 폴리(아크릴산 옥타데실) 등을 들 수 있다.
그 중에서도, 상기 합성 고분자 화합물로서는, 생체 흡수성을 가지는 점에서, 폴리히드록시산(예를 들면, 폴리락타이드, 폴리글리콜라이드 등), 폴리에틸렌테레프탈레이트, 폴리(히드록시부티르산), 폴리(히드록시발레르산), 폴리［락타이드-co-(ε-카프로락톤)］, 폴리［글리콜라이드-co-(ε-카프로락톤)］ 등), 폴리(히드록시알카노에이트), 폴리오르소에스테르, 또는 이들의 코폴리머인 것이 바람직하다.
다공질막의 재료는, 상기에 예시된 재료중 한 종류로 구성될 수 있으며, 두 종류 이상으로 구성될 수도 있다. 또한, 다공질막의 재료는 천연 고분자 화합물 또는 합성 고분자 화합물 중 어느 하나로 구성될 수 있으며, 천연 고분자 화합물 및 합성 고분자 화합물 모두로 구성될 수도 있다.
또한, 다공질막이 상기에 예시된 재료중 두 종류 이상으로 구성되어 있는 경우, 다공질막은 상기에 예시된 재료의 혼합물로 구성되어 있을 수 있다. 또는, 다공질막은 한 종류의 재료로 이루어지는 다공질막을 2층 이상 적층하여 이루어지고, 각 다공질막을 구성하는 재료가 서로 다른 막으로 구성되어 있을 수도 있다.
그 중에서도, 본 실시 형태에서의 다공질막이 멤브레인 필터인 경우, 그 재료로서는 합성 고분자 화합물이 바람직하고, 폴리아미드가 보다 바람직하고, 나일론이 더욱 바람직하다.
그 중에서도, 본 실시 형태에서의 다공질막이 반투막인 경우, 그 재료로서는 천연 고분자 화합물이 바람직하고, 겔화되는 세포외 매트릭스 유래 성분이 보다 바람직하고, 콜라겐이 더욱 바람직하다. 또한, 콜라겐 중에서도 보다 바람직한 원료로서는 네이티브 콜라겐 또는 아테로 콜라겐을 예시할 수 있다.
본 실시 형태에서의 다공질막의 재료가 세포외 매트릭스 유래 성분인 경우, 세포외 매트릭스 유래 성분을 다공질막(특히, 반투막)의 단위면적 1cm2당 0.1mg 이상 10.0mg 이하 함유하는 것이 바람직하고, 0.5mg 이상 5.0mg 이하 함유하는 것이 보다 바람직하다. 특히, 세포외 매트릭스 유래 성분이 아테로 콜라겐인 경우, 아테로 콜라겐을 다공질막(특히, 반투막)의 단위면적 1cm2당 0.5mg 이상 10.0mg 이하 함유하는 것이 바람직하고, 1cm2당 2.5mg 이상 5.0mg 이하 함유하는 것이 보다 바람직하다.
다공질막(특히, 반투막)에서의 세포외 매트릭스 유래 성분(특히, 아테로 콜라겐)의 함유량이 상기 범위인 것으로 인해, 세포를 세포 봉입용 디바이스 내에 주입하고 배양하는 것이 가능한 강도로 만들 수 있다.
한편, 상기 「막의 단위면적 1cm2당 질량」이란, 막의 두께를 임의로 하여 그 재료편 1cm2당 함유되는 성분의 질량을 가리킨다.
또한, 본 실시 형태에서의 다공질막은, 사용시에 깨질 우려가 없으며, 실용상 매우 우수한 것이다. 특히 의료용 세포 이식 디바이스에 이용하는 경우, 다공질막(특히, 반투막)의 강도는 이식 조작에 견딜 수 있는 강도를 갖는다.
(다공질막의 제조 방법)
1. 합성 고분자 화합물을 이용한 다공질막의 제조 방법
예를 들면, 다공질막의 구성 재료가 상기 합성 고분자 화합물인 경우는, 공지의 방법(예를 들면, 특허문헌 3 등 참조)을 이용하여 제조할 수 있다.
상기 합성 고분자 화합물을 이용한 다공질막의 제조 방법으로서 보다 구체적으로는, 우선 합성 고분자 화합물을 유기 용제 중에 용해한 제막 원액을 조제한다.
유기 용제로서는, 합성 고분자 화합물에 대한 양(良)용제이면 무방하며, 예를 들면, 테트라히드로푸란, 디옥산, 디메틸포름아미드, 디메틸아세트아미드, N-메틸-2-피롤리돈 등을 들 수 있으며, 이들에 한정되지 않는다.
합성 고분자 화합물과 유기용제의 혼합 비율은, 사용하는 합성 고분자 화합물 및 유기 용제의 종류에 따라 적절히 조정할 수 있으며, 예를 들면, 합성 고분자 화합물 15질량%, 유기 용제 85질량%이면 무방하다.
또한, 용해 시의 유기 용제의 온도는, 통상 30℃ 이상 100℃ 이하일 수 있으며, 바람직하게는 50℃ 이상 80℃ 이하이다.
계속해서, 조제한 제막 원액을, 예를 들면 노즐로부터 토출시키는 방법 등을 이용하여 응고액중에서 응고시켜, 소정 형상의 다공질막을 제작한다.
응고액으로서는, 유기 용제와 물의 혼합액을 이용하는 것이 바람직하다. 응고액에 이용하는 유기 용제로서는, 합성 고분자 화합물의 용해에 이용한 유기 용제로서 예시된 것과 동일한 것을 이용할 수 있다. 한편, 응고액에 이용하는 유기 용제는, 합성 고분자 화합물의 용해에 이용한 유기 용제와 동일한 종류여도 되고, 다른 종류여도 무방하다.
또한, 응고액중에서 물의 비율은, 예를 들면, 30질량% 이상 80질량% 이하일 수 있다.
또한, 응고 속도를 조정하는 목적으로, 응고액중에, 예를 들면, 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 글리세린 등의 알코올류나 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 등의 글리콜류를 첨가할 수 있다.
얻어진 다공질막은, 증류수 등으로 세정하고, 자외선 조사 등에 의한 멸균을 행하여 사용하면 된다.
2. 하이드로겔을 이용한 다공질막의 제조 방법
또한, 예를 들면, 다공질막의 구성 재료가 하이드로겔인 경우는, 공지의 방법(예를 들면, 특허문헌 4~6 등 참조.)을 이용하여 제조할 수 있다.
한편, 본 명세서에서 「하이드로겔」이란, 고분자 화합물이 화학 결합에 의해 그물 구조를 취하고, 이 그물에 다량의 물을 보유한 물질을 나타낸다. 하이드로겔로서 보다 구체적으로는, 천연물 고분자 화합물이나 합성 고분자 화합물의 인공 소재에 가교를 도입하여 겔화시킨 것을 의미한다.
하이드로겔에는, 예를 들면, 상술한 겔화되는 세포외 매트릭스 유래 성분, 피브린, 한천, 아가로오스, 셀룰로오스 등의 천연 고분자 화합물, 및 폴리아크릴아미드, 폴리비닐알코올, 폴리에틸렌옥사이드, 폴리(2-히드록시에틸메타크릴레이트/폴리카프로락톤)(poly(II-hydroxyethylmethacrylate)/polycaprolactone) 등의 합성 고분자 화합물이 포함된다.
하이드로겔을 이용한 다공질막의 제조 방법으로서 보다 구체적으로는, 우선, 주형에 완전히는 겔화되지 않은 상태의 하이드로겔(이하, 「콜로이드 용액」이라고 칭할 수 있다.)을 배치하고, 겔화를 유도한다.
콜로이드 용액이 콜라겐 콜로이드 용액인 경우, 콜라겐 콜로이드 용액은 적합한 염 농도를 가지는 것으로서, 생리 식염수, 인산 완충 생리 식염수(Phosphate Buffered Saline; PBS), 행크스 평형 염류 용액(Hank＇s　Balanced　Salt　Solution：HBSS), 기초 배양액, 무혈청 배양액, 혈청 함유 배양액 등을 이용하여 조제한 것을 이용할 수 있다. 또한, 콜라겐 겔화시의 용액의 pH는, 예를 들면 6 이상 8 이하일 수 있다.
특히, 무혈청 배양액을 이용하는 경우, 타동물 혈청 성분중에 포함되는 이식에 적합하지 않는 물질(예를 들면, 항원, 병원 인자 등)이 다공질막에 포함되는 것을 피할 수 있기 때문에, 의료용 세포 이식 디바이스에 이용하는 경우에 매우 적합한 다공질막(특히, 반투막)을 얻을 수 있다.
또한, 콜라겐 콜로이드 용액의 조제는, 예를 들면 4℃ 정도에서 행할 수 있다. 그 후, 겔화할 때의 보온은, 이용하는 콜라겐의 동물종에 의존한 콜라겐의 변성 온도보다 낮은 온도로 할 수 있으며, 일반적으로는 20℃ 이상 37℃ 이하의 온도로 보온함으로써 몇분 내지 수시간에 겔화를 행할 수 있다.
또한, 다공질막을 제작하기 위한 콜라겐 콜로이드 용액의 농도는, 0.1% 이상 1.0% 이하인 것이 바람직하고, 0.2% 이상 0.6% 이하인 것이 보다 바람직하다. 콜라겐 콜로이드 용액의 농도가 상기 하한값 이상인 것으로 인해 겔화가 너무 약하지 않으며, 콜라겐 콜로이드 용액의 농도가 상기 상한값 이하인 것으로 인해 균일한 콜라겐 겔로 이루어지는 다공질막(특히, 반투막)을 얻을 수 있다.
또한, 얻어진 하이드로겔을 건조하여, 하이드로겔 건조체로 만들 수 있다. 하이드로겔을 건조시킴으로써, 하이드로겔 내의 자유수를 완전히 제거하여, 결합수의 부분 제거를 더 진행할 수 있다.
또한, 얻어진 하이드로겔 건조체를 PBS나 사용하는 배양액 등으로 재수화(再水和)함으로써, 비트리겔(등록상표)로 만들 수도 있다.
이 유리화 공정(하이드로겔 내의 자유수를 완전히 제거한 후, 결합수의 부분 제거를 진행시키는 공정)의 기간을 길게 할수록, 재수화했을 때에 투명도, 강도가 우수한 비트리겔(등록상표)을 얻을 수 있다. 한편, 필요에 따라서 단기간의 유리화 후에 재수화하여 얻은 비트리겔(등록상표)을 PBS 등으로 세정하여, 다시 유리화할 수도 있다.
건조 방법으로서는, 예를 들면, 풍건, 밀폐 용기 내에서 건조(용기 내의 공기를 순환시켜, 항상 건조 공기를 공급한다), 실리카겔을 둔 환경 하에서 건조하는 등, 여러 가지 방법을 이용할 수 있다. 예를 들면, 풍건의 방법으로서는, 10℃, 40%의 습도로 무균으로 유지된 인큐베이터에서 2일간 건조시키거나, 혹은 무균 상태의 클린 벤치 내에서 만 하루, 실온으로 건조하는 등의 방법을 예시할 수 있다.
한편, 본 명세서에서, 「비트리겔(등록상표)」이란, 종래의 하이드로겔을 유리화(vitrification)한 후에 재수화하여 얻어지는 안정된 상태에 있는 겔을 가리키며, 본 발명자에 의해 「비트리겔(vitrigel)(등록상표)」로 명명되고 있다.
또한, 본 명세서에서는, 하이드로겔로 이루어지는 다공질막의 제조 공정을 상세하게 설명함에 있어, 상기 유리화 공정의 직후이며 재수화의 공정을 거치지 않은 하이드로겔의 건조체에 대해서는, 단순히 「하이드로겔 건조체」라고 하였다. 그리고, 상기 유리화 공정 후에 재수화의 공정을 거쳐 얻어진 겔을 「비트리겔(등록상표)」로서 구별하여 나타내었다. 또한, 그 비트리겔(등록상표)을 유리화하여 얻어진 건조체를 「비트리겔(등록상표) 건조체」라고 하였다. 또한, 비트리겔(등록상표) 건조체에 자외선 조사하는 공정을 실시하여 얻어지는 것을 「자외선 조사 처리를 실시한 비트리겔(등록상표) 건조체」라고 하였다. 또한, 「자외선 조사 처리를 실시한 비트리겔(등록상표) 건조체」에 재수화하는 공정을 실시하여 얻어지는 겔을 「비트리겔(등록상표) 재료」라고 하였다. 또한, 비트리겔(등록상표) 재료를 유리화하여 얻어진 건조체를 「비트리겔(등록상표) 재료의 건조체」라고 하였다. 따라서, 「비트리겔(등록상표)」 및 「비트리겔(등록상표) 재료」는 수화체이다.
즉, 얻어진 비트리겔(등록상표)을 재건조함으로써, 재유리화하여 비트리겔(등록상표) 건조체로 만들 수 있다.
건조 방법으로서는, 상기 예시한 방법과 동일한 방법을 들 수 있다.
또한, 얻어진 비트리겔(등록상표) 건조체에 자외선을 조사하여, 「자외선 조사 처리를 실시한 비트리겔(등록상표) 건조체」로 만들 수 있다.
자외선의 조사에는 공지된 자외선 조사 장치를 사용할 수 있다.
비트리겔(등록상표) 건조체로의 자외선 조사 에너지는, 단위 면적당 총 조사량이, 0.1mJ/cm2 이상 6,000mJ/cm2 이하인 것이 바람직하고, 10mJ/cm2 이상 4,000mJ/cm2 이하인 것이 보다 바람직하고, 100mJ/cm2 이상 3,000mJ/cm2 이하인 것이 더욱 바람직하다. 총 조사량이 상기의 범위인 것으로 인해, 이어지는 재수화 공정에서 얻어지는 비트리겔(등록상표) 재료의 투명도 및 강도를 특히 바람직한 것으로 만들 수 있다.
또한, 비트리겔(등록상표) 건조체에 대한 자외선 조사는, 복수회 반복하여 행할 수 있다. 비트리겔(등록상표) 건조체에 자외선 조사를 반복하는 경우, 첫 번째의 자외선 조사를 행한 후, 자외선 조사 처리를 실시한 비트리겔(등록상표) 건조체의 재수화 및 재유리화의 공정을 행하고, 그 후 두 번째 이후의 재유리화 후의 비트리겔(등록상표) 재료의 건조체로의 자외선 조사를 행하는 것이 바람직하다.
단위 면적당 자외선 총 조사량이 동일할 때, 비트리겔(등록상표) 건조체에 대한 자외선의 조사를 복수회 분할하여 반복하여 행함으로써, 이어지는 재수화 공정에서 얻어지는 비트리겔(등록상표) 재료의 투명도 및 강도를 보다 높일 수 있다. 또한 분할 횟수는 많을수록 바람직하다. 예를 들면, 비트리겔(등록상표) 건조체에 대한 자외선 조사의 단위 면적당 총 조사량이 1,000mJ/cm2 이상 4,000mJ/cm2 이하의 범위일 때, 그 범위 내에서의 조사 횟수가 2회 이상 10회 이하인 것이 바람직하고, 2회 이상 6회 이하인 것이 보다 바람직하다.
또한, 비트리겔(등록상표) 건조체에 대한 자외선의 조사를 반복하는 경우, 자외선의 조사 부위를, 비트리겔(등록상표) 건조체의 일방의 면과 타방의 면(상면과 하면)으로 나누어 조사하고, 그 총 조사량을 비트리겔(등록상표) 건조체에 대한 단위 면적당 자외선 총 조사량으로 할 수 있다.
자외선의 조사를 비트리겔(등록상표) 건조체에 행함으로써, 이어지는 재수화 공정에서 얻어지는 비트리겔(등록상표) 재료의 강도와 투명도가 높아지는 것은, 비트리겔(등록상표) 재료 내의 고분자 화합물끼리가 자외선에 의해 가교되기 때문이라고 생각된다. 즉, 상기 조작에 의해 높은 투명도 및 강도를 비트리겔(등록상표) 재료에 유지시킬 수 있는 것으로 추측된다.
또한, 얻어진 자외선 조사 처리를 실시한 비트리겔(등록상표) 건조체를 PBS나 사용하는 배양액 등으로 재수화함으로써, 비트리겔(등록상표) 재료로 만들 수 있다.
또한, 얻어진 비트리겔(등록상표) 재료를 건조함으로써, 재유리화하여 비트리겔(등록상표) 재료의 건조체로 만들 수 있다.
건조 방법으로서는, 상기 예시한 방법과 동일한 방법을 들 수 있다.
［프레임 부재］
세포 봉입용 디바이스에서, 다공질막 이외의 부분을 구성하는 부재, 즉 프레임 부재는 액밀성을 가지는 것으로 만들 수 있다.
또한, 프레임 부재는 통기성을 갖는 것일 수 있으며, 통기성을 갖지 않는 것일 수도 있다.
프레임 부재가 통기성을 가지는 것인 경우, 산소 투과 계수가, 예를 들면 100cm3/m2·24hr·atm 이상 5,000cm3/m2·24hr·atm 이하일 수 있으며, 예를 들면 1,000cm3/m2·24hr·atm 이상 3,000cm3/m2·24hr·atm 이하일 수 있고, 예를 들면 1,200cm3/m2·24hr·atm 이상 2,500cm3/m2·24hr·atm 이하일 수 있다. 또한, 이산화탄소 투과 계수가, 예를 들면 1,000cm3/m2·24hr·atm 이상 20,000cm3/m2·24hr·atm 이하일 수 있고, 예를 들면 3,000cm3/m2·24hr·atm 이상 15,000cm3/m2·24hr·atm 이하일 수 있으며, 예를 들면 5,000cm3/m2·24hr·atm 이상 10,000cm3/m2·24hr·atm 이하일 수 있다.
또한, 프레임 부재가 통기성을 가지지 않는 것인 경우, 산소 투과 계수가, 예를 들면 100cm3/m2·24hr·atm 이하일 수 있고, 예를 들면 50cm3/m2·24hr·atm 이하일 수 있다. 또한, 이산화탄소 투과 계수가, 예를 들면 1,000cm3/m2·24hr·atm 이하일 수 있고, 예를 들면 500cm3/m2·24hr·atm 이하일 수 있다.
세포 봉입용 디바이스에서, 프레임 부재의 재료로서는 세포의 배양에 적절한 것이면 무방하다. 프레임 부재를 구성하는 재료로서는 예를 들면, 금속 재료, 유리 재료, 엘라스토머 재료, 덴드리머를 포함하는 플라스틱, 코폴리머 등을 들 수 있으며, 이들에 한정되지 않는다.
금속 재료로서는, 예를 들면 스텐레스강 등을 들 수 있다.
유리 재료로서는, 예를 들면, 소다 석회 유리, 파이렉스(등록상표) 유리, 바이콜(등록상표) 유리, 석영 유리 등을 들 수 있다.
엘라스토머 재료로서는, 예를 들면, 우레탄 고무, 니트릴 고무, 실리콘 고무, 실리콘 수지(예를 들면, 폴리디메틸실록산), 불소 고무, 아크릴 고무, 이소프렌 고무, 에틸렌프로필렌 고무, 클로로술폰화 폴리에틸렌 고무, 에피클로로히드린 고무, 클로로프렌 고무, 스티렌·부타디엔 고무, 부타디엔 고무, 폴리이소부틸렌 고무 등을 들 수 있다.
덴드리머로서는, 예를 들면, 폴리(염화비닐), 폴리(비닐알코올), 폴리(메타크릴산 메틸), 폴리(아세트산 비닐-co-무수말레산), 폴리(디메틸실록산)모노메타크릴레이트, 고리형 올레핀 폴리머, 탄화불소 폴리머, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌이민 등을 들 수 있다.
코폴리머로서는 예를 들면, 폴리(아세트산 비닐-co-무수말레산), 폴리(스티렌-co-무수말레산), 폴리(에틸렌-co-아크릴산) 및 이들의 유도체 등을 들 수 있다.
프레임 부재의 재료는 상기에 예시된 재료중 한 종류로 구성될 수 있으며, 두 종류 이상으로 구성될 수도 있다.
또한, 프레임 부재가 상기에 예시된 재료 중 두 종류 이상으로 구성되어 있는 경우, 프레임 부재는 상기에 예시된 재료의 혼합물로 구성될 수 있다. 또는, 프레임 부재는, 한 종류의 재료로 이루어지는 프레임 부재를 조합하여 형성되어 있고, 각 프레임 부재를 구성하는 재료가 서로 다를 수도 있다.
그 중에서, 프레임 부재의 재료로서는, 엘라스토머 재료를 포함하는 것이 바람직하고, 실리콘 수지를 포함하는 것이 보다 바람직하고, 폴리디메틸실록산을 포함하는 것이 더욱 바람직하다.
또한, 프레임 부재는 엘라스토머 재료만으로 이루어지거나, 또는 덴드리머를 포함하는 플라스틱과 엘라스토머 재료의 조합으로 이루어지는 것이 바람직하다. 프레임 부재가 플라스틱과 엘라스토머 재료의 조합으로 이루어지는 경우, 흡인관이 끼워지는 부분이 엘라스토머 재료에 의해 구성되고, 그 외의 부분에 대해서는 덴드리머를 포함하는 플라스틱에 의해 구성되어 있는 것이 바람직하다. 상기 구성으로 함으로써, 본 실시 형태의 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스를 간편하게 제조할 수 있다.
또한, 프레임 부재의 형상은, 세포 봉입용 디바이스의 전체 형상 및 세포 봉입용 디바이스를 구성하는 부분에 따라 적절하게 선택할 수 있다.
또한, 프레임 부재에는 개개의 세포 봉입용 디바이스를 식별하기 위해, 예를 들면, 착색, 인자(印字) 등을 실시할 수도 있다.
(프레임 부재의 제조 방법)
프레임 부재는, 이용하는 재료에 따라 공지의 방법을 이용하여 제조할 수 있다.
예를 들면, 프레임 부재의 재료로서 엘라스토머 재료 또는 플라스틱을 이용하는 경우의 제조 방법으로서는, 압축 성형법, 사출 성형법, 압출 성형법 등을 들 수 있으며, 이들에 한정되지 않는다.
또한, 예를 들면, 프레임 부재의 재료로서 유리 재료를 이용하는 경우의 제조 방법으로서는, 예를 들면, 액적 성형법, 대너(Danner)법, 오버 플로우법, 플로트법, 블로우 성형법, 프레스 성형법 등을 들 수 있으며, 이들에 한정되지 않는다.
［접착제층］
각 접착제층의 두께는, 예를 들면 0.1μm 이상 1,000μm 이하로 할 수 있다.
여기서, 「각 접착제층의 두께」란, 각 접착제층 전체의 두께를 의미하며, 예를 들면 복수층으로 이루어지는 제1 접착제층의 두께란, 제1 접착제층을 구성하는 모든 층의 합계 두께를 의미한다.
접착제층의 재료로서는 세포 독성이 없는 것이면 무방하다. 또한, 접착제층의 재료는, 접착 대상인 다공질막, 프레임 부재 및 기밀성을 가지는 필름의 각 재료에 따라 적절하게 선택할 수 있다.
또한, 기밀성을 가지는 필름은, 「기밀성을 가지는 필름에 대한 접착성이 낮고, 다공질막에 대한 접착성이 높은 접착제」 또는 「기밀성을 가지는 필름에 대한 접착성이 높고, 다공질막에 대한 접착성이 낮은 접착제」를 이용함으로써, 다공질막의 외면에 대하여 착탈 가능하게 할 수 있다.
예를 들면, 다공질막이 멤브레인 필터이며, 기밀성을 가지는 필름이 실리콘 코팅된 폴리에틸렌테레프탈레이트(PET) 막인 경우, 멤브레인 필터와 PET막의 실리콘 코팅면의 접착에 박형 발포체 기재 방수 양면 테이프(Nitto　Denko　Corporation, No. 57210B, Lot　No.8328702, 두께： 0.1mm)를 이용함으로써, 기밀성을 가지는 필름인 실리콘 코팅된 PET막을 멤브레인 필터에 대하여 착탈 가능하게 할 수 있다. 한편, 이 경우는 실리콘 코팅된 PET막을 착탈했을 때, 박형 발포체 기재 방수 양면 테이프의 접착제가 멤브레인 필터의 외면에 노출되게 된다. 후술하는 실시예에는, PET막을 착탈했을 때에도 박형 발포체 기재 방수 양면 테이프의 접착제가 멤브레인 필터의 외면에 노출되지 않는 사용예를 나타내었다.
접착제층의 재료로서 구체적으로는, 예를 들면, 합성 화합물의 접착제, 천연 화합물의 접착제, 양면 테이프 등을 들 수 있으며, 이들에 한정되지 않는다.
합성 화합물의 접착제로서는, 예를 들면, 우레탄계 접착제, 시아노아크릴레이트계 접착제, 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA), 인산 칼슘계 접착제, 레진계 시멘트 등을 들 수 있다.
천연 화합물의 접착제로서는, 예를 들면, 피브린 글루, 젤라틴 글루 등을 들 수 있다.
양면 테이프로서는, 의료 용도로 이용되고 있는 것 등을 바람직하게 이용할 t수 있다.
양면 테이프로서는, 예를 들면 지지 테이프의 양면에 점착제가 적층된 구조를 가지는 것 등을 들 수 있다.
점착제로서는, 예를 들면, 고무계, 아크릴계, 우레탄계, 실리콘계, 비닐에테르계 등의 공지의 점착제를 들 수 있다.
양면 테이프로서 보다 구체적으로는, 예를 들면, 3M 재팬사제의 피부 부착용 양면 테이프(제품 번호： 1510, 1504XL, 1524 등), 닛토 덴코샤제의 피부용 양면 점착 테이프(제품 번호： ST502, ST534 등), 니치반 메디칼사제의 의료용 양면 테이프(제품 번호： ＃1088, ＃1022, ＃1010, ＃809SP, ＃414125, ＃1010R, ＃1088R, ＃8810 R, ＃2110R 등), DIC사제의 박형 발포체 기재 양면 접착 테이프(제품 번호：＃84010, ＃84015, ＃84020 등) 등을 들 수 있다.
한편, 흰색이나 검정색 등의 착색된 색이 다른 양면 접착 테이프(예를 들면, DIC사제의 ＃84010 WHITE 및 ＃84010 BLACK 등)를, 각각 프레임 부재의 상면 및 바닥면에 이용함으로써, 다공질막(10a)이 투명 또는 반투명인 경우에는, 상면측 및 바닥면측을 육안으로 용이하게 구별할 수 있다.
접착제층은 상기 예시된 재료중 한 종류로 구성될 수 있으며, 두 종류 이상으로 구성될 수도 있다.
또한, 접착제층이 상기에 예시된 재료중 두 종류 이상으로 구성되어 있는 경우, 접착제층은 상기에 예시된 재료의 혼합물로 구성되어 있을 수 있다. 또는, 접착제층은, 한 종류의 재료로 이루어지는 접착제층을 2층 이상 적층하여 이루어지고, 각 접착제층을 구성하는 재료가 서로 다를 수 있다.
［기밀성을 가지는 필름］
기밀성을 가지는 필름의 두께는, 예를 들면 10μm 이상 1,000μm 이하로 할 수 있으며, 예를 들면 30μm 이상 500μm 이하로 할 수 있고, 예를 들면 50μm 이상 200μm 이하로 할 수 있다.
여기서, 「기밀성을 가지는 필름의 두께」란, 기밀성을 가지는 필름 전체의 두께를 의미하며, 예를 들면, 복수층으로 이루어지는 기밀성을 가지는 필름의 두께란, 기밀성을 가지는 필름을 구성하는 모든 층의 합계 두께를 의미한다.
기밀성을 가지는 필름의 재료로서는 기밀성을 가지는 재료이면 무방하다.
기밀성을 가지는 필름의 재료로서 구체적으로는, 유기 재료일 수 있으며 무기 재료일 수도 있다.
유기 재료로서는 예를 들면, 폴리아미드(예를 들면, 나일론 등), 폴리올레핀계 수지, 폴리에스테르계 수지, 폴리스티렌계 수지, 폴리카보네이트, 폴리아미드계 수지, 실리콘 수지 등을 들 수 있으며, 특별히 한정되지 않는다.
무기 재료로서는 예를 들면, 세라믹, 유리 등을 들 수 있으며, 특별히 한정되지 않는다.
기밀성을 가지는 필름은, 상기에 예시된 재료중 한 종류로 구성될 수 있으며, 두 종류 이상으로 구성되어 있을 수도 있다.
또한, 기밀성을 가지는 필름이 상기에 예시된 재료중 두 종류 이상으로 구성된 경우, 기밀성을 가지는 필름은 상기에 예시된 재료의 혼합물로 구성될 수 있을 수 있다. 또는, 기밀성을 가지는 필름은 한 종류의 재료로 이루어지는 기밀성을 가지는 필름을 2층 이상 적층하여 이루어지고, 각 기밀성을 가지는 필름을 구성하는 재료가 서로 다를 수 있다.
(기밀성을 가지는 필름의 제조 방법)
기밀성을 가지는 필름은, 이용하는 재료에 따라 공지의 방법을 이용하여 제조할 수 있다.
예를 들면, 기밀성을 가지는 필름의 재료로서 유기 재료를 이용하는 경우의 제조 방법으로서는, 예를 들면, 압축 성형법, 캘린더 성형법, 사출 성형법, 압출 성형법, 인플레이션 성형 등을 들 수 있으며, 이들에 한정되지 않는다.
또한, 예를 들면, 기밀성을 가지는 필름의 재료로서 유리를 이용하는 경우의 제조 방법으로서는, 예를 들면, 상술한 「부재의 제조 방법」에서 예시된 방법과 동일한 것을 들 수 있다.
또한, 예를 들면, 기밀성을 가지는 필름의 재료로서 세라믹을 이용하는 경우의 제조 방법으로서는, 예를 들면, 건식 성형법(예를 들면, 금형 성형법, 냉간 정수압 성형법, 핫 프레스법, 열간 정수압 성형법 등), 소성 성형법(예를 들면, 물레 성형법, 압출 성형법, 사출 성형법), 슬립 주조 성형법(예를 들면, 슬러리 주조법, 압력 주조법, 회전 주조법 등), 테이프 성형법 등을 들 수 있으며, 이들에 한정되지 않는다.
［지지체］
지지체의 재료는 유기 재료일 수 있고 무기 재료일 수도 있다. 유기 재료 및 무기 재료로서는, 상술한 「기밀성을 가지는 필름」에서 예시된 것과 동일한 것을 들 수 있다.
또한, 지지체의 형상은 예를 들면, 시트 형상, 막대 형상 등을 들 수 있으며, 이들에 한정되지 않는다.
또한, 지지체에는 개개의 세포 봉입용 디바이스를 식별하기 위해, 예를 들면, 착색, 인자 등을 실시할 수도 있다.
(지지체의 제조 방법)
지지체는 이용하는 재료에 따라 공지의 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 구체적인 제조 방법으로서는, 상술한 「기밀성을 가지는 필름의 제조 방법」에서 예시된 것과 동일한 것을 들 수 있다.
＜흡인관＞
흡인관은, 제1 관상 부재 및 제2 관상 부재를 갖는다. 제1 관상 부재 및 제2 관상 부재의 양단부는 각각 개구되어 있다.
또한, 제1 관상 부재 및 제2 관상 부재의 일방의 단부는 각각 프레임 부재의 제1 관통공 및 제2 관통공과 연통되어 있다.
또한, 제1 관상 부재의 타방의 단부는 흡인 수단과의 연결 기구를 갖는다.
흡인 수단으로서는, 예를 들면, 피펫터, 실린지, 스포이드 등을 들 수 있다.
연결 기구로서는, 예를 들면, 흡인 수단이 피펫터인 경우, 제1 관상 부재의 타방의 단부의 내부 형상이 피펫터의 선단부 형상과 일치하고 있는 것 등을 들 수 있다. 이에 따라, 피펫터의 선단부에 본 실시 형태의 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스를 제1 관상 부재의 타방의 단부에 의해 연결할 수 있다.
또한, 상기 연결 기구는, 흡인 수단에 이물이 혼입되는 것을 방지하기 위해, 필터를 가질 수 있다. 필터로서는, 에어졸 내성 팁이나 하이퍼 필터 팁에 구비되는 공지의 필터 등을 들 수 있다.
흡인관의 재료로서는 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면 세포 봉입용 디바이스를 의료용 세포 이식 디바이스로서 활용하는 경우, 상기 흡인관의 재료로서는 생체 적합성을 가지는 재료인 것이 바람직하다. 상기 생체 적합성을 가지는 재료로서는, 상술한 「다공질막」에서 예시된 천연 고분자 화합물 및 합성 고분자 화합물을 들 수 있다.
또한, 세포 봉입용 디바이스를 세포의 활성을 검사하는 시험 등의 인비트로 시험계에서 이용되는 다세포 구조체를 구축하기 위하여 이용하는 경우에는, 상기 생체 적합성을 가지는 재료일 수 있고, 또는 세포의 배양에 적절한 재료일 수도 있다. 상기 생체 적합성을 가지는 재료로서는, 상술한 「다공질막」에서 예시된 천연 고분자 화합물 및 합성 고분자 화합물을 들 수 있다. 상기 세포의 배양에 적절한 재료로서는, 상술한 「부재」에서 예시된 것과 동일한 것을 들 수 있다.
또한, 흡인관으로서 바람직하게 이용되는 것으로서 보다 구체적으로는, 예를 들면, 겔 로딩 팁, 실리코나이즈드 팁 등을 들 수 있다.
(흡인관의 제조 방법)
흡인관은, 이용하는 재료에 따라 공지의 방법을 이용하여 제조할 수 있다.
구체적인 제조 방법으로서는, 상술한 「다공질막의 제조 방법」 및 「부재의 제조 방법」에서 예시된 방법과 동일한 방법을 이용하여, 관 형상이 되도록 성형할 수 있다.
≪흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스의 제조 방법≫
본 실시 형태의 세포 봉입용 디바이스는, 원하는 형상이 되도록 다공질막과 프레임 부재와 흡인관을 조립함으로써 제조할 수 있다. 또한, 필요에 따라, 지지체 및 기밀성을 가지는 필름을 구비할 수 있다.
다공질막, 프레임 부재, 지지체, 기밀성을 가지는 필름 및 흡인관의 각각의 제조 방법은, 상술한 바와 같다.
보다 구체적으로는, 도 2c에 나타내는 본 실시 형태의 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스의 제조 방법을 이하에 상세하게 설명한다.
우선, 원하는 크기의 프레임 부재(10b)를 준비한다. 계속해서, 프레임 부재(10b)의 외주면에 주사 바늘 등을 이용하여 제1 관통공 및 제2 관통공을 형성하고, 제1 관상 부재(20a) 및 제2 관상 부재(20b)를 각각 찔러넣는다. 계속해서, 접착제 또는 양면 테이프를 이용하여, 프레임 부재(10b)의 상면 및 바닥면상에, 각각 제1 접착제층(11a) 및 제2 접착제층(11b)를 형성한다.
계속해서, 프레임 부재(10b)의 상면 및 바닥면과 동일한 크기, 또는 프레임 부재(10b)의 상면 및 바닥면보다 한 단계 큰 2매의 다공질막(10a-1, 10a-2)을 준비한다. 이때, 2매의 다공질막(10a-1 및 10a-2)은 서로 동일한 재료로 구성될 수 있으며, 다른 재료로 구성될 수도 있다.
계속해서, 2매의 다공질막(10a-1, 10a-2)을 각각 부재(10b)의 상면 및 바닥면이 되도록, 제1 접착제층(11a) 및 제2 접착제층(11b)를 개재하여 접착한다.
계속해서, 다공질막(10a-1 및 10a-2)과 동일한 크기, 또는 다공질막(10a-1, 10a-2)보다 한 단계 큰 2매의 기밀성을 가지는 필름(12a, 12b)을 준비한다. 이때, 2매의 기밀성을 가지는 필름(12a, 12b)은 서로 동일한 재료로 구성될 수 있으며, 다른 재료로 구성될 수 있다.
계속해서, 접착제 또는 양면 테이프를 이용하여, 준비한 2매의 기밀성을 가지는 필름(12a, 12b) 상에 각각 제3 접착제층(11c) 및 제4 접착제층(11d)을 형성한다.
계속해서, 2매의 기밀성을 가지는 필름(12a, 12b)을, 상면 및 바닥면에 부착되어 있는 다공질막(10a-1, 10a-2)에 각각 제3 접착제층(11c) 및 제4 접착제층(11d)을 개재하여 접착한다.
계속해서, 필요에 따라, UV 조사 등에 의한 살균 처리 또는 γ선 조사 등에 의한 멸균 처리를 실시하고, 다공질막(10a), 프레임 부재(10b), 제1 관상 부재(20a) 또는 제2 관상 부재(20b)의 크기를 정리함으로써, 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스(400)를 얻을 수 있다.
또한, 세포 봉입용 디바이스가 지지체를 구비하는 경우, 미리 지지체를 프레임 부재(10b)에 접합해 둘 수 있다. 또는, 조립된 세포 봉입용 디바이스(10)에 지지체를 접합할 수도 있다. 접합 방법으로서는, 상술한 다공질막과 프레임 부재의 접합 방법과 동일한 방법에 의해 고정될 수 있으며, 장착 도구 등을 이용하여 분리 가능하게 장착될 수도 있다.
≪흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스 세트≫
본 실시 형태의 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스 세트는, 상기 실시 형태의 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스와 랙을 구비한다.
본 실시 형태의 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스 세트에 의하면, 연속적인 세포 봉입용 디바이스의 제작을 효율적으로 행할 수 있다.
도 3은, 본 실시 형태의 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스 세트의 일례를 나타내는 사시도 및 측면도이다. 도 3을 참조하면서, 본 실시 형태의 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스 세트의 구조에 대하여, 이하 상세히 설명한다.
도 3에 나타내는 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스 세트(A)는, 복수의 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스(100)가 랙(110)의 U자형 걸림부(111)에 걸린 상태로 수납되어 있다. 또한, 예를 들면, 랙(110)의 뚜껑을 도 3의 측면도에 나타낸 바와 같이 개폐하는 경우, 랙(110) 내에 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스를 수납하면서, 피펫터 등의 흡인 수단과 연결할 수 있다. 또한, 흡인 수단과 연결된 상태로 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스(100)를 정면 방향의 비스듬한 상방으로 끌어올림으로써, 세포 봉입용 디바이스의 다공질막을 손상시키지 않고 꺼낼 수 있다. 따라서, 연속적인 세포 봉입용 디바이스의 제작에 있어서도, 효율적으로 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스를 꺼내어 사용할 수 있다.
또한, 본 실시 형태의 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스 세트는, 복수의 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스(100)가 랙에 수납된 상태로, γ선 등에 의한 멸균을 행할 수 있다.
＜랙＞
랙(110)은 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스(100)을 수납하기 위한 걸림부(111)를 갖는다. 걸림부(111)는 도 3에 나타낸 바와 같이 U자형일 수 있으며, 그 외의 형상일 수도 있다. 그 중에서, 걸림부(111)의 형상은, 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스(100)의 다공질막을 손상시키지 않고 꺼낼 수 있다는 측면에서, U자형인 것이 바람직하다.
랙은 통상의 피펫 팁 등을 수납하고 있는 공지의 랙의 재료와 동일한 것을 이용할 수 있다.
≪세포의 봉입 방법≫
본 실시 형태의 세포의 봉입 방법은, 상기 실시 형태의 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스를 이용하는 방법이다.
본 실시 형태의 봉입 방법에 의하면, 간편하게 세포를 디바이스 내에 봉입할 수 있다.
본 실시 형태의 봉입 방법에서는 우선, 흡인 수단을 제1 관상 부재의 연결 기구를 개재하여 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스에 연결하고, 세포의 현탁액을 상기 실시 형태의 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스 내에 흡인시킨다.
흡인 수단으로서는, 예를 들면, 피펫터, 실린지, 스포이드 등을 들 수 있다.
봉입 대상이 되는 세포로서는, 예를 들면, 포유 동물 세포, 조류 세포, 파충류 세포, 양서류 세포, 어류 세포 등의 척추 동물 세포； 곤충 세포, 갑각류 세포, 연체 동물 세포, 원생 동물 세포 등의 무척추 동물 세포； 그람 양성균(예를 들면, 바실러스종 등), 그람 음성균(예를 들면, 대장균 등) 등의 세균： 효모, 식물 세포 및 그들의 단일 세포 또는 복수의 세포로 구성되는 작은 생명 개체 등을 들 수 있다.
상기 작은 생명 개체로서는, 예를 들면, 단세포 생물, 미소 갑각류 동물, 플라나리아(세절 후의 재생 플라나리아도 포함한다), 육생 절지 동물의 유생, 선형 동물, 식물의 종자(특히, 발아 종자), 캘러스, 원생 동물, 해양 미생물, 치어, 조개 유생 등을 들 수 있으며, 이들에 한정되지 않는다. 단세포 생물로서는, 예를 들면, 아메바, 짚신 벌레, 클로스테리움, 피눌라리아, 클로렐라, 유글레나, 파쿠스 등을 들 수 있다. 미소 갑각류 동물로서는, 예를 들면, 물벼룩, 아르테미아 유생, 요각류, 패충류, 초갑류의 유생, 엽하아강의 유생, 낭하상목의 유생, 진하상목의 유생 등을 들 수 있다. 해양 미생물로서는, 예를 들면, 해양 세균, 조류 등을 들 수 있다. 해양 세균으로서는, 예를 들면, 비브리오속, 슈드모나스속, 에로모나스속, 아르테로모나스속, 플라보박테리움속, 사이토파가속, 플렉시박터속 등에 속하는 세균 등을 들 수 있다. 조류로서는, 예를 들면, 남조, 클립트조, 와편모조, 규조, 라피드조, 황갈조, 착편모조, 유글레나조, 담녹조, 녹조 등을 들 수 있다.
예를 들면, 본 실시 형태의 세포 봉입용 디바이스를 이용하여 발아 종자를 배양하는 경우에 있어서, 세포 봉입용 디바이스의 상면은 발아한 싹이 관통될 수 있을 정도의 경도를 가지며, 생분해성 재료로 이루어짐으로써, 발아 종자를 디바이스 내에 넣은 것을 그대로 토양에 심어 식물체를 생육할 수 있다.
한편, 본 명세서에서 「생분해성 재료」란, 토양중 또는 수중 미생물 등에 의해 무기물로 분해되는 성질을 가지는 재료를 의미한다.
상기 척추 동물 세포(특히, 포유 동물 세포)로서는, 예를 들면, 생식 세포(정자, 난자 등), 생체를 구성하는 체세포, 줄기세포, 전구세포, 생체로부터 분리된 암세포, 생체로부터 분리되어 불사화 능력을 획득하여 체외에서 안정되어 유지되는 세포(세포주), 생체로부터 분리되어 인위적으로 유전자 개변된 세포, 생체로부터 분리되어 인위적으로 핵이 교환된 세포 등을 들 수 있으며, 이들에 한정되지 않는다. 또한, 이들 세포의 세포 덩어리(스페로이드)를 이용할 수도 있다. 또한, 생체의 정상 조직 또는 암 조직으로부터 분리된 작은 조직편을, 그대로 세포 덩어리와 마찬가지로 이용할 수도 있다.
생체를 구성하는 체세포로서는, 예를 들면, 피부, 신장, 비장, 부신, 간장, 폐, 난소, 췌장, 자궁, 위, 결장, 소장, 대장, 방광, 전립선, 정소, 흉선, 근육, 결합 조직, 뼈, 연골, 혈관 조직, 혈액, 심장, 눈, 뇌, 신경 조직 등의 임의의 조직으로부터 채취되는 세포 등을 들 수 있으며, 이들에 한정되지 않는다. 체세포로서 보다 구체적으로는, 예를 들면, 섬유아세포, 골수 세포, 면역 세포(예를 들면, B 림프구, T 림프구, 호중구, 매크로파지, 단구 등), 적혈구, 혈소판, 골세포, 골수 세포, 주피 세포, 수상 세포, 표피 각화 세포(케라티노사이트), 지방 세포, 간엽세포, 상피 세포, 표피 세포, 내피 세포, 혈관 내피 세포, 림프관 내피 세포, 간 세포, 췌도 세포(예를 들면, α세포, β세포, δ세포, ε세포, PP 세포 등), 연골 세포, 난구 세포, 글리아 세포, 신경 세포(뉴런), 올리고덴드로사이트, 마이크로글리아, 별아교 세포, 심근 세포, 식도 세포, 근육 세포(예를 들면, 평활근 세포, 골격근 세포 등), 멜라닌 세포, 단핵 세포 등을 들 수 있으며, 이들에 한정되지 않는다.
줄기 세포란, 자기를 복제하는 능력과 다른 복수 계통의 세포로 분화하는 능력을 겸비한 세포이다. 줄기 세포로서는, 예를 들면, 배성 줄기 세포(ES 세포), 배성 종양 세포, 배성 생식 줄기 세포, 인공 다능성 줄기 세포(iPS 세포), 신경 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 간엽계 줄기 세포, 간 줄기 세포, 췌장 줄기 세포, 근육 줄기 세포, 생식 줄기 세포, 장 줄기 세포, 암 줄기 세포, 모낭 줄기 세포 등을 들 수 있으며, 이들에 한정되지 않는다.
전구 세포란, 상기 줄기 세포로부터 특정 체세포 또는 생식 세포로 분화하는 도중의 단계에 있는 세포이다.
암세포란, 체세포로부터 파생하여 무한의 증식 능력을 획득한 세포이며, 주위의 조직에 침윤하거나, 또는 전이를 일으키는 악성 신생물이다. 암세포의 유래가 되는 암으로서는, 예를 들면, 유방암(예를 들면, 침윤성 유관암, 비침윤성 유관암, 염증성 유방암 등), 전립선암(예를 들면, 호르몬 의존성 전립선암, 호르몬 비의존성 전립선암 등), 췌장암(예를 들면, 췌관암 등), 위암(예를 들면, 유두선암, 점액성 선암, 선편평 표피암 등), 폐암(예를 들면, 비소세포 폐암, 소세포 폐암, 악성 중피종 등), 결장암(예를 들면, 소화관 간질 종양 등), 직장암(예를 들면, 소화관 간질 종양 등), 대장암(예를 들면, 가족성 대장암, 유전성 비폴리포시스 대장암, 소화관 간질 종양 등), 소장암(예를 들면, 비호지킨 림프종, 소화관 간질 종양 등), 식도암, 십이지장암, 설암, 인두암(예를 들면, 상인두암, 중인두암, 하인두암 등), 두경부암, 침샘암, 뇌종양(예를 들면, 송과체 성상세포종, 모양세포성 성상세포종, 미만성 성상세포종, 역형성 성상세포종 등), 신경초종, 간암(예를 들면, 원발성 간암, 간외 담관암 등), 신장암(예를 들면, 신장 세포암, 신우와 요관의 이행 상피암 등), 담낭암, 췌장암, 자궁 내막암, 자궁 경부암, 난소암(예, 표피성 난소암, 생식선외 배세포 종양, 난소 배세포 종양, 저악성 난소 종양 등), 방광암, 요도암, 피부암(예를 들면, 안내(눈) 흑색종, 메르켈 세포암 등), 혈관종, 악성 림프종(예를 들면, 세망육종, 림프육종, 호지킨병 등), 멜라노마(악성 흑색종), 갑상선암(예를 들면, 갑상선 수질암 등), 부갑상선암, 비강암, 부비강암, 골종양(예를 들면, 골육종, 유잉 종양, 자궁 육종, 연부 조직 육종 등), 전이성 수아종, 혈관 섬유종, 융기성 피부 섬유 육종, 망막 육종, 음경암, 정소 종양, 소아 고형암(예를 들면, 윌름스 종양, 소아 신장 종양 등), 악성 피부암, 에이즈에 기인하는 악성 피부암, 상악동 종양, 섬유성 조직구증, 평활근 육종, 횡문근 육종, 만성 골수 증식성 질환, 백혈병(예를 들면, 급성 골수성 백혈병, 급성 림프아구성 백혈병 등) 등을 들 수 있으며, 이들에 한정되지 않는다.
또한, 본 명세서에서, 「암」이란, 진단명을 나타낼 때에 사용되며, 「암」이란, 악성 신생물의 총칭을 나타낼 때에도 사용된다.
세포주란, 생체 밖에서의 인위적인 조작에 의해 무한 증식 능력을 획득한 세포이다. 세포주로서는, 예를 들면, HCT116, Huh7, HEK293(인간 태아 신장 세포), HeLa(인간 자궁 경부암 세포주), HepG2(인간 암세포주), UT7/TPO(인간 백혈병 세포주), CHO(차이니즈 햄스터 난소 세포주), MDCK, MDBK, BHK, C-33A, HT-29, AE-1, 3D9, Ns0/1, Jurkat, NIH3T3, PC12, S2, Sf9, Sf21, High Five, Vero 등을 들 수 있으며, 이들에 한정되지 않는다.
또한, 세포는, 세포 현탁액 상태로 흡인되어 봉입되는 것이 바람직하다. 세포 현탁액에 이용되는 배양액으로서는, 세포가 동물세포인 경우, 세포의 생존 증식에 필요한 성분(무기염, 탄수화물, 호르몬, 필수 아미노산, 비필수 아미노산, 비타민) 등을 포함하는 기초 배양액이면 무방하며, 세포의 종류에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 상기 배양액으로서는, 예를 들면, 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco＇s　Modified　Eagle＇s　Medium；DMEM), 최소 필수 배지(Minimum　Essential　Medium; MEM), RPMI-1640, 이글 기본 배지(Basal　Medium　Eagle; BME), 둘베코 변형 이글 배지 Nutrient　Mixture　F-12(DMEM/F-12), 글래스고 최소 필수 배지(Glasgow　Minimum　Essential　Medium; Glasgow MEM) 등을 들 수 있으며, 이들에 한정되지 않는다.
또한, 세균, 효모, 식물세포 및 그들의 단일 세포 또는 복수의 세포로 구성되는 작은 생명 개체의 배양액은, 각각의 생육에 적합한 조성의 배양액을 조제하면 된다.
또한, 본 실시 형태의 세포의 봉입 방법에서, 세포를 현탁시킨 배양액에, 세포외 매트릭스 유래 성분, 생리 활성 물질 등을 혼합하여 주입할 수 있다.
상기 세포 매트릭스 유래 성분으로서는, 상술한 「다공질막」에서 예시된 것과 동일한 것을 들 수 있다.
또한, 상기 생리 활성 물질로서는, 예를 들면, 세포 증식 인자, 분화 유도 인자, 세포 접착 인자 등을 들 수 있으며, 이들에 한정되지 않는다. 예를 들면, 분화 유도 인자를 포함함으로써, 주입하는 세포가 줄기 세포 또는 전구 세포 등인 경우, 그 줄기 세포 또는 전구 세포를 분화 유도하여 원하는 조직을 재현한 다세포 구조체를 구축할 수 있다.
또한, 본 실시 형태의 봉입 방법에서, 세포를 현탁시킨 배양액을 세포 봉입용 디바이스의 용량 가득히 주입할 수 있으며, 또는, 세포 봉입용 디바이스의 용량에 못 미치는 양을 주입할 수도 있다.
세포가 봉입된 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스는, 프레임 부재로부터 제1 관상 부재 및 제2 관상 부재를 떼어내어, 세포가 봉입된 세포 봉입용 디바이스로 만들 수 있다.
얻어진 세포가 봉입된 세포 봉입용 디바이스는, 예를 들면, 세포의 배양, 세포의 운반, 조직형 팁, 기관형 팁, 기관형 팁 시스템 등에 사용할 수 있다.
본 명세서에서, 「조직」이란, 한 종류의 줄기 세포가 분화해 나가는 일정한 계보에 기초한 패턴으로 집합된 구조의 단위를 나타내고, 전체적으로 하나의 역할을 갖는다. 예를 들면, 표피 각화 세포는, 표피의 기저층에 존재하는 줄기 세포가 유극층을 거쳐 과립층을 구성하는 세포로 분화되고, 최종 분화되어 각질층을 형성함으로써, 표피로서의 배리어 기능을 발휘하고 있다. 따라서, 본 실시 형태의 조직형 팁은, 하나의 세포 계보에 유래하는 한 종류의 세포를 포함하여 다세포 구조체를 구축함으로써, 예를 들면, 상피 조직, 결합 조직, 근조직, 신경 조직 등을 재현 할 수 있다.
또한, 본 명세서에서, 「기관」이란, 두 종류 이상의 조직으로 구성되며, 전체적으로 하나의 기능을 담당한다. 따라서, 본 실시 형태의 기관형 팁은, 세포 계보가 다른 적어도 두 종류의 세포를 포함하여 다세포 구조체를 구축함으로써, 예를 들면, 위, 장, 간, 신장 등을 재현할 수 있다.
또한, 본 명세서에서, 「기관계」란, 동일한 기능을 가진 두 개 이상의 기관이나, 전체적으로 일련의 기능을 담당하는 두 개 이상의 기관의 집합을 나타낸다. 따라서, 본 실시 형태의 기관형 팁 시스템은, 조직형 팁 또는 기관형 팁을 복수 조합함으로써, 예를 들면, 소화기계, 순환기계, 호흡기계, 비뇨기계, 생식기계, 내분비계, 감각기계, 신경계, 운동기계, 신경계 등의 기관계를 재현할 수 있다. 한편, 생체는 이들 기관계의 상호 작용에 의해 항상성을 유지하고 있다. 본 실시 형태의 기관형 팁 시스템에서는, 기관계가 다른 기관형 팁을 복수 조합할 수 있기 때문에, 기관계가 다른 기관의 상호 작용을 해석하는 것도 가능하다. 예를 들면, 소장형 팁, 간장형 팁, 신경형 팁의 순서로 연결한 기관형 팁 시스템에서, 소장형 팁에 약제를 첨가한 경우, 소장형 팁에서 흡수된 약제가 간장형 팁에서 대사되어, 간장형 팁에서 배출된 약제의 간 대사물이 신경형 팁에 미치는 독성 등을 해석하는 것이 가능해진다.
실시예
이하, 실시예에 의해 본 발명을 설명하지만, 본 발명은 이하의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
［제조예 1］흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스(비트리겔(등록상표)-실리콘 링-비트리겔(등록상표))의 제작
1. 실리콘 링의 준비
실리콘 시트(에즈원사, 두께： 2mm, 2-9318-01)를 φ13mm×φ8mm의 펀칭날(모리시타 세이한사제)로 구멍을 뚫고, 실리콘 링을 제작하였다. 계속해서, 70% 에탄올에 10분간 침지하고, PBS×3회 세정함으로써 살균하였다.
계속해서, 살균한 실리콘 링에 24G 주사바늘(테루모사제, NN-2432R, 0.55mm×32mm)로 구멍을 뚫고, 겔 로딩 팁(에즈원사, 2-4493-06)을 꽂았다. 180도 대칭측에도 동일하게 24G 주사바늘로 구멍을 뚫고 겔 로딩 팁을 꽂았다.
계속해서, 실리콘 고무 접착용 양면 테이프(Nitto　Denko　Corporation, No. 5302a, 두께： 0.085mm)를 φ12mm×φ8.5mm의 펀칭날(모리시타 세이한사제)로 구멍을 뚫고, 실리콘 링의 양면에 부착하였다. 이때, 양면 테이프의 실리콘 점착제면(박리지：투명측)을 실리콘 링에 부착하였다.
2. 비트리겔(등록상표)의 준비
이하, 「비트리겔(등록상표)」의 「등록상표」라는 기재를 생략할 수 있다. 아크릴 제조 24-웰 플레이트(기시모토 고교사제)의 웰(φ15mm) 내에, φ13mm의 실리콘 코팅 PET 필름(후지모리 고교사제, 두께： 75μm) 지지체를 실리콘 코팅면이 위가 되도록 설치하고, 그 위에 소 유래 네이티브 콜라겐 용액(고켄사제, I-AC, 콜라겐 농도 0.5질량%)과 배양액을 등량 혼합한 0.25%콜라겐 콜로이드 용액을 0.36mL 적하하였다. 계속해서, 콜라겐 콜로이드 용액의 겔화, 유리화, 재수화 및 재유리화를 행한 후, 콜라겐 비트리겔막 건조체가 흡착된 실리콘 코팅 PET 필름을 웰로부터 꺼냈다. 이 일련의 작업을 2회 행함으로써, φ13mm의 실리콘 코팅 PET 필름 지지체를 구비한 콜라겐 비트리겔막 건조체를 2매 제작하였다.
3. 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스(비트리겔-실리콘 링-비트리겔)의 제작
계속해서, 「1.」에서 제작한 양면 테이프를 부착한 실리콘 링에, 「2.」에서 제작한 실리콘 코팅 PET 필름 지지체를 구비한 상태의 콜라겐 비트리겔막 건조체를 부착하였다. 상기 실리콘 링의 반대면에도 마찬가지로 콜라겐 비트리겔막 건조체를 부착하였다.
계속해서, 콜라겐 비트리겔막 건조체로부터 PET 필름을 벗기고, 겔 로딩 팁 두 개 중의 하나를 선단 부분만 남기고 잘라내고, 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스(비트리겔-실리콘 링-비트리겔)를 얻었다.
4. 배양액의 봉입
계속해서, 얻어진 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스(비트리겔-실리콘 링-비트리겔)에 피펫을 장착하였다. 계속해서, 피펫에 장착한 겔 로딩 팁의 선단을 배양액에 대고 흡인하였다(도 4a 참조).
계속해서, 피펫에 장착한 쪽의 겔 로딩 팁을 먼저 떼어냈다. 계속해서, 반대쪽의 겔 로딩 팁의 선단을 떼어내고, 배양액이 봉입된 세포 봉입용 디바이스(비트리겔-실리콘 링-비트리겔)를 얻었다(도 4b 참조).
계속해서, 얻어진 배양액이 봉입된 세포 봉입용 디바이스(비트리겔-실리콘 링-비트리겔)를, 배양액을 웰 내에 포함하는 24-웰 플레이트에 침지하였다(도 4c 참조).
이상으로부터, 세포 봉입용 디바이스(비트리겔-실리콘 링-비트리겔)에 용이하게 배양액을 봉입할 수 있음이 확인되었다. 또한, 세포 봉입용 디바이스(비트리겔-실리콘 링-비트리겔)를 이용함으로써, 세포 현탁액에 대해서도 마찬가지로 용이하게 봉입할 수 있다.
［제조예 2］세포 봉입용 디바이스(비트리겔-실리콘 링-필터)의 제작
1. 실리콘 링의 준비
우선, 제조예 1의 「1.」과 동일한 방법을 이용하여, 실리콘 링을 준비하였다..
2. 비트리겔의 준비
계속해서, 제조예 1의 「2.」와 동일한 방법을 이용하여, φ13mm의 실리콘 코팅 PET 필름(두께 75μm) 지지체를 구비한 콜라겐 비트리겔막 건조체를 1매 제작하였다.
3. 필터의 준비
계속해서, 필터(옴니포어(상표) 멤브레인(수계, 용매계 양용), JHWP4700, 구멍 지름： 0.45μm, 직경： φ47mm)를 펀칭기로 φ11mm로 구멍을 뚫고, 70% 에탄올에 10분간 침투시켜 살균하고, 건조하였다.
4. 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스(비트리겔-실리콘 링-필터)의 제작
계속해서, 「1.」에서 제작한 양면 테이프를 부착한 실리콘 링에, 「2.」에서 제작한 실리콘 코팅 PET 필름 지지체를 구비한 상태의 콜라겐 비트리겔막 건조체를 부착하였다.
계속해서, 콜라겐 비트리겔막 건조체를 부착한 면과는 반대쪽 면에, 「3.」에서 제작한 필터를 부착하였다.
계속해서, 실리콘 코팅 PET 필름(후지모리 고교사제, 두께： 75μm)과 박형 발포체 기재 방수 양면 테이프(Nitto　Denko　Corporation, No. 57210B, 두께： 0.1mm)를 각 1매씩, φ12mm×φ8.5mm의 펀칭날로 구멍을 뚫었다. 얻어진 링 상태의 실리콘 코팅 PET 필름을 70% 에탄올로 살균하였다. 건조한 후, 링 형상의 PET 필름의 실리콘 코팅되어 있지 않은 면과 링 형상의 박형 발포체 기재 방수 양면 테이프를 맞붙였다.
계속해서, 한쪽 면에 비트리겔, 다른 한쪽 면에 필터가 부착된 실리콘 링에서 필터가 부착되어 있는 면 위에, 링 형태의 PET 필름을 양면 테이프가 부착되어 있는 면과 필터가 접촉하도록 부착하였다.
계속해서, 실리콘 코팅 PET 필름(후지모리 고교사제, 두께： 75μm)을 φ16mm의 펀칭날로, 박형 발포체 기재 방수 양면 테이프(Nitto　Denko　Corporation, No. 57210B, 두께： 0.1mm)를 φ12mm×φ8.5mm의 펀칭날로 구멍을 뚫었다. 얻어진 원 형상의 실리콘 코팅 PET 필름을 70% 에탄올로 살균하였다. 건조한 후, 원 형상의 PET 필름의 실리콘 코팅되어 있지 않은 면과 링 형상의 박형 발포체 기재 방수 양면 테이프를 맞붙였다. 이때, 원 형상의 PET 필름의 가능한 한 중앙에 양면 테이프를 부착하였다.
계속해서, 한쪽 면에 비트리겔, 다른 한쪽 면에 필터가 부착되고, 필터 위에 링 형상의 PET 필름을 부착한 실리콘 링에 대하여, 링 형상의 PET 필름의 실리콘 코팅되어 있는 면과, 양면 테이프를 부착한 원 형상의 PET 필름의 양면 테이프가 부착된 면이 접촉하도록 부착하였다.
계속해서, 콜라겐 비트리겔막 건조체로부터 PET 필름을 벗기고, 겔 로딩 팁 두 개 중 하나를 선단 부분만 남기고 잘라내어, 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스(비트리겔-실리콘 링-필터)를 얻었다.
5. 배양액의 봉입
계속해서, 얻어진 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스(비트리겔-실리콘 링-필터)에 피펫을 장착하였다. 계속해서, 피펫에 장착한 겔 로딩 팁의 선단을 배양액에 대고 흡인하였다(도 5a 참조).
계속해서, 피펫에 장착한 쪽의 겔 로딩 팁을 먼저 떼어내었다. 계속해서, 필터면에 부착되어 있는 PET 필름을 벗겼다. 계속해서, 반대측의 겔 로딩 팁의 선단을 떼어내고, 배양액이 봉입된 세포 봉입용 디바이스(비트리겔-실리콘 링-필터)를 얻었다(도 5b 참조).
계속해서, 얻어진 배양액이 봉입된 세포 봉입용 디바이스(비트리겔-실리콘 링-필터)를, 배양액을 웰 내에 포함하는 24-웰 플레이트에 침지하였다(도 5c 참조).
이상으로부터, 세포 봉입용 디바이스(비트리겔-실리콘 링-필터)에 용이하게 배양액을 봉입할 수 있음이 확인되었다. 또한, 세포 봉입용 디바이스(비트리겔-실리콘 링-필터)를 이용함으로써, 세포 현탁액에 대해서도 마찬가지로 용이하게 봉입할 수 있다.
［제조예 3］세포 봉입용 디바이스(필터-실리콘 링-필터)의 제작
1. 실리콘 링의 준비
우선, 제조예 1의 「1.」과 동일한 방법을 이용하여 실리콘 링을 준비하였다.
2. 필터의 준비
계속해서, 필터(옴니포어(상표) 멤브레인(수계, 용매계 양용), JHWP4700, 구멍 지름： 0.45μm, 직경： φ47mm)를 펀칭기로 φ11mm로 2매 구멍을 뚫고, 70% 에탄올에 10분간 침투시켜 살균하고, 건조하였다.
3. 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스(필터-실리콘 링-필터)의 제작
계속해서, 「1.」에서 제작한 양면 테이프를 부착한 실리콘 링의 양면에, 「2.」에서 제작한 필터를 부착하였다.
계속해서, 실리콘 코팅 PET 필름(후지모리 고교사제, 두께： 75μm)과 박형 발포체 기재 방수 양면 테이프(Nitto　Denko　Corporation, No. 57210B, 두께： 0.1mm)를 각 2매씩, φ12mm×φ8.5mm의 펀칭날로 구멍을 뚫었다. 얻어진 링 형상의 실리콘 코팅 PET 필름을 70% 에탄올로 살균하였다. 건조한 후, 링 형상의 PET 필름의 실리콘 코팅되어 있지 않은 면과 링 형상의 박형 발포체 기재 방수 양면 테이프를 맞붙인 것을 2세트 제작하였다.
계속해서, 양면에 필터가 부착된 실리콘 링의 필터가 부착되어 있는 면 위에, 링 형상의 PET 필름을 양면 테이프가 부착되어 있는 면과 필터가 접촉하도록 부착하였다.
계속해서, 실리콘 코팅 PET 필름(후지모리 고교사제, 두께： 75μm)을 φ16mm의 펀칭날 및 박형 발포체 기재 방수 양면 테이프(Nitto　Denko　Corporation, No. 57210B, 두께： 0.1mm)를 φ12mm×φ8.5mm의 펀칭날로 각 2매씩 구멍을 뚫었다. 얻어진 원 형상의 실리콘 코팅 PET 필름을 70% 에탄올로 살균하였다. 건조한 후, 원 형상의 PET 필름의 실리콘 코팅되어 있지 않은 면과 링 형상의 박형 발포체 기재 방수 양면 테이프를 맞붙인 것을 2세트 제작하였다. 이때, 원 형상의 PET 필름의 가능한 한 중앙에 양면 테이프를 부착하였다.
계속해서, 양면에 필터가 부착되고, 필터 위에 링 형상의 PET 필름을 부착한 실리콘 링의 한쪽 면에 대하여, 링 형상의 PET 필름의 실리콘 코팅되어 있는 면과 양면 테이프를 붙인 원 형상의 PET 필름의 양면 테이프가 부착된 면이 접촉되도록 부착하였다.
계속해서, 실리콘 링의 반대쪽 면도 동일하게, 필터, 링 형상의 PET 필름 및φ16mm의 원 형상의 PET 필름의 순서가 되도록 부착하였다.
계속해서, 겔 로딩 팁 두 개 중 하나를 선단 부분만 남기고 잘라내고, 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스(필터-실리콘 링-필터)를 얻었다.
4. 배양액의 봉입
계속해서, 얻어진 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스(필터-실리콘 링-필터)에 피펫을 장착하였다. 계속해서, 피펫에 장착한 겔 로딩 팁의 선단을 배양액에 대고 흡인하였다(도 6a 참조).
계속해서, 피펫에 장착한 쪽의 겔 로딩 팁을 먼저 떼어내었다. 계속해서, 양면의 필터면에 부착되어 있는 PET 필름을 벗겼다. 계속해서, 반대쪽 겔 로딩 팁의 선단을 떼어내고, 배양액이 봉입된 세포 봉입용 디바이스(필터-실리콘 링-필터)를 얻었다(도 6b 참조).
계속해서, 얻어진 배양액이 봉입된 세포 봉입용 디바이스(필터-실리콘 링-필터)를, 배양액을 웰 내에 포함하는 24-웰 플레이트에 침지하였다(도 6c 참조).
이상으로부터, 세포 봉입용 디바이스(필터-실리콘 링-필터)에 용이하게 배양액을 봉입할 수 있음이 확인되었다. 또한, 세포 봉입용 디바이스(필터-실리콘 링-필터)를 이용함으로써, 세포 현탁액에 대해서도 마찬가지로 용이하게 봉입할 수 있다.
［제조예 4］세포 봉입용 디바이스(필터-플라스틱제 링-필터)의 제작
실리콘 링 대신, 플라스틱제 링을 이용한 것 이외에는, 제조예 3과 동일한 방법을 이용하여 세포 봉입용 디바이스(필터-플라스틱제 링-필터)를 제조하였다. 구체적으로는, 세포 봉입용 디바이스는, 스텐레스 구(球)를 마개로 하여 막는 벽면 구멍 통로가 구비된 플라스틱제 링(내경 7.98mm, 외경 13.0mm, 두께 2.0mm)의 양면에, 필터(옴니포어(상표) 멤브레인(수계, 용매계 양용), JHWP4700, 구멍 지름： 0.45μm)를 부착함으로써 제작하였다.
［실시예 1］스페로이드의 제작
제조예 4에서 얻어진 세포 봉입용 디바이스(필터-플라스틱제 링-필터)에 HepG2 세포(인간 간암 세포주)를 봉입하고 10일간 배양하였다. 이에 따라, HepG2 세포의 스페로이드를 제작할 수 있음을 확인하였다(도 7 참조).
본 실시 형태의 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스에 의하면, 간편하게 세포를 봉입할 수 있고, 세포 보호 성능이 뛰어나고 취급도 용이하며, 세포를 장기간 배양할 수 있다.
1a: 제1 관상 부재의 일방의 단부 1b: 제1 관상 부재의 타방의 단부
2a: 제2 관상 부재의 일방의 단부 2b: 제2 관상 부재의 타방의 단부
3: 흡인 수단과의 연결 기구 10: 세포 봉입용 디바이스
10a: 다공질막 10a-1: 상면측의 다공질막
10a-2: 바닥면측의 다공질막 10b: 프레임 부재
11a: 제1 접착제층 11b: 제2 접착제층
11c: 제3 접착제층 11d: 제4 접착제층
12a: 상면측의 기밀성을 가지는 필름
12b: 바닥면측의 기밀성을 가지는 필름
20: 흡인관 20a: 제1 관상 부재
20b: 제2 관상 부재
100, 200, 300, 400: 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스
110: 랙 111: 걸림부
A: 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스 세트

Claims (12)

  1. 　상면 및 바닥면 중 적어도 어느 하나에 다공질막을 구비하고, 측면에 프레임 부재를 구비하고, 세포를 배양하여 이루어지는 다세포 구조체를 구축하기 위한 세포 봉입용 디바이스; 및
    제1 관상 부재 및 제2 관상 부재를 가지는 흡인관;을 구비하고,
    상기 프레임 부재의 외주면에, 상기 제1 관상 부재의 일방의 단부 및 상기 제2 관상 부재의 일방의 단부와 각각 연통된 제1 관통공 및 제2 관통공이 형성되어 있고,
    상기 제1 관상 부재는 그 타방의 단부에 흡인 수단과의 연결 기구를 가지며,
    상기 제2 관상 부재는 그 타방의 단부가 외부에 개구되어 있는, 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 제1 관상 부재와 상기 제2 관상 부재가 상기 세포 봉입용 디바이스를 개재하여 서로 대향하도록 배치되어 있는, 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    배양액에 현탁시킨 다세포를 주입할 수 있으며, 내부 용적이 10mL 이하인, 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 다공질막이 기상중에서 액밀성을 가지고, 액상중에서 반투성을 가지는 반투막인, 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 반투막이 생체 적합성을 가지는 재료를 포함하는, 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 생체 적합성을 가지는 재료가 겔화되는 세포외 매트릭스 유래 성분인, 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 겔화되는 세포외 매트릭스 유래 성분이 네이티브 콜라겐 또는 아테로 콜라겐인, 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    기밀성을 가지는 필름이 상기 다공질막의 외면에 대하여 착탈 가능하게 이루어져 있는, 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 연결 기구가 필터를 가지는, 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 기재된 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스; 및
    상기 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스를 수납하는 랙;을 구비하는, 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스 세트.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 랙이 U자형 걸림부를 가지는, 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스 세트.
  12. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 기재된 흡인관을 구비한 세포 봉입용 디바이스를 이용한, 세포의 봉입 방법.
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