KR102226056B1 - 생체피부와 물리적 및 생물학적으로 유사한 인공 표피층, 인공 진피층 및 이를 포함하는 인공피부 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 생체피부와 유사한 인공 표피층, 인공 진피층 및 이를 포함하는 인공피부에 관한 것으로, 생체피부와 유사한 물성을 갖는 인공 표피층, 생체피부와 유사한 생물학적 특성을 갖는 인공 진피층 및 상기 인공 표피층 및 인공 진피층이 적층된 인공피부를 포함함으로써, 인체 상관성이 높은 인공피부 모델을 제공한다.

Description

생체피부와 물리적 및 생물학적으로 유사한 인공 표피층, 인공 진피층 및 이를 포함하는 인공피부{Epidermis and dermis matrix similar to the real skin and artificial skin comprising the same}
본 발명은 생체피부와 유사한 물성을 갖는 인공 표피층, 생체피부와 유사한 생물학적 특성을 갖는 인공 진피층 및 상기 인공 표피층 및 인공 진피층이 적층된 인공피부에 관한 것이다.
피부는 자외선, 세균과 같은 생물 작용제(biological agent) 뿐만 아니라 화장품, 계면활성제와 같은 화학물질로부터 내부 장기들을 보호하는 장벽의 역할을 하기 때문에 상기 물질들로 인한 염증 및 알레르기, 과민증 등의 반응이 일어날 수 있다. 상기와 같은 이유로 화장품이나 피부에 사용하는 약물개발 후에는 이들에 대한 유효성 및 안전성 평가가 필요로 하게 되며, 현재 상용되고 있는 평가법은 쥐나 토끼와 같은 동물을 이용한 동물 실험법이다.
하지만, 최근 동물윤리를 강조하는 시대적 흐름과 실제 사람과 동물의 피부 사이 차이점에 의한 다수의 실패사례들로 인하여 인간의 피부조직을 모사하는 체외 평가 플랫폼에 대한 많은 연구들이 진행되어 왔고 다양한 피부 모델이 개발되어 상용화되고 있다[F. Groeber et al, Advanced drug delivery reviews 63(4), 352-366 (2011), C.M. Reijnders et al, Tissue engineering. Part A 21(17-18), 2448-59 (2015)].
인간의 피부는 크게 표피층과 진피층으로 구성되어 있다. 상기 표피층은 피부의 바깥쪽을 구성하고 있는 얇은 층으로서(약 90 ㎛), 각질층, 투명층, 과립층, 유극층, 기저층으로 구성되어 있으며, 분화하는 세포인 케라틴세포(keratinocyte)로 이루어져 있는데 이들은 외부 환경으로부터 피부를 보호하기 위해 세포들을 계속 새로운 세포로 교체해준다.
상기 표피층 아래에 위치하는 진피층은 콜라겐과 같은 세포외기질이 표피의 15~40배 정도로 두꺼운 층(약 1500 ㎛)으로 형성되어 있으며 혈관, 신경과 같은 다양한 구조물들을 포함하고 있다. 이러한 구조적 특징을 가짐에도 불구하고 대부분의 모델이 진피층을 구성하는 섬유아세포(fibroblast) 또는 표피층을 구성하는 케라틴세포(keratinocyte)를 이용한 2차원적 배양이거나 표피 또는 진피 일부만을 모사하고 있기 때문에 실제 생체피부와는 많은 차이를 보이고 있다.
이에, 본 발명에서는 이러한 한계점을 개선하기 위하여 실제 생체피부의 특징적 구조를 바탕으로 예의 연구 노력한 결과, 표피층과 유사한 구조와 물성을 갖는 고분자를 이용한 다공성 구조의 멤브레인과 진피층과 유사한 물리적, 생물학적 특성을 갖는 하이드로겔로 이루어진 3차원 조직을 복합화시킨 표피층 및 진피층 모사 플랫폼을 완성하였다.
대한민국 등록특허 제1874790호 대한민국 등록특허 제1846138호
본 발명의 목적은 생체피부와 유사한 물성을 갖는 인공 표피층을 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 생체피부와 유사한 생물학적 특성을 갖는 인공 진피층을 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 표피층 및 진피층을 포함하여 인체 상관성이 높은 인공피부를 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 인공피부를 제조하는 방법을 제공하는데 있다.
상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 생체피부와 유사한 인공 표피층은 전기방사된(electrospun) 다공성의 생분해성 고분자; 상기 생분해성 고분자에 코팅된 콜라겐 코팅층; 및 상기 콜라겐 코팅층 상에 케라틴세포(keratinocyte)로 배양된 각질층;을 포함할 수 있다.
상기 케라틴세포의 농도는 1X105 내지 5X106 cells/cm2일 수 있으며, 상기 케라틴세포는 32 내지 39 ℃에서 7 내지 28일 동안 배양된 것일 수 있다.
상기 전기방사된 생분해성 고분자의 두께는 50 내지 120 ㎛일 수 있다.
상기 생분해성 고분자는 폴리카프로락톤(PCL), 락티드, 폴리글리콜산(PGA), 폴리(D,L-락트산-co-글리콜산)(poly(D,Llactide-co-glycolide); PLGA), 디올/이에시드계 지방족 폴리에스테르, 폴리에스테르-아미드/폴리에스테르-우레탄, 폴리(발레로락톤), 폴리(하이드록시 부티레이트), 폴리(하이드록시 발레레이트), 폴리안하이드리드, 폴리오르토에스터(polyorthoesters), 폴리비닐알콜, 폴리에틸렌글리콜, 폴리우레탄, 폴리아크릴산 및 폴리-N-이소프로필아크릴아미드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 생분해성 고분자는 유기용매에 용해되어 전기방사되는 것일 수 있다.
상기 유기용매는 헥사플루오루이소프로판올(Hexafluoroisopropanol), THF(tetrahydrofuran), DMF(dimethylformamide), DMSO(dimethylsulfoxide), 클로로포름, 디클로로메탄, 헥산, 디에틸에테르 및 아세토니트릴로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 전기방사는 방사거리 15 내지 20 cm, 인젝션 속도 1 내지 10 ml/h 및 전압 5 내지 15 kV의 조건으로 수행될 수 있다.
상기 생분해성 고분자는 전기방사 후 산소플라즈마로 후처리될 수 있다.
또한, 상기한 다른 목적을 달성하기 위한 본 발명의 생체피부와 유사한 인공 진피층은 콜라겐을 포함하는 하이드로겔에 섬유아세포 및 내피세포를 인캡슐레이션시켜 인공혈관이 형성된 것일 수 있다.
상기 하이드로겔은 콜라겐과, 피브린, 헤파린, 카테콜 및 키토산으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 추가성분이 1 : 0.5-3의 중량비로 혼합된 것일 수 있다.
상기 콜라겐과, 상기 추가성분이 혼합된 혼합물의 농도는 1 내지 10 mg/ml일 수 있다.
상기 섬유아세포 및 내피세포는 1 : 0.2-5의 중량비로 혼합될 수 있다.
상기 인캡슐레이션된 섬유아세포 및 내피세포가 혼합된 혼합세포의 농도는 1X106 내지 9X107 cells/ml일 수 있다.
또한, 상기한 또 다른 목적을 달성하기 위한 본 발명의 생체피부와 유사한 인공피부는 콜라겐을 포함하는 하이드로겔에 섬유아세포 및 내피세포를 인캡슐레이션시켜 인공혈관이 형성된 진피층; 및 상기 진피층 상면에 형성되며, 전기방사(electrospinning)된 다공성의 생분해성 고분자에 코팅된 콜라겐 상에 케라틴세포로 배양된 각질층이 형성된 표피층;을 포함할 수 있다.
또한, 상기한 또 다른 목적을 달성하기 위한 본 발명의 인공피부의 제조방법은 (A) 생분해성 고분자를 전기방사(electrospinning)시켜 다공성 구조의 멤브레인을 형성하는 단계; (B) 상기 멤브레인의 표면을 콜라겐으로 코팅시키는 단계; (C) 상기 콜라겐이 코팅된 멤브레인 위에서 케라틴세포(keratinocyte)를 배양하여 각질층을 형성시킴으로써 표피층을 수득하는 단계; (D) 콜라겐을 포함하는 하이드로겔 상에 섬유아세포 및 내피세포를 인캡슐레이션시켜 적층시킴으로써 인공혈관이 형성된 진피층을 형성하는 단계; (E) 상기 표피층에서 배양된 면과 상기 진피층의 하이드로겔이 서로 맞닿도록 적층시키는 단계; 및 (F) 상기 진피층과 표피층이 적층된 인공피부를 겔화시키는 단계;를 포함할 수 있다.
상기 (F)단계 이후에, (G) 상기 겔화된 인공피부에 저장층을 형성하고 상기 저장층에 미디어를 투입한 다음 인공피부를 완전히 겔화시키는 단계; (H) 상기 겔화된 진피층 내부에 채널을 형성한 후 내피세포를 첨가하여 상기 채널을 코팅시키는 단계; (I) 상기 저장층에 배양액을 채우고 배양하는 단계;를 포함할 수 있다.
상기 내피세포는 1X106 내지 9X107 cells/ml의 농도로 첨가될 수 있다.
또한, 상기한 또 다른 목적을 달성하기 위한 본 발명의 생체피부와 유사한 인공피부는 콜라겐과, 피브린, 헤파린, 카테콜 및 키토산으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 추가성분이 1 : 0.5-3의 중량비로 혼합된 혼합물을 1 내지 10 mg/ml의 농도로 함유하는 하이드로겔에 섬유아세포 및 내피세포가 1 : 0.2-5의 중량비로 혼합된 혼합세포를 1X106 내지 9X107 cells/ml의 농도로 인캡슐레이션시켜 인공혈관이 형성된 진피층; 및 상기 진피층 상면에 형성되며, 두께가 50 내지 120 ㎛인 전기방사된 다공성의 생분해성 고분자를 산소플라즈마로 처리하고 콜라겐을 코팅시킨 표피층;을 포함하되,
상기 표피층은 콜라겐이 코팅된 생분해성 고분자 위에 케라틴세포를 1 X 105 내지 5 X 106 cells/cm2의 농도로 첨가하여 32 내지 39 ℃에서 15 내지 25일 동안 배양한 것이며, 상기 전기방사는 방사거리 15 내지 20 cm, 인젝션 속도 1 내지 10 ml/h 및 전압 5 내지 15 kV의 조건으로 수행될 수 있다.
본 발명의 인공 표피층은 각질층을 포함하고 있으므로 동물실험 대체 화장품 체외 평가 플렛폼 및 창상피복제 평가 플렛폼 등으로 이용할 수 있다.
또한, 본 발명의 인공 진피층은 인공혈관 조직을 포함하므로 피부질환 모델 유도를 통한 신약 스크리닝 및 화상 치료제 평가 플렛폼 등에 이용할 수 있다.
또한, 본 발명의 인공피부는 생체피부와 유사한 물리적, 생물학적 특성을 가지고 있을 뿐만 아니라 인공혈관 조직을 가지고 있으므로 생착률과 재생율이 향상된 상처드레싱 및 이식피부로 활용이 가능하다. 또한, 신약 개발 시 복합적인 스크리닝 용도로 사용이 가능할 뿐만 아니라, 피부 미백 검증, 피부 노화 검증 또는 피부 자극 검증용 등으로 사용될 수도 있다.
또한, 본 발명의 인공피부는 실제 생체피부와 유사한 조직을 갖고 있으므로 조직적 변형으로 인한 생리적 변형이나 부작용을 최소화할 수 있다.
도 1은 본 발명의 실시예 1 내지 9에 따라 제조된 인공 표피층에 구비된 각질층을 나타낸 형광이미지이다.
도 2는 본 발명의 실시예 1 내지 9에 따라 제조된 인공 표피층에 구비된 각질층을 TUNEL assay로 수행한 단면 이미지이다.
도 3a는 본 발명의 실시예에 따라 제조된 인공 표피층에 이용된 멤브레인의 표면 및 단면을 SEM으로 촬영한 사진이며, 도 3b는 도 3a의 멤브레인의 표면을 콜라겐으로 코팅한 멤브레인의 형광이미지이고, 도 3c는 콜라겐으로 코팅된 멤브레인에 케라틴세포를 5일 동안 배양한 표면과 단면을 촬영한 형광이미지이다.
도 4A는 본 발명의 인공 진피층에 이용되는 하이드로겔의 형태를 나타낸 사진이며, 도 4B는 본 발명의 인공 진피층에 이용되는 하이드로겔의 탄성율을 나타낸 그래프이고, 도 4C는 상기 도 4B를 수치로 나타낸 표이다.
도 5A는 제조예에서 제조된 인공 진피층 조직 내에서 섬유아세포(HDFs)의 세포 생존능을 보여주는 형광이미지이며 (green = live cells, red = dead cells), 도 5B는 상기 도 5A의 세포 생존능을 정량적으로 나타낸 그래프이다.
도 6A는 본 발명의 실시예에 따라 제조된 인공 진피층의 인공혈관 형성 정도를 나타낸 형광 이미지이며(배양 1일), 도 6B는 본 발명의 실시예에 따라 제조된 인공 진피층의 인공혈관 형성 정도를 나타낸 형광 이미지이고(배양 4일), 도 6C는 본 발명의 실시예에 따라 제조된 인공 진피층의 인공혈관 형성 정도를 나타낸 형광 이미지이며(배양 7일), 도 6D는 상기 도 6C에서 관찰된 인공혈관의 길이를 측정한 그래프이고, 도 6E는 상기 도 6C에서 관찰된 인공혈관의 면적을 측정한 그래프이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따라 인공피부를 제조하는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 8a는 본 발명의 실시예에 따라 제조된 인공피부의 인공혈관화 조직(RFP-HUVECs), 진피층(HDF) 및 표피층(HaCaT)을 보여주는 형광이미지이며, 도 8b는 본 발명의 실시예에 따라 제조된 인공피부의 단면적을 보여주는 형광이미지이다.
도 9A는 본 발명의 실시예에 따라 제조된 인공피부에 FITC-Toner를 처리한 단면을 나타낸 이미지이고, 도 9B는 본 발명의 실시예에 따라 제조된 인공피부에 FITC-Toner를 처리한 후 FITC-Toner의 투과 깊이를 나타낸 이미지이다.
본 발명은 생체피부와 유사한 물성을 갖는 인공 표피층, 생체피부와 유사한 생물학적 특성을 갖는 인공 진피층 및 상기 인공 표피층과 인공 진피층이 적층된 인공피부에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
인공 표피층
본 발명의 인공 표피층은 전기방사된(electrospun) 다공성의 생분해성 고분자; 상기 생분해성 고분자에 코팅된 콜라겐 코팅층; 및 상기 콜라겐 코팅층 상에 케라틴세포(keratinocyte)로 배양된 각질층;을 포함하여 형성된다. 특히, 본 발명의 인공 표피층은 전기방사된 다공성의 생분해성 고분자를 이용하여 생체피부와 유사한 물성을 모사하고, 각질층을 이용하여 생체피부와 유사한 생물학적 특성을 모사한다.
상기 인공 표피층은 생분해성 고분자를 특정한 조건의 전기방사로 처리하여 두께가 50 내지 120 ㎛, 바람직하게는 80 내지 100 ㎛가 되도록 얇고 공극의 크기도 작은 다공성의 멤브레인을 제조함으로써 실제 표피층의 조밀한 구조를 모사한다. 이때 공극의 평균입경은 0.01 내지 0.04 mm이다.
상기 생분해성 고분자는 유기용매에 용해되어 전기방사되는데, 이때 유기용매로는 헥사플루오루이소프로판올(Hexafluoroisopropanol), THF(tetrahydrofuran), DMF(dimethylformamide), DMSO(dimethylsulfoxide), 클로로포름, 디클로로메탄, 헥산, 디에틸에테르 및 아세토니트릴로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용하는 것이 원하는 두께 및 공극크기를 갖는 멤브레인을 제조하는데 바람직하다.
상기 전기방사는 방사거리 15 내지 20 cm, 바람직하게는 16 내지 18 cm; 인젝션 속도 1 내지 10 ml/h, 바람직하게는 2 내지 5 ml/h; 및 전압 5 내지 15 kV, 바람직하게는 8 내지 12 kV의 조건으로 수행한다. 전기방사 시 방사거리, 인젝션 속도 및 전압이 상기 바람직한 범위의 하한치 미만인 경우에는 다공성 구조로 멤브레인이 형성되지 않을 뿐만 아니라 실제 피부를 모사할 수 있을 장도로 두께도 얇게 형성되지 않을 수 있으며, 상기 상한치 초과인 경우에는 경도가 낮은 멤브레인이 제공될 뿐만 아니라 공극의 크기가 커져 실제 표피층의 구조를 모사할 수 없다.
본 발명에 따른 생분해성 고분자는 전기방사로 처리된 후 산소플라즈마로 처리함으로써 표면의 활성 증가로 인하여 케라틴세포의 부착 정확성, 케라틴세포의 부착량 증가 및 부착 유지 시간이 증가된다. 상기 생분해성 고분자를 전기방사로 처리하지 않고 바로 산소플라즈마로 처리하는 경우에는 케라틴세포의 부착률이 전기방사 후 산소플라즈마로 처리한 경우보다 낮으며 실제 피부와 달리 뻣뻣해지고 표피층에 케라틴세포가 배양되지 않을 수 있다.
또한, 상기 전기방사가 처리되거나 전기방사 후 산소플라즈마로 처리된 생분해성 고분자의 표면에 콜라겐을 코팅시켜 케라틴세포의 부착률을 향상시킨다. 상기 콜라겐은 EDC/NHS 화학적 방법으로 코팅되는데, 구체적으로 N-하이드록시숙신이미드(NHS)의 존재하에서 N-(3-디메틸아미노프로필)-N-에틸카보디이미드 하이드로클로라이드(EDC)를 사용함으로써 화학적으로 코팅된다.
상기 콜리겐이 코팅된 생분해성 고분자 상면에 케라틴세포를 1X105 내지 5X106 cells/cm2, 바람직하게는 7X105 내지 2X106 cells/ml의 농도로 첨가하여 배양시킨다. 케라틴세포의 농도가 바람직한 범위를 벗어나는 경우에는 각질층이 형성되지 않아 실제 표피층과 생물학적으로 유사한 인공 표피층을 형성할 수 없다.
또한, 상기 케라틴세포는 32 내지 39 ℃, 바람직하게는 35 내지 37 ℃에서 7 내지 28일, 바람직하게는 21 내지 28일 동안 배양된다. 케라틴세포의 배양온도 및 시간이 상기 바람직한 범위의 하한치 미만인 경우에는 각질층이 형성되지 않을 수 있으며, 상기 상한치 초과인 경우에는 각질층이 쉽게 탈락될 수 있다.
상기 생분해성 고분자로는 폴리카프로락톤(PCL), 락티드, 폴리글리콜산(PGA), 폴리(D,L-락트산-co-글리콜산)(poly(D,Llactide-co-glycolide); PLGA), 디올/이에시드계 지방족 폴리에스테르, 폴리에스테르-아미드/폴리에스테르-우레탄, 폴리(발레로락톤), 폴리(하이드록시 부티레이트), 폴리(하이드록시 발레레이트), 폴리안하이드리드, 폴리오르토에스터(polyorthoesters), 폴리비닐알콜, 폴리에틸렌글리콜, 폴리우레탄, 폴리아크릴산 및 폴리-N-이소프로필아크릴아미드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 들 수 있으며, 바람직하게는 폴리카프로락톤(PCL)과 폴락티드의 혼합물일 수 있고, 더욱 바람직하게는 폴리카프로락톤(PCL)과 락티드 1 : 1-5의 중량비로 혼합된 혼합물일 수 있으며, 보다 바람직하게는 폴리카프로락톤(PCL)과 락티드 1 : 1-2의 중량비로 혼합된 혼합물일 수 있다. 본 발명에 따른 생분해성 고분자가 상기 보다 바람직한 범위를 만족하는 경우에는 원하는 두께 및 공극크기를 갖는 멤브레인을 제조할 수 있으며, 이에 따라 실제 표피층과 유사한 조직, 물성 및 생물학적 특성을 갖는 표피층 모사체를 제공할 수 있다.
인공 진피층
본 발명의 인공 진피층은 콜라겐을 포함하는 하이드로겔에 사람의 진피를 구성하는 섬유아세포 및 혈관을 형성하는 내피세포를 인캡슐레이션시켜 인공혈관이 형성된 것이다.
상기 하이드로겔은 콜라겐과, 피브린, 헤파린, 카테콜 및 키토산으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이 1 : 0.5-3의 중량비, 바람직하게는 1 : 1-2의 중량비로 혼합된 것이다. 콜라겐을 기준으로 피브린, 헤파린, 카테콜 및 키토산으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 함량이 상기 바람직한 범위의 하한치 미만인 경우에는 실제 진피층과 유사한 물성과 생물학적 특성을 발휘할 수 없으며, 상기 상한치 초과인 경우에는 실제 진피층에 비하여 물성이 저하될 수 있다.
상기 콜라겐과, 피브린, 헤파린, 카테콜 및 키토산으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 추가성분이 혼합된 혼합물의 농도는 1 내지 10 mg/ml, 바람직하게는 3 내지 5 mg/ml이다. 혼합물의 농도가 상기 바람직한 범위의 하한치 미만인 경우에는 실제 진피층과 유사한 물성의 진피층을 수득할 수 없으며, 상기 상한치 초과인 경우에는 진피층 내에 함유된 진피형성 세포의 생존이 어려울 수 있다.
상기 섬유아세포는 상기 하이드로겔과의 함께 사용되어 실제 진피층과 유사한 물리적, 생물학적 특성을 발휘할 수 있으며, 상기 내피세포는 인공혈관을 형성하여 장기적으로 세포 생존능을 확보하고 섬유아세포와 함께 사용되어 생물학적 특성을 더욱 발휘할 수 있다.
상기 섬유아세포 및 내피세포는 함께 인캡슐레이션되어 상기 하이드로겔 위에 적층된다. 섬유아세포 및 내피세포는 1 : 0.2-5의 중량비, 바람직하게는 1 : 0.3-3의 중량비로 혼합되어 인캡슐레이션된다. 섬유아세포를 기준으로 내피세포의 상기 바람직한 범위를 벗어나는 경우에는 혈관이 형성되지 않고, 인공 진피층의 수축을 억제하지 못하여 모델의 안정성을 확보하지 못함으로써 조직적 변형으로 인한 생리적인 변형이나 부작용을 최소화할 수 없을 뿐만 아니라 알레르기 반응과 같은 부작용이 크다.
본 발명의 인공 진피층은 최초 진피층 단면적 100%를 기준으로 단면적 감소율이 25% 이하, 바람직하게는 15% 이하, 더욱 바람직하게는 11% 이하이며, 이는 더 안정적으로 오랜 시간 동안 생체 외에서 배양을 가능하게 할 뿐만 아니라 창상 치유를 위해 생체 내에 적용되었을 때 흉터를 억제할 수 있다.
또한, 상기 인캡슐레이션된 섬유아세포 및 내피세포가 혼합된 혼합세포의 농도는 1X106 내지 9X107 cells/ml, 바람직하게는 2X106 내지 9X106 cells/ml이다. 혼합세포의 농도가 상기 바람직한 범위를 벗어나는 경우에는 혈관형성이 촉진되지 않으며, 제제 침입도 수준(penetration level)이 낮을 뿐만 아니라, 이식피부로 이용 시 상처부위의 혈액공급이 원활하지 않고 실제 피부에 유착이 어려울 수 있다.
또한, 본 발명은 섬유아세포 및 내피세포를 1 : 1-3의 중량비로 혼합하고 상기 혼합된 혼합세포의 농도가 2X106 내지 9X106 cells/ml 이어야만 혈관화가 가능하다.
본 발명의 인공피부는 상기 표피층 및 진피층을 포함하여 형성된다.
또한, 본 발명은 생체피부와 물성이 유사한 인공피부를 제조하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 인공피부를 제조하는 방법은 (A) 생분해성 고분자를 전기방사(electrospinning)시켜 다공성 구조의 멤브레인을 형성하는 단계; (B) 상기 멤브레인의 표면을 콜라겐으로 코팅시키는 단계; (C) 상기 콜라겐이 코팅된 멤브레인 위에서 케라틴세포를 배양하여 각질층을 형성시킴으로써 표피층을 수득하는 단계; (D) 콜라겐을 포함하는 하이드로겔 상에 섬유아세포 및 내피세포를 인캡슐레이션시켜 적층시킴으로써 인공혈관이 형성된 진피층을 형성하는 단계; (E) 상기 표피층에서 배양된 면과 상기 진피층의 하이드로겔이 서로 맞닿도록 적층시키는 단계; 및 (F) 상기 진피층과 표피층이 적층된 인공피부를 겔화시키는 단계;를 포함한다.
또한 상기 (F)단계 이후에, (G) 상기 겔화된 인공피부에 저장층을 형성하고 상기 저장층에 미디어를 투입한 다음 인공피부를 완전히 겔화시키는 단계; (H) 상기 겔화된 진피층 내부에 채널을 형성한 후 내피세포를 첨가하여 상기 채널을 코팅시키는 단계; (I) 상기 저장층에 배양액을 채우고 배양하는 단계;를 포함할 수 있다.
먼저, 상기 (A) 및 (B)단계에서는 생분해성 고분자를 유기용매에 용해시킨 후 전기방사(electrospinning)시켜 두께가 얇은 다공성 구조의 멤브레인을 형성시킨 후 상기 멤브레인을 산소플라즈마로 처리한 다음 멤브레인의 표면을 콜라겐으로 코팅시킨다.
다음으로, 상기 (C)단계에서는 상기 콜라겐이 코팅된 멤브레인 위에 케라틴세포를 뿌리고 32 내지 39 ℃에서 7 내지 28일 동안 배양하여 각질층을 형성시킴으로써 표피층을 수득한다.
다음으로, 상기 (D)단계에서는 콜라겐과, 피브린, 헤파린, 카테콜 및 키토산으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이 포함된 하이드로겔 상에 인캡슐레이션된 섬유아세포 및 내피세포가 혼합된 혼합세포를 적층시켜 진피층을 형성한다.
다음으로, 상기 (E) 및 (F)단계에서는 상기 표피층에서 배양된 면과 상기 진피층의 하이드로겔이 서로 맞닿도록 적층시킨 후 35 내지 40 ℃에서 10 내지 50분 동안 겔화시킨다.
다음으로, 상기 (G) 및 (H)단계에서는 상기 겔화된 인공피부에 저장층을 형성하고 상기 저장층에 미디어를 투입한 다음 35 내지 40 ℃에서 20 내지 26시간 동안 겔화시켜 인공피부를 완전히 겔화시킨 후 상기 겔화된 진피층 내부에 채널을 형성하고 상기 채널에 농도가 1X106 내지 9X107 cells/ml, 바람직하게는 6X106 내지 9X106 cells/ml인 내피세포를 첨가하여 0.5 내지 2시간 동안 회전시킴으로써 상기 채널에 내피세포를 코팅시킨 후 상기 저장층에 배양액을 채우고 35 내지 40 ℃에서 20 내지 26시간 동안 배양한다.
특히, 본 발명의 인공피부는 콜라겐과, 피브린, 헤파린, 카테콜 및 키토산으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 추가성분이 1 : 0.5-3의 중량비로 혼합된 혼합물을 1 내지 10 mg/ml의 농도로 함유하는 하이드로겔에 섬유아세포 및 내피세포가 1 : 0.2-5의 중량비로 혼합된 혼합세포를 1X106 내지 9X107 cells/ml의 농도로 인캡슐레이션시킨 진피층; 및 상기 진피층 상면에 형성되며, 두께가 50 내지 120 ㎛인 전기방사된 다공성의 생분해성 고분자를 산소플라즈마로 처리하고 콜라겐을 코팅시킨 표피층;을 포함하되,
상기 표피층은 콜라겐이 코팅된 생분해성 고분자 위에 표피세포를 1X107 내지 9X108 cells/ml의 농도로 첨가하여 배양한 것이며, 상기 전기방사는 방사거리 15 내지 20 cm, 인젝션 속도 1 내지 10 ml/h 및 전압 5 내지 15 kV의 조건으로 수행하는 것으로서, 상기 모든 조건을 동시에 만족하는 경우에는 상기 모든 조건을 동시에 만족하지 않거나 상기 모든 조건 중 일부분만 만족하는 경우에 비하여 실제 피부와 더욱 유사한 생물학적 특성을 발휘할 수 있으며, 실제 피부 구조와 더욱 유사하므로 인체 상관성이 더욱 향상되어 실험에 이용 시 더욱 정확한 결과를 도출할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범주 및 기술사상 범위 내에서 다양한 변경 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연한 것이다.
[인공 표피층]
실시예 1 내지 9: 인공 표피층 제조
락티드(L-Lactide)와 ε-Caprolactone의 중량비가 50:50인 PLCL을 1,1,1,3,3,3-Hexafluoroisopropanol(HFIP)에 9 중량%로 용해시킨 후 방사거리 18 cm, 인젝션 속도 3 ml/h, 전압 9 kV의 조건으로 전기방사하여 100 ㎛ 두께의 멤브레인을 제작하고 이를 1 X 1cm 사이즈로 절단하였다. 상기 제조된 멤브레인에 산소 플라즈마 처리(CUTE-B system, FEMTO Science, Korea)를 해준 후 EDC/NHS 화학적 방법을 이용하여 공유결합으로 collagen type I을 코팅하였다(ccPLCL-NFM). 상기 콜라겐이 코팅된 멤브레인 위에 케라틴세포인 HaCaT cells을 각각 4X105 cells/cm2, 7X105 cells/cm2 및 10X105 cells/cm2의 농도로 씨드(seeding)해준 후 각각 1, 2 및 3주 동안 37 ℃에서 인큐베이터로 배양하여 각질층을 형성함으로써 각질층이 구비된 인공 표피층을 수득하였다.
시험예 1: 인공 표피층에 구비된 각질층의 형광이미지 및 TUNEL 분석 이미지
도 1은 본 발명의 실시예 1 내지 9에 따라 제조된 인공 표피층에 구비된 각질층을 나타낸 형광이미지이며, 도 2는 본 발명의 실시예 1 내지 9에 따라 제조된 인공 표피층에 구비된 각질층을 TUNEL assay로 수행한 단면 이미지이다.
도 1 및 도 2에 도시된 바와 같이, HaCaT cells의 농도가 증가할수록 ccPLCL-NFM에 부착된 HaCaT cells 세포의 수가 많으며 증식도 많이 되는 것을 확인하였으며, 3주 배양 시 HaCaT cells 세포로 부터 죽은 세포층인 각질층이 형성되는 것을 확인하였다. 1, 2주 배양 시에는 각질층이 형성되지 않았다.
본 발명에서는 HaCaT cells을 10X105 cells/cm2의 농도로 씨드하여 3주 동안 배양시 원하는 각질층을 수득할 수 있다는 것을 확인하였다.
시험예 2: SEM 촬영
도 3a는 본 발명의 실시예에 따라 제조된 인공 표피층에 이용된 멤브레인의 표면 및 단면을 SEM으로 촬영한 사진이며, 도 3b는 도 3a의 멤브레인의 표면을 콜라겐으로 코팅한 멤브레인의 형광이미지이고, 도 3c는 콜라겐으로 코팅된 멤브레인에 케라틴세포를 5일 동안 배양한 표면과 단면을 촬영한 형광이미지이다.
도 3a 내지 도 3c에 도시된 바와 같이, 본 발명의 인공 표피층에 이용된 멤브레인은 다공성이며, 두께가 사람의 표피층과 유사한 100 ㎛로 제조된 것을 확인하였으며, 콜라겐이 코팅된 멤브레인의 전면 및 내부 전체에 걸쳐 케라틴세포가 배양된 것을 확인하였다.
[인공 진피층]
제조예 1 내지 6: 인공 진피층 제조(내피세포 생략)
500 ㎛ 직경의 관 2개를 꽂은 PDMS 칩에 각각 3 mg/ml 및 5 mg/ml 농도의 콜라겐과 피브린을 25:75의 중량비, 50:50의 중량비 및 75:25의 중량비(콜라겔:피브린)로 혼합한 후 피부 섬유아세포인 HDF를 1X106 cells/ml의 농도로 인캡슐레이션(encapsulation)시켜 탄성율을 측정하고, 이를 1 및 7일 동안 37 ℃에서 배양시켜 세포 생존능을 확인하였다.
시험예 3: 하이드로겔의 탄성율 측정
도 4A는 진피층에 이용되는 하이드로겔의 형태를 나타낸 사진이며, 도 4B는 진피층에 이용되는 하이드로겔의 탄성율(universal testing machine (UTM)을 사용)을 나타낸 그래프이고, 도 4C는 상기 도 4B를 수치로 나타낸 표이다. *는 collagen50/fibrin50 그룹에 대한 p< 0.05, **는 collagen50/fibrin50 그룹에 대한 p< 0.001임을 나타낸다.
도 4A 내지 도 4C에 나타낸 바와 같이, 하이드로겔의 형태 및 탄성율은 3 mg/ml 및 5 mg/ml 농도의 콜라겐과 피브린을 50:50의 중량비 및 75:25의 중량비로 혼합한 것이 우수한 것을 확인하였다.
시험예 4: 하이드로겔의 세포 생존능 측정
도 5A는 제조예에서 제조된 진피층 조직 내에서 섬유아세포(HDFs)의 세포 생존능을 보여주는 형광이미지이며 (green = live cells, red = dead cells), 도 5B는 상기 도 5A의 세포 생존능을 정량적으로 나타낸 그래프이다. Scale bar = 50 ㎛. *는 collagen 50/fibrin 50, day 1그룹에 대한 p< 0.05, ＋는 collagen 50/fibrin 50, day 7그룹에 대한 p< 0.05, ＋＋는 collagen 50/fibrin 50, day 7 그룹에 대한 p< 0.001임을 나타낸다.
도 5A 내지 도 5B에 나타낸 바와 같이, 3 mg/ml 농도의 콜라겐과 피브린을 50:50의 중량비 조건에서 섬유아세포의 생존율이 1일과 7일 배양 후에도 90%이상 유지되는 것을 확인하였다.
즉, 3 mg/ml 농도의 콜라겐과 피브린을 50:50의 중량비로 혼합한 하이드로겔이 우수한 것을 확인하였다.
상기 제조예에서 제조된 진피층에는 혈관화가 관찰되지 않았다.
실시예 10 내지 18: 인공 진피층 제조(내피세포 포함)
500 ㎛ 직경의 관 2개를 꽂은 PDMS 칩에 3 mg/ml 농도의 콜라겐/피브린 하이드로겔(콜라겔:피브린 = 50:50의 중량비)에 Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit로 태깅한 피부 섬유아세포인 HDF와 내피세포의 한 종류인 red fluorescent protein expressing human umbilical vein endothelial cells(RFP-HUVECs)을 25:75의 중량비, 50:50의 중량비 및 75:25의 중량비(HDF:RFP-HUVECs)로 2X106 cells/ml농도가 되도록 인캡슐레이션(encapsulation)시키고 1, 4 및 7일 동안 배양시켰다.
시험예 5: 진피층 조직 내의 혈관형성능 측정
도 6A는 본 발명의 실시예에 따라 제조된 진피층의 인공혈관 형성 정도를 나타낸 형광 이미지이며(배양 1일), 도 6B는 본 발명의 실시예에 따라 제조된 진피층의 인공혈관 형성 정도를 나타낸 형광 이미지이고(배양 4일), 도 6C는 본 발명의 실시예에 따라 제조된 진피층의 인공혈관 형성 정도를 나타낸 형광 이미지이며(배양 7일), 도 6D는 상기 도 6C에서 관찰된 인공혈관의 길이를 측정한 그래프이고, 도 6E는 상기 도 6C에서 관찰된 인공혈관의 면적을 측정한 그래프이다. red = 내피세포(HUVECs), green = 섬유아세포(HDFs), Scale bar = 200 ㎛. *는 p < 0.05, **는 p < 0.001임을 나타낸다. Isolated branch는 미성숙 혈관 구조, segment는 성숙한 혈관 구조를 나타내며 capillary-like tubular structure area는 안정된 혈관 네트워크 구조를 의미한다.
도 6A 내지 도 6C에 도시된 바와 같이, HDF와 RFP-HUVECs을 50:50의 중량비로 2X106 cells/ml농도가 되도록 인캡술레이션(encapsulation)하였을 때, 7일간 배양 후 신생인공혈관 구조가 잘 형성되고 혈관내피세포(RFP-HUVECs) 및 섬유아세포(HDFs)가 모두 잘 생존하는 것을 확인하였다.
또한, 도 6D 내지 도 6E에 도시된 바와 같이, HDF:RFP-HUVECs=25:75의 중량비인 경우가 성숙한 인공혈관 구조인 segment가 많으며 인공혈관의 면적도 넓은 것을 확인하였다. 하지만, 진피구조의 형성 정도는 HDF:RFP-HUVECs=75:25 및 50:50 의 중량비인 경우에 비해 미흡한 것을 확인하였다.
[인공피부]
실시예 19: 인공피부 제조
인공 표피층
락티드(L-Lactide)와 ε-Caprolactone의 중량비가 50:50인 PLCL을 1,1,1,3,3,3-Hexafluoroisopropanol(HFIP)에 9 중량%로 용해시킨 후 방사거리 18 cm, 인젝션 속도 3 ml/h, 전압 9 kV의 조건으로 전기방사하여 100 ㎛ 두께의 멤브레인을 제작하고 이를 1 X 1 cm 사이즈로 절단하였다. 상기 제조된 멤브레인에 산소 플라즈마 처리(CUTE-B system, FEMTO Science, Korea)를 해준 후 EDC/NHS 화학적 방법을 이용하여 공유결합으로 collagen type I을 코팅하였다(ccPLCL-NFM). 상기 콜라겐이 코팅된 멤브에인 위에 케라틴세포인 HaCaT cells을 10X105 cells/cm2의 농도로 씨드(seeding)해준 후 3주 동안 37 ℃ 인큐베이터에서 배양하여 인공 표피층을 형성하였다.
인공 진피층
500 ㎛ 직경의 관 2개를 꽂은 PDMS 칩에 3 mg/ml 농도의 콜라겐/피브린 하이드로겔(콜라겔:피브린 = 50:50의 중량비)에 피부 섬유아세포인 HDF와 내피세포인 RFP-HUVECs을 50:50의 중량비로 2X106 cells/ml농도가 되도록 인캡술레이션(encapsulation)시키고 7일 동안 배양하여 인공 진피층을 형성하였다.
인공피부
상기 제조된 표피층을 상기 진피층의 하이드로겔 위에 올려주는데, 이때 표피층의 배양된 면이 상기 하이드로겔과 맞닿도록 한다. 이후, 30분간 37 ℃ 인큐베이터에서 겔화시키고, 하이드로겔이 겔화되면 저장층(reservoir)에 미디어를 투입하고 하이드로겔의 완전한 겔화를 위해 37 ℃ 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하였다. 상기 하이드로겔이 완전히 겔화되면 상기 꽂아 두었던 500 ㎛ 직경의 관을 제거하여 하이드로겔 내부에 채널을 만들고, 상기 채널에 7 x 106 cells/ml의 농도로 HUVECs을 seeding한 다음 1시간 동안 회전시켜주면서 채널에 코팅시켜준 후 저장층에 배양액을 채우고 37 ℃ 인큐베이터에서 배양하여 인공피부를 수득하였다(도 7).
본 발명에서 혈관은 진피층 내부에 포함된 내피세포에 의해 자연적으로 모세혈관과 같은 구조를 형성하기도 하고, 채널을 통해 모사한 마이크로사이즈의 혈관에서 가지 뻗듯이 혈관이 진피층으로 뻗어나가 혈관이 형성되도록 하였다.
시험예 6: 인공피부의 형광 이미지
도 8a는 본 발명의 실시예에 따라 제조된 인공피부의 혈관화 조직(RFP-HUVECs), 진피층(HDF) 및 표피층(HaCaT)을 보여주는 형광이미지이며, 도 8b는 본 발명의 실시예에 따라 제조된 인공피부의 단면적을 보여주는 형광이미지이다 (red = 혈관화 조직, green = 진피 조직, blue = 표피 조직).
도 8a 및 도 8b에 도시된 바와 같이, 혈관, 진피 및 진피 내 모세혈관, 표피조직이 복합화된 인체의 피부모사 복합조직이 잘 형성되고 배양기간 동안 유지되는 것을 확인하였다.
시험예 7: 토너 테스트
도 9A는 본 발명의 실시예에 따라 제조된 인공피부에 FITC-Toner를 처리한 단면을 나타낸 이미지이고(red : CM-Dil로 태깅한 HUVEC, blue : CMAC로 태깅한 HaCaT, green : FITC-Toner), 도 9B는 본 발명의 실시예에 따라 제조된 인공피부에 FITC-Toner를 처리한 후 FITC-Toner의 투과 깊이를 나타낸 이미지이다. Scale bars = 200 ㎛ (도 9A), 50 ㎛(도 9B).
도 9A 및 도 9B에 도시된 바와 같이, 실시예에 따라 제조된 인공 표피층에 실제 화장품의 흡수율을 확인해보기 위하여 FITC-Toner를 처리한 결과, 대부분의 FITC-Toner가 표피층에 분포되어있고 혈관층에서는 거의 발견되지 않는 것을 확인하였다. 이는 개발된 인공피부의 인공 표피층이 실제 피부의 표피와 유사하게 장벽의 역할을 수행하여 toner가 혈관이 존재하는 피하조직까지 흡수되지 않도록 한다는 것을 보여주는 결과로서 본 발명의 인공피부가 실제 화장품의 유효성/안전성 평가 플랫폼으로 잠재력을 갖고 있음을 시사한다 할 수 있다.

Claims (19)

  1. 전기방사된(electrospun) 다공성의 생분해성 고분자;
    상기 생분해성 고분자에 코팅된 콜라겐 코팅층; 및
    상기 콜라겐 코팅층 상에 케라틴세포(keratinocyte)로 배양된 각질층;을 포함하며,
    상기 생분해성 고분자는 폴리카프로락톤(PCL)과 락티드가 1 : 1-2의 중량비로 혼합된 혼합물이고,
    상기 전기방사는 방사거리 15 내지 20 cm, 인젝션 속도 1 내지 10 ml/h 및 전압 5 내지 15 kV의 조건으로 수행되는 것을 특징으로 하는 인공 표피층.
  2. 제1항에 있어서, 상기 케라틴세포의 농도는 1X105 내지 5X106 cells/cm2인 것을 특징으로 하는 인공 표피층.
  3. 제1항에 있어서, 상기 케라틴세포는 32 내지 39 ℃에서 7 내지 28일 동안 배양된 것을 특징으로 하는 인공 표피층.
  4. 제1항에 있어서, 상기 전기방사된 생분해성 고분자의 두께는 50 내지 120 ㎛인 것을 특징으로 하는 인공 표피층.
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서, 상기 생분해성 고분자는 유기용매에 용해되어 전기방사되는 것을 특징으로 하는 인공 표피층.
  7. 제6항에 있어서, 상기 유기용매는 헥사플루오루이소프로판올(Hexafluoroisopropanol), THF(tetrahydrofuran), DMF(dimethylformamide), DMSO(dimethylsulfoxide), 클로로포름, 디클로로메탄, 헥산, 디에틸에테르 및 아세토니트릴로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 인공 표피층.
  8. 삭제
  9. 제1항에 있어서, 상기 생분해성 고분자는 전기방사 후 산소플라즈마로 후처리되는 것을 특징으로 하는 인공 표피층.
  10. 콜라겐을 포함하는 하이드로겔에 섬유아세포 및 내피세포를 인캡슐레이션시켜 인공혈관이 형성된 것이며,
    상기 하이드로겔은 콜라겐과, 피브린, 헤파린 및 카테콜로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 추가성분이 1 : 0.5-3의 중량비 혼합된 것을 특징으로 하는 인공 진피층.
  11. 삭제
  12. 제10항에 있어서, 상기 콜라겐과, 상기 추가성분이 혼합된 혼합물의 농도는 1 내지 10 mg/ml인 것을 특징으로 하는 인공 진피층.
  13. 제10항에 있어서, 상기 섬유아세포 및 내피세포는 1 : 0.2-5의 중량비로 혼합된 것을 특징으로 하는 인공 진피층.
  14. 제10항에 있어서, 상기 인캡슐레이션된 섬유아세포 및 내피세포가 혼합된 혼합세포의 농도는 1X106 내지 9X107 cells/ml인 것을 특징으로 하는 인공 진피층.
  15. 인공 진피층 및 인공 표피층을 포함하는 인공피부로서,
    상기 진피층은 콜라겐을 포함하는 하이드로겔에 섬유아세포 및 내피세포를 인캡슐레이션시켜 인공혈관이 형성된 것이며;
    상기 표피층은 상기 진피층 상면에 형성되며, 전기방사된(electrospun) 다공성의 생분해성 고분자, 상기 생분해성 고분자에 코팅된 콜라겐 코팅층, 및 상기 콜라겐 코팅층 상에 케라틴세포(keratinocyte)로 배양된 각질층을 포함하며,
    상기 하이드로겔은 콜라겐과, 피브린, 헤파린 및 카테콜로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 추가성분이 1 : 0.5-3의 중량비 혼합된 것이며,
    상기 생분해성 고분자는 폴리카프로락톤(PCL)과 락티드가 1 : 1-2의 중량비로 혼합된 혼합물이고,
    상기 전기방사는 방사거리 15 내지 20 cm, 인젝션 속도 1 내지 10 ml/h 및 전압 5 내지 15 kV의 조건으로 수행되는 것을 특징으로 하는 인공피부.
  16. (A) 생분해성 고분자를 전기방사(electrospinning)시켜 다공성 구조의 멤브레인을 형성하는 단계;
    (B) 상기 멤브레인의 표면을 콜라겐으로 코팅시키는 단계;
    (C) 상기 콜라겐이 코팅된 멤브레인 위에서 케라틴세포(keratinocyte)를 배양하여 각질층을 형성시킴으로써 표피층을 수득하는 단계;
    (D) 콜라겐을 포함하는 하이드로겔 상에 섬유아세포 및 내피세포를 인캡슐레이션시켜 적층시킴으로써 인공혈관이 형성된 진피층을 형성하는 단계;
    (E) 상기 표피층에서 배양된 면과 상기 진피층의 하이드로겔이 서로 맞닿도록 적층시키는 단계; 및
    (F) 상기 진피층과 표피층이 적층된 인공피부를 겔화시키는 단계;를 포함하며,
    상기 생분해성 고분자는 폴리카프로락톤(PCL)과 락티드가 1 : 1-2의 중량비로 혼합된 혼합물이고,
    상기 전기방사는 방사거리 15 내지 20 cm, 인젝션 속도 1 내지 10 ml/h 및 전압 5 내지 15 kV의 조건으로 수행되며,
    상기 하이드로겔은 콜라겐과, 피브린, 헤파린 및 카테콜로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 추가성분이 1 : 0.5-3의 중량비 혼합된 것을 특징으로 하는 인공피부의 제조방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 (F)단계 이후에, (G) 상기 겔화된 인공피부에 저장층을 형성하고 상기 저장층에 미디어를 투입한 다음 인공피부를 완전히 겔화시키는 단계;
    (H) 상기 겔화된 진피층 내부에 채널을 형성한 후 내피세포를 첨가하여 상기 채널을 코팅시키는 단계;
    (I) 상기 저장층에 배양액을 채우고 배양하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 인공피부의 제조방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 내피세포는 1X106 내지 9X107 cells/ml의 농도로 첨가되는 것을 특징으로 하는 인공피부의 제조방법.
  19. 콜라겐과, 카테콜 및 피브린으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 추가성분이 1 : 0.5-3의 중량비로 혼합된 혼합물을 1 내지 10 mg/ml의 농도로 함유하는 하이드로겔에 섬유아세포 및 내피세포가 1 : 0.2-5의 중량비로 혼합된 혼합세포를 1X106 내지 9X107 cells/ml의 농도로 인캡슐레이션시켜 인공혈관이 형성된 진피층; 및
    상기 진피층 상면에 형성되며, 두께가 50 내지 120 ㎛인 전기방사된 다공성의 생분해성 고분자를 산소플라즈마로 처리하고 콜라겐을 코팅시킨 표피층;을 포함하되,
    상기 표피층은 콜라겐이 코팅된 생분해성 고분자 위에 케라틴세포를 1 X 105 내지 5 X 106 cells/cm2의 농도로 첨가하여 32 내지 39 ℃에서 15 내지 25일 동안 배양한 것이며, 상기 전기방사는 방사거리 15 내지 20 cm, 인젝션 속도 1 내지 10 ml/h 및 전압 5 내지 15 kV의 조건으로 수행되고, 상기 생분해성 고분자는 폴리카프로락톤(PCL)과 락티드가 1 : 1-2의 중량비로 혼합된 혼합물인 것을 특징으로 하는 인공피부.
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